các phương pháp định lượng protein

Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang

MỤC LỤC
LỜI NÓI ĐẦU.....................................................................................................................................................2
TỔNG QUAN.............................................................................................................................................................3
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ACID AMIN.......................................................................................7
I. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ACID AMIN ĐẦU N, C

8

II. CÁC PHẢN ỨNG NHẬN BIẾT CÁC ACIDAMIN ĐẶC TRƯNG

12

III. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG ACID AMIN

21

CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH PROTEIN...........................................................................................28
I. PHẢN ỨNG BIURE

29

II. PHƯƠNG PHÁP LOWRY

30

III. PHƯƠNG PHÁP TẠO TỦA VỚI TCA (ACID TRICLOACETIC)

32

CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG PROTEIN.....................................................................................34
I. ĐỊNH LƯNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL:[4], [6]

34

II. ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU: [4]

41

III. ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP DÙNG BICINCHONINIC ACID (BCA). [10]

49

IV. ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ:[4]

50

V. PHƯƠNG PHÁP HUỲNH QUANG O-PHTHALALDEHYDE (OPA): [10]

52

VI. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG AMONIAC.[4]

52

1

Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang

LỜI NÓI ĐẦU
Protein là thành phần không thể thiếu của tất cả các cơ thể sinh vật, nó được
cấu tạo từ nhiều nguyên tố: C, H, O, N… Chủ yếu bao gồm các L-axit amin kết hôp
với nhau bằng các liên kết peptid. Tỉ lệ phần trăm khối lượng các nguyên tố này
trong phân tử Protein như sau: C 50-55; O 21-24;N 15-18; H 6,5 - 7,3; S 0 – 0.24.
Ngoài các nguyên tố trên một số protein còn chứa một lượng rất ít các nguyên tố
khác như P,Fe,Zn,Cu, Mn,Ca…
Protein có đặc tính đặc thù cao cho từng loài, từng cơ quan mô của cùng một
cá thể. Protein rất đa dạng về cấu trúc và chức năng của cơ thể sống.
Trong mô và tế bào của các sinh vật cũng như trong thành phần Protein (chất
đạm) tồn tại ở nhiều dạng khác nhau như: đạm hữu cơ, đạm vô cơ, đạm Protein
(comoniac hoặc muối amonium). Để xác đònh được chúng hiện nay có nhiều
phương pháp tùy theo đối tượng khảo xác và tùy theo chiều hướng muốn khảo xác,
người ta áp dụng từng phương pháp thích hợp có thể trục tiếp hoặc gián tiếp.
Seminar này sẽ trình bày một số phương pháp dùng để đònh tính và đònh lượng
Protein, cùng với một số lưu ý khi sử dụng từng phương pháp cụ thể.

2


Seminar

GVHD: ThS. Nguyeãn Thò Thu Sang

PHAÀN I

TOÅNG QUAN

3


Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang

CẤU TẠO PHÂN TỬ PROTEIN
Tất cả các protein đều chứa các nguyên tố C,O,N,H, một số còn chứa một
lượng nhỏ S. Tỉ lệ phần trăm khối lương các nguyên tố này trong phân tử protein
như sau: C 50-55; O 21-24;N 15-18; H 6,5 - 7,3; S 0 – 0.24. Ngoài các nguyên tố
trên một số protein còn chứa một lượng rất ít các nguyên tố khác như P,Fe,Zn,Cu,
Mn,Ca…
Protein có thành phần phức tạp và có nhiều bật cấu trúc khác nhau, mổi bật
cấu trúc có cấu trúc và chức năng khác nhau và giử vai trò rất quan trọng dối với
tất cả các cơ thể sinh vật.
Để thuận tiện người ta thường cấu trúc thành 4 bậc 1,2,3,4
Cấu trúc bậc 1: là trình tự sắp xếp các gốc acid amin trong mạch polypeptide
cấu trúc này được giữ vững nhờ liên kết peptide(liên kết cộng hoá trò)

O
H3N – CH – C

+ +H3N – CH – C

+

R1

O

O-

R2

O

O
+

O

H3N – CH – C – NH – CH – C
R1

R2

+ H2O
O–

Liên kết peptide
H

H

H

O

H

H

H O

H

– HN – C – C – N – C – C – N – C – C – N – C – C – N – C –
R1 O

R2

H R3 O

R4

H

R5

4


Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang

Cấu trúc bậc 2:

Là tương tác không gian giữa các gốc acid amin ở gần nhau trong mạch
polypeptide. Nói cách khác nó là không gian cục bộ của từng phần trong mạch
polypeptide. Cấu trúc được làm bền chủ yếu nhờ liên kết Hidro được tạo thành
giữa các liên kết peptide ở gần nhau cách nhau khoảng xác đònh.

