Nghiên cứu khả năng đối kháng của một số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng rừng đối với một số loại nấm vật gây bệnh thực vật phổ biến ở miền bắc Việt Nam

LỜI CẢM ƠN
Hiện nay, trong quá trình học tập tại các trường Đại học chủ yếu chú
trọng đào tạo cho Sinh viên nắm vững kĩ thuật lý thuyết, và kiến thức tổng quan
ngành nghề, và những hiểu biết về khoa học nói chung. Nên chưa thể đi sâu vào
thực tế. Việc tham gia nghiên cứu khoa học là 1 cơ hội cho sinh viên tiếp cận,
ứng dụng những kiến thức đã được học trên ghế nhà trường vào cuộc sống cụ
thể, đem lại cho sinh viên những kinh nghiệm bổ ích, và tinh thần hăng say lao
động, thêm yêu ngành nghề mình đã chọn. Bên cạnh đó còn rèn luyện kĩ năng
thực hành, rèn cho sinh viên sự nhạy bén, sáng tạo điều rất cần thiết cho Sinh
viên sau này khi ra trường.
Báo cáo nghiên cứu khoa học đã được hoàn thành tại Viện Công nghệ
Sinh học, trường Đại học Lâm Nghiệp - thị trấn Xuân Mai - huyện Chương Mỹ Thành phố Hà Nội. Để hoàn thành báo cáo này, chúng em luôn được sự quan
tâm của nhà trường, sự động viên của bạn bè và sự giúp đỡ, hướng dẫn nhiệt
tình của các thầy cô.
Nhân dịp này, cho phép chúng em được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
ThS. Nguyễn Thị Minh Hằng đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ chúng em trong suốt
quá trình nghiên cứu. Xin được cảm ơn Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp,
trường Đại học Lâm Nghiệp đã tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá
trình nghiên cứu để hoàn thành bản báo cáo này.
Do trong quá trình nghiên cứu khoa học còn có nhiều hạn chế về mặt thời
gian và kinh nghiệm, báo cáo không tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong
nhận được những ý kiến đóng góp của thầy cô giáo để báo cáo nghiên cứu khoa
học được hoàn thiện hơn.
Chúng em xin trân thành cảm ơn!

1


MỤC LỤC

2

DANH MỤC CÁC BẢNG

3


DANH MỤC CÁC HÌNH

4


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DDT:

Dichloro diphenyl trichloroethane

FAO:

Food and Agriculture Organization of the United Nations.

IPM:

Integrated Pest Management.

CFU:

Colony Forming Unit.

CZ:

Czapek Dox Agar.

PDA:

Potato Dextrose Agar.

ISP :

International Streptomyces Project

LB:

Lysogeny Broth.

TSB:

Tryptone - casein soy broth.

VSVKĐ:

Vi sinh vật kiềm định.

HTKS:

Hoạt tính kháng sinh.

CKS:

Chất kháng sinh.

5


ĐẶT VẤN ĐỀ
Nước ta là một nước nhiệt đới gió mùa nóng ẩm nên điều kiện thích hợp
để cho dịch bệnh nấm tồn tại và phát triển. Hàng năm phải chịu thiệt hại hàng
trăm tỉ đồng vì hoa màu bị nhiễm nấm bệnh. Hàng ngàn hecta cây ăn quả, cây
công nghiệp bị giảm năng suất sau thu hoạch hoặc chặt bỏ vì nhiễm nấm bệnh.
Bệnh hại do nấm là một vấn đề mà người nông dân còn gặp nhiều khó khăn
trong việc quản lý và phòng trừ. Thiệt hại kinh tế của bệnh cây là điều thấy rất
rõ: làm giảm năng suất cây trồng, giảm phẩm chất nông sản khi thu hoạch và
bảo quản, ảnh hưởng xấu đến đất trồng và cơ cấu cây trồng. Từ thế kỷ 18 Anton
De Bary đã đặt nền móng môn khoa học bệnh cây (1853). Để khắc phục những
thiệt hại do bệnh cây gây ra, người ta đã sử dụng nhiều biện pháp như: kỹ thuật
canh tác, thuốc hóa học, … trong đó sử dụng thuốc hóa học để phòng ngừa và
ngăn chặn bệnh hại cây trồng là được nhiều người ưa chuộng do tính dễ sử
dụng, hiệu quả cao nếu kết hợp với biện pháp canh tác thì việc phòng bệnh cho
cây đạt hiệu quả lớn. Tuy nhiên, sau thời gian dài sử dụng thuốc hóa học cũng
như phân hóa học người ta đã nhận thấy chúng ảnh hưởng đến môi trường sống
rất lớn. Chúng tác động xấu đến cân bằng sinh thái, gây ô nhiễm môi trường đất,
nước làm cho người và gia súc bị ngộ độc. Đáng ngại hơn, một số thuốc trừ sâu
chậm phân hủy đã lưu tồn lâu trong đất (DDT lưu tồn được 25 năm) sự lưu tồn
lâu trong đất của các chất hoá học này làm nồng độ của chúng tăng dần theo thời
gian. Đồng thời việc sử dụng tuỳ tiện liều lượng, thời gian phun thuốc hóa học
đã tạo nên dư lượng lớn không cho phép trong rau màu và lương thực, gây nên
những vụ ngộ độc thực phẩm lớn mà con người mà chúng ta từng biết trong thời
gian qua.
Chính vì vậy, Hội nghị tư vấn khu vực châu Á Thái Bình Dương của FAO
năm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của chương trình IPM

(Quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lược là sử dụng tác nhân sinh học để hạn
chế các quần thể VSV gây bệnh. Trong số các tác nhân sinh học thường được sử
6


dụng để ức chế VSV gây bệnh, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì tỷ
lệ loài có khả năng sinh chất kháng sinh cao, trong đó có nhiều chất kháng sinh
có khả năng chống nấm mạnh. Cho tới nay , trong khoảng hơn 8.000 chất kháng
sinh được biết đến trên thế giới thì 80% là do xạ khuẩn sinh ra
(Dhanasekaranetal., 2012). Vì vậy, việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có khả
năng sinh chất kháng sinh kháng nấm bệnh cây có thể góp phần vào công tác bảo
vệ cây trồng và xây dựng nền nông nghiệp an toàn và bền vững.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng em thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu khả năng đối kháng của một số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng
rừng đối với một số loại nấm vật gây bệnh thực vật phổ biến ở miền bắc Việt
Nam”.

7


CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Nấm được xếp vào nhóm sinh vật, nhưng không giống như Rong Tảo,
nấm không chứa diệp lục tố. Cấu tạo thường là đơn bào hoặc đa bào, có thể quan
sát dưới kính hiển vi hoặc nhìn bằng mắt thường, chúng có thể đo được từ vài
microns cho tới vài centimeters có khi tới vài metters, trường hợp nấm có quả
thể ở Lớp Đảm khuẩn (Basidiomycetes). Nấm có cơ quan sinh trưởng dạng sợi,
phân nhánh. Một tập hợp nhiều sợi nấm sinh trưởng tạo thành tản nấm là thể
dinh dưỡng của nấm. Sợi nấm không có màng ngăn gọi là sợi đơn bào và sợi
nấm có nhiều màng ngăn gọi là sợi đa bào. Chiều rộng của sợi nấm biến động

trong khoảng 0,5-100 µm, phần lớn từ 5-20 µm, chiều dài thay đổi tùy theo các
loại nấm và điều kiện dinh dưỡng. Nấm có thể sợi không màu hoặc các màu
khác nhau. Nấm đất gây bệnh có thể tồn tại trong đất trong thời gian rất dài kể
cả trong điều kiện không có cây ký chủ. Chúng bảo tồn bằng các sợi nấm, hạch
nấm, hậu bào tử, bào tử trứng và những bào tử có vách dày ở trong đất và trên
tàn dư cây trồng. Nấm xâm nhiễm, gây hại cây trồng làm cho rễ và các tế bào
mạch dẫn của cây không còn khả năng hút nước và chất dinh dưỡng từ giá thể.
Vì vậy mà các triệu chứng của bệnh nấm gây ra thường rất giống nhau, đều gây
héo vàng, còi cọc và chết cây. Nhiệt độ thích hợp nhất của nấm là 25 – 28 oC,
nhiệt độ thấp nhất là 5 – 10oC, cao nhất là 35oC.
1. 1. Một số bệnh do nấm gây ra và chất kháng sinh trong phòng chống
nấm bệnh
1.1.1. Thực trạng về bệnh hại cây trồng
Ở các nước sản xuất nông nghiệp, bệnh cây đã gây ra những thiệt hại kinh
tế nghiêm trọng. Các dịch bệnh đạo ôn hại lúa, bệnh bạc lá (do vi khuẩn gây ra),
bệnh vàng lụi (do virus gây ra), bệnh khô vằn (do nấm gây ra), …đã gây tổn thất
lớn không những về năng suất mà còn làm mất tính ổn định của giống cây trồng.
Theo thống kê của tổ chức lương nông thế giới cho thấy: các loại cây trồng trên
đồng ruộng hiện nay phải chống đở với 100.000 loài sâu hại khác nhau, 10.000

