PHÂN lập một số CHỦNG xạ KHUẨN có KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TÌNH THỪA THIÊN HUẾ

PHẦN 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Với hơn 1,9 triệu ha diện tích mặt nước,Việt Nam có tiềm năng lớn để
phát triển nuôi trồng thủy sản, trong đó tôm sú và tôm thẻ chân trắng là
một trong những loài nuôi phổ biến nhất hiện nay Năm 2014, đã thả nuôi
khoảng 676 nghìn ha; trong đó diện tích nuôi tôm sú là 583 nghìn ha, tôm
chân trắng là 93 nghìn ha.(Cục Thủy sản, 2014) [15].
Tuy nhiên, trong những năm gần đây, tình trạng ô nhiễm môi trường và
dịch bệnh ngày càng nghiêm trọng, vùng nuôi tôm bị nhiễm nghiêm trọng
từ Quảng Ninh đến Phú Yên đang gia tăng, đặc biệt là trong năm 2013
tôm vùng bị mắc bệnh 2.304 ha / 68.099 ha (bằng 10,4 % so với tổng số
nuôi tôm diện tích cả nước) [1].Trong tình hình nuôi tôm thâm canh và
bán thâm canh đang ngày càng khó khăn do môi trường nuôi bị ô nhiễm,
dịch bệnh ngày càng tăng cao, chất lượng tôm không đạt yêu cầu xuất
khẩu để giải quyết những vấn đề này, người nông dân thường lạm dụng
việc sử dụng hóa chất và thuốc kháng sinh mà sau này gây ra suy thoái
môi trường và tạo ra các vi khuẩn đa kháng thuốc [14].
Mặc dù chưa có nghiên cứu đánh giá việc sử dụng các hóa chất và kháng
sinh tại các vùng nuôi tôm ở Thừa Thiên Huế, nhưng Nguyễn Ngọc
Phước, (2014) nói rằng 90% các chủng Vibrio phân lập từ ao nuôi tôm ở
Phong Điền có khả năng chống lại 4 loại kháng sinh, Oxytetraciline,
Amoxiciline, axitoxalic,và trimethoprim -sulphamethoxazole.
Xạ khuẩn là nguồn gốc sản xuất tự nhiên thuốc kháng sinh và các chất
hoạt tính sinh học khác [5]. Người ta ước tính rằng có 10.000 kháng sinh
được phát hiện ra từ các vi sinh vật, thì 2/3 của các chất này được sản
xuất từ xạ khuẩn, và trong đó ngày nay có nhiều loại thuốc đang được áp
dụng và sản xuất. Các nghiên cứu chỉ ra rằng: cứ 1000 xạ khuẩn được
phân lập một cách ngẫu nhiên, 10 chủng sẽ sản xuất streptomycin và 4
chủng sẽ sản xuất tetracycline [3] [5].
Xạ khuẩn là một trong những nhóm vi sinh vật rất quan trọng bởi khả
năng cung cấp một lượng lớn các sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và thứ
cấp có ý nghĩa trong công nghiệp, dược phẩm, nông nghiệp như các loại

enzym, chất kháng sinh, chất kháng nấm, chất ức chế các dòng tế bào ung
thư [36].

1


Trong môi trường nước, xạ khuẩn tiết ra các loại kháng sinh làm ức chế
sự tăng trưởng của vi khuẩn gây bệnh trong ao nuôi, đặc biệt là Vibrio
harveyi, V. alginolitycus, V. vulnificus (Mohanraj và Sekar, 2013) [35].
Vì vậy: "Nghiên cứu phân lập một số chủng xạ khuẩncó khả năng
kháng khuẩn tại Thừa Thiên Huế” được tiến hành với mục đích sau:
phân lập các chủng xạ khuẩn probiotic tiềm năng có khả năng phân hủy
các hợp chất hữu cơ ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn gây bệnh trong
nuôi tôm.

2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu về xạ khuẩn
2.1.1 Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩntrong tự nhiên
Theo hệ thống phân loại hiện nay, Xạ khuẩnthuộc ngành Tenricutes (gồm
vi khuẩn Gram dương và xạ khuẩn), thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria)
và siêu giới nhân sơ (Prokaryota) [34].
Xạ khuẩn thuộc lớp Antinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ
Actinomycetales, gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài, trong đó
có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại
được xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm. Streptomyces với đòi sống là ký sinh
hoại sinh phát triển nhiều trong đất có nhiều chất hữu cơ, trong quá trình