Cấu trúc bậc 3:

5


Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang

Tương tác không gian giữa các gốc acid amin ở xa nhau trong mạch
polypeptide, là dạng cuộn lại trong không gian của mạch polypeptide (hình dạng
chung của chuỗi polypeptide). Trong nhiều protein hình cầu có chứa các gốc Cys,
sự tạo thành các liên kết disunfua giữa các gốc Cys ở xa nhau trong mạch
polypeptide, làm cho mạch bò cuộn lại đáng kể. Các liên kết khác như liên kết
Vandecvan,liên kết tónh điện, lk hidro giữa các mạch bên của các gốc acid amin …
đều tham gia làm bền cấu trúc bậc 3. Kết quả nguyên cứu nhiều protein cho thấy
chính trình tự sắp xếp các gốc acid amin trong chuỗi polypeptide chứa những thông
tin cần thiết để hình thành cấu trúc bậc 3.

Cấu trúc bậc 4:
Đối với các phân tử protein bao gồm 2 hay nhiều chuỗi polypeptide hình cầu,
tương tác không gian giữa các chuỗi trong phân tử gọi là cấu trúc bậc 4. Mỗi chuỗi
polypeptide gọi là”phần dưới đơn vò ” chúng gắn với nhau nhờ liên kết hidro, lực
Vandecvan giữa các nhóm phân bố trên bề mặt của các “phần dưới đơn vò”.

6


Seminar

GVHD: ThS. Nguyeãn Thò Thu Sang

PHAÀN II

CAÙC PHÖÔNG PHAÙP XAÙC ÑÒNH
ACID AMIN

7


Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang

I. Phương pháp xác đònh acid amin đầu N, C
Việc xác đònh được amino acid đầu N và đầu C cho phép xác đònh số lượng
sợi polypeptide tạo nên phân tử protein và đánh giá mức độ đồng nhất của mẫu
protein. Ngoài ra biết được amino acid đầu N cho phép kiểm soát quá trình tách
phân đoạn đối với phân tử protein.

I.1. Xác đònh amino acid đầu N:
Phương pháp Sanger:
Xác đònh amino acid đầu N được Sanger đề xuất vào năm 1945. gồm các bước
chủ yếu sau:
Dựa vào phản ứng của nhóm ∝ - NH2 của amino acid đầu N với 2,4

dinitroftorbenzol tạo ra dẫn xuất dinitrophenyl (DNP) của amino acid cần xác đònh
có màu vàng.
Sau đó tiến hành thuỷ phân bằng acid HCl 5,7N cắt toàn bộ amino acid có
mặt trong sợi polypeptide và dẫn xuất màu vàng của DNP – aminoacid đầu N.
Tách dẫn xuất trên bằng cách chiết suất eter và xác đònh dẫn xuất trên là của
amino acid nào bằng phương pháp sắc ký bản mỏng.

8


Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang
Sơ đồ phương pháp Sanger

O2N

F+

Al

Gl

As

Le

Ar

Th

a

y

p

u

g

r

Al

Gl

As

Le

Ar

Th

a

y

p

u

g

r

NO2
O2N
NO2

HCl
As

Gl

p

y

O2N

Al
a

NO2

Th

Le

Ar

u

g

r

Phương pháp Dansyl:
Do harly đề ra vào năm 1963, bản chất của phương pháp này cũng tương tự
phương pháp Sanger gồm các bước:
Đầu tiên cho dansylchloride tác dụng với nhóm NH 2 của amino acid đầu N tạo
ra dansyl-peptide. Tiến hành thủy phân sợi polypeptide bằng acid HCl 5,7N ởù
105°C trong khoảng 12- 16 h sẽ giải phóng phức dansyl-amino acid đầu N phát
huỳnh quang ở λ = 365 nm. Sau đó xác đònh dansyl- amino acid là phương pháp sắc
ký bản mỏng 2 chiều hoặc gần đây người ta sử dụng phương pháp sắc ký cột lỏng
ngược pha có độ phân giải cao sử dụng detector huỳnh quang.

