tìm hiểu Hệ NZYME BROMELIN

Công nghệ enzyme

Enzyme Bromelin

Enzyme Bromelin
I. Đặc điểm nguồn nguyên liệu và bromelin [1]
1. Đặc điểm nguồn nguyên liệu
Cây dứa (Ananas comusus) thuộc lớp đơn tử diệp, họ Bromeliaceae có nguồn
gốc từ Nam Mỹ. Hiện nay, ở nước ta loại dứa được trồng nhiều nhất là Ananas
comusa được sử dụng như nguồn thực phẩm tươi, đóng hộp, nguồn thu nhận
enzyme và ngoài ra còn được sử dụng trong một số lónh vực khác như dược, mỹ
phẩm ... Phần thân và lá sau khi thu hoạch quả có thể được sử dụng làm giấy, lấy
sợi hoặc làm phân bón.
Trong quả dứa chín, nước chiếm đa số, hàm lượng 80 – 86%, phần còn lại là
carbonhydrate chiếm 10 – 18% (trong đó 60 – 67% saccharose, glucose và fructose
chiếm 30 – 40%), protein 2 – 3%, acid hữu cơ 0.1 – 1.6% (trong đó citric acid
chiếm 87% và 13% còn lại là maleic acid ), tro 0.3%, sắc tố 0.03 – 0.6% và các
hợp chất phenolic (tạo màu), các hợp chất tạo mùi, các vitamin như: vitamin A, B 1
và C và enzyme bromelin là một enzyme thủy phân protein. Ngoài ra ở lá non trên
ngọn thân cây dứa có chứa rất nhiều vitamin C.
2. Đặc điểm của enzyme bromelin
Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfhydryl,
có khả năng phân giải protein được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt là ở cây
dứa (thân và trái).
Trước đây, cây dứa được sử dụng như một loại cây làm thuốc. Năm 1957,
Heinicke nhận thấy trong thân cây dứa có một lượng lớn bromelin và người ta bắt
đầu chiết tách nó và sản xuất dưới dạng thuốc để chữa bệnh. Tùy theo nguồn thu
nhận mà người ta phân biệt bromelin thân hay bromelin quả và bromelin thân là
nhóm enzyme có giá trò kinh tế. Ở mỗi bộ phận khác nhau trên thân cây dứa,
bromelin có pH tối ưu khác nhau và có cấu tạo khác nhau.
Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa. Nó khả năng thủy phân khá

mạnh và hoạt động tốt ở pH 6 – 8. Bromelin có hoạt tính xúc tác sự phân giải
protein tương tự như papain trong mủ đu đủ hay ficin trong cây thuộc họ Sung.
Enzyme bromelin có trọng lượng phân tử khoảng 33000 Da, lớn gấp 1.5 lần so với
papain.

1


Công nghệ enzyme

Enzyme Bromelin

Thòt quả dứa chỉ có hoạt tính enzyme bromelin kể từ 3 tháng trước khi chín,
trong đó hoạt tính bromelin cao nhất là khoảng 20 ngày trước khi chín. Khi trái chín
hoạt tính bromelin giảm xuống nhưng không mất hẳn.
Bromelin còn có thể thu được từ trong thân dứa (trung bình có thể thu được
3.6 kg bromelin từ 378l nước rút ra từ thân cây dứa).
II. Tính chất của enzyme bromelin [1]
Thành phần chủ yếu của bromelin có chứa nhóm sunfhydryl thủy giải
protein. Trong dòch chiết bromelin còn chứa một ít peroxydase, phosphatase acid
và chất cản protease. Khi chiết tách và tinh sạch phân đọan có chứa nhóm
sunfhydryl của bromelin thì thu được một enzyme thủy phân protein hiệu quả
invitro, nhưng lại bò bất hoạt sinh lý invitro ở một số điều kiện mà bromelin có hiệu
quả. Như vậy, rõ ràng rằng phần lớn các hoạt động sinh lý của bromelin không chỉ
phụ thuộc vào phân đọan có hoạt tính thủy phân protein mà nó còn phụ thuộc vào
nhiều yếu tố khác trong bromelin.
Hiện tại người ta ghi nhận được trong bromelin thân dứa có tám thành phần
cơ bản có hoạt tính thủy phân protein. Hai thành phần chính được gọi là F4 và F5.
Phân đoạn có hoạt tính mạnh nhất là F9 chiếm khoảng 2% protein trên tổng số.
Người ta ước tính rằng khoảng 50% protein của F4 và F5 là glycosylate, trong khi