8


loài nấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh;
thiệt hại hàng năm khoảng 20% (tức 1/5) sản lượng lương thực thực phẩm trên
thề giới bị mấttrắng.
Sau đây là một số bệnh gây thiệt hại lớn phổ biến ở miền Bắc Việt Nam:
* Bệnh thối gốc cây đu đủ:
- Bệnh phát sinh trên thân cây,vết bệnh lúc đầu bằng đầu kim, sau đó lan
rộng ra khắp thân cây đổi sang màu nâu hay đen. Lá bị vàng, rũ và rụng đi,do

gốc bị thối cây sẽ bị đổ và chết. Thường cây được 2-3 năm tuổi dễ bị nhiễm
bệnh, tuy nhiên cây non vẫn bị bệnh. Cây con gieo từ đất có mầm bệnh có thể
mang mầm bệnh và sau khi trồng nếu điều kiện thích hợp bệnh sẽ phát
triển.Bệnh thường phát triển nặng vào đầu mùa mưa, do nấm pythium
aphanidermatum thuộc lớp Phycomycetes gây ra. Có nhiều loài Pythium gây
bệnh này nhưng chủ yếu là P.aphanidermatum. Nấm có đặc điểm như: túi bào
tử có hình cầu tròn.

Hình 1.1 Triệu chứng đốm thân cây đu đủ do nấm P.aphanidermatum gây ra.
* Bệnh phồng lá chè:
- Thường phát sinh ở các bộ phận: lá non, lá bánh tẻ, đôi khi xuất hiện ở
cành non và quả non. Ban đầu vết bệnh là những đốm nhỏ màu vàng nhạt, xung
quanh vết bệnh bong lên bất thường, sau đó vết bệnh lớn dần, mặt trên lõm
xuống, mặt dưới phồng lên. Trên vết bệnh phủ một lớp phấn màu trắng, cuối
cùng vết bệnh chuyển sang màu nâu, vết phồng khô xẹp xuống.

9


- Bệnh do nấm exsobasidium vexans gây ra. Dưới điều kiện độ ẩm cao,
nhiệt độ thấp bệnh phát sinh mạnh. Các thời điểm bệnh thường phát sinh mạnh
thường từ tháng 3 đến tháng 5 và tháng 9- 10. Nhiệt độ thích hợp là 15–20 0C.
Nhiệt độ 11-120C không có lợi ích cho sự phát triển của bệnh và trên 26 0C bệnh
không phát triển.

Hình 1.2 Triệu chứng phồng lá chè do nấm exsobasidium vexans gây ra.
* Bệnh thán thư trên cây xoài:
- Là loại bệnh nguy hiểm nhất, thường gây hại trong mùa mưa hoặc
những lúc đêm có sương. Nấm bệnh tấn công trên cành non, lá non, hoa và quả.
Trên hoa bệnh là rụng hoa, ở lá đốm bệnh màu xám nâu, tròn hay góc cạnh, tạo

đốm cháy lá và rách lá, cuối cùng lá bị rụng. Trên quả, bệnh ban đầu chỉ là các
đốm nâu nhỏ, sau đó phát triển thành các đốm thối đen lõm xuống vỏ quả. Bệnh
do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra.

10


Hình 1.3. Triệu chứng bệnh thán thư hại xoài do nấm Colletotrichum
gloeosporioides gây ra
* Bệnh thối than và tướp lá ngô:
- Bệnh làm thối phần trên của thân và gây ra các vết bệnh trên lá. Trên lá,
ban đầu vết bệnh ươn ướt như giọt dầu, về sau phần giữa vết bệnh khô, nhưng
chung quanh vẫn còn một viền màu nhạt, sau tạo thành vết bệnh trên lá dài, kích
thước rất khác nhau, cuối cùng lá bị bệnh rách theo chiều dọc và tướp ra.
Thân cây ngô thường bị thối bắt đầu ở phần trên ngang gần mắt đóng bắp.
Trên bề mặt dóng thân xuất hiện các sọc màu nâu đỏ, còn phần bên trong thân
thì bị thối nâu hoặc thối đen. Hiện tượng thối thân càng phát triển, ngọn cây ngô
bị héo và chết, hoa cờ không phát triển được.

Hình 1.4 Triệu chứng bệnh thối than và tướp lá ngô.
* Bệnh phấn đen ở cây ngô:
- Bệnh thường xuất hiện ở bắp ngô là chính. Mới đầu chỗ bị bệnh chỉ nổi
lên như một bọc nhỏ, mầu trắng nhẵn, sau đó cứ lớn dần và tạo thành dạng vô
11


định hình, phình to ra, nhiều khía cạnh, mầu trắng, bên trong là một khối rắn
mầu vàng nhạt, sau biến dần thành bột mầu đen, bóp dễ vỡ.
- Bệnh do nấm Ustilago zeae Shwein Unger (DC.) Corda thuộc bộ
Ustilaginales, lớp Nấm Đảm gây ra.