sống nó tiết ra các enzyme ngoại bào phân huỷ các mùn bã hữu cơ này.
Một phần rất lớn các chất kháng sinh được sử dụng hiệu quả trong điều
trị có nguồn gốc từ các loài Streptomyces. trong đó được biết đến nhất là
Streptomycin, Erythromycin, Tetracyclin [38].
Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật rất đa dạng trong đó đa số sinh trưởng
hiếu khí và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự nấm. Tên xạ khuẩnactinomycete - bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp "actys" (tia) và "mykes" (nấm)
và ban đầu xạ khuẩnđược coi là vi nấm vì chúng sinh trưởng giống với
nấm. Mạng lưới phân nhánh của hệ sợi thường phát triển ở cả bề mặt cơ
chất rắn (tạo thành hệ sợi khí sinh) lẫn bên trong (tạo thành hệ sợi cơ
chất) [24]. Đây là một trong những đặc điểm để phân loại xạ khuẩn.
Xạ khuẩn là vi khuẩn Gram (+) có tỷ lệ G+C cao (>55%) trong DNA. Đa
số xạ khuẩn sống tự do, hoại sinh và phân bố rộng rãi trong đất, nước và
xác thực vật. Xạ khuẩn đóng vai trò quan trong về mặt sinh thái trong
vòng tuần hoàn tự nhiên. Chúng phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ
khó phân hủy như humic acid trong đất [41]. Nhiều chủng xạ khuẩn có
khả năng hòa tan lignhin (một loại chất hữu cơ cao phân tử) bằng cách
sinh các enzyme thủy phân cellulose, hemicellulose và các peoxidase
ngoại bào [33].
Nhìn chung, nhiệt độ trong khoảng 25 - 30oC và pH trung tính là điều
kiện tối ưu cho xạ khuẩn phát triển. Mặc dầu vậy, nhiều loài đã được
phân lập ở các môi trường khắc nghiệt ví dụ Arthrobacter ardleyensis ưa
lạnh được phân lập từ trầm tích hồ ở Nam cực có thể sống ở nhiệt độ 0 oC

3


[26] và Nocardiopis alkaliphila được phân lập từ đất xa mạc ở Ai Cập có
thể sống với pH 9,5 - 10 [22].
2.1.2 Đặc điểm sinh thái của xạ khuẩn
Đa số xạ khuẩn đã được phân lập có nguồn gốc từ đất. Chúng thường

hiện diện trong mùn, rác, phân với mật độ cao, có thể lên đến bốn triệu
cfu/g đất. Streptomyces là loài phổ biến và chiếm ưu thế có thể chiếm đến
95% các chủng phân lập [20].
Phần lớn xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 25 - 30 oC. Một vài loài thuộc
nhóm ưa nhiệt có nhiệt độ phát triển tối ưu ở 45-55oC [20].
Xạ khuẩn đất thường được xem là hiếu khí bắt buộc, một số loài là vi
hiếu khí (Actynomyces humiferus và Agromyces ramosus) hoặc kỵ khí
(Oerskovia) [20].
Xạ khuẩn phân lập từ đất thuộc dạng pH trung tính với dãy phát triển dao
động từ pH 5,0 đến 9,0 và pH tối ưu khoảng pH 7,0. Một số loài ưa acid
có thể phát triển ở khoảng pH 3,5 đến pH 6,5. Các nghiên cứu gần đây
cho thấy các loài Streptomycetes ưa acid hay chịu acid cũng phân bố và
hiện diện nhiều trong đất tự nhiên và acid nhân tạo. Hiện nay còn ít báo
cáo về xạ khuẩnưa kiềm . Streptomyces caeruleus có thể phát triển trong
khoảng pH từ 6,5 đến pH 9,5 [20].
Xạ khuẩn cũng có thể được phân lập từ nước ngọt nhưng mật độ hiện
diện thấp, các giống phổ biến trong nước ngọt là Actinoplsnes,
Micromonospora,
Nocardia,
Rhodococcus,
Streptomyces
và
Thermoactinomyces,
Nhiều giống xạ khuẩn đã được phân lập từ nước biển và trầm tích biển
bao gồm Streptomyces, Micromonospora, Mocrobispora, Nocardia,
Thermoactinomyces và Coryneforms. Mật độ xạ khuẩn là tương đối cao
hơn ở vùng biển cạn và thấp nhất ở trầm tích biển sâu hiếm khi quá vài
ngàn cfu/ml. Streptomyces chiếm ưu thế ở khu vực nước nông ở biển Thái
Bình Dương và biển Atlantic, trong khi Micromonosporae và
Nocardioforms chiếm ưu thế trầm tích ở biển sâu [20].

Xạ khuẩn cũng hiện diện ở dạng cộng sinh trong hệ đường ruột các động
vật trong đất, giữ vai trò quan trọng trong quá trình tiến hóa ở mối (
Isoptera) [20].

4


2.1.3 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
2.1.3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạng
và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống sinh bào tử khi hình thành bào tử).
Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơn nấm mốc với đường kính thay đổi trong
khoảng 0.2 - 1 μm, chiều dài có thể đạt tới một vài centimet [3] [13].
Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào
điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Đây là một trong những đặc điểm phân biệt
khuẩn lạc của xạ khuẩnvà khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc
có đường kình rất lớn thay đổi từ 5 - 10 μm, dễ quan sát bằng mắt thường
[10].
Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng vôi, dạng nhung tơ
hay dạng mảnh dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩncó màu sắc rất đa dạng: đỏ, da
cam, vàng, nâu, xám, trắng...tùy thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh
[10].
Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tùy loài và tùy
điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm... Đường
kính của mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 - 2 mm nhưng cũng có khuẩn lạc
đại tới đường kính 1 cm hoặc lớn hơn [10].
Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương
đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong (Hình 2.1) [3].