đó ở F9 không có glycosylate. pH tối thích của các phân đoạn F4 và F5 là 4 – 4.5
và của F9 thì gần với pH trung tính. Dòch chiết bromelin toàn phần có hoạt động
trong khoảng pH 4.5 – 9.8. Bromelin được chiết tách từ các thành phần khác nhau
trên cây dứa và bromelin từ những nguồn khác nhau sẽ có hoạt động sinh lý khác
nhau nhưng hoạt tính thủy phân protein thì giống nhau. Bromelin không ổn đònh với
nhiệt độ do đó các hoạt động sinh lý của nó sẽ giảm đi nếu quá trình chiết tách hay
bảo quản không thích hợp.
Bromelin có thể thấm hoàn toàn qua dạ dày và ruột của động vật. Nồng độ
cao nhất của bromelin được tìm thấy trong máu sau khi ăn một giờ, tuy nhiên hoạt
động thủy phân protein của nó bò bất hoạt nhanh chóng có là do tác động của các
protease nội sinh và yếu tố α – 2 – macroglobuline của huyết thanh.
1. Cấu tạo hoá học
Bromelin thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác
như papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3
manose, 2 glucosamine, 1 xylose và 1 fructose. Sợi hydrate carbon này liên kết
hoán vò với sợi polypeptide. Trong sợi hydrate carbon này dường như một nửa sợi
không liên quan đến cơ chế xúc tác của phân tử. Người ta đề nghò cấu trúc sợi
hydrate carbon của phân tử bromelin như sau:
2


Công nghệ enzyme

Enzyme Bromelin

OH

OH
OH
Fructose

OH
OH
Maltose

CH2 OH
CH2

OH
OH

OH
OH

Maltose

Glucofamine

CH2 OH

Maltose
CH2 OH

NHCONH3

OH
OH
Xylose

C

NHCOCH2 CH

OH

OH

N

NHCONH3

Hình 1 - Cấu trúc sợi hydrate carbon của bromelin
Khi phân tích thành phần amino acid ở bromelin thân và bromelin quả thì
tuỳ theo phương pháp thu nhận và phương pháp phân tích mà có thành phần amino
acid thay đổi khác nhau. Bromelin có thành phần acid thay đổi trong khoảng 321 –
144 amino acid và bromelin quả là 283 – 161 amino acid.
Bromelin thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amine và valine
và ở đầu carbon hydrate là glycine, còn bromelin quả có amino acid ở đầu amine
là alanine.

3


Coâng ngheä enzyme

Enzyme Bromelin

Aminoaciad

Thaân

Quả xanh

Quả chín

29 - 29.4

29.8

29.8

23

23.2

23.4

Glycine

24.6 - 35

32.6

32.2

Alanine

35 - 35.4

23.8

24.4

Valin

21.6 - 22

19.8

20.1

Leucine

10

10

10

Threonin

21 - 21.2

16.4

16.2

Cysteine

28 - 28.2

32.2

32

Methionine

13.6 - 14

13.5

13.8

Proline

14 - 14.2

11.6

12.1

8.8 - 9

7.6

8

20.8 - 21

22.4

22.2

Tryptophan

8 - 8.1

5.6

-

Hystydine

1.9-2

1.4

1.3

Lysine

22.9 - 23

7.8

8.3

Arginine

11.5 - 12

8.6

9.1

Amid

41.6 - 42

43

43.4

Glucosamine

5.8 - 6

0.2

0.2

Carbohydrate

1.46

3.2

3.2

Aspatic acid
Glutamic acid

Phenylalanine
Tyrosine

Bảng 1 - Thành phần hóa học của quả dứa

4


Công nghệ enzyme

Enzyme Bromelin

2. Cấu trúc không gian của bromelin
Murachi và busan phân tích cấu trúc bậc 1 cua bromelin và nhận thấy cách
sắp xếp amino acid trong phân tử bromelin như sau:
Ser - Val - Lys - Asn - Gln - Asn - Pro - Cys - Gly - Ala - Cys - Tryp - Gly - Cys - Lys -

Bromelin là một protease trong tâm hoạt động chứa cysteine và hai sợi
polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối – S – S –. Phân tử có dạng hình cầu do
có cách sắp xếp phức tạp.
Trong phân tử bromelin thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu trong
hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài ra, trong
phân tử có các ion Zn2+ có lẽ vai trò trong duy trì cấu trúc không gian của enzyme.
3. Tính chất vật lý
Các nghiên cứu về tính chất vật lý của bromelin thân dứa được Murachi và
cộng sự nghiên cứu và công bố vào năm 1964 như sau:
Hằng số sa lắng

S

2.73s

Hằng số khuếch tán

D

7.77x10-7 cm2/s

Thể tích riêng phần

V

0.743mI/g

Độ nhớt bên trong

[I]