Hình 1.5 Triệu chứng bệnh phấn đen ở bắp ngô do nấm Ustilago zeae
Shwein Unger gây ra.
* Bệnh khô cành lá cây cà phê:
Bệnh do nấm Colletotrichum cofeanum gây ra trên cây cà phê, bệnh phát triển
đặc biệt vào mùa mưa. Khi bị bệnh trên cành, lá ban đầu chỉ xuất hiện những
đốm tròn màu nâu đen,

sau đó lan rộng dần,

trên đó có các vòng

tròn đồng tâm. Nếu bị

nặng các vết bệnh liên

kết với nhau thành

từng mảng khô, màu

nâu hay đen sẫm.

12


Hình 1.6. Triệu chứng bệnh khô cành lá cây cà phê do nấm Colletotrichum
cofeanum gây ra
1.2. Giới thiệu về xạ khuẩn
1.2.1. Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố

rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn,
thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Sự
phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác
và thảm thực vật. Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số VSV. Sự phân bố của xạ
khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường,chúng có nhiều trong các lớp
đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5. Xạ khuẩn có rất ít trong lớp
đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng xạ khuẩn
trong đất cũng thay đổi theo thời gian tro ng năm. Một trong những đặc tính
quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh, 60 - 70%
xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh.
Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có
tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra. Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các
loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes,
Streptoverticillium, Streptosporangium. Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm
đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như
gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi. Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích
cực vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp chất trong đất, nước. Dùng để sản
13


xuất nhiều enzym như proteaza,amylaza, xenluloza…một số axit amin và axit
hữu cơ. Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật.
1.2.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Xạ khuẩn sống rất phổ biến trong tự nhiên cũng như trong đất, chúng có
nhiều đặc điểm giống vi khuẩn và khác với nấm mốc như kích thước tế bào nhỏ,
thành tế bào không chứa cenllulose hay kitin, phân chia tế bào theo kiểu vô ti
(Amytoz), không phân biệt giới tính; tuy nhiên, xạ khuẩn cũng có những đặc
điểm giống nấm mốc hơn như có hệ sợi khuẩn ty phân nhánh, nhưng ở xạ khuẩn
hệ sợi không có vách ngăn. Sự phân hoá của khuẩn ty khí sinh bắt đầu từ những
mấu lồi xuất hiện trên bề mặt của sợi khuẩn ty sau đó mấu lồi lớn lên thành chồi,

chồi phát triển dài ra thành sợi, cuối cùng tạo thành hệ sợi dầy đặc. Đường kính
mỗi sợi khuẩn ty là 0,5µm – 1,5µm. (R.E. Buchanan,1998).
Khuẩn ty khí sinh của xạ khuẩn phát triển ra bên ngoài không khí trên bề
mặt môi trường rắn tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn; khuẩn lạc xạ khuẩn dạng hình
tròn do khuẩn ty phát triển theo hình phóng xạ tạo thành nhiều vòng tròn đồng
tâm (xem hình 1.7), khác với khuẩn lạc của nấm men, nấm mốc và vi khuẩn,
khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, bề mặt có mấu lồi, có nếp nhăn hoặc
sần sùi. Theo Procofieva Bengopxkaia (1936), cho rằng khuẩn lạc của xạ khuẩn
có 3 lớp: lớp ngoài gồm các sợi bện chặt lại với nhau, lớp trong tương đối xốp
hơn, và lớp giữa thì có cấu trúc tổ ong. Khuẩn lạc của xạ khuẩn có thể mang các
màu sắc khác nhau như: màu đỏ, màu lam, màu xám, màu tím.

14


Hình 1.7. Các dạng khuẩn lạc của xạ khuẩn
Các khuẩn ty mọc phía dưới khuẩn lạc và cắm sâu vào trong môi trường
là khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty cơ chất có nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng để cung
cấp dinh dưỡng cho toàn bộ cơ thể nên còn gọi là khuẩn ty dinh dưỡng. Đường
kính khuẩn ty cơ chất thay đổi từ 0,2μm – 0,3μm, khuẩn ty không có vách ngăn
và không bị đứt đoạn. Tuỳ loại môi trường mà khuẩn ty cơ chất có thể tiết ra
môi trường một số loại sắc tố trong đó có sắc tố hòa tan được trong nước có sắc
tố hòa tan được trong dung môi hữu cơ.
Sau thời gian phát triển, trên đầu sợi khuẩn ty khí sinh hình thành nên
những sợi phân hóa gọi là cuống sinh bào tử; tuỳ theo từng loài mà cuống sinh
bào tử có thể thẳng hay uốn cong, xoắn lò so hay xoắn ốc; chúng có thể mọc
đơn, mọc đối, mọc vòng, mọc thành chùm, số vòng xoắn của cuống sinh bào tử
có thể từ 5 – 10 vòng, đường kính vòng xoắn có thể thay đổi từ 5 – 7nm
(hình1.8).

