Tách và xác định một số độc tố nhóm alkaloid trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------

ĐỖ THỊ THU HẰNG

TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID
TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------

ĐỖ THỊ THU HẰNG
TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID
TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG KHỐI PHỔ

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã Số: 60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người Hướng Dẫn Khoa Học: PGS TS. Lê Thị Hồng Hảo

Hà Nội – 2015

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho sự phát
triển của thực vật và đây được coi là một kho tàng vô giá về nguồn cây thuốc và
dược liệu quý. Trong đó alkaloid là những thành phần hoạt tính chính của nhiều cây
thuốc. Alkaloid là amin nguồn gốc tự nhiên do thực vật tạo ra, nhưng các amin do
động vật và nấm tạo ra cũng được gọi là các alkaloid. Cấu trúc bao gồm carbon,
hydro, nitơ, và thường có oxy. Các alkaloid là bazơ hữu cơ tương tự như kiềm (bazơ
vô cơ); tên có nghĩa là như kiềm. Alkaloid xuất hiện chủ yếu trong các chi khác
nhau của thực vật có hạt, chẳng hạn như cây thuốc phiện và cây thuốc lá, mã tiền….
Chúng có thể được tìm thấy trong hầu hết các bộ phận của các loại thực vật này, bao
gồm cả lá, rễ, hạt, và vỏ cây. Mỗi một phần của thực vật thường có chứa một số
chất hóa học liên quan đến alkaloid. Chức năng của alkaloids trong chuyển hóa thực
vật chưa được biết, nhưng hầu hết các alkaloid có ảnh hưởng rõ rệt đến hệ thống
thần kinh của người và động vật khác. Trong số hàng trăm alkaloid được tìm thấy
trong tự nhiên, chỉ có khoảng 30 chất được sử dụng thương mại. Một số alkaloid,
chẳng hạn như nicotin, được sử dụng trong thuốc trừ sâu, và một số khác được sử
dụng làm thuốc thử hóa học. Tuy nhiên, các alkaloid được sử dụng chủ yếu trong y
học, bởi vì chúng có thể tác động một cách nhanh chóng trên các khu vực cụ thể của
hệ thần kinh. Alkaloid là những thành phần hoạt tính chính của nhiều thuốc gây mê,
thuốc an thần, các chất kích thích và thuốc an thần. Chúng được dùng bằng đường
uống và tiêm. Ngoại trừ dưới sự giám sát của bác sĩ, sử dụng các alkaloid là nguy
hiểm, bởi vì hầu hết hình thành thói quen (ví dụ, gần như tất cả các chất ma tuý là
alkaloid) và dùng liều lượng lớn có thể là độc hại.
Trong dân gian ta thường sử dụng các cây thảo dược như cà độc dược, mã
tiền, củ ấu tàu… dùng để chữa bệnh nhưng trong các loại cây này có chứa một hàm

lượng không nhỏ các chất độc nhóm alkaloid. Hiện nay, một số loại thực phẩm chức
năng có nguồn gốc thảo dược cũng sử dụng các loại cây này hoặc có thành phần
được chiết xuất từ cây thuốc có các hoạt chất

như các alkaloid, terpenoid,

phenolic… được biết đến như là các hợp chất thứ cấp. Sử dụng các loại thực phẩm
chức năng này có thể là con dao hai lưỡi, dùng với liều lượng vừa phải có tác dụng
chữa một số bệnh song dùng không đúng cách hoặc quá liều có thể dẫn đến ngộ độc
hoặc các biến chứng. Vì vậy sử dụng những thực phẩm chức năng có chứa các
alkaloid độc này phải cẩn trọng và phải được sự quản lý và cho phép của các cơ
quan chức năng. Tuy nhiên, ở Việt Nam việc xác định đồ ng thời các alkaloid đô ̣c
trong thực phẩm chức năng vẫn chưa được nghiên cứu. Do vậy, để góp phần kiểm
soát các nguy cơ tiềm ẩn để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng và giúp cơ quan
chức năng quản lý đưa ra các khuyến cáo nhằm giảm nguy cơ ngộ độc do sử dụng
các thực phẩm chức năng có ngồn gốc thảo dược. Chúng tôi đã tiến hành đề tài:
“Tách và xác định một số độc tố nhóm alkaloids trong thực phẩm chức năng
bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ”.