0.039dI/g

Tỷ số ma sát

f/fo

1.26

Pi

9.55

A1%cmở 280nm

20.1

Điểm đẳng điện
Sự hấp thu
Trọng lượng phân tử

32200
32100
32500

Bảng 2 – Những tính chất vật lý của Bromelin thân
*

Tính bằng phương pháp sa lắng

**

Tính bằng phương pháp sa lắng và độ nhớt bên trong

*** Tính bằng phương pháp Archibald
4. Hoạt tính của bromelin
5


Công nghệ enzyme

Enzyme Bromelin

a. Hoạt tính phân giải của bromelin
Bromelin có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase.
Bromelin thân có nhiều chất tự nhiên và có thể thuỷ phân được cơ chất tự nhiên
lẫn cơ chất tổng hợp.
Hoạt tính phân giải casein (UI/mg)

Cơ chất

Bromelin thân
BAA

Bromelin quả xanh Bromelin quả chín

7.4

4.0

3.0

Bảng 3 – Hoạt tính phân giải casein của Bromelin
Khả năng phân giải cơ chất nhân tạo cuả bromelin
Cơ chất
BAA

Hoạt tính phân giải casein (UI/mg)
Bromelin thân

Bromelin quả xanh Bromelin quả chín

3.7

9.1

7.2

Bảng 4 - Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide(BBA) của bromelin

Bromelin thân

BAA

BAEE

BAEM

1.2x 10-3

1.7x10-1

3.2x10-2

Bảng 5 - Hằng số Michaelis với các cơ chất tổng hợp khác nhau
Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelin thân cao hơn
bromelin quả xanh và bromelin quả chín.
So với BAA, hằng số xúc tác của bromelin thân trên BAEE cao hơn gấp 140
lần. Sự khác biệt này có lẽ do cơ chế xúc tác khác nhau.
b. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelin
Giống như các cấu trúc xúc tác sinh học khác, bromelin chòu ảnh hưởng của
các yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim

loại, một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh khiết ...
Các yếu tố như nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúc
tác của bromelin không ổn đònh mà phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu
tố khác như: bản chất cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, thời gian phản
ứng, sự có mặt của các chất hoạt hoá ....

6


Công nghệ enzyme

Enzyme Bromelin

 Ảnh hưởng bởi cơ chất: trên những loại cơ chất khác nhau, bromelin có
hoạt tính khác nhau. Nếu là cơ chất hemoglobin thì khả năng phân giải của
bromelin mạnh hơn papain 4 lần, nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của bromelin
tương tự như papain. Đối với các cơ chất tổng hợp như BAA (Benzoyl – L –
Arginine amide), BAEE (Benzoyl – L – Arginine ethyl ester) thì khả năng phân
giải của bromelin yếu hơn papain.
 Ảnh hưởng bởi nhiệt độ : nhiệt độ của phản ứng xúc tác chòu ảnh hưởng
bởi nhiều yếu tố: thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm
ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn
tại của enzyme.
Ở dịch chiết quả (pH = 3.5) khi tăng nhiệt độ lên đến 60oC thì bromelin vẫn
còn hoạt tính nhưng bromelin tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ. Ở 5oC, Ph 4 -10 thì
enzyme giữ hoạt tính tối đa trên casein trong vòng 24 giờ. Ở 55 oC, pH 6.1 thì
enzyme bò mất 50% hoạt tính trong vòng 20 phút. Quá trình đông khô làm mất 27%
hoạt tính.

 Ảnh hưởng của độ pH: pH là hoạt tính quan trọng nhất ảnh hưởng tới hoạt

tính xúc tác của enzyme. pH tối thích của bromelin không ổn đònh mà tùy thuộc
vào nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của
enzyme, bản chất của dung dòch đệm, sự hiện diện của chất tăng hoạt.
Khi thu nhận beo thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là ammonium sulfate hoặc
molypdeum carbonate thì enzyme có hoạt tính cao nhất ở pH 4.8 và ổ đònh ở pH
4.6 – 5.4. Bromelin thân đã được tinh sạch một phần có hoạt tính cao nhất ở pH 6.0
và pH 8.0, ổn đònh ở pH 3.5 – 5.6 với nhiệt độ 63 oC. Enzyme bromelin đã tinh sạch
chỉ còn lại 60 - 70% hoạt tính.

 Ảnh hưởng bởi các ion kim loại : các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt
tính của enzyme do chúng tường gắn vào các trung tâm hoạt động của enzyme.
Muối thủy ngân có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính của enzyme bromelin và
mức độ kìm hãm thay đổi theo nồng độ muối.
Ngoài ra, còn có những chất có tác động ức chế bromelin do chúng kết hợp
với nhóm - SH của trung tâm phản ứng của enzyme.

7


Công nghệ enzyme

Enzyme Bromelin

 Ảnh hưởng bởi trạng thái và điều kiện bảo quản:
Hoạt tính (UI/protein)
Dịch chiết

Đơng khơ

Ngun liệu tươi

1600

1150

Bảo quản ở 4oC trong 5 ngày

830

630

Sấy khơ ở 4oC

1880

1360

Bảng 6 – nh hưởng của trạng thái và điều kiện
III. Phương pháp thu nhận và tinh sạch bromelin [1]
1.