15


Hình 1.8. Các dạng cuống sinh bào tử xạ khuẩn
1.2.3. Cấu tạo của xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ
cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh
chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.
Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác
dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp:
Lớp ngoài cùng dày khoảng 60 - 120A°, khi già có thể đạt tới 150 - 200A°, lớp
giữa rắn chắc, dày khoảng 50A°, lớp trong dày khoảng 50A°. Các lớp này chủ
yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N – axetyl glucozamin liên
kết với N - axetyl muramic bởi các liên kết 1,4 - glucozit. Khi xử lý bằng
lyzozym, các liên kết 1,4 - glucozit bị cắt đứt, thành tế bào bị phá huỷ tạo thành
thể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ khi xử lý tế bào với hỗn
hợp este chlorofom và các dung môi hoà tan lipit khác. Nguyên nhân là do lớp
ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipit khác với nấm. Thành tế bào xạ khuẩn
không chứa xenllulose và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quátrình
trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào.
Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo
chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc biệt
quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ
khuẩn. Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với
tế bào vi khuẩn. Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom và
các thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm
sudan III và các hạt polysaccharide bắt màu với dung dịch lugol).

16

Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote ở
chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong DNA, thường lớn hơn 55%, trong khi đó
ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 45% [8].
Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên ngoài yếu tố di truyền
trong nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có
thể tự nhân lên mà được Lederberg gọi là plasmid. Các plasmid đem lại cho tế
bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số
hợpchất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển
gene, sản xuất các chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn [9].
Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng là
đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ là protein,
pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amôni…Khả
năng đồng hoá các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau là khác nhau.
1.2.4. Đặc điểm sinh lý hóa của xạ khuẩn
1.2.4.1. Đặc điểm sinh lý nuôi cấy
Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong môi trường đất - xạ
khuẩn chiếm 20 – 40% tổng số vi sinh vật trong đất, tập trung ở nhiều lớp đất
trên bề mặt (sâu xuống khoảng 40cm). Hầu như trong các loại đất đều có mặt
của xạ khuẩn, đa số xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, một số xạ khuẩn ưa
nhiệt. Xạ khuẩn thường sống tốt trong môi trường có pH trung tính.
Xạ khuẩn thuộc cơ thể dị dưỡng nên nguồn hydratcacbon mà chúng sử
dụng có thể là tinh bột, đường, polysaccaric… nguồn nitơ mà xạ khuẩn sử dụng
bao gồm: muối amon, muối nitrat (nguồn nitơ vô cơ); protein, pepton, cao ngô,
…(nguồn nitơ hữucơ).
1.2.4.2. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn
Có nhiều lập luận khác nhau hoặc theo nguồn gốc hoặc theo hướng điều
trị bệnh nhưng nhìn chung có thể hiểu chất kháng sinh (Antibiotic) là các chất có
nguồn gốc vi sinh vật và thực vật có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt
một số vi sinh vật khác một cách có chọn lọc ngay khi ở nồng độ thấp. Chất

17


kháng sinh là một chất hóa học có hoạt tính kháng lại các vi sinh vật như: vi
khuẩn gây bệnh cho người và động vật; nấm gây bệnh ở động vật và thực vật. Các
vi sinh vật mẫn cảm với chất kháng sinh ở những mức độ khác nhau, đa số các vi
khuẩn gram dương mẫn cảm với chất kháng sinh hơn các vi khuẩn gram âm.
1.2.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh
* Điều kiện nuôi cấy:
- Độ thông khí: yếu tố thông khí ảnh hưởng quyết định đến sinh tổng hợp
chất kháng sinh. Các xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí nên độ thông khí
để đạt hiệu suất cực đại đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng khả năng sinh kháng
sinh; lượng không khí cung cấp vào môi trường nuôi cấy là lưu lượng thổi khí 1
thể tích môi trường /1phút.
- Nhiệt độ: có những loài xạ khuẩn ưa nhiệt hay sống tốt khi nhiệt độ của
môi trường cao nhưng đa số các xạ khuẩn sinh kháng sinh mà chúng ta khảo sát
o
o
thường phát triển tốt ở nhiệt độ 28 C – 30 C (nhiệt độ phòng thí nghiệm). Nhiệt
o
độ tối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường nằm trong khoảng 18 C –
o
28 C.
- pH: sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc đáng kể vào độ pH của môi
trường. Độ pH thích hợp để sinh tổng hợp chất kháng sinh là pH trung tính, ở
pH acid và kiềm sẽ ức chế quá trình sinh tổng hợp chất khángsinh.
- Nhân giống: Qua thực nghiệm cho thấy sinh tổng hợp chất kháng sinh
không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men mà còn phụ thuộc vào chất lượng
của bào tử và giống sinh dưỡng, nghĩa là tuổi và khả năng đồng đều về mặt di
truyền và hoạt tính trao đổi chất của giống phản ánh điều kiện nuôi cấy. Điều

