Hoàn thiện quy trình phát hiện nhanh bacillus cereus và escherichia coli, trong sữa tiệt trùng với sự hỗ trợ của kỹ thuật real time PCR
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (698 KB, 20 trang )
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, trước hết em xin bầy tỏ
lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, TS.
Lê Quang Hòa người đã tận tình giảng dạy và hướng dẫn em trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành bản luận văn này. Em cũng xin bày
tỏ lòng biết ơn đến đã toàn bộ cán bộ Viện CNSH và CNTP trường ĐHBK
HN đã giúp đỡ và hướng dẫn em tận tình trong quá trình nghiên cứu tại phòng
thí nghiệm :”công nghệ Protein enzyme và kỹ thuật gen“.
Qua đây, em cũng xin chân thành cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những
người thân đã đọng viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành bản
luận văn này.
Hà Nội, ngày 28 tháng 5 năm 2007
Sinh viên
Trương Thị Thu Hiền
Trang 1
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt: Nghĩa tương ứng:
VSV Vi sinh vật
UHT(Ultra heat treatment) Xử lý tiệt trùng sữa
PCR(Polymerase Chain Reaction) Phản ứng chuỗi trùng hợp
dNTP Deoxynucleotidetriphosphate
DNA Deoxyribonucleic acid
EDTA Ethylendiamin etetraacetic acid
TE TRISEDTA
CFU( colony forming units) Đơn vị hình thành khuẩn lạc
Trang 2
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH VẼ
Bảng 1. Tiêu chuẩn vi sinh vật cho một số sản phẩm sữa
Bảng 2. Kết quả ly tâm với E.Coli
Bảng 3. Kết quả ly tâm với Bacillus
Bảng 4. Kết quả lựa chọn môi trường tăng sinh
Bảng 5. Kết quả lựa chọn thời gian tăng sinh với E.coli.
Bảng 6. Kết quả lựa chọn thời gian tăng sinh với Bacillus.
Hình 1 Hình thái Escherichia coli
Hình 2. Hình thái Bacillus cereus.
Hình 3. Sơ đồ một số phương pháp của kỹ thuật Real Time PCR
Hình 4. Đồ thị chuẩn hóa của phản ứng Realtime PCR
Hình 5. Quy trình phát hiện Bacillus và E.coli trên sữa tiệt trùng không
đường ở mật độ nhiễm ban đầu 1CFU/1ml
Hình 6. Quy trình phát hiện Bacillus trên sữa tiệt trùng không đường ở
mật độ nhiễm ban đầu 1CFU/25ml
Hình 7. Đường quan hệ tuyến tính giữa giá trị mật độ quang và mật độ
tế bào của Bacillus
Hình 8. Đường quan hệ tuyến tính giữa giá trị mật độ quang và mật độ
tế
bào của E.coli
Trang 3
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
Hình 9. Kết quả lựa chọn thời gian ly tâm thích hợp thu sinh khối tế
bào
vi sinh vật.
MỞ ĐẦU
Sản lượng sữa và nhu cầu tiêu thụ sữa trên thị trường Việt Nam đang
tăng một cách đáng kể, trong 10 năm qua mức độ tiêu thụ là 15 lần. Ước tính
đến năm 2010, nhu cầu về các sản phẩm sữa ở nước ta sẽ gia tăng khoảng
1015% mỗi năm để đạt mức khoảng 10kg/đầu người /năm. Vốn là một thực
phẩm bổ dưỡng, sữa cũng là môi trường thích hợp cho các vi sinh vật gây
bệnh. Do vậy, công tác kiểm tra, và đảm bảo vệ sinh cho sản phẩm sữa là
mối quan tâm hàng đầu của các nhà sản xuất sữa và người tiêu dùng. Tuy
nhiên với các phương pháp phân tích hiện nay, một số hiện tượng nhiễm tạp
vi sinh vật gây bệnh thường được phát hiện muộn, kết quả là các biện pháp
xử lý kỹ thuật ít có hiệu quả và ảnh hưởng nhiều đến quá trình sản xuất
Việc xác định các vi sinh vật có khả năng nhiễm tạp trong các sản
phẩm sữa bằng các phương pháp truyền thống thường ít chính xác, độ nhạy
không cao và thời gian dài. Các kết quả phân tích hầu như không có tính ngăn
ngừa chỉ là căn cứ để giải quyết hậu quả của sự nhiễm tạp. Sự chậm trễ
của phương pháp này sẽ làm tổn thất lớn cho các nhà máy khi có sự cố
nhiễm VSV
Đề tài ”Hoàn thiện quy trình phát hiện nhanh Bacillus cereus và
Escherichia coli, trong sữa tiệt trùng với sự hỗ trợ của kỹ thuật Real
Trang 4
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
Time PCR” được lựa chọn cũng nhằm góp phần giảm bớt những hạn chế
trên của việc phát hiện những vi sinh vật nhiễm tạp.