5

Hình 2.1. Hình khuẩn lạc xạ khuẩn. [3]
Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản phẩm
trong quá trình trao đổi chất như: chất kháng sinh, độc tố, enzyme,
vitamin, axit hữu cơ... Có thể được tích lũy trong sinh khối của tế bào xạ
khuẩn hay được tiết ra môi trường.[5]

6


Hình 1.2. Hình dạng cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử của chủng
Streptomycs cinereotuber subp [5]
2.1.3.2. Đặc điểm khuẩn ty
Trên môi trường cơ chất đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại:
1 loại cắm sâu vào trong môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ
chất - substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng. Một
loại phát triển trên bề mặc thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh aerial mycelum) với chức năng chủ yếu là sinh sản [10].
Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya)
lạichỉ có hệ sợi khí sinh. Khi đó hệ sợi khuẩn ty vừa làm nhiệm vụ sinh
sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng [10].
2.1.4 Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn

7


Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các náanh phân hóa của khuẩn ty
khí sinh - gọi là cuống sinh bào tử. Đây là cơ quan sinh sản đặc trưng cho
xạ khuẩn. Trên mỗi cuống sinh bào tử mang 30 - 100 bào tử, đôi khi có
thể mang dưới 200 bào tử. Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là đặc

điểm quan trong nhất trong phân loại xạ khuẩn [8].
Cuống sinh bào tử của xạ khuẩncó dạng thẳng hoặc lượn sóng (RF), dạng
xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có hình
móc câu (RA). Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài cuống
sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thưởng có hình trụ,
ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc không gai phát triển
thành dạng lông [8].
Bào tử xạ khuẩnđược bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein
với độ dày khoảng 30 - 300 Å chia làm 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào
tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ,
pH...
Hình dạng kích thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những tính
trạng tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại
xạ khuẩn. Tuy nhiên những tính trạng này có thể có những thay đổi nhất
định khu nuôi cấy trên môi trường có nguồn nitơ khác nhau [10]
2.1.5 Cấu tạo của xạ khuẩn
Xạ khuẩncó cấu trúc tế bào tương tự vi khuẩn Gram (+), toàn bộ cơ thể
chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh
chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.
Thành tế bào có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 cm có cấu trúc tương tự
thành tế bào vi khuẩn Gram (+), thành phần chủ yếu là peptidoglucan tạo
nên một lớp vách tế bào tương đối vững chắc. Phân tích dưới kính hiển vi
điện tử thành tế bào xạ khuẩn gồm ba lớp: lớp ngoài cùng dày 60 Å, lớp
trong và lớp giữa dày 50 Å, căn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào
được chia thành 4 nhóm chính. [4] [9]
Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6
diaminopimelic (L - ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này
[9].

8

Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6
diaminopimelic (meso - ADP) và glyxin. Thuộc nhóm này gồm các chi
Micromonospora, Actinoplanes, Ampullarriella...[9].
Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic. Thuộc nhóm này có các chi: Dermatophilus,
Geodermatophilus, Frankia...[9].
Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic, arabinose và glactose. Thuộc nhóm này có các chi
Mycobacterium, Nocardia, Pseudonocardia...[9].
Thành tế bào có kết cấu dạng lưới, có tác dụng duy trì hình dáng của
khuản ty và bảo vệ tế bào. Ngoài ra thành tế bào xạ khuẩn có thể cho
phép nhiều chất như: chất kháng sinh, axit amin và nhiều hợp chất khác
có kích thước tương đối lớn đi qua một cách dễ dàng. Các chất dinh
dưỡng từ môi trường cũng thẩm thấu một cách chọn lọc qua thành tế bào
[9].
Màng sinh chất là lớp tế bào nằm ngay sát dưới thành tế bào, dày khoảng
7,5 - 10 nm, chức năng chủ yếu là điều hòa sự hấp thu các chất dinh
dưỡng vào tế bào, tham gia vào quá trình hình thành bào tử. Tế bào chất
của xạ khuẩn gồm một số thành phần chủ yếu như: thế nhân, không bào
và thể ẩn nhập [9].
Nhân của tế bào xạ khuẩn không có cấu trúc điển hình, chỉ là nhiễm sắc
thể không có màng bao bọc. Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có một
nhiễm sắc thể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn
ty [9].
2.2 Khả năng phân giải enzyme của xạ khuẩn
Enzyme là một chất xúc tác sinh học được tạo thành trong tế bào vi sinh
vật, nó đóng một vai trò quan trọng trong trao đổi chất của vi sinh vật
[21] .
Enzyme không những hoạt động xúc tác những phản ứng chuyển hóa
trong cơ thể mà còn xúc tác những chuyển hóa bên ngoài môi trường điều này có ý nghĩa quan trọng lớn trong việc ứng dụng enzyme vi sinh

vật vào công nghiệp, nông nghiệp,...[21] .