9


Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang
Sơ đồ phương pháp Dansyl

H R1
H2N

H R3

H
N

O R2 H

N
H

O
H R1 H
H R3 H
N
N
N
HN
O
O R2 H H

H
N

O

Cl
O

O

O

polypeptide

S

O

S

H3C

N

CH3

N
H3C

CH3

N-dansyl derivative of peptide
HCl

Dansyl chloride
H
H
⊕
⊕
H3N – C –CO2H + H3N – C – CO2H …– +

R2

O H H
O = S – N – C – CO2H
R1

R3

N
H3C

CH3

N- dansyl- amino
acid
Phương pháp Edman:
Phương pháp này cho phép xác đònh lần lượt thứ tụ amino acid từ đầu N nhờ
phản ứng của nhóm NH2 của amino acid đầu N với phenyllisothiocyanate (PITC ).
Gồm hai giai đoạn:
• Tạo phenylearbamat-peptide
• Tách amino acid đầu N ở dạng dẫn xuất phenylthihydantoin (PTH ) của
10


Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang

amino acid đầu N, tách và xác đònh dẫn xuất bằng phương pháp sác ký bản mỏng
ngoài ra người ta còn sử dụng phương pháp enzyme aminopeptidase.

I.2. Xác đònh amino acid đầu C:
Phương pháp hydrazyl hoá :
Do giáo sư Akabori đề xuất. Bản chất của phương pháp này là người ta cho
hydrazine tác động với nhóm cacbonyl của amino acid đầu C. tách phức trên bằng
phương pháp sắc ký bản mỏng và xác đònh tên của amino acid. Tuy nhiên phương
pháp này có hạn chế là một số amino acid bò phân hủy khi tạo phức hợp với
hydrazine ở nhiệt độ khá cao 100 = 120oC.
R3

R

2

R

1

NH2 - NH2

… – NH – CH – C – NH – CH – C – NH – CH – C
O

O

R3

O

NH2 – CH – C – NH – NH2 +

OH

O

R2
R1
O
+ NH2 – CH – C – NH – NH2 NH
+ 2 – CH – C
O
OH

Phương pháp oxazolone:
Do nhà khoa học người Nhật Matsuo đề xuất. Bản chất của phương pháp này
là: cho nhóm COOH của amino acid đầu C tác động với acetate anhydride tạo ra
cấu trúc mạch vòng oxazolone. Trong môi trường kiềm cho một nguyên tử H của
mạch vòng này trao đổi với đông vò H 3 tạo ra dẩn xuát phóng xạ. Tiến hành sắc ký
để tách và xác đònh amino acid đầu C trên nhờ phương pháp chụp phóng xạ.
Ngoài ra người ta còn sử dụng phương pháp thủy phân nhờ enzym
carboxypeptidase để cắt riêng và xác đònh amino acid đầu C.

11


Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang

II. Các phản ứng nhận biết các acidamin đặc trưng

II.1. Phản ứng ninhydrin :[4]
Nguyên tắc:
Tất cả các α-acid amin của protein đều phản ứng với ninhydrin tạo thành hợp
chất màu xanh tím(hấp thụ cực đại ở bước sóng 570nm). Phản ứng này rất nhạy có
thể phát hiện đến microgram acid amin,vì vậy được dùng nhiều trong phân tích
đònh tính và đònh lượng acid amin(trong phương pháp sắc kí và điện di). Cơ chế
phản ứng khá phức tạp và có nhiều chỗ chưa thống nhất. Có thể nêu một số phản
ứng chính như sau:
Dưới tác dụng của ninhydrin ở nhiệt độ cao,acid amin tạo thành NH 3,CO2 và
andehit tương ứng có mạch carbon ngắn hơn acid amin 1 carbon;ninhydrin chuyển
thành aminodixetohydrinden.
O

O
H
R

C
NH

COOH

+

OH

O

NH3

OH

+

CO2

+

RCHO

+

O

O

OH
O

O

Aminodixetohidrinden
Aminodixetohydrinden, NH3 mới tạo thành tiếp tục phản ứng với 1 phân tử
ninhydrin khác tạo thành hợp chất màu xanh tím có công thức như sau:
O

O

O

O

N
O

O

Đặc biệt riêng aminoacid như prolin khi tạo phức chất với ninhydrin sẽ có
màu vàng, khác biệt hẳn với màu do acid amin khác tạo nên trong phản ứng. Do
vậy,ninhydrin còn được sử dụng cho phản ứng màu đặc trưng để phát hiện prolin.