Để đạt mục tiêu trên, nội dung nghiên cứu của đề tài gồm các phần
sau:
Lựa chon thời gian ly tâm thu sinh khối tế bào vi sinh vật
Lựa chọn một môi trường tăng sinh cho vi sinh vật.
Lựa chọn thời gian tăng sinh thích hợp cho vi sinh vật
Ứng dụng kỹ thuật Real time PCR để phát hiện nhanh các vi sinh vật
B.cereus và E.Coli
PHẦN I: TỔNG QUAN
I. Hiện trạng ngành công nghiệp sữa Việt nam:
Ngành công nghiệp Sữa Việt Nam là một ngành công nghiệp có nhiều
triển vọng vì hiện giờ các nhà sản xuất trong nước mới chỉ đáp ứng được
11% nhu cầu tiêu thụ. Nhu cầu sữa trên thị trường cũng tăng không ngừng,
năm 1990 tính bình quân trên đầu người mới chỉ ở mức 0,47kg/năm, đến năm
2000 con số nằy đã tăng đến 6,5 kg/năm và đến năm 2005 đạt tới 9kg/ năm.
Cùng với sự gia tăng về nhu cầu tiêu thụ thì sản lượng sản xuất sữa đã tăng
lên đáng kể. Theo số liệu thống kê năm 2000, sản lượng sữa trong nước đạt
54.000 tấn, năm 2003 tăng hơn gấp hai lần(112000 tấn) và đến năm 2004 con
số này đã tăng lên thành xấp xỉ 198000 tấn.
Trang 5
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
Sản lượng sữa được dự báo còn tăng nhanh hơn nữa trong giai đoạn
tới. mặc dù có sựu tăng trưởng tốt và sản lượng tiêu thụ và sản xuất nhưng
ngành sữa Việt Nam vẫn còn rất nhiều vấn đề cần giải quyết trong bản thân
các nhà máy cũng như cơ chế quản lý sao cho đảm bảo chất lượng sản phẩm
và quyền lợi người tiêu dùng.
Hiện nay, đã có nhiều chương trình chăn nuôi bò sữa ở các vùng miền
tuy nhiên vẫn chưa đem lại lợi nhuận kinh tế đáng kể vì những nguyên nhân
như mức đầu tư chưa lớn, kỹ thuật chưa đủ đáp ứng và quản lý chưa hiệu
quả.Chính vì nguyên nhân trên mà ngành chăn nuôi bò sữa còn vấp phải vòng
luẩn quẩn đó là nguồn thu từ bán sữa tươi chưa đủ để đầu tư cơ sở vật chất
kỹ thuật tốt.
II. Các vi sinh vật nhiễm tạp trong quá trình chế biến sữa
1. Các nhóm vi sinh vật thường gặp
Trong sữa luôn chứa một lượng vi sinh vật nhất định ngay cả khi sữa
được thu hoạch trong điều kiện vệ sinh tốt. Hệ vi sinh vật trong sữa cũng rất
đa dạng bao gồm nấm men, mấn mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn. Trong các đối
tượng trên thì vi khuẩn được quan tâm hơn cả vì trong sữa chúng thường phát
triển vượt trội hơn. Vi khuẩn trong sữa hay gặp nhất đó là nhóm vi khuẩn
lactic như Streptococcus lactic, S.diaxetylactic, S. Paracitrovous, Lactobacillus
bulgaricum, L.acidophilum, L. Lactic, L.helveticum. [4] Nhóm vi khuẩn này
dóng vai trò quan trọng trong sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa như sữa
chua, phomát. Tuy nhiên nếu chúng có xuất hiện trong các sản phẩm sữa tươi
Trang 6
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
tiệt trùng hoặc sữa tươi thanh trùng thì sẽ là tác nhân làm hỏng sản phẩm
dưới dạng tạo kết tụ protein.