9


Tuy đã biết hơn 1000 loại enzyme khác nhau nhưng cũng chỉ các enzyme
thủy phân mới được sử dụng rộng rãi trong hơn 30 ngành kinh tế khác
nhau, đó là các enzyme amylase, celllulase và protease. Lượng các
enzyme sản xuất hành năm: Protease từ vi khuẩn là 500 tấn/năm, protease
từ nấm mốc là 10 tấn/năm, pectinase là 10 tấn/năm...[21] Các enzyme này
có ứng dụng nhiều trong nông nghiệp, đặc biệt là trong chăn nuôi, với
mục đích là làm tăng giá trị dinh dưỡng, tăng hệ số tiêu hóa thức ăn, giảm
chi phí thức ăn... Các enzyme được dùng ngày càng nhiều ở các nước trên
thế giới [18]
Ở xạ khuẩn, người ta đã thu nhận các loại enzym như:
Enzyme amylaza: thu nhận từ loài Steptomyces aureofaciens,
Streptomyces diastochromogens,...[18] . Là enzyme đường hoá, có khả
năng phân hủy amylose và amylopectin và các polysaccharid tương tự
giải phóng glucose. Các enzyme này có ý nghĩa quan trọng trong việc
phân hủy phế thải chứa các nguồn tinh bột từ làng nghề làm bún, bánh đa,
bánh cuốn, chế biến nông sản, ngô, khoai, sắn... Từ các phế thải lương
thực này, nhờ các amylase có thể dùng để sản xuất alcohol. Cũng nhờ các
enzyme đường hóa α-amylase và glucoamylase, từ các phế thải lương
thực chứa tinh bột của các dây chuyền quy trình chế biến thức ăn có thể
sản xuất màng bao gói có tính chất phân hủy quang học và sinh học [25].
Enzyme cellulaza: thu nhận từ các loài Strepmyces antibioticus,
Steptomyces sp. ,...[18] Trong thập kỷ qua, ezyme thủy phân cellulose
ngày càng được quan tâm. Sự quan tâm này là do các enzyme này có khả
năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hóa các hợp chất kiểu
lignocelllulose và celllulose trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng

thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các sản phẩm
giàu năng lượng khác. Thí dụ: từ các chất thải nhà máy giấy như các sản
phẩm từ bột giấy và giấy có thể thu nguồn năng lượng ethanol [33].
Enzym proteaza: thu nhận từ Streptomyces kinoluteus, Streptomyces
verticillatus var.zynogenes, Actinomyces fradiae,...[18] Protease thuộc
nhóm enzyme thủy phân protein được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp
thực phẩm, chẳng hạn trong chế biến cá và thịt. Protease có thể thủy phân
các protein có trong cơ chất, để sản xuất các dung dịch đặc hoặc các chất
rắn khô có giá trị dinh dưỡng cho cá hoặc vật nuôi. Protease thủy phân

10


các protein không tan thông qua nhiều bước, ban đầu chúng được hấp thụ
lên các chất rắn, cắt các chuỗi polypeptit tạo thành các liên kết lỏng trên
bề mặt. Sau đó, quá trình hòa tan những phần rắn xảy ra với tốc độ chậm
hơn phụ thuộc vào sự khuếch tán enzyme lên bề mặt cơ chất và tạo ra
những phần nhỏ. Chính vì tính chất trên mà protease được sử dụng, một
mặt để tận dụng các phế thải từ protein để những phế thải này không còn
là các tác nhân gây ô nhiễm môi trường, một mặt để xử lý các phế thải
protein tồn đọng trong các dòng chảy thành dạng dung dịch rửa trôi
không còn mùi hôi thối [27].
Enzyme proteaza của xạ khuẩn được ứng dụng nhiều trong công nghệ
thực phẩm có tác dụng làm mềm thịt. Các chế phẩm được bán trên thị
trường như: PRONAZA Nhật Bản (chiết xuất từ Streptomyces griseus),
M-zim của Mỹ (từ Streptomyces fradiae) [27].
Enzyme chitinase: thu nhận từ Streptomyces griseus,...[18].
Chitin là một polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, là một polyme sinh
học được tổng hợp với số lượng lớn từ sinh vật. Lượng chitin được sản
xuất hàng năm trên thế giới chỉ đứng sau celllulose, trong 1 năm chitin

trung bình được tạo ra vào khoảng 20g/1m2 bề mặt trái đất. Trong tự
nhiên chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật [16].
Trong giới động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng trong
lớp vỏ của một số động vật không xương sống cũng như côn trùng,
nhuyễn thể, giáp xác và sân tròn. Trong giới thực vật, chitin có ở thành tế
bào của nấm và một số tảo Chlorphiceate [16].
Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể, đó là cấu trúc gồm nhiều
phân tử được nối với nhau bằng các liên kết hydro tạo thành một hệ thống
sợi. Trong tự nhiên, chitin hiếm khi tồn tại ở trạng thái tự do mà gần như
luôn luôn liên kết dưới dạng phức hợp chitin-protein. Điều này dẫn đến
sự đề kháng với các hóa chất và các enzyme thủy phân, gây nhiều khó
khăn cho việc chiết tách, tinh chế chúng, Tùy thuộc vào các đặc tính cơ
thể và sự thay đổi từng giai đoạn sinh lý mà trong cùng một loài có thể
thấy sự thay đổi và chất của kitin [16].
Trong động vật thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực,
hàm lượng chitin chiếm khá cao từ 14 - 35 % so với trọng lượng khô. Vì