Phương pháp thu nhận tủa bromelin thơ

Enzyme bromelin có thể được thu nhận trong thân, trong phần thòt quả và
trong chồi quả. Việc thu nhận và tinh sạch bromelin có thể thực hiện theo sơ đồ
sau:
Bã
Quả/thân/chồi dứa

Xay nhuyễn

Lọc

Dịch lọc

Ly tâm
Dịch ly tâm
Kết tủa

Sản Phẩm
enzyme tinh khiết

Tinh sạch

Sấy khơ

Chế phẩm bromelin thơ

Hình 2 - Quy trình tổng quát thu nhận và tinh sạch enzyme bromelin
a. Thu dòch enzyme thô
Quả dứa hoặc thân được xay nhuyễn, vắt kỹ, lọc bỏ bã và thu dòch lọc, ly
tâm dòch lọc với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ chất sơ sẽ thu được
dòch chiết có chứa bromelin.
Tuy nhiên, khi sử dụng phương pháp siêu lọc để tinh sạch enzyme bromelin
thì các hợp chất pectin trong dòch chiết quả sẽ làm tăng độ nhớt của dòch chiết làm
trở ngại cho quá trình lọc. Các nhà khoa học đã tìm ra phương pháp đồng hoá
nguyên liệu dưới điều kiện áp suất cao thì có thể phá vỡ tế bào mô dứa, giảm độ
nhớt của dòch chiết, phóng thích các enzyme nội bào mà không làm biến tính
chúng.
Theo như nghiên cứu này thì khi đồng hoá nguyên liệu ở 15Mpa độ nhớt
trong dòch chiết giảm xuống, giá trò của độ brix và pH thay đổi không đáng kể, sản

8


Công nghệ enzyme

Enzyme Bromelin

lượng và hoạt tính của enzyme gia tăng. Ở 15Mpa, sản lượng enzyme tăng gấp hai
lần (1.27g/500ml dòch chiết từ quả dứa kể cả phần lõi) với hoạt tính cao nhất là
2.06UI/mg so với khi đồng hoá ở điều kiện bình thường và ở 20Mpa thì sản lượng
enzyme thu được từ vỏ quả là 0.9g/500ml dòch chiết. Vậy đồng hoá mẫu dưới áp
suất cao có thể làm giảm độ nhớt của dòch chiết giúp việc sử dụng phương pháp
siêu lọc thuận lợi hơn, đồng thời làm tăng sản lượng và hoạt tính của enzyme
bromelin từ quả dứa và các phế phẩm của nó.
b. Các phương pháp thu tủa bromelin thơ
 Phương pháp kết tủa
Nguyên tắc: điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn pH 7, do đó trong
điều kiện sinh lý, các phân tử protein có tích điện âm thừa này đã kết hợp với các
đầu mang điện tích dương của phân tử nước hữu cực (ở trong dung dòch, protein liên
kết với một lượng nước khá lớn) cũng như các ion dương. Sự kết hợp với nước tạo
ra một lớp nước xung quanh phân tử protein và cản trở sự kết tủa của chúng. Đối
với enzyme protein cũng như các protein enzyme khác, để có thể kết tủa được
enzyme, điều cần thiết là phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân tử này
bằng cách bổ sung vào dung dòch protein enzyme các dung môi hoặc các hoá chất
ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn protein để lôi kép nước ra khỏi phân tử
protein đó, giúp cho protein tủa xuống.
Các dung môi thường được sử dụng để kết tủa bromelin là acetone và
ethanol, còn có các hoá chất khác như muối trung tính ở nồng độ cao cũng có thể
kết tủa được enzyme. Ammonium sulfate là loại muối trung tính có độ hoà tan rất
tốt do đó ở dung dòch bão hoà của muối này thì tất cả protein đều tủa.

Hình 3 – Các phân tử enzyme trong dung môi hữu cơ
Heinicker và Gortner đã dùng acetone để kết tủa bromelin từ thân và trái.
Bromelin trong dung dòch nước rất nhạy cảm với các dung môi hữu cơ do đó để sự
kết tủa đạt hiệu quả cao thường tiến hành quá trình kết tủa trong điều kiện lạnh.
Như vậy nước từ thân và trái dứa phải được làm lạnh ở 0oC đến 4oC và acetone tinh
9