Dựa vào khả năng chịu nhiệt người ta chia các vi sinh vật thường
nhiễm trong sữa thành các nhóm chính sau:
1.1 Vi sinh vật chịu lạnh (Psychrotrophs)
Là những vi sinh vật có khả năng phát triển được ở nhiệt độ dưới 7 oC.
Trong công nghệ sản xuất sữa nhóm vi sinh vật chịu lạnh hay gặp trong mẫu
sữa hỏng là nhóm trực khuẩn Gram (), thường được xác định thuộc loài
Pseudomonas. hầu hết những vi sinh vật chịu lạnh này sẽ nhanh chóng làm
hỏng sữa khi được bảo quản ở khoảng nhiệt độ từ 0 đến 10oC. Tuy nhiên nó
lại bị tiêu diệt dễ dàng trong các quá trinh gia nhiệt vì vậy ở sản phẩm đã qua
gia nhiệt thì thường hay bị tái nhiễm sau gia nhiệt do điều kiện vệ sinh không
đảm bảo.
1.2 Vi sinh vật ưa ấm (Meso philic)
Những vi khuẩn ưa ấm quan trọng nhất là Streptococci, Lactobacilli và
Coliforms, những vi khuẩn này sản sinh axit, sinh khí và làm mất mùi sữa.
Tuy nhiên chúng lại dễ dàng bị tiêu diệt trong quá trình gia nhiệt Pasteur.
1.3 Vi sinh vật chịu nhiệt (Thermoduric)
Là nhóm có thể không bị tiêu diệt trong quá trình gia nhiệt pasteur hoặc
các xử lý nhiệt khác. Tuy nhiên nhóm này không phát triển ở nhiệt độ gia
nhiệt Pasteur. Giống chịu nhiệt hay gặp nhất là Mcrobacterium,
Corynebacterrium, Micrococos, Streptococcus và Bacillus
Trang 7
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
1.4 Nhóm ưa nhiệt (Thermophilic)
Là nhóm vi khuẩn phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ xử lý Pasteur. Loài
ưa nhiệt thường thấy nhất trong 2 nhóm Bacillus và Clostridium.
1.5 Nhóm ưa nhiệt có thể phát triển trong điều kiện lạnh (Thermoduric
Psychrotrophs) là một số ít các vi sinh vật chịu nhiệt hoặc tạo bào tử chịu
nhiệt nên vẫn có thể sống sót sau khi gia nhiệt nhưng chúng cũng có khả
năng phát triển được trong điều kiện lạnh. Nhóm này thường phát triển chậm
sau đó gây hỏng sản phẩm trong quá trình lưu thông sản phẩm. thường hay
gặp nhất trong nhóm này là Bacillus.[16]
2.Tổng quan về Bacillus và E.coli
E.coli và Bacillus là hai vi sinh vật gây bệnh thường gặp và phát triển
tốt trong môi trường sữa, ngoài ra Bacillus còn là vi sinh vật dễ ràng sinh bào
tử và bào tử rất dễ nảy mầm vì thế gây khó khăn trong quá trình bảo quản.