11


vậy vỏ tôm, cua ghẹ, mai mực là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất
chitin và các sản phẩm từ chúng [16].
Ngoài ra người ta còn chú ý một loại enzyme quý ở xạ khuẩn là glucoza
izomeraza, enzyme này giúp biến đổi đường glucose thành đường
fructose với độ ngọt cao hơn [16].
Để thu enzyme người ta thường thu từ môi trường nuôi cấy của chúng.
Thành phần dinh dưỡng của môi trường cũng ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng và tổng hợp enzyme, nên để tăng sự tổng hợp enzyme thì môi
trường nuôi cấy phải có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng đặc biệt cần
bổ sung "chất cảm ứng" tổng hợp enzyme, thường là cơ chất tương ứng

của enzyme cần tổng hợp [16].
Ví dụ: Trong tổng hợp proteaza của Actinomyces cần chất cảm ứng là
protein đậu nành hay protein động vật [18].
2.3 Khả năng kháng khuẩn của xạ khuẩn
2.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh
2.3.1.1 Điều kiện nuôi cấy
Độ thông khí: yếu tố thông khí ảnh hưởng quyết định đến sinh tổng hợp
chất kháng sinh. Các xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí nên độ
thông khí để đạt hiệu suất cực đại đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng khả
năng sinh kháng sinh, lượng không khí cung cấp vào môi trường nuôi cấy
là lưu lượng thổi khí 1 thể tích môi trường/ 1 phút [18].
Nhiệt độ: có những loài xạ khuẩn ưa nhiệt hay sống tốt khi nhiệt độ của
môi trường cao nhưng đa số các xạ khuẩn sinh kháng sinh mà chúng ta
khảo sát thường phát triển tốt ở nhiệt độ 28 oC – 30oC. Nhiệt độ tối ưu cho
sinh tổng hợp chất kháng sinh thường nằm trong khoảng 18 oC - 28oC
[18].
pH : sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc đáng kể vào độ pH của môi
trường. Độ pH thích hợp để sinh tổng hợp chất kháng sinh là pH trung
tính, ở pH acid và kiềm sẽ ức chế quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh
[18].
Nhân giống: Qua thực nghiệm cho thấy sinh tổng hợp chất kháng sinh
không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men mà còn phụ thuộc vào chất
lượng của bào tử và giống sinh dưỡng, nghĩa là tuổi và khả năng đồng

12


đều về mặt di truyền và hoạt tính trao đổi chất của giống phản ánh điều
kiện nuôi cấy. Điều kiện của môi trường nhân giống cũng như thời gian
nhân giống cũng khác nhau tùy vào từng chủng và tuổi của bào tử giống

[18].
Hình thức lên men: trong sinh tổng hợp chất kháng sinh phương pháp
nuôi cấy cũng là một trong những yếu tố quyết định. Qui trình sản xuất
chất kháng sinh thường được nuôi cấy theo phương pháp nuôi cấy chìm
trong nồi lên men có khuấy đảo sục khí [18].
Sinh tổng hợp chất kháng sinh ở vi sinh vật phụ thuộc chặt chẽ vào môi
trường lên men. Trước hết là nguồn C, N và phosphat vô cơ. Các vi sinh
vật khi đã phát triển trên môi trường nhân giống và cấy truyền lên môi
trường lên men có nguồn gốc C, N và các thành phần môi trường khác
nhau sẽ dẫn đến khả năng sinh các chất khác nhau [18].
Nguồn cacbon: quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinh
chịu ảnh hưởng sâu sắc thông qua các nguồn cacbon khác nhau. Tùy
thuộc vào từng chủng mà cần chọn nguồn cacbon thích hợp, các loại
đường đơn: Glucose, Mantiole,.. hay các loại đường kép: Saccarose,
Lactose,.. Cũng có thể là các loại tinh bột hoặc các chất có thành phần
không xác định như rỉ đường, đại mạch,... Đối với xạ khuẩn, nhiều chủng
có hoạt tính amylaza cao nên nguồn cacbon thích hợp đối với chúng là
tinh bột [18].
Nguồn nitơ: nguồn và nồng độ nitơ trong môi trường nuôi cấy cũng ảnh
hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh. Sự dư thừa các ion
amin hoặc các nitơ chuyển hóa nhanh khác sẽ ức chế sinh tổng hợp chất
kháng sinh như Erytromoxin, Leucomicin, Novobioxin,... Quá trình sinh
tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn thường đòi hỏi có cả 2 nguồn nitơ
hữu cơ và vô cơ trong môi trường, nguồn nitơ hữu cơ thích hợp là các
hợp chất từ thực vật như: bột đậu tương, bột đậu nành, cao ngô,...Nguồn
nitơ vô cơ là: muối amon hoặc nitrat [18].
2.3.2 Sự hình thành các con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh
Có nhiều quan điểm về chất kháng sinh, có quan điểm cho rằng chất
kháng sinh là sản phẩm thải của quá trình trảo đổi chất của xạ khuẩn,
cũng có quan điểm cho rằng chất kháng sinh là chất tham gia cạnh tranh