Công nghệ enzyme

Enzyme Bromelin

khiết ở 20oC ethanol cũng được sử dụng để kết tủa protein và hỗn hợp bromelin –
ethanol cũng phải được giữ ở điều kiện nhiệt độ lạnh. Sau khi thu được kết tủa, tủa
bromelin phải được rửa bằng acetone và làm khô thật nhanh để bromelin không bò
biến tính.
Renée Tisseau đã sử dụng ammonium sulfate với nồng độ bão hoà là 0.7
(70% bão hoà) để làm tác nhân kết tủa bromelin. Sự kết tủa với các tác nhân
ammonium sulfate (đặc biệt ở nhiệt độ thấp) là một quá trình thuận nghòch, tủa dễ
dàng hoà tan bằng nước và muối có thể được loại ra khỏi protein bằng cách thẩm
tích. Phương pháp này có thể thực hiện ở nhiệt độ thường. Để có thể thu nhận
enzyme, việc đầu tiên là phải phá vỡ tổ chức mơ có chưá enzyme bằng cách nghiền
mơ để thu dịch chiết có chưá Bromelin rồi sau đó dung các tác nhân khác nhau để kết
tuả bromelin. Những yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng cuả chế
phẩm enzyme đó là :
 Nồng độ cuả ammonium sulfate
 pH cuả dung dịch chiết
 Nhiệt độ kết tuả
 Thời gian tiếp xúc cuả tác nhân đệm và dịch tiết

Thơng thường nếu sử dụng phương pháp kết tuả với ammonium sulfate thì cứ
60kg ngun liệu tươi sẽ thu được khoảng 1kg bromelin thơ.
Cách làm
Tuả bằng muối ammonium sulfate: chuẩn bị 1lít dung dịch nước dứa sau li
tâm,cho từ từ 532g ammonium sulfate vào và khuấy đều (dung dịch đạt độ bão hồ
ammonium sulfate là 70%). Để n ở nhiệt độ phòng 10-15 phút, sau đó ly tâm với tốc
độ 6000 vòng /phút trong 5 phút để thu nhận tuả.
Tuả bằng ethanol: làm lạnh dung dịch nước dứa sau ly tâm, cho ethanol 96 o
(cũng đã được làm lạnh ) vào theo tỷ lệ 4 : 1(4 nước dứa,1 cồn ), trộn đều để ở 0 oC
trong 3 - 4giờ. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút. Rồi tuả bằng
acetone và thu nhận tuả.
Tuả bằng acetone: Thêm một thể tích acetone lạnh hoặc 20% acetone lạnh vào
một dung dịch nước dứa sau ly tâm. Để n trong một giờ ở nhiệt độ 0 - 4 oC. Ly tâm
với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ tuả. Thêm hai thể tích acetone lạnh
vào để một giờ ở 0 - 4oC, ly tâm thu tuả và rửa tuả bằng acetone lạnh.

10


Coâng ngheä enzyme

Enzyme Bromelin

Phế liệu của dịch quả dứa
Xay nhiễn để phá vỡ tổ chức
mô ly tâm,làm lạnh ở 0-4oC
Dịch nước dứa sau ly tâm
Etanol(4:1)
Làm lạnh hoãn
hợp trong 4-5

giờ

(NH4)2SO4
70% bão hòa

Acetone 20%
(1:1)
Làm lạnh hỗn
hợp trong 1giờ

Để hỗn hợp ở
nhiệt độ phòng
ttrong 30 phút

Ly tâm bỏ tủa
Acetoan lạnh(2:1)
Ly tâm thu tủa

Sấy khô
BRO-EtOH

Ly tâm thu tủa

Ly tâm thu
tủa

Sấy khô

Sấy khô

BRO-A

BRO-N

Hình 4 - Sơ đồ thu tủa bromelin bằng phương pháp kết tủa
 Phương pháp hấp phụ
Có nhiều chất được sử dụng làm chất hấp phụ enzyme. Có thể sử dụng kaolin
hay betonite để hấp phụ bromelin. Trình tự thực hiện tương tự nhau.
Kaolin là một chất có tính hấp phụ tốt. Kích thước hạt nhỏ hơn 1µm do đó diện
tích tiếp xúc giữa hạt kaolin và chất bị hấp phụ tăng lên rất nhiều. Một lí do khác dẫn
đến khả năng hấp phụ vật chất của kaolin cao là do trên bề mặt kaolin có rất nhiều ion
OH- và O2-, những ion này có khả năng liên kết tương đối bền vững với chất bị hấp
phụ.
Cách làm: Cho kaolin khô (hoặc đã ngâm cho trương nở) vào dung dịch nước
dứa sau ly tâm với tỉ lệ 25mg kaolin/ml dung dịch nước dứa. Khuấy đều bằng máy
khuấy từ, sau đó ly tâm để thu tủa. Tủa được gọi là bromelin - kaolin.