2.1 Escherichia coli
E.coli là vi sinh vật hiếu khí tuỳ ý hiện diện trong đường ruột của
người và các loài động vật máu nóng. Hầu hết các dòng E.coli không gây hại
và đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định sinh lý đường ruột. Tuy nhiên có
4 dòng có thể gây bệnh cho người và một số loài động vật là
Enteropathogenic
E.coli
(EPEC), Enterotoxigenic
E.coli
(ETEC),
Enteroinvasive E.coli (EIEC) và Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC) hay E.coli
O157:H7.[2]
Trang 8
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
Hình 1 Hình thái Escherichia coli
Các loài E.coli hiện diện rộng rãi trong môi trường bị ô nhiễm hay phân
chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường. Gần đây
người ta còn chứng minh được rằng E.coli cũng hiện diện trong những vùng
nước ấm, không bị ô nhiễm chất hữu cơ. Do sự phân bố rộng rãi trong tự
nhiên nên E.coli dễ dàng nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua
nguồn nước trong quá trình sản xuất, chế biến. Các dòng E.coli gây bệnh gây
ra các triệu chứng rối lọan đường tiêu hoá. Các triệu chứng lâm sàng thay đổi
từ nhẹ đến rất nặng, có thể gây chết người phụ thuộc vào mức độ nhiễm,
dòng gây nhiễm và khả năng đáp ứng của từng người.
2.2 Bacillus cereus
Trang 9
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
Bacillus cereus là trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử, kỵ khí tuỳ tiện,
tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ 550oC, tối ưu ở 3540oC, pH dao
động từ 4,59,3, dễ tạo bào tử và bào tửu nảy mầm rất dễ dàng. Vi khuẩn
này hiện diện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (Sữa, thịt, rau quả, các loại
sản phẩm khô...)[2]
Hình 2 Hình thái Bacillus cereus
Vi khuẩn này sinh ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu
chảy và emetic toxin gây nôn mửa. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi B.cereus
Trang 10
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
khi thực phẩm được chuẩn bị mà không được giữ trong điều kiện lạnh trong
vài giờ trước khi sử dụng.
Thực phẩm chứa vi khuẩn ở mật độ 106 tế bào/g đủ gây ngộ độc.
Triệu chứng ngộ độc gây ra bởi B.cereus chủ yếu là đau bụng, tiêu chảy,
không sốt, bắt đầu 4 đến 16 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm và kéo dài
trong 1224 giờ. Một dạng triệu chứng ngộ độc khác là buồn nôn và nôn sau
15 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn, không bị tiêu chảy, kéo dài khoảng
24 giờ
III. Tiêu chuẩn vi sinh vật cho một số sản phẩm sữa
Giới hạn tối đa về vi sinh vật cho phép có mặt trong các sản phẩm sữa
khác nhau là khác nhau. Trong cùng một sản phẩm nhưng ở mỗi quốc gia
khác nhau thì giới hạn này cũng khác nhau
Tiêu chuẩn Việt Nam
Hiện nay Việt Nam đang áp dụng tiêu chuẩn về giới hạn vi sinh vật
trong các sản phẩm sữa theo quyết định số 3742/2001/QĐBYT ngày 31 tháng
08 năm 2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế (Bảng 1)[8]
Nhóm sữa
a. Sữa khô, sữa bột ....
TSVKHK
Coliforms
E.coli
S.Aureus
Trang 11
5.104
10
0
0
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
Salmonella*
b. Sữa tươi tiệt trùng theo phương pháp Pasteur.
0
TSVKHK
Coliforms
E.coli
Salmonella*
5.104
10
3
TSVKHK
Coliforms
E.coli
S.Aureus
Salmonella*
10
0
0
0
0
d. Sản phẩm chế biến của sữa : bơ, sữa chua, pho TSVKHK
mat, ...( dùng trực tiếp, không qua xử lý nhiệt trước Coliforms
E.coli
khi sử dụng ).
S.Aureus
Salmonella*
104
10
0
0
c. Sữa tươi tiệt trùng theo phương pháp U.H.T.
0
0
(*) Salmonella : Không được có trong 25g thực phẩm
Bảng 1 Tiêu chuẩn vi sinh vật cho một số sản phẩm sữa
IV. Các phương pháp phát hiện vi sinh vật trong mẫu thực phẩm
Để kiểm soát vi sinh vật thì có nhiều phương pháp khác nhau. Dựa vào
thời gian cho kết quả, người ta có thể chia thành hai nhóm phương pháp chính
là phương pháp truyền thống và phương pháp phân tích nhanh.
Trang 12
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
1. Các phương pháp truyền thống
Nhóm các phương pháp này dựa trên đặc điểm phát triển của vi sinh
vật trên các môi trường đặc trưng và đặc điểm sinh lí, sinh hoá của các
chủng, các loài vi sinh vật khác nhau.
Ưu điểm của phương pháp này là thao tác đơn giản, dễ làm, không
phải đầu tư dụng cụ, thiết bị đắt tiền. Tuy nhiên với nhóm phương pháp này
còn một số hạn chế như độ nhạy không cao, tốn nhiều nhân công và thời
gian phân tích thường kéo dài do đó hạn chế trong công tác phòng ngừa.
2. Các phương pháp phân tích nhanh
Theo nguyên lí của các phương pháp phân tích vi sinh vật có thể chia
phương pháp này thành hai nhóm nhỏ: nhóm dựa trên nguyên tắc của sự kết
hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên kháng thể (phương pháp miễn dịch) và
nhóm dựa trên sự bắt cặp bổ sung các nucleotit
2.1 . Phương pháp miễn dịch
Nhóm các phương pháp này dựa trên phản ứng của kháng thể
đặc hiệu với kháng nguyên bề mặt của tế bào vi sinh vật. Dựa trên
nguyên tắc này có rất nhiều kĩ thuật đã phát triển thành phương pháp
phát hiện nhanh vi sinh vật.
Kĩ thuật ELISA, khi trong mẫu xuất hiện vi sinh vật m ục tiêu sẽ
xảy ra phản ứng kháng nguyên kháng thể và phản ứng này sẽ
được phát hiện nhờ một kháng thể cộng hợp gắn enzym thứ hai
làm biến màu cơ chất. Ngưỡng phát hiện của kĩ thuật này giao
động từ 104106 cfu/ml, do vậy trong phân tích phát hiện vi sinh
Trang 13
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
vật thường phải qua giai đoạn tăng sinh. Tuy nhiên, giờ đây
người ta đã có thể sử dụng bi từ có gắn kháng thể đặc hiệu để
thu nhận trực tiếp vi sinh vật mục tiêu với một sốlượng lớn mà
không cần giai đoạn tăng sinh.
Kĩ thuật latex agglutination (LA), sử dụng các hạt cao su có mầu
có đính kháng thể đặc hiệu để định tính nhanh các chủng vi
khuẩn đã được phân lập. Khi có mặt kháng nguyên tương ứng,
quá trình kết tụ (agglutination) sẽ diễn ra và có thể quan sát trực
tiếp bắng mắt thường (tạo ra hạt hoặc dải có màu). Kĩ thuật này
có thể sử dụng để xác định nhanh vi sinh vật nhiễm tạp trong
môi trường thuần sau khi phân lập từ thực phẩm.
2.2. Kĩ thuật lai phân tử( DNA hybridization):
Kỹ thuật này có thể sử dụng đầu dò với đoạn rARN đích do vậy có
tính chính xác và độ nhạy cao. Đây là kĩ thuật cho phép phát hiện sự có
mặt của nhiều loài vi sinh vật một lúc với thời gian nhanh. Tuy nhiên kỹ
thuật cũng phức tạp và phải tốn công thiết kế các mẫu dò và sử dụng vật
liệu phóng xạ.
2.3. Kỹ thuật PCR
Về lý thuyết kỹ thuật này có thể nhân một đoạn ADN đích lên hàng
triệu bản chỉ trong khoảng hơn một giờ vì vậy giảm được rất nhiều hoặc
không cần thời gian tăng sinh cũng có thể xác định được sự có mặt của vi
sinh vật đích. Tuy nhiên sự có mặt của các chất ức chế trong thực phẩm
hoặc trong môi trường tăng sinh cũng có thể ức chế sự bắt cặp của mồi
và làm giảm khả năng khuyếch đại đoạn ADN đích..Kỹ thuật này cho
Trang 14
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
phép phát hiện được nhiều loài vi sinh vật với thời gian tương đối nhanh
và độ nhạy khá cao. Phương pháp này có thể áp dụng trong các nhà máy
trong công tác phòng ngừa và phát hiện.
2.4. Kỹ thuật Microarray, Macroarray:
Kỹ thuật này thực chất là dựa trên kỹ thuật lai phân tử, trên các phiến
kính hoặc các màng cellulose có gắn hang chục nghìn mẫu do AND theo
một trình tự xác định. Nhờ vào phản ứng lai, bắt cặp của AND có trình tự
tương đồng mà sự có mặt của một đoan gen của một vi sinh vật đích nào
đó có thể được phát hiện và số copy có thể xác định chính xác. Với kỹ
thuật này có thể xác định được nhiều gen đích ( vi sinh vật) trong cùng
một thời điểm với mức độ chính xác cao và thời gian nhanh và chính xác
3. Phương pháp phát hiện vi sinh vật bằng kỹ thuật Real Time PCR
Nguyên tắc
Kỹ thuật Real Time PCR hay còn gọi là PCR động về cơ bản dựa trên
nguyên tắc của kỹ thuật PCR. Tuy nhiên nó cho phép hiển thị và theo dõi trực
tiếp qúa trình nhân bản DNA đang diễn ra theo từng chu trình nhiệt qua sử
dụng kỹ thuật phát huỳnh quang. Dựa vào độ phát huỳnh quang ta có thể định
lượng các đoạn DAN hình thành
Do mồi có tính phát quang cho nên có thể đánh dấu chúng với các chất
nhuộm khác nhau, nhờ thế để có thể nhân các đoạn khác nhau trong cùng một
phản ứng PCR. Tuy nhiên phương pháp này có hạn chế là phải tổng hợp các
mẫu dò khác nhau cho các trình tự nhận biết khác nhau.[10]
Trang 15
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
Các phương pháp định lượng bằng Real time PCR
Phương pháp sử dụng chất nhuộm mầu SYBR Green:
Chất nhuộm mầu này được gắn với rãnh nhỏ của chuỗi DNA kép, khi
được gắn với sợi DNA kép thì cường độ phát huỳnh quang tăng lên, khi
bản sao tạo ra càng nhiều thì tín hiệu phát ra của chất mầu sẽ tăng lên
theo tỉ lệ thuận. Ưu điểm của phương pháp này là SYBR sẽ đính vào
bất cứ chuỗi DNA kép nào có mặt.
Phương pháp đầu dò thuỷ phân TaqMan:
Kỹ thuật này sử dụng các đầu dò có thể phát huỳnh quang, các
mẫu dò là một oligonucleotit trong đó một đầu được gắn với chất
nhuộm mầu có phát huỳnh quang, đầu kia được gắn với chất nhuộm
có vai trò làm tắt sự phát huỳnh quang. Khi có mặt đoạn DNA cần
nhân, mẫu dò sẽ gắn vào DNA khuôn ở vùng dưới của mồi theo hướng
5’. Ở trạng thái này không có hiện tượng phát huỳnh quang.
Khi bắt đầu tiến hành quy trình PCR với sự hoạt động của
enzyme taqpolymerase mồi được kéo dài cho tới khi gặp mẫu dò thì
mẫu dò sẽ bị phân giải bởi hoạt tính 5’ nuclease của taqDNA
polymerase.Sự phân giải mẫu dò sẽ làm giải phóng chất nhuộm mầu
có khả ăng phát huỳnh quang khỏi ảnh hưởng kìm hãm của chất
nhuộm có vai trò làm tắt sự phát huỳnh quang. Sự phát huỳnh quang
này có thể nhận biết được.
Phương pháp đầu dò lai
Trong kỹ thuật này một đầu dò được gắn với một chất cho
huỳnh quang ở đầu 3’ và một đầu dò thứ hai gắn với một chất nhuộm
Trang 16
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
huỳnh quang. Khi hai đầu dò này tiến lại gần nhau, cách nhau khoảng
15 nucleotide, chất phát quang phát ra từ chất cho huỳnh quang sẽ kích
thích chất nhận huỳnh quang và kết quả là phát ra tín hiệu huỳnh
quang.
Hình 3 Sơ đồ một số phương pháp của kỹ thuật Real Time
PCR
Ưu điểm
Trang 17
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
Kỹ thuật này khắc phục được những nhược điểm của PCR như sau:
Không cần chạy điện di kiểm tra kết quả PCR
Có thể định lượng chính xác sản phẩm PCR, trong khi sử dụng PCR
thông thường việc phân biệt dựa trên độ lớn của vạch thu được sau điện
di
Độ đặc hiệu và độ nhạy cao hơn, thời gian tiến hành phản ứng ngắn
Có thể tiến hành với nhiều đoạn DNA cùng lúc trong cùng một ống
nghiệm nên giảm khả năng nhiễm mẫu
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
I. Vật liệu và thiết bị
1. Chủng vi sinh vật
STT
Chủng chuẩn
Nguồn gốc
1
Bacillus cereus
ATCC 10876
2
Escherichia coli
ATCC 25923
2. Mẫu sữa thí nghiệm
Mẫu sữa tươi tiệt trùng không có vi sinh vật của Vinamilk.
3. Hoá chất
Hóa chất dùng tách chiết DNA tổng số và hóa chất real time PCR được cung
cấp bởi Amersham Pharmacia Biotech.
Các hóa chất phân tích DNA do Invitrogen và Applied Biosystem cung cấp
Trang 18
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
Hóa chất môi trương nuôi cấy do Merck và Difco cung cấp
4.Môi trường
Các môi trường sử dụng trong đề tài gồm có
Môi trường Violet Red Bile Agar (VRBA): Dùng để nuôi E.coli
Môi trường MannitolEgg Yolkpolymyxin(MYP) agar (g/l):Dùng
để nuôi Bacillus
Môi trường LB(g/l) dùng trong tăng sinh vi khuẩn
Trypticase soy broth yeast extract (TSBYE)
Letheen Broth
Fluid Thioglycollate Medium
Nutrient Broth
Terrific Broth
II. Phương pháp nghiên cứu
1. Xây dựng đường quan hệ tuyến tính giữa giá trị mật độ quang và
mật độ tế bào của E.coli và Bacillus
Để có thể thu được mẫu sữa với các mật độ vi sinh vật nhất định cần
phải tiến hành nhiễm chủ động vi sinh vật mong muốn vào mẫu sữa tiệt
trùng không có vi sinh vật ở mật độ mong muốn phù hợp với yêu cầu thí
nghiệm. Như vậy cần phải xây dựng đường quan hệ tuyến tính giữa giá trị
mật độ quang và mật độ tế bào của E.coli và Bacillus, nhằm xác định được
Trang 19
Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền
mật độ vi sinh vật của một dung dịch chứa vi sinh vật thông qua mật độ
quang.
1.1. Nguyên tắc:
Khi phát triển trong môi trường lỏng mật độ tế bào thay đổi theo thời
gian. Khả năng hấp thụ ánh sáng của canh trường phụ thuộc vào mật độ tế
bào trong dịch nuôi cấy. Ta sẽ tiến hành xây dựng đường quan hệ tuyến tính
giữa giá trị mật độ quang và mật độ tế bào
1.2. Cách tiến hành:
Cho 100µl chủng chuẩn vào trong 10ml môi trường tăng sinh TSBYE, nuôi
lắc với vận tốc lác 200 vòng/phút ở 37oC
Sau các khoảng thời gian 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 gi ờ, 14 gi ờ
tăng sinh, đem mẫu đi đo giá trị mật độ quang so với môi trường TSBYE ở
bước sóng 600nm
Pha loãng dung dịch tại các thời điểm tăng sinh, trải 100µl dung dịch đó trên
môi trường đặc hiệu.
Đếm khuẩn lạc và xác định mật độ tế bào (N/ml) của các dung dịch đó tại
các thời điểm khác nhau.
Tính các giá trị Log (N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với mỗi
độ đục. Vẽ đường biễu diễn của Log (N/ml) theo OD 600nm. Xác định khoảng
tuyến tính giữa log (N/ml) và OD.
2. Lựa chọn thời gian ly tâm thích hợp thu cặn tế bào trong quá trình ly
tâm
Trang 20