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về nhóm alkaloid

1.1.1. Lịch sử phát hiện
Năm 1804- 1805, các nhà hóa học Pháp và Đức đã phân lập được morphin
và điều chế được dạng muối của nó. Đồng thời đã chứng minh được morphin là
hoạt chất chính của cây thuốc phiện có tác dụng sinh lý rõ rệt. Năm 1980, từ vỏ cây
canhkina, đã chiết và kết tinh được một chất đặt tên là “cinchonino” sau đó hai nhà

hóa học Pháp đã xác định cinchonino là hỗn hợp của hai alkaloid là quinin và
cinchonin. Năm 1918, phát hiện ra alkaloid của hạt mã tiền là strychnin và brucin;
phát hiện ra cafein trong chè, cà phê. Sau đó tiếp tục phát hiện ra nicotin trong thuốc
lá, atropin trong cà độc dược, theobromin trong cacao, codein trong thuốc phiện,
cocain trong lá coca. Giữa năm 1973, người ta đã xác định được 4959 alkaloid khác
nhau trong đó có 3293 chất đã xác định được công thức hóa học. Hiện nay đã phát
hiện ra được rất nhiều alkaloid và cũng đã được đưa vào ứng dụng trong y học ngày
một tăng [15].
1.1.2.

Khái quát về nhóm alkaloid

1.1.2.1. Khái niệm
Alkaloid có nguồn gốc từ chữ: alcali tiếng Ả rập là kiềm. Alkaloid là:
- Những hợp chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ thường gặp ở
trong nhiều loài thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật.
- Có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối này dễ kết tinh.
- Có hoạt tính sinh học rất quan trọng.
- Có một số phản ứng chung là tạo “tủa“ cần thiết cho sự xác định chúng.
Chúng là một nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng về nhiều mặt. Đặc biệt trong
lĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và độc đáo
[15] [16].


1.1.2.2. Cấu tạo hóa học
Về mặt hóa học, sự phong phú và đa dạng của alkaloid đã trở thành một
chuyên nghành, chiếm một vị trí quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu và trong tạp
chí thông tin về hóa học. Đối với việc nghiên cứu alkaloid còn quan trọng hơn bởi
vì chúng có trong hệ thực vật nhiệt đới phong phú là nguồn cung cấp alkaloid chủ
yếu. Về mặt cấu trúc hóa học, chúng có ít nhất 1 nguyên tử N trong phân tử, chủ

yếu nằm trong vòng. Sự có mặt của nguyên tử của N trong cấu trúc quyết định tính
bazơ của alkaloid và là chỗ dựa rất quan trọng cho các nhà hóa học trong nghiên
cứu alkaloid [15].
1.1.2.3. Phân loại
Các alkaloid đã biết có đến trên 250 dạng cấu trúc khác nhau với hơn 5.500
hợp chất alkaloid trong tự nhiên. Vì vậy cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ
bản trước đây (khoảng 20 nhóm cấu trúc) chưa đáp ứng được nên ngày càng có xu
hướng chia chúng thành những nhóm nhỏ: nhóm alkaloid Ecgotamia, Harmin,
Yohimbin, Strychnin, Echitamin. Nhóm alkaloid có nhân isoquinolin được chia
thành

các

nhóm:

Benzyliaoquinolin,

Apocphin,

Protobecberin,

Benzophenanthridin…Có ý kiến xếp các hợp chất có N ngoài vòng như Colchicin,
Hordenin, là các protoalkaloid [15] [27].
1.1.2.4. Sự phân bố
Cromwell (1995) ước tính alkaloid phân bố trong khoảng 1 phần 7 loài thực
vật có hoa. Một ước tính khác (Hegnauer, 1963) cho rằng alkaloid có từ 12%-20%
trong tổng số cây có nhựa. Còn Willaman và Schubert (1955) thì cho rằng trong hơn
300 họ của nghành hạt kín thì 1/3 họ có chứa alkaloid. Nhiều tổng kết cho thấy đại
đa số cây có chứa alkaloid là cây hai lá mầm. Chỉ có một số ít cây chứa alkaloid là
cây 1 lá mầm và nghành hạt trần. Theo thống kê đến nay thì cây thuộc thảo và cây

bụi có nhiều alkaloid hơn cây gỗ, và trọng lượng phân tử của alkaloid trong cây gỗ