11


Công nghệ enzyme

Enzyme Bromelin

Hình 5 – Cấu tạo của kaolin

Phế liệu của dịch quả dứa
Xay nhiễn để phá vỡ tổ chức
mơ ly tâm,làm lạnh ở 0-4oC
Dịch nước dứa sau ly tâm

Khuấy 30 phút

Ly tâm thu tủa

Dung dịch
nước dứa 2

Sấy khơ

BRO-K

Hình 6 - Sơ đồ thu tủa bromelin bằng phương pháp hấp phụ
 Phương pháp siêu lọc
Siêu lọc là q trình dung dịch lỏng chảy qua một màng lọc dưới một áp suất để
tách phân đọan các thành phẩn trong chất lỏng đó. Sự phân chia các phân đoạn phụ
thuộc vào kích thước lỗ trên màng và tùy theo trọng lượng phân tử của chất thấm qua.
Tùy theo kích thước của lỗ trên màng mà sau khi thực hiện q trình siêu lọc sẽ thu
được nước và những chất có phân tử nhỏ còn những chất có phân tử lớn sẽ bị giữ lại
trên màng.
Dung dịch enzyme thu được từ ngun liệu thực vật sẽ có chưá những tạp chất
có trọng lượng phân tử khác nhau. Đầu tiên sẽ sử dụng phương pháp lọc để loại trừ
các chất bẩn. Sau đó chuyển sang phương pháp siêu lọc thì sẽ loại được các chất có
trọng lượng phân tử thấp hơn các protein, enzyme và đồng thời cơ đặc được enzyme.
Màng siêu lọc được cấu tạo bởi các sợi rỗng. Trong mỗi sợi rỗng lại có nhiều
sợi rỗng xếp song song và gắn chặt với lớp ngoài tạo thành những lỗ để các chất thấm
qua. Các sợi này được chế tạo từ các lọai polime bền như fluoro polime (FS),
Cenlulose acetate (CA), polysulphone (GR)… Tùy theo mục đích cụ thể mà người ta
sử dụng lọai màng thích hợp. Ví dụ, cơ đặc protein (dung màng FS, GR); Cơ đặc
enzyme (dung màng GR).

12


Coõng ngheọ enzyme

Enzyme Bromelin

Hỡnh 7 Loùc cross - flow
Cỏc yu t nh hng n quỏ trỡnh siờu lc
Trong quỏ trỡnh siờu lc cn chỳ ý n cỏc yu t sau:
Nhit : Nhit phi thớch hp vi sn phm v lai mng s dng. Khi chn
nhit s dng cn lu y n kh nng kt ta ca protein v s tng nhit trong
quỏ tỡnh siờu lc vỡ quỏ trỡnh ny cú th lm bớt mng.
p sut: Thng tc ca dũng chy (s lớt cht lng qua 1m2 mng trong mt
gi) s tng cựng vi s gia tng ỏp sut cho n khi t n giỏ tr (tc ) cc i.
Nu apsuaast tng lờn cao hn na thỡ dũng chy s gim. Ngi ta ngh tc
dũng chy nờn c iu chnh t 4 - 5 lớt/phỳt, tng ng vi hiu sut PI1 - PI2
trong khang 0.5 - 3bar. p sut dũng vo ln nht (PI 1max) l 7bar (tng ng
102Psi), apsuaast dũng ra nh nht (PI2min) l 0.5 baz (tng ng 7.25Psi).
Cỏc kiu siờu lc : cú ba kiu h thng siờu lc
- Kiu mt bc ( single pas operation)

Hỡnh 8 - Kiu mt bc
- Kiu lụ (batch operation): Cht lng c tun hon qua mng n nng
ca dch cụ c trong chu cha t c nh yờu cu .

13


Coâng ngheä enzyme

Enzyme Bromelin

Hình 9 - Kiểu lô
- Kiểu thể tích không đổi (constant volume operation): Dòng chất lỏng được
cung cấp liên tục để thể tích ở trong chậu chứa không thay đổi và chất lỏng được tuần
hoàn qua màng đến nồng độ dung dịch cô đặc ở trong chậu chứa đạt được như yêu
cầu.

Hình 10 - Kiểu thể tích không đổi
Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc
Có thể lựa chọn màng thích hợp với từng mục đích cụ thể.
Đối với enzyme: Enzyme có thể cô đặc 25 lần mà không bị mất hoạt tính.
Quá trình siêu lọc vừa làm cô đặc, vừa tinh sạch được enzyme. Trong quá trình
thực hiện nếu thêm nước vào thì độ tinh sạch của enzyme càng cao.
Trong quá trình siêu lọc, nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính của enzyme, do
đó nhiệt độ 10 - 20oC được xem là khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho năng xuất mà
không làm mất hoạt tính enzyme. Quá trình siêu lọc có thể thực hiện tốt ngay ở nhiệt
độ thấp (5oC).
Cách làm: Sử dụng màng FS 50PP có giá trị loại trừ (cut-of) 30.000, diện tích
màng 366cm2.