12


Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang
O

O

O

O

+

HN

O

COOH

O

Ninhydrin

Prolin

+

+

N

CO2

+

H2 O

O

phức màu vàng

Thực hành:
Nguyên liệu và hóa chất: dung dòch lòng trắng trứng 1%,prolin 1%,dung dòch
ninhydrin 0.1% pha trong axeton 95%.
Lấy 2 ống nghiệm cho vào ống 1 : 1ml dung dòch lòng trắng trứng 1%,ống 2:
1ml prolin 1%,thêm vào mỗi ống 1 ml dung dòch ninhydrin đun sôi trong 1-2 phút.

Quan sát màu trong 2 ống,giải thích kết qủa nhận được.
Có thể làm phản ứng trên giấy lọc như sau: nhỏ 1 giọt dung dòch prolin hoặc
protein (lòng trắng trứng 1%) lên giấy,sấy khô cho thêm 1 giọt thuốc thử
ninhydrin,sấy khô bằng máy sấy.Quan sát màu tạo thành.

II.2. Phản ứng Xantoprotein với acid amin vòng:[4]
Nguyên tắc:
Đây là những phản ứng đặc trưng cho những protein có chứa acid amin vòng
như phenilalanin,tirozin, tryptophan. Khi đun nóng dung dòch protein với HNO 3
đậm đặc tạo thành dẫn xuất Nitơ màu vàng. Khi thêm dung dòch kiềm vào sẽ tạo
thành muối có cấu tạo Quinoit màu da cam. Ngược lại, các protein không chứa acid
amin vòng như gelatin không cho phản ứng này.
H2N

H
C

COOH

H2N

CH2

O
OH

H
C

COOH

CH2

+

O

2 HNO2
O2N

NO2

+

H2 O

OH

Dinitrotyrozin (màu vàng)
13


Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang

H
H2N C COOH

H

H2N C COOH

CH2

CH2

+

O2N

NO2

O2N

O

NaOH

N
OH

O

Thểquinoit of dinotrotyrozin

ONa

+

H2 O

O

Muối natri của dinitrotyrozin (màu da cam)

Thực hành:
Nguyên liệu và hóa chất: Lòng trắng trứng 1%, gelatin 1%, NaOH 20%, HNO 3
đặc.
Lấy 2 ống nghiệm, cho vào ống 1:2ml dung dòch albumin, ống 2: 2ml dung
dòch gelatin, thêm vào mỗi ống 1 ml HNO3 đậm đặc. Đun nhẹ hỗn hợp, màu vàng
xuất hiện và cuối cùng trầm hiện tan hết để cho dung dòch màu vàng. Để nguội,
thêm từng giọt dung dòch NaOH 20%, màu trở nên vàng cam.

II.3. Phản ứng Millon đặc trưng cho tyrozin.[4]
Nguyên tắc:
Thuốc thử Millon là hỗn hợp các muối Nitrat và nitric thủy ngân được hòa tan
trong HNO3. Khi thuốc thử tác dụng với nhân phenol của tyrozin sẽ tạo nên hợp
chất nitrotyrozin thuỷ ngân có màu đỏ.
Phản ứng Millon được dùng để phát hiện tyrozin và các hợp chất phenol.
OH

O
CH2
HOOC C NH2
H

tyrozin

O

+

HgNO3

O2N

OHg
N

O

+

H2 O

CH2
HOOC C NH2
H

Thủy ngân – nitrotyrozin(màu đỏ)

14


Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang

Thực hành:
Nguyên liệu và hóa chất: Dung dòch lòng trắng trứng 1%, gelatin 1%.

Thuốc thử Millon được điều chế như sau: hòa tan 40g thủy ngân trong 57 ml
HNO3 đậm đặc, sau đó đun nhẹ (50 oC) trong nồi cách thủy đến khi thủy ngân tan
hoàn toàn. Dung dòch được pha loãng gấp đôi bằng nước cất, thêm 1ml KNO 2 hoặc
NaNO2 1%, khuấy đều, để lắng, gạn lấy dòch trong.
Lấy 2 ống nghiệm, cho vào ống 1 : 1ml dung dòch lòng trắng trứng 1%,ống 2:
1ml gelatin 1%. Thêm vào mỗi ống 1ml (hoặc 6 giọt) thuốc thử Millon,lắc đều, đun
nhẹ cho đến khi xuất hiên màu trong ống 1. So sánh kết quả trong 2 ống giải thích.
Chú ý: Không cho quá nhiều thuốc thư ûMillon vì HNO 3 có trong thuốc thử sẽ
tác dụng với protein cho màu vàng.