13


của xạ khuẩn trong môi trường tự nhiên. Dù theo quan điểm nào đi nữa
thì các con đường sinh ra các chất kháng sinh được tóm tắt như sau:
Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất trao đổi sơ cấp duy nhất (như
chất kháng sinh Cloramphenicol, các chất kháng sinh thuộc nhóm
nucleozit).
Chất kháng sinh được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc một
khác nhau (như các chất kháng sinh lincomicin, novobiocin) [18].
Chất kháng sinh được tổng hợp bằng cách polyme hóa các chất trao đổi
bậc 1, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác. Có thể
phân biệt thành 4 dạng:
Dạng 1: Chất kháng sinh nhóm polypeptit theo con đường trùng hợp các
amin: bactritracin, polymycin.
Dạng 2: Chất kháng sinh được tạo thành nhờ phản ứng polyme hóa các
đơn vị acetat: chất kháng sinh nhóm macrolit, tetracilin, rifamicin.
Dạng 3: Chất kháng sinh aminoglycozit được tạo thành nhờ các phản ứng
trùng hợp polysacarit: neomicin, streptomycin.
Dạng 4: Chất kháng sinh dược hình thành theo con đường tổng hợp các
chất izopreonit từ các đơn vị acetat...[18].
2.3.3 Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn
Đa số các chất kháng sinh được dùng trong y học có nguồn gốc từ xạ
khuẩn, trong số đó có nhiều chất hiện vẫn đang được sử dụng tương đối
phổ biến trong thực tiễn [11].
Streptomycin: Được Waksman phát hiện ra từ năm 1943, có nguồn gốc
từ xạ khuẩn Streptomyces griseus, có khả năng chống các vi khuẩn Gram
(+) khá mạnh. Streptomycin được sử dụng rất hiệu quả để điều trị các
bệnh dịch hạch, ho gà và đặc biệt hơn cả là dùng để chữa các bệnh lao

[11].
Neomycin: Là chất kháng sinh có hoạt phổ rộng, được tách ra từ xạ
khuẩn Streptomyces fradiae vào năm 1949, có tác dụng chống cả vi
khuẩn Gram (+) và Gram (-). Đặc biệt là chống được nhiều loài vi khuẩn
đã kháng lại với penicillin và Streptomycin [11].

14


Gentamycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Micromonospora putpurea, có
phổ kháng sinh rộng, có tác dụng chống cả vi khuẩn Gram (+) như tụ cầu,
phế cầu đã kháng lại penicillin và vi khuẩn Gram (-) như màng não cầu,
lậu cầu. Trong y học, chủ yếu dùng để điều trị các bệnh do nhiễm
Pseudomonas [11].
Tetracyclin: là kháng sinh được tách chiết từ dịch nuôi cấy một số chủng
xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, các chất kháng sinh này có phổ kháng
sinh rộng, chống được cả vi khuẩn Gram (-) và Gram (+), ricketsia và
một vài loài virus. Ngoài sử dụng trong y học, tetracyclin còn được sử
dụng trong chăn nuôi - thú y [2] [11].
Chloramphenicol: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces venezuelae,
được phát hiện vào năm 1947, có hoạt tính chống được nhiều vi khuẩn
Gram (+) và Gram (-) , Ngoài sử dụng trong y học , chất kháng sinh này
còn được dùng trong chăn nuôi - thú y và thủy sản [30] .
Erythromycin: Có nguồn gốc từ Xạ khuẩn Streptomyces erythreus, chất
kháng sinh có phổ rộng đối với vi khuẩn Gram (+), được sử dụng nhiều
nhất trong điều trị bệnh viêm phổi do Mycoplasma và viêm họng do liên
cầu khuẩn [11] [19].
Novobicin: Có nguồn gốc từ Xạ khuẩn Streptomyces spheroides và
Streptomyces niveris, có hoạt tính mạnh với các vi khuẩn Gram (+). Đặc
biệt có khả năng chống các tụ cầu đã kháng với penicillin và một số chất

kháng sinh khác [17].
Amphotercin B: Có nguồn gốc từ Xạ khuẩn Streptomyces nodosus, được
dùng để điều chỉnh các bệnh ngoài da do nấm Candida abbicans gây ra
[19].
Dactinomycin:
Có nguồn gốc từ Xạ khuẩn Streptomyces
ceoruleorubidus, được dùng để điều trị một số bệnh ung thư [19].
Daunorubixin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces
coeruleorubidus, được dùng để điều trị bệnh bạch cầu cấp tính, bệnh
Hodgkin [19].
2.4 Các phương pháp phân loại xạ khuẩn hiện đại
Cùng với sự phát triển mạnh của sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh
học...nên việc định tên một chủng xạ khuẩn được tiến hành tương đối

15


nhanh chóng và chính xác với nhiều phương pháp mới như phân loại số,
nghiên cứu chủng loại phát sinh... Song người ta vẫn chủ yếu dựa vào đặc
điểm hình thái, nuôi cấy đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh
học phân tử [23].
2.4.1 Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy
Đặc điểm hình thái và tính chất môi trường nuôi cấy là một trong những
thông tin quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Để làm cho các chủng xạ
khuẩn cần định loại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, người ta thường
xuyên nuôi cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng khác nhau trong điều
kiện nhiệt độ và thời gian nhất định. Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh
và ghi lại những đặc điểm hình thái và nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt là
cơ quan mang bào tử, hình dạng và bề mặt bào tử [23].
Theo Pridham và cộng sự [36], cuống sinh bào tử chia thành 3 nhóm:

(i)

RF là những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng.

(ii)

RA là loại cuống sinh bào tử xoắn, thô sơ và ngắn.

(iii)

S là dạng cuống sinh bào tử phát triển mạnh và xoắn.

Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là
những dữ liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên như ta đã
biết xạ khuẩn rất không bền vững về mặt di truyền, thường xuyên xảy ra
sự sắp xếp lại trong phân tử DNA. Trong cùng một loài có thể biểu hiện
khác nhau về hình thái hay những loài khác nhau có thể giống nhau về
mặt hình thái. Vì vậy để phân loại được chính xác, ngày nay người ta phải
dùng thêm các chỉ tiêu khác bổ sung như các đặc điểm sinh lý, sinh hóa,
miễn dịch học hay sinh học phân tử [36].
2.4.2 Đặc điểm hóa học của thành tế bào
Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng 20
năm trở lại đây. Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua
việc định tính và định lượng thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật.
Hóa phân loại chủ yếu dựa vào đặc điểm sau:
(i)

Phân tích axit amin trong thành phần peptit và đường trong tế bào
hay các polysaccarit gắn vào thành tế bào [12].

16


(ii)

Phân tích tính chất hoá học của peptidoglycan (PG) dựa vào các
thông tin về thành phần và cấu trúc của mạch tetrapeptit của PG
cầu nối peptit và các liên kết giữa các mắt xích của PG [12].

Axit mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi Nocardia,
Rhodococus, Mycobacterium và cornebacter. Đây là đặc điểm phân loại
cở bản cho các chi đó [12].
Axit béo thường được sử dụng trong phân loại là axit béo bão hòa mạch
thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteriso metyl
hóa ở nguyên tử cacbon thứ 10. Sự có mặt của axit 10 - metylloctade
canoit (axit tubereulostearinoic) là đặc điểm để phân loại đến chi .
Photpholipit có 5 dạng (PI, PII, PIII, PIV, Pv) có thành phần đặc trưng có ý
nghĩa cho phân loại xạ khuẩn [12].
Trong phân loại xạ khuẩn thì dạng thành tế bào là đặc điểm quan trọng
nhất. Khi muốn đưa ra một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào
đó, người ta không thể nào xác định cấu trúc thành tế bào [12].
2.4.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Để phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm
sinh lý, sinh hóa khác như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ,
nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác
nhau nhờ hệ thống enzyme. Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu,
khả năng chịu muối và các yếu tố khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy
cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản
phẩm trao đổi đặc trưng khác của xạ khuẩn[29].
Hopwood (1975) khẳng định rằng phần lớn các đặc điểm sinh lý - sinh

hóa cùng đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động và có giá trị thấp về mặt
phân loại. Do tính không ổn định và biến dị cao của xạ khuẩn mà ngày
nay những nguyên tắc sử dụng các đặc điểm sinh lý - sinh hóa để phân
loại xạ khuẩn cũng phải thay đổi [29].
2.4.4 Phân loại số (Numerical taxonomy)
Để phát hiện những loài mới trên cở sở sự khác nhau về đặc điểm sinh lý,
sinh hóa người ta còn sử dụng các kết quả dựa vào phân loại số [40]..
Phương pháp này dựa trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau
giữa các vi sinh vật theo một số lớn đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm

17


hình thái, sinh lý, sinh hóa [40].
Để so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau từng đôi một, người ta căn cứ
vào hệ số giống nhau (hệ số S - Similarity) có 2 công thức tính hệ số S
hay được sử dụng [40].
Công thức của Sokal và Michener (SSM) và công thức của Jacard (Sj).
Kết quả cuối cùng của phân loại số là vẽ được sơ đồ phân nhánh (kiểu "rễ
cây") của các thông số. Ở sở đồ này những chủng giống nhau nhiều nhất
được xếp vào một nhóm. Bằng phân loại số người ta chia xạ khuẩn chi
Streptomyces thành 2 nhóm lớn, 37 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13 cụm
với những đại diện nhất định [40].

2.4.5 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces
Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Wakman và
Henrici đặt tên năm 1943 [31]. Đây là chi có số lượng được mô tả lớn
nhất. Các đại điện này có hệ số ký sinh và hệ số cơ chất phát triển phân
nhánh. Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng 1-10 μm, khuẩn lạc thường
không lớn có đường kính khoảng 1 - 5 mm. Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc

đâm sâu vào cơ chất. Bề mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi khuẩn ty khí
sinh dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi có tính kỵ nước [16].
Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử. Trên đầu sợi khí
sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào tử có
những hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc,
vòng...[16].
Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp
phân đoạn và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ,
hình cầu với đường kính khoảng 1,5 μm. Màng bào tử có thể nhắn, gai,
khối u, nếp nhăn... Tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy
[16].
Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucoza, các bào tử biểu
hiện các đặc điểm rất rõ. Màu sắc khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng rất
khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi
khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau. Vì vậy mà ủy ban quốc tế về

18


phân loại xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trường chuẩn và phương pháp
chung để phân loại nhóm vi sinh vật này [16].
Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn
Gram (+), hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là
25 – 30oC, pH tối ưu là 6,5 - 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ
cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh) [16].
Xạ khuẩn này có khả năng tạo thành số lượng lớn các chất kháng sinh ức
chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật
[16]. Cho đến nay để xác định thành phần loài của chi Streptomyces, các
nhà phân loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại
khác nhau [16].