14


Coõng ngheọ enzyme

Enzyme Bromelin

Dch nc da sau li tõm c cho qua siờu lc, trong quỏ trỡnh ny cho nc

ct vo tinh sch v thu c dung dch cụ c. Thu nhn ta bng cỏch s dng
acetone hoc sy thng hoa dung dch cụ c.
Ph liu ca dch qu da
Xay nhin phỏ v t chc
mụ ly tõm,lm lnh 0-4oC
Dch nc da sau ly tõm

Mng siờu lc

Dch cụ c

Cụ ụng

Dch thm qua mng
dựng l siroo, ru,
acid citric
Ly tõm thu ta vi
acetone lnh (2:1)

Sy khụ

BRO-SL

BRO-SL

Hỡnh 11 - S thu nhn bromelin bng phng phỏp siờu lc
Phng phỏp thu ta bng carboxyl methyl cellulose CMC).
Phng phỏp tỏch bromelin bng CMC cho phộp thu c bromelin dng bt
trng cú hoaùt tớnh cao, thi gian nhanh v n gin hn so vi cỏc phng phỏp khỏc.
Cụng ngh ch to CMC: CMC c ch to t vi mn, bụng, vi gc lai t.

Cõn 300g bụng hay vi mn hay gc ngõm trong 2000 ml dung dch NaOH 45% trong
10 phỳt, thnh thong trn u monochloacetic 15% cho vo thnh 4 ln, va cho va
o trn u. un cỏch thu hn hp 60 oC trong thi gian 30 phỳt. Sau ú lm lnh
bng nc ỏ n khi dung dch cú mu vng. Thờm vo ú 100 ml dung dch acid
acetic 10% t t tng ớt mt. Sau 2 gi pha loóng vi nc ct n 20 lớt. yờn, gn
b ri thờm nc nh trờn n phn ng trung tớnh. Nu cũn kim thỡ ngõm tip vi
dung dch acid aceti, ri ra loi acid. Ngõm trong H 2SO4 0.1N trong thi gian 48 gi,
15


Coâng ngheä enzyme

Enzyme Bromelin

sau đó rưả bằng nước cất đến pH trung tính, sấy khô ở 50 oC. Quá trình phản ứng xảy
ra như sau:
Vải màn

NaOH

Alcalicellulose

ClCH2COOH

Carboxyl methyl cellulose(CMC)

Tách chiết bromelin từ dịch chiết dứa bằng CMC
CMC vải màng được tẩm ướt bằng dung dịch đệm phosphat 0,005M, pH = 6.1,
sau đó cho dịch chiết dứa vào thỉnh thoảng khuấy trộn. Sau 2 giờ tháo ra vắt kiệt,vẩy
sạch chất bẩn bám vào CMC. Rửa protein bằng đệm phosphat 0.05M, pH = 6.5. Sau

đó tiến hành phản ứng hấp phụ lần thứ nhất,cho dung dịch phản ứng hấp phụ là đệm
phosphat 0.05M, pH 7.1 và NaCl ), 5 khuấy trộn 3 - 4 lần. Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt thì
thu được dung dịch đậm đặc chứa bromelin. Tiếp tục phản ứng hấp phụ lần thứ hai
như lần thứ nhất. Sau đó gộp cả dịch chiết lại và tuả bằng aceton hay cồn lạnh để tách
lấy enzyme.
Với phương pháp thu này hiệu suất đạt được 0.1% so với chồi dứa tươi và có
hoạt tính 24 nk/mg chế phẩm enzyme. So với tủa (NH 4)2SO4 thì độ sạch cuả chế phẩm
enzyme cao hơn hai lần, thời gian nhanh hơn và tiến hành thuận lợi hơn.
2. Phương pháp tinh sạch enzym bromelin
Enzym bromelin được tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích, lọc qua
Sephadex, phương pháp sắc ký.
a. Tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích
Cân 1 gam enzym thô, pha trong 10 ml dung dịch đệm sodium phosphate 0.03M
có pH 7.2. Sau khi tất cả enzym đã hoà tan thì cho hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt
túi vào cốc có chứa 1 lít dung dịch đệm sodium phosphate 0.03M, pH 7.2. Túi
cellophane được chuẩn bị bằng cách trước khi dùng được trán đầy bằng dung dịch
đệm tương như trên. Tiến hành thẩm tích trong 6 giờ và cứ hai giờ thay dung dịch đệm
bên ngoài một lần. Dung dịch đệm phiá ngoài túi được khuấy liên tục bằng một máy
khuấy từ.
Trong quá trình thẩm tích, khi thay đổi nhiệt độ trong một giới hạn nhất định thì
vận tốc khuếch tán sẽ tăng theo sự gia tăng nhiệt độ. Nhưng nếu sự gia tăng nhiệt độ
vượt qua mức cho phép thì protein enzyme sẽ bị biến tính do nhiệt độ cao làm ảnh
hưởng đến những mối tương tác giúp cho sự ổn định cấu trúc enzyme. Chính vì vậy,
để làm giảm sự biến tính cuả enzyme do nhiệt, người ta thường tiến hành tinh sạch
enzyme ở nhiệt độ thấp.
b. Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex
 Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-50
Sephadex G-50 được đun cách thuỷ ở 100 OC trong một giờ rồi nhồi vào cột
(kích thước cột 23.5x0.9cm). Đặt một cái phễu thuỷ tinh phía trên cột, cho sephadex từ
từ vào phễu và khuấy liên tục. Các hạt sẽ lắng từ từ xuống cột, chú ý phải khuấy từ từ