II.4. Phản ứng Adamkievic đặc trưng cho tryptophan.[4]
Nguyên tắc:
Trong môi trường acid, tryptophan phản ứng với nhiều loại aldehid tạo thành
những sản phẩm ngưng kết có màu đỏ tím đặc trưng.
COOH
H2 N

H2 N

CH
CH2

O

+

2

C
H

H

Tryptophan

COOH

COOH

CH

CH

CH2

CH2

H2SO4
- H2 O

NH2

CH2
N

N

H

H

Bis – 2-tryptophanalilmetan

Thực hành:
Nguyên liệu và hóa chất: Dung dòch lòng trắng trứng 1%, gelatin 1%, acid
acetic đặc, H2SO4 đặc, CuSO4 đặc, formaldehid,saccharose 1%.
 Phản ứng với acid glioxilic
15


Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang

Lấy 2 ống nghiệm,cho vào ống 1: 1ml dung dòch lòng rắng trứng 1%,ống 2 :
gelatin 1%,thêm vào cả 2 ống 1 ml axit axetic đặc(có chứa acid glioxylic ở dạng
vết),lắc đều thêm vài giọt CuSO4 rồi tiếp tục lắc.Cầm nghiêng ống nghiệm,nhỏ
theo thành ống 1ml H2SO4,cho chảy xuống từ từ.Quan sát sự xuất hiện vòng tím ở
mặt phân cách hai chất lỏng ở ống 1. Giải thích sự sai khác giữa hai ống.
Phản ứng với oximetylfucrurol(được hình thành do saccharose bò thủy phân
mất nước dưới tác dụng của CuSO4 đặc)
Cho vào ống nghiệm 2ml dung dòch lòng trắng trứng 1%,thêm vài giọt
saccharose 1% và CuSO4 5%,lắc đều.nhỏ theo thành ống nghiệm 1ml H 2SO4
đặc.Quan sát sự hình thành sản phẩm có màu.
 Phản ứng formaldehid:
Cho vào ống nghiệm 2 ml dung dòch lòng trắng trứng 1% thêm vài giọt
formaldehid loãng và CuSO4 5%,lắc đều.Nhỏ theo thành ống nghiệm 1ml H 2SO4
đặc.Quan sát sự hình thành sản phẩm có màu.CuSO 4 có tác dụng làm tăng độ nhạy
của phản ứng.

II.5. Phản ứng Sakagichi đặc trưng cho arginin. [4]
Nguyên tắc:
Đây là phản ứng phát hiện arginin : khi tác dụng với hypobromit(NaBrO) và
α-naphtol,arginin sẽ tạo sản phẩm màu đỏ cam.
HO

H
H2N C COOH
NaBrO

(CH2)3

alpha naphtol

NH
C NH
NH2

Arginin

H
H2N C COOH

NH3

+

NaBrO

N2

+

NaBr + H2 O

NaBr

(CH2)3
NH
HN C
N

O

Naphtoquinoimin
(màu đỏ cam)
16


Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang

Thực hành:
Nguyên liệu và hóa chất : arginin 1%,α-naphtol 2% pha trong etanol 96%
(trước khi dùng pha loãng 10 lần bằng cùng loại dung môi) NaOH 10% và 5%
Dung dòch hypobromit (NaBrO) được chuẩn bò như sau: hòa tan 1g Brom trong
50ml NaOH 5% ( thao tác trong điều kiện lạnh). Bảo quản thuốc thử trong tủ
lạnh,thời gian sử dụng 2 tuần.
Cho vào ống nghiệm 2ml arginin, 2ml NaOH 10%,vài giọt α-naphtol, lắc đều

thêm 0,5 ml hypobromit, lắc, màu đỏ xuất hiện.