kiện của môi trường nhân giống cũng như thời gian nhân giống cũng khác nhau
tùy vào từng chủng và tuổi của bào tửgiống.
- Hình thức lên men: trong sinh tổng hợp chất kháng sinh phương pháp
nuôi cấy cũng là một trong những yếu tố quyết định; Qui trình sản xuất chất
18


kháng sinh thường được nuôi cấy theo phương pháp nuôi cấy chìm trong nồi lên
men có khuấy đảo và sụckhí.
* Thành phần môi trường nuôi cấy:
- Sinh tổng hợp chất kháng sinh ở vi sinh vật phụ thuộc chặt chẽ vào môi
trường lên men. Trước hết là nguồn C, N và phosphat vô cơ. Các vi sinh vật khi
đã phát triển trên môi trường nhân giống và cấy truyền lên môi trường lên men
có nguồn gốc C, N và các thành phần môi trường khác nhau sẽ dẫn đến khả năng
sinh các chất khác nhau.
- Nguồn cacbon: quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinh
chịu ảnh hưởng sâu sắc thông qua các nguồn cacbon khác nhau. Tuỳ thuộc vào
từng chủng mà cần chọn nguồn cacbon thích hợp; các loại đường đơn: Glucose,
Manitole, … hay các loại đường kép: Saccarose, Lactose, … cũng có thể là các
loại tinh bột hoặc các chất có thành phần không xác định như rỉ đường, đại
mạch, …Đối với xạ khuẩn, nhiều chủng có hoạt tính amylaza cao nên nguồn
cacbon thích hợp đối với chúng là tinh bột.
- Nguồn nitơ: nguồn và nồng độ nitơ trong môi trường nuôi cấy cũng ảnh
hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh. Sự dư thừa các ion amin hoặc các nitơ
chuyển hóa nhanh khác sẽ ức chế sinh tổng hợp chất kháng sinh như
Erytromoxin, Leucomicin, Novobioxin, … Quá trình sinh tổng hợp chất kháng
sinh từ xạ khuẩn thường đòi hỏi có cả 2 nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ trong môi
trường. Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp là các hợp chất từ thực vật như: bột đậu
tương, bột đậu xanh, cao ngô… nguồn nitơ vô cơ là: muối amon hoặc nitrat.
1.3. Giới thiệu về Bacillus

Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương. Thuộc chi
Bacilliaceae. Có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu.
Bacillus có hình dạng tế bào hình que (giúp phân biệt với các loài vi
khuẩn sinh nội bào tử khác) sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị khí
không bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi, chúng chuyển động
bằng tiêm mao. Nhờ khả năng sinh bào tử nên các vi khuẩn Bacillus có thể tồn
19


tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự
nhiên nên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, thức ăn,
trầm tích biển,… nhưng chủ yếu là phân lập từ đất nơi mà đóng vai trò cực kì
quan trọng trong chu trình C, N.
Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh
nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ,…
Một vài loài có thể lên men cacbohydrat tạo thành glycerol và butanediol, một
vài loài khác thì cần acid amin, vitamin B1 để sinh trưởng. Hầu hết chúng đều là
loài ưu nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30 0C - 450C, nhưng cũng có nhiều
loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 650C.
Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 - 10
như B.alcalophillus, hay có loài phù hợp với pH = 2 - 6 như B.acidocaldrius.
Ngoài khả năng sản sinh enzyme ngoại bào như emylase, protease,
cellulase … nó còn có khả năng tiết các chất kháng sinh, do đó chúng được ứng
dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ môi trường, trong sản xuất chế
phẩm sinh học bảo vệ thực vật…
Bacillus thường gặp trong tự nhiên tồn tại nhiều trong đất là Bacillus
subtilis.
1.3.1. Vị trí phân loại và sự phân bố của Bacillus subtilis trong tự nhiên
Bacillus subtilis được Ferdinand Cohn- một cộng sự của Robert Koch
mô tả và đặt tên năm 1872. Đó là 1 loại vi khuẩn Gram dương, có khả năng mọc

được khi có sự hiện diện của oxi và có thể tạo thành dạng đặc biệt khi tế bào ở
trạng thái nghỉ được gọi là nội bào tử (endospore). B.subtilis là vi khuẩn đại diện
cho loài (genus) Bacillus của họ Bacillaceae (family). Năm 2004, dựa trên
phương pháp phân tích 16S rRNA người ta phân chia loài Bacillus thành nhiều
họ và loài vi khuẩn tạo bào tử khác nhau. Những thành viên của họ Bacillus
được đề cập ở đây là loại vi khuẩn “ gram dương, kỵ khí hay kỵ khí tùy tiện, tạo
nội bào tử”.
* Vị trí phân loại:
20