19


PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Xạ khuẩn (Actinobacteria).
3.1.2 Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 01/2016 đến tháng 05/2016.
3.1.3 Địa điểm nghiên cứu
3.1.3.1 Địa điểm thu mẫu
Mẫu bùn đáy được thu tại các vùng nuôi tại một số huyện: Phú Vang,
Phong Điền, Phong Hải,Điền Lộc... tỉnh Thừa Thiên Huế.
3.1.3.2 Địa điểm nghiên cứu và phân tích mẫu
Phòng thí nghiệm bộ môn bệnh Thủy Sản, khoa Thủy Sản, trường Đại
học Nông Lâm Huế.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1. Dụng cụ thí nghiệm
Dụng cụ bố trí thí nghiệm: các đĩa peptri thạch.
Dụng cụ thí nghiệm: cân điện tử, thước đo, kim tiêm, đèn cồn, que cấy,
bông tẩm cồn, găng tay, bình tam giác
Dụng cụ nuôi cấy phân lập vi khuẩn: Các ống nghiệm vô trùng, đĩa
peptri, que cấy vô trùng, lamen, lam kính, pipep, kính hiển vi độ phóng
đại 100x, dầu soi kính, nước muối sinh lí 0,86 % NaCl, nước cất vô trùng,
đèn cồn, tủ lạnh,...
3.3.2. Môi trường và hóa chất
* Môi trường
Môi trường phân lập xạ khuẩn (MT1) (hình 3.1) gồm: Tinh bột 15 g/l,

K2HPO4 0,5 g/l, MgSO4 0,5 g/l, FeSO4 0,01 g/l, Agar 6g/l.
Môi trường nuôi cấy chuyên biệt xạ khuẩn (MT2): tinh bột 10 g/l, Yeast
4 g/l, Peptone 20 g/l.

20


Hình 3.1. Môi
trường phân
lập xạ khuẩn
(MT 1)

21


22


Hình 3.2. Môi trường đặc trưng xạ khuẩn(MT 2)
Môi trường thử khả năng sản xuất enzyem:
Amlylase - Thạch tinh bột (Hình 3.3) : Peptone 10 g/l, cao thịt 10 g/l,
tinh bột 5 g/l, Agra 20 g/l.
Lipase - Thạch Tributyrin: Peptone 5 g/l, cao thịt 3 g/l, tributysin 10
ml/l, agar 20 g/l.
Gelatinase - Thạch Fraziers (hình 3.3) : Peptone 5 g/l, cao thịt 3 g/l,
gelatin 2 g/l, agar 20 g/l.
Celluose - Thạch celluose : Cellulose powder 5 g/l, yest 0,5 g/l, NaNO3
1 g/l, Casein 0,5 g/l, agar 20 g/l.

23

Hình 3.3. Môi trường Amlylase (trái) và môi trường Gelatinase (phải)
3.4 Nội dung nghiên cứu
3.4.1. Phân lập các chủng xạ khuẩn từ các ao nuôi công nghiệp tôm thẻ chân trắng và
vùng đất ngập mặn (Rú Chá) ở Thừa Thiên-Huế.
3.4.2. Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn phân lập được với các
vi khuẩn gây bệnh trên tôm (Vibrio parahaemolyticus).
3.4.2 Đánh giá khả năng sản xuất enzyme của các chủng xạ khuẩn phân lập được

3.5 Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp phân lập xạ khuẩn
Các chủng xạ khuẩn được phân lập từ các mẫu bùn đáy thu thập từ các trang trại nuôi
tôm ở huyện Phong Điền, tỉnh Thừa Thiên Huế. Các mẫu bùn đáy sẽ được xử lý để
phân lập chọn lọc các xạ khuẩn theo Laskshmi, (2008). Mẫu thu được xử lý tại 50 60°C trong 60 phút. Trộn 1 g của các mẫu bùn đáy với 0,1 g CaCO3 và ủ ở 28°C
trong một tuần trong tủ ấm. Các mẫu sau đó sẽ được pha loãng, trộn đều và cấy lên
môi trường xạ khuẩn (MT1) (Himedia, Ấn Độ) có bổ sung chất chống nấm Bavistin
(BASF India Limited, Bombay) và kháng khuẩn novobiocin (Himedia). Khuẩn lạc với
các đặc điểm của xạ khuẩn sẽ được nuôi cấy lên môi trường đặc trưng xạ khuẩn
(MT2) cho đến khi tạo được khuẩn lạc thuần. Lấy khuẩn lạc thuần cấy lên môi trường
thạch nghiêng đặc trưng của xạ khuẩn nước mặn. Lấy mẫu trong ống thạch nghiêng
tăng sinh trong 20 ml môi trường đặc trưng lỏng, nuôi trong máy lắc 100 vòng/phút ở
nhiệt độ 33oC.

24


Hình 3.4. Mẫu bùn đáy và thùng thu mẫu bùn đáy

3.5.2 Thử khả năng kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn phân lập

được
Để kiểm tra khả năng kháng khuẩn của xạ khuẩn đã phân lập từ mẫu bùn đáy, mẫu vi
khuẩn thuộc chủng Vibrio parahaemolyticus (hình 3.5) phân lập từ tôm thẻ chân trắng
nhiễm bệnh được cung cấp từ phòng thí nghiệm Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản,
Đại học Nông Lâm Huế.

25