II.6. Phản ứng của các acid amin chứa lưu hùynh( phản ứng Folia).[4]
Nguyên tắc
Các acid amin chứa lưu hùynh như cystin, cystein, methionin dưới tác dụng
của kiềm bò phân hủy tạo thành natri sunfua( Na2S):
RSH + 2 NaOH

Na2S + ROH + H2O

Thêm chì acetat và Na2S sẽ phản ứng tạo thành kết tủa nâu đen của chì sulfua
( PbS):
Na2S +

Pb(CH3COO)2

2(CH3COO)Na

+

PbS

(kết tủa màu đen)
Thực hành
Nguyên liệu và hóa chất:
Dung dòch lòng trắng trứng 1%, NaOH 10%, chì acetat 1%, cho vào ống
nghiệm 2ml dung dònh lòng trắng trứng 1% và 2ml NaOH 10%. Đun sôi trong ba
phút. Lắc đều . thêm vài giọt Pb(CH3COO)2 1%. Quan sát sự tạo thành kết tủa,

17

Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang

II.7. Phản ứng của prolin với thuốc thử Isatine. [4]
Nguyên tắc
Ngoài phản ứng màu đặc trưng với ninhydrin, prolin còn có thể phát hiện
được dễ dàng nhờ phản ứng với thuốc thử Isatine:

O

N

O
O

N
H

Izatin

+

COOH
N

+

O

O

H

H

+

O

N

N

N

H

H

H

Prolin

CO2+ 2 H2 O

Izatin – prolin(màu xanh lơ đậm)

Thực hành
Nguyên liệu và hóa chất:
Dung dònh prolin và exiprolin 0,1% pha trong acid đặc . Thuốc thử isatine gồm
hỗn hợp các dung dònh : Isatin 0,2 %, CdCl 0,06 % và acid acetid 4% trong aceton.
Cũng có thể chuẩn bò một cách đơn giản hơn bằng cách pha dung dònh Isatin 0,2 %
trong acid acetic đặc.
Chấm dung dònh prolin lên giấy lọc. Hơ nhẹ cho tới khô. Sau đó phun thuốc
như Isatine lên giấy, sấy nhẹ, sẽ xuất hiện màu xanh lơ đậm. Nếu chấm oxiprolin
thì sẽ hiện ra màu xanh nhạt.

II.8. Phản ứng Pauli để phát hiện histidin và tyrozin. [4]
Nguyên tắc
Khi tác dụng với acid diazobenzosunfonic ( thuốc thử diazo), histidin tạo
thành phức chất màu da cam.
Công thức của phản ứng như sau:
Sự tạo thành aciddiazobenzosunfonic:

18


Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang
SO3H

SO3

+

KNO2

+

+

H Cl

KCl

+

H2 O

+
N N

NH2

Acid sunfanilic

Acid diazobenzosunfonic

Phản ứng của histidin:
COOH
H2N
SO3

SO3

CH2

+
N

CH

N

N

SO3H

COOH
H2N

SO3H

CH

+

CH2
N

OH

N

N

N

N N

N

H

2, 5-bis-N-sunforbenzonazo histidin
(màu mận chín)
Phản ứng của tyrozin:
COOH
H2N
SO3

+

SO3

CH2

+
N

CH

N

N

SO3H

COOH
H2N

+

CH2
+

OH

SO3H

CH

N

N
N

N

N N

N

H

2,5-bis-N-sunforbenzonazo tirozin

(màu dacam)

Thực hành:
Nguyên liệu và hóa chất : dung dònh histidin và tyrozin chuẩn 0,1%, Na 2CO3
10% , thuốc thử Pauli: hòa tan 1g acid sunfanilic trong 100ml HCL 1N, sau đó trộn
với 10ml dung dònh nitrit natri 0,7% trong nước cất

19


Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang

Nhỏ dung dònh histidin hoặc tyrozin lên giấy lọc, sấy nhẹ cho khô, sau đó
phun thuốc thử Pauli lên, làm khô giấy. Cuối cùng phun lên giấy dung dònh Na 2CO3
10% . quan sát, so sánh và giải thích các kết quả nhận được.