Giới (kingdom): Bacteria
Ngành (phylum): Firmicutes
Lớp (class): Bacilli
Bộ (order): Bacillales
Họ (family): Bacillaceae
Loài (genus): Bacillus
* Đặc điểm phân bố:
Vi khuẩn Bacillus subtilus phân bố hầu hết ở trong tự nhiên. Phần lớn
chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 – 100 triệu
CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc thì Bacillus subtilus rất hiếm.
Nước và bùn cửa sông cũng như ở biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus
subtilus (Vũ Thị Thứ, 1996).
1.3.2. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilus là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, là vi khuẩn Gram dương,
kích thước 0,5 - 0,8 μm × 1,5 - 3μm, đứng đơn lẽ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi
khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế
bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 – 1,8μm. Bào tử phát triển
bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu
nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ (Tô Minh Châu, 2000).

1.3.3. Đặc điểm nuôi cấy
- Điều kiện phát triển: Hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 37°C.
- Nhu cầu Oxi: Bacillus subtilus là vi khuẩn hiếu khi nhưng lại có khả
năng phát triển yếu trong môi trường thiếu oxi.
- Độ pH: Bacillus subtilus thích hợp nhất với pH = 7,0 – 7,4.
- Môi trường nuôi cấy: Bacillus subtilus có thể sinh trưởng và phát triển
được trên nhiều môi trường khác nhau như môi trường TSA, môi trường gelatin,
môi trường PDA, môi trường TSB,…

21


+ Môi trường thạch đĩa TSA: Khuẩn lạc có dạng hình tròn, rìa răng cưa
không đều, có tâm sẩm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính 3 5mm. Sau 1- 4 ngày bề mặt nhăn nheo màu hơi sẩm.
+ Môi trường thạch nghiêng TSA: Dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa gợn
sóng.
+ Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường,
tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên.
Dinh dưỡng cần các nguyên tố C, H, O, N và các nguyên tố khác.
1.3.4. Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis
Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, nó giúp cho vi khuẩn
vượt qua những điều kiện bất lợi như: môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt độ,
pH không thích hợp, môi trường tích luỹ nhiều sản phẩm trao đổi chất bất lợi….
Mỗi vi khuẩn chỉ tạo được một bào tử. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ
nảy mầm để trở về dạng tế bào sinh dưỡng.
1.3.5. Sự hình thành bào tử
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng
tạo bào tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình
thành bào tử trong chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện
bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ, nhiệt độ…) (Tô Minh Châu,

2000).
* Quá trình hình thành bào tử gồm các bước:
- Hình thành vách ngăn.
- Sự tạo tiền bào tử.
- Tạo lớp vỏ bào tử.
- Sự tổng hợp các lớp vỏ bào tử.
- Sự giải phóng bào tử.
Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và
nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc
và tạo thành tiền bào tử (prospore). Tiền bào tử dần được bao bọc bởi các lớp
22


màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào
sinh dưỡng phân giải và bào tử được giải phóng.
1.3.6. Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với một số vi sinh vật gây bệnh
Do Bacillus subtilis là vi khuẩn bắt buộc đường ruột nên ngoài khả
năng chịu đựng được acid dạ dày, các chất dịch tiêu hoá trong đường ruột.
Chúng còn có khả năng đấu tranh lại với các vi sinh vật gây bệnh ở đường ruột.
Với các vi sinh vật gây bệnh, khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện
của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ gây ra sự cạnh tranh dinh dưỡng,
cạnh trạnh không gian sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh
hơn (trong 24h) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường,
đồng thời tạo ra kháng sinh subtilin nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế.
Các chuyên gia tại Đại Học Havard, Mỹ cho biết: khi chất dinh dưỡng bắt
đầu cạn kiệt, các vi sinh vật đối phó bằng cách chuyển sang tình trạng “ngủ
đông”, hay nghỉ ngơi trong một thời gian dài. Bacillus subtilis thực hiện điều đó
bằng cách tạo ra bào tử, có thể duy trì trạng thái sống tiềm tàng trong nhiều năm,
thậm chí hàng thế kỉ.
Tuy nhiên trong thí nghiệm của mình, nhóm nghiên cứu nhận thấy ở giai

đoạn rất sớm của sự hình thành bào tử, một vài tế bào Bacillus đã tạo ra kháng
sinh để giết chết những tế bào vi khuẩn ở bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này.
Chất kháng sinh sẽ phá vỡ màng tế bào vi khuẩn bị tấn công, giải phóng chất
dinh dưỡng và được tế bào đang hình thành bào tử tiêu thụ. Theo các nhà nghiên
cứu trên, quá trình tạo bào tử tiêu tốn một lượng lớn năng lượng, phải mất vài
giờ và khi đã bắt đầu thì không thể đảo ngược. Do đó, vi khuẩn sẽ cố gắng tránh
thời điểm đó càng lâu càng tốt. Đặc biệt, khi dinh dưỡng trong môi trường đã
cạn kiệt, vi khuẩn sẽ tiêu diệt những kẻ xung quanh để hút chất dinh dưỡng và
kéo dài thời kì chờ đợi này, cho đến khi phải chuyển sang sống tiềm sinh
(Nguyễn Thị Công Dung, 2004).
1.4. Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật đối kháng trong bảo vệ thực
vật ở trong nước và trên thế giới
23