thường bé hơn trọng lượng phân tử cây thuộc thảo. Cây một năm có nhiều alkaloid
hơn cây lưu niên (Levin, 1976). Alkaloid không có trong loài sống ở nước ngoại trừ
họ sen (Nympheaceae) (Mc.Nair.1943). Thực ra rất nhiều loài có alkaloid nhưng chỉ
ở mức độ dạng vết hoặc ở tỷ lệ phần vạn, mười vạn. Để giới hạn với ý nghĩa thực
tiễn, một cây được xem là có alkaloid phải chứa ít nhất là 0.05% alkaloid so với
dược liệu khô. Mối liên quan giữa alkaloid với các chất khác trong 1 cây cũng đã
được nghiên cứu. Cây có chứa alkaloid đều vắng mặt tinh dầu và ngược lại
(Trelibs,1955) [27].
1.1.2.5. Tính chất
Alkaloid là các bazơ yếu, do sự có mặt của nguyên tử N. Nhưng độ kiềm
của alkaloid không giống nhau do ảnh hưởng khác nhau của lớp điện tích nguyên tử
N gây ra và ảnh hưởng của các nhóm chức khác. Nói chung tính bazơ giảm dần theo
thứ tự amoni bậc 4, amoni bậc 1, amoni bậc 2, amoni bậc 3.
Hầu hết các alkaloid bazơ thực tế không tan trong nước nhưng tan trong các
dung môi hữu cơ như CHCl3, eter và các ancol bậc thấp (methanol, ethanol,
butanol). Một số nhóm alkaloid có thêm các nhóm phân cực nên tan được một phần
trong nước hoặc trong kiềm. Ví dụ: Morphine, Cephalin, do có nhóm OH phenol
nên tan trong dung dịch kiềm và các bazơ của chúng thì gần như là không tan trong
eter. Ngược lại với bazơ, các muối alkaloid nói chung tan được trong nước và cồn
nhưng hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: CHCl3, eter, benzene. Có
một số trường hợp ngoại lệ như Ephedrin, Cochicin, Ecgovonin, các bazơ của
chúng tan được trong nước nhưng cũng khá tan trong dung môi hữu cơ và các muối
của chúng thì ngược lại. Alkaloid có N – Bậc 4 và N – oxide bazơ của alkaloid có N
– Bậc 4 và N – oxide khác tan trong nước và trong kiềm ít tan trong dung môi hữu
cơ. Các muối của chúng có độ hòa tan khác nhau tùy thuộc vào gốc acid tạo ra
chúng. Vì vậy có thể chiết chúng bằng dung dịch kiềm và kết tủa dưới dạng muối có
độ hòa tan thấp nhất. Đối với các alkaloid N – oxide thì dùng phản ứng khử. Oxy

bằng bột kẽm trong môi trường HCl để chúng chuyển thành alkaloid dạng thường
sau đó kết tủa bằng kiềm và chiết bằng dung môi hữu cơ [14].

1.1.3.

Cấu tạo của một số alkaloid độc

Bảng 1.1. Cấu trúc hoá học của một số alkaloid độc được xác định trong đề tài.
STT

Alkaloid

Công thức
phân tử

Khối
lượng
phân tử
(g/mol)

pKa

C23H26N2O4

394,46

8,28

C21H22N2O2

334,41

8,26

C34H47NO11

645,74

5,88

Brucin
1

10,11Dimethoxystrychnine

Strychnin
(4aR,5aS,8aR,13aS,15aS,
15bR)4a,5,5a,7,8,13a,15,15a,15
2

b,16-decahydro-2H-4,6methanoindolo[3,2,1ij]oxepino[2,3,4de]pyrrolo[2,3h]quinoline-14-one

Aconitin
3
Acetylbenzoylaconine

Công thức cấu tạo

Atropin
(RS)-(8-Methyl-84

azabicyclo[3.2.1]oct-3-yl)

C17H23NO3

289,37

4,35

C17H21NO4

303,35

7,75

C20H22N2O

306,41

_

C22H25N O6

399,44

12,35

C10H14N2

162,23

8,5

3-hydroxy-2phenylpropanoate

Scopolamin

5

(–)-(S)-3-hydroxy-2phenylpropionic
acid(1R,2R,4S,7S,9S)-9methyl-3-oxa-9azatricyclo[3.3.1.02,4]no
n-7-yl ester

Koumin
7,20(2H,19H)6

Cyclovobasan, 1,2,18,19tetradehydro-3,17-epoxy, (3R,7alpha,20alpha)-

Colchicin
N-[(7S)-1,2,3,107

Tetramethoxy-9-oxo5,6,7,9tetrahydrobenzo[a]heptal
en-7-yl]acetamide
Nicotin
(−)-1-Methyl-2-(3-

8

pyridyl)pyrrolidine,(S)-3(1-Methyl-2-pyrrolidinyl)
pyridine


1.1.4.