II.9. Phản ứng với acid nitơ (HNO2) (phương phápVan Slyke). [4]
Nguyên tắc
Dưới tác dụng của HNO2 , acid amin bò dezamin dezamin hóa tạo thành nitow
ở dạng khí. Phản ứng này được sử dụng để đònh lượng các α-acid amin( phương
pháp Van Slyke).
Phản ứng xảy ra như sau:
COOH
|
H2N – CH + O=N – OH
|
R

→

COOH
|
OH – CH + N2 + H2O
|
R

Thực hành
Nguyên liệu và hóa chất: dung dònh glycin 0,5%, NaNO2 10% , acid acetic 2 N
cho vào ống nghiệm 1ml dung dònh NaNO2 10%, 2ml acid acetic 2N và 0,5 % .
quan sát sự xuất hiện của bọt khí(N2)

II.10. Phản ứng với nitơ pruxit đặc trưng cho các acid amin, protein chứa lưu
huỳnh. [4]
Nguyên tắc
Phản ứng diễn ra tương tự như phản ứng Folia, nhưng ở phản ứng này, natri
nitropruxit thay thế vò trí của chì axetat

20


Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang
2 NAOH

R – SH

R – SH

Na2S

H2O

H2O
Na2Fe( CN) 5NO

Na4Fe(CN)5NO

H2S

Thực hành
Nguyên liệu và hóa chất : cystein 0,1 % , albumin 1% , NaOH 30 % , natri
nitropruxit 10% : chỉ pha trước khi dùng
Lấy hai ống nghiệm , cho vào ống 1: 1ml cystein 0,1%, ống 2 : 1ml albumin
1% . thêm vào mỗi ống 1ml NaOH 30%, đun sôi trong vài phút , để nguội , cho vào
vài giọt thuốc thử natri nitropruxit 10%, lắc đều , quan sát sự sự xuất hiện màu ở
ống 1 và ống 2, so sánh và giải thích kết quả.

III. Phương pháp đònh lượng acid amin
III.1. Phương pháp Formol
Nguyên tắc:
Các axit amin, ogligopeptit trong dung dòch nước thì trung tính do hai nhóm
axit (-COOH ) và amin (-NH2 ) trung hòa lẫn nhau và do cả hai nhóm chức đều
yếu, quá trình điện ly kém. Khi gặp formol, nhóm amin kết hợp với formol thành

21

Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang

metylen (-N=CH2) mất tính chất kiềm, nên tính axit của nhóm (–COOH ) nổi bật
lên và có thể đònh lượng bằng một chất kiềm với phenolphtalein làm chỉ thò màu.
R CH COOH + HCHO
NH2

R CH COOH + H2O
N =CH2

Các nhóm carbonxyl tự do bằng số nhóm amin liên kết với formol, khi chuẩn
độ nhóm carbonxyl thì xác đònh được nhóm amin. Vì vậy cho phép đònh lượng
được amino axit trong dung dòch nghiên cứu.
Cách tiến hành:
Hoá chất:
• Dung dòch NaOH 0,1N
• Dung dòch HCl 0,1N
• Dung dòch formol trung tính 30% : Lấy 50 ml formol 30% cho thêm 0,1 ml
phenolphthalein trong etanol 1% và chỉnh bằng NaOH 0,1N đến khi xuất
hiện màu vàng nhạt
• Dung dòch phenolphthalein 1%
Tiến hành
• Cho vào erlen 20ml dd amino axit, cho từng giọt NaOH 0,1N đến khi xuất
hiện màu vàng nhạt
• Cho thêm 20 ml dd formol 30% đã trung hòa và lắc đều erlen. Sau 5 phút
dung dòch mất màu
• Chuẩn độ bằng NaOH O,1N đến khi màu vàng xuất hiện trở lại
• Thí nghiệm trên cùng được tiến hành tương tự với các hóa chất trên nhưng

thay thế dung dòch amino axit bằng nước cất cùng thể tích.
Tính kết quả:
1 ml dd NaOH 0,1N tương đng 1,4 mg nitơ. Số mg nitơ amin của dd nghiên
cứu đïc tính theo công thức:
22


Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang
N = (A – B) x 1,4

(mg)

trong đó A : số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm
B : số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra
Ngoài ra ta còn có thể tiến hành theo cách khác
Hoá chất:
• Dung dòch NaOH 0,2N
• Dung dòch Ba(OH)2 bão hòa trong cồn metylic
• Dung dich phenolphthalein 1% trong cồn
• BaCl2 tinh thể
• Dung dich dinatriphotphat 0,1N (chức 17,91g Na2HPO4.12H2O trong 1lít
nước).
• Dung dòch formol trung tính 30%
Tiến hành
Cân chính xác m(g) mẫu đã xay nhuyễn (hoăc V(ml) mẫu ở dạng lỏng) cho
vào bình đònh mức 100ml với 50ml nước cất,lắc mạnh trong 10 phút để hòa tan.
Cho thêm 0,5ml phenolphthalein, 2g BaCl2 tinh thể và từng giọt Ba(OH)2 cho
đến khi có màu hồng nhạt .Sau đó thêm 5ml Ba(OH)2 để kết tủa các muối