16


Coâng ngheä enzyme

Enzyme Bromelin

đến khi nhồi xong cột. Khi nhồi cột phải cố gắng nhồi sao cho nồng độ hạt đồng nhất
và không có bọt khí. Trong quá trình nhồi cột vẫn phải xả cột trong một giờ, với vận
tốc khoảng 1ml/7 phút.
Cân 100 mg enzym thô hoà vào 1ml dung dịch đệm sodium phosphate 0.03M,
pH 7.2. Khi enzyme đã hoà tan hoàn toàn thì cho từ từ enzyme vào cột.cho dung môi
phân ly enzyme qua cột và điều chỉnh tốc độ chảy khoảng 2ml/7phút. Loại bỏ 5ml
đầu tiên rồi mới bắt đầu thu dịch enzyme. Dịch enzym thu nhận được làm đông khô.
Quá trình lọc enzyme qua sephadex G-50 nên được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ
thấp do nhiệt độ thấp có thể giảm thiểu sự biến tính của enzyme. Quá trình lọc enzyme
qua sephadex diễn ra trong khoảng thời gian một giờ.
 Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-100
Sephadex G-100 được đun cách thủy ở 100oC trong 5 giờ, sau đó nhồi vào cột
kích thước 28x1cm. Thực hiện nhồi cột tương tự như thực hiện với sephadex G-50.
Sau khi hoàn tất việc nhồi cột, cho dung dịch đệm sodium phosphate 0.03mg pH 7.2
chảy qua cột khoảng 3 - 4 giờ để cân bằng cột.
Cân 100 mg enzyme thô hoà vào 1ml dung dịch đệm như trên rồi cho vào cột.
Chỉnh cho tốc độ của dung môi phân ly enzyme là 1ml/5 phút. Thu từng phân đoạn
enzyme (mỗi phân đoạn là 3 ml) và đo OD ở bước sống 280 nm. Tính trọng lượng của
phân tử enzyme theo công thức: LgM=5.941 – 0.874 Ve/Vo
Trong đó: Vo = 40%Vt (Vt: thể tích tổng cộng cuả cột )
Ve: Thể tích dung môi phân ly enzym được tính từ lúc cho mẫu vào
đến khi thu nhận mẫu.
 Tinh sạch bromelin bằng phương pháp sắc kí

Bromelin thân được cho chạy sắc kí trên Duolite CS101 ở pH 6.05 cho hai phân
đoạn khác nhau về điện tích với hoạt tính xúc tác phân giải BAEE, casein và glucagon.
Sắc ký bromelin thân trên Bio rex ở pH 6.1 sẽ thu được 5 phân đoạn khác nhau
về thành phần aminoacid. Khi sắc ký trên sephadex G-75 cũng nhận được 5 thành
phần có hoạt tính enzyme. Trọng lượng phân tử của 5 thành phần này khoảng 17800
đến 20000 Dalton.
Bromelin thân và bromelin quả thô được cho chạy sắc ký gel trên sephadex G75, tiếp theo sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên sulfo ethyl sephadex chỉ
cho một phân đoạn protein đơn có hoạt tính phân giải protein. Còn nếu sắc ký hoán vị
gel ở pH 7 rồi sau đó sắc ký trao đổi trên sulfo ethyl sephadex cho thấy sự hiện diện
của hai protease riêng biệt được đặt tên là bromelin II và III, hai protease này có tốc
độ di chuyển khác nhau khi điện di trên polyacrylamide ở pH 9.5.
Bromelin thân: khi dùng sắc ký gel trên sephadex G-50 và sắc ký trao đổi ion
trên DEAE - cellulose thì thấy có một thành phần chính và 5 thành phần phụ.
Bromelin quả: khi sắc ký trên DEAE-cellulose và sulfo ethy sephadex thì thấy
có một thành phần chính và hai thành phần phụ.
17


Công nghệ enzyme

Enzyme Bromelin

IV. Ứng dụng