Tác dụng và độc tính của một số alkaloid

Các chất trong nghiên cứu này thuộc nhóm alkaloid chúng có tác dụng lên hệ
thần kinh, tim mạch và hô hấp [3] [12]. Khi dùng với hàm lượng nhỏ chúng có tác
dụng chữa bệnh nhưng khi dùng với hàm lượng lớn gây ngộ độc có thể dẫn đến tử
vong vì đây đều là các alkaloid độc. Bảng 1.2 giới thiệu giá trị LD50 (liều lượng
chất độc gây chết cho một nửa số cá thể trong nghiên cứu) [24].
Bảng 1.2. Các giá trị LD50 của các chất phân tích.
Tên chất
Brucin
Strychnin
Colchicin
Koumin
Scopolamin
Nicotin
Aconitin
Atropin

LD50 trên chuột đường LD50 trên chuột đường
uống (mg/kg)
tiêm (mg/kg)
150
12

2,2
0,16
5,886
100
1270
650
3
1
0,12
75
30

1.1.4.1. Brucin và strychnin
Brucin và strychnin đều là alkaloid đắng, brucin có liên quan chặt chẽ với
strychnin. Hai chất này xuất hiện ở một số loài thực vật, được biết đến nhiều nhất là
alkaloid chính trong vỏ, lá, hạt cây mã tiền được tìm thấy ở Đông Nam Á. Hạt chứa
khoảng 1,5% strychnin, còn hoa khô chứa khoảng 1,023 %, ngay cả vỏ cây cũng
chứa các hợp chất độc, bao gồm cả brucin [5]. Strychnin là một alkaloid không
màu, ít tan trong dầu lửa và trong nước, không tan trong ethyl eter. Strychnin trích
từ hạt cây mã tiền hay nhân, rất độc, chất strychnin được ghi vào bảng A của các
dược điển


Trong y học dân gian, mã tiền dùng như thuốc bổ lành bệnh và kích thích sự
thèm ăn và là một loại thuốc vi lượng đồng căn, được dùng cho những vấn đề tiêu
hóa thông thường, nhạy cảm với nhiệt độ lạnh, cáu kỉnh khó chịu và sử dụng như
thuốc bổ cho hệ thống tuần hoàn trường hợp bị chứng suy tim.
Strychnin dạng tinh thể sử dụng làm thuốc trừ sâu, đặc biệt là để giết chết
động vật có xương sống nhỏ như các loài chim và động vật gặm nhấm. Strychnin
gây co giật cơ bắp và cuối cùng chết vì ngạt.

ÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Trần Quốc Bình, Đỗ Thị Oanh (2011), "Góp phần nghiên cứu xây dựng tiêu
chuẩn nguyên liệu và bán thành phẩm cà độc dược sử dụng trong chế phẩm
Camat", tạp chí Dược học,421,tr.45-49.
2. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007),
Hóa học phân tích, phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ, Nhà xuất bản
Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
3. Khoa dược (2008), "Giáo trình dược liệu", tập II, NXB ĐH Y Dược TP.HCM.
4. Phạm Thanh Kỳ (1998), "Bài giảng dược liệu", tập II, NXB Đại học Dược Hà
Nội.
5. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học.
6. Phạm Luận (1998), Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao, ĐH
Quốc Gia Hà Nội.
7. Lương Thị Phấn (2014), Nghiên cứu định lượng đồng thời strychnin và brucin
trong huyết tương bằng phương pháp HPLC, khóa luận tốt nghiệp, Trường
Đại học Dược Hà nội.
8. Nguyễn Văn Ri (2009), Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa học
trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.


9. Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở các phương pháp phổ ứng dụng trong hóa
học, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
10. Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình Thống kê trong Hóa học phân tích, khoa Hóa
học trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
11. Trần Thị Văn Thi, Trần Thanh Minh (2011), "Nghiên cứu phân lập và nhận
dạng cấu trúc alkaloid trong dịch chiết từ lá vông nem Thừa Thiên Huế", tạp
chí Khoa học Đại học Huế, 65, tr.225-230.
12. Mai Tất Tố, Nguyễn Thị Trâm (2007), Dược lý học tập 1, NXB Y học.
13. Mai Tất Tố, Nguyễn Thị Trâm (2007), Dược lý học tập 2, NXB Y học.