phosphate và carbonat. Cho nước cất vừa đủ 100 ml. Lắc đều và lọc.
Lấy 25ml dòch lọc, cho vào bình erlen với 20ml dung dòch formol trung tính.
Chuẩn độ bằng NaOH 0,2N cho đến khi có màu đỏ tươi
 Ghi chu ù:
Điểm chuyển màu rất khó nhận biết. Do đó dùng 100ml dd NaHPO4 0,1N
trộng đều với 0,5ml phenolphthalein 1% để có màu đỏ tươi làm mẫu so sánh điểm
tương đương.
Kết quả:
• Nếu nguyên liệu là chất rắn
23


Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang
Hàm lượng nitơ formol trong 100g mẫu:
N formol (g) = 0,0028.V1.100/25.100/m

• Nếu nguyên liệu là chất lỏng :
N formol (g) = 0,0028.V1.100/25.100/V
Trong đó:
0.0028 : số gam nitơ tương ứng với 1 ml NaOH 0,2N
v1

: thể tích NaOH 0,2N dùng cho việc chuẩn độ (ml)

m hay V: khối lượng (g) hay thể tích(ml) mẫu
Độ nhạy và khả năng ứng dụng:
Độ nhạy:
Phương pháp đònh lượng bằng chuẩn độ formol có độ nhạy không cao vì

không thể sử dụng để đònh lượng với mẫu có chứa muối amoni. Khi gặp formol làm
cho dung dòch trở thành axit, do hình thành hexametylen tetramin và HCl theo phản
ứng :

4NH4Cl + 6HCHO

(CH2)6N4

+ 6H2O + 4HCl

Khả năng ứng dụng:
Phương pháp chuẩn độ Sorensen được sử dụng để đònh lượng amino axit trong
dung dòch nghiên cứu. Nhưng phương pháp nàykhông cho kết quả chính xác giá trò
nitơ amin. Vì nếu trong dung dòch có prolin, nó sẽ liên kết không bền với formol
nên làm giảm kết quả đònh lượng. Ngược lại nếu dung dòch không có tyrosin, nó lại
làm tăng kết quả đònh lượng v1 nó có nhóm phenol.

24


Seminar

GVHD: ThS. Nguyễn Thò Thu Sang

III.2. Phương pháp sắc ký giấy. [4]
Nguyên tắc
Khi chấm một hỗn hợp các acid amin lên một tờ giấy lọc rồi nhúng đầu tờ
giấy vào một dung môi thích hợp (phenol, butanol, …) thì dung môi sẽ thấm trên tờ
giấy và kéo theo các cấu tử trong hỗn hợp trên chiều dài của tờ giấy. Mỗi acidamin
có một hệ số phân bố riêng giữa pha di động vàpha tónh. Kết quả là hỗn hợp acid

amin được phân tích ra thành từng acid amin riêng biệt.
Dùng thuốc thử phun lên giấy, sẽ thể hiện màu tại các vết ứng với các chất.
Ta sẽ nhận được vò trí của từng acid amin được tách ra khỏi hỗn hợp. Trong những
điều kiện nhất đònh (dung môi, nhiệt độ, loại giấy, …), tốc độ di chuyển của dung
môi và các cấu tử của hỗn hợp được đặc trưng bởi hệ số Rf.
Rf =( khoảng dòch chuyển của cấu tư)û/ (khoảng dòch chuyển của dung môi)
Cách tiến hành
Nguyên liệu, hóa chất, thiết bò
Nguyên liệu: Các acid amin chẩn (hỗn hợp MI): dung dòch nguyên cứu
Thiết bò: Bình sắc ký, giấy chạy sắc ký: Whatman – 1
Hóa chất: Dung môi cho sắc ký thường là hỗn hợp nhiều chất khác nhau.
Ví dụ: butanol: acid acetic: H2O với tỉ lệ 5:2:3.
Thuốc thử Sakaguchi I:
α Naphtol

0,01

Ure

5g

Cồn

10ml

Thuốc thử Sakaguchi II:
Brome

2g

NaOH 5%

10ml

Thuốc thử Isatin:
25