- Năm 1992, Lê Gia Hy và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu “Tính đối
kháng của xạ khuẩn được phân lập từ đất Việt Nam đối với bệnh đạo ôn”, (Tạp
chí Công nghệ sinh học, tập 14, số a, tr. 11 - 12).
- Năm 2012, Lê Thu Hiền và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu “Nghiên
cứu vi khuẩn, xạ khuẩn đối kháng với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo
vàng cà chua, dưa chuột”, (Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ
nhất năm 2012, tr. 1009 -1017).
- Năm 2000, Biền Văn Minh (nay là PGS.TS Biền Văn Minh) đã nghiên
cứu khả năng sinh chất kháng sinh của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất
Bình - Trị - Thiên.
- Năm 2001, Đỗ Thu Hà đã tiến hành nghiên cứu “Sự phân bố của xạ
khuẩn sinh các chất kháng sinh nhóm Polyen chống nấm trong đất của khu vực
Quảng Nam - Đà Nẵng” (Tạp chí Sinh học, tập 23, số 4, tr. 46 - 52).
- Năm 2012, Nguyễn Quang Huy và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu
“Phân lập các chủng Bacillus có hoạt tính tạo màng sinh vật (Biofilm) và tác

dụng kháng khuẩn của chúng”, (Tạp chí sinh học, tập 34, số 1, tr.99 - 106)
- Năm 2013, Đỗ Thị Tuyến và cộng sự đã nghiên cứu đề tài “Đặc điểm
phân loại chủng xạ khuẩn HT17.8 có khả năng kháng nấm gây bệnh trên chè tại
Thái Nguyên”, (Tạp chí Khoa học & Công nghệ, tập 107, số 07, tr.97 - 102).
- Năm 2014, Vũ Thúy Nga đã nghiên cứu “Phân lập, tuyển chọn chủng vi
khuẩn Bacillus đối kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ trên một số
cây trồng cạn.
- Năm 2014, Trần Thị Hồng và cộng sự đã nghiên cứu đề tài “Phân lập vi
sinh vật đối kháng một số nguồn bệnh nấm thực vật và đánh giá hoạt tính của
chúng in vitro và in vivo”, (Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 52, số 4). Kết
quả nhận được cho thấy có 31 chủng vi khuẩn và 5 chủng xạ khuẩn phân lập đối
kháng nấm F.oxysporum, tất cả 37 chủng vi khuẩn và 2 chủng xạ khuẩn ức chế
sinh trưởng của F.sonali, 10 chủng vi khuẩn và 6 chủng xạ khuẩn đối kháng với
Phytophthora sp.
24


- Năm 2015, Nguyễn Thị Thu Thủy và cộng sự đã nghiên cứu đề tài
“Đánh giá tính đa dạng và hoạt tính sinh học của xạ khuẩn ở rừng ngập mặn
Xuân Thủy - Nam Định”, (Hội nghị Khoa học toàn quốc về sinh thái và tài
nguyên sinh vật lần thứ 6, 2015).
- Năm 2015, Nguyễn Thị Thúy Nga đã thực hiện nghiên cứu “Phân lập,
tuyển chọn một số chủng vi khuẩn nội sinh tạo chất kích thích sinh trưởng
Indole - 3 - acetic acid (IAA) và đối kháng nấm gây bệnh thối cổ rễ cây thông”,
(Tạp chí Khoa học Lâm Nghiệp, tr. 3948 - 3959). Kết quả đã xác định được loài
Bacillus subtilis đối kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thối cổ rễ thông.

CHƯƠNG II
MỤC TIÊU – NỘI DUNG – ĐỐI TƯỢNG
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mục tiêu nghiên cứu
- Phân lập được một số chủng nấm gây bệnh thực vật ở miền Bắc.
- Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn, vi khuẩn có hoạt tính kháng
nấm gây bệnh trên cây nông- lâm nghiệp.
- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một số
chủng xạ khuẩn, vi khuẩn Bacillus có hoạt tính chống nấm mạnh, có nhiều triển
vọng ứng dụng.
- Tối ưu 1 số điều kiện nuôi cấy xạ khuẩn, vi khuẩn Bacillus cho hoạt tính
đối kháng cao.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập được một số chủng nấm gây bệnh thực vật phổ biến ở miền Bắc.
- Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn, vi khuẩn Bacillus có hoạt
tính kháng nấm gây bệnh.
25