14. Trường Đại học Dược Hà Nội (2001), Dược liệu, Nhà xuất bản Y học
15. TS. Đỗ Thị Tuyên Viện CNSH Việt Nam , Bài giảng công nghệ tách chiết các
hợp chấ t thứ sinh.
16. Viện dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I,
NXB khoa học kỹ thuật.
17. Viện dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II,
NXB khoa học kỹ thuật.
18. Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), "Thẩm định
phương pháp trong phân tích hóa học & vi sinh vật", NXB Khoa học và Kỹ
thuật.
Tiếng Anh
19. AOAC International (2007), How to meet ISO 17025 requirements for method
verification, USA
20. Borbla Boros, Agnes Farkas, Silvia Jakabova, Ivett Bacskay (2000), “LC-MS
Quantitative Deterrmination of Atropine and Scopolamine in the Floral Nectar
of Datura Species”, Journal of Chromatographia, 58, 1–37.
21. Dirk Steinmann, Markus Ganzera (2011), “Recent advances on HPLC/MS in
medicinal plant analysis”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical
Analysis, 55, 744-757.


22. Hua-Tao Feng, Sam F.Y Li (2002), “Deterrmination of five toxic alkaloids in
two common herbal medicines with capillary electrophoresis”, Journal of
Chromatography A, 1-2, 243–247
23. Huiqin Wu, Xiaoting Xiong, Xiaolan Huang, Zhixin Zhu (2013), “
Simultaneous deterrmination of 17 toxic alcaloids in human fluids by liquid
chromatography coupled whith electrospray ionization tandem mass
spectrometry”, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies,
36:9, 1149-1162.
24. Goodman, L. (2006), “Goodman & Gilman's the pharmacological basis of

therapeutics” (11 ed.), New York: McGraw-Hill
25. José Diana Di Mavungu, Svetlana V. Malysheva, Melanie Sanders, Daria
Larionova (2012), “Development and validation of a new LC–MS/MS method
for the simultaneous deterrmination of six major ergot alcaloids and their
corresponding epimers. Application to some food and feed commodities”,
Food Chemistry, 135, 292–303.
26. Miao Li, Xiao-Fang Holi, Jie Zhang, Si-Cen Wang, Qiang Fu, Lang-Chong He
(2011), “Applications of HPLC/MS in the analysis of traditional Chinese
medicines”, Journal of Pharmacertical Analysis, 1:2, 81- 91.
27. Lounasmaa M.; Tamminem T.(1993), The Alkaloids, Academic Press: New
York, 114.
28. Peihong

Qiu,

Xiaohong

Chen,

Xiang

Chen

(2008),

“Simultaneous

deterrmination of five toxic alkaloids in body fluids by high-performance
liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass
spectrometry”, Journal of Chromatography B, 875(2), 471–477

29. R.E. Ardrey (2003), “Liquid chromatography-mass spectrometry: an
introduction”, New York, J. Wiley.
30. Somenath Mitra (2003), “Sample Preparation Techniques in Analytical
Chemistry’’, John Wiley & Sons.


31. Tadeusz Aniszewski (2012), Alcaloids - Secrets of Life, Alkaloid Chemistry,
Biological Significance and applications and ecological Role, Elsevier
Science.
32. Xie Y, Jiang ZH, Zhou H, Xu HX, Liu L (2005), “ Simultaneous
deterrmination of six Aconitum alkaloids in proprietary Chinese medicines by
high-performance liquid chromatography’’, Journal Chromatography A,
1093(1-2), 195-203.
33. Kang XQ1, Fan ZC, Zhang ZQ (2010), “Simultaneous deterrmination of three
Aconitum alkaloids in six herbal medicines by high-performance liquid
chromatography”, Journal Chromatography Science, 48(10),860-865.
34.

Yu L, Xu Y, Feng H, Li SF (2005), “Separation and deterrmination of
toxic pyrrolizidine alkaloids in traditional Chinese herbal medicines by
micellar electrokinetic chromatography with organic modifier’’,
Electrophoresis, 26(17), 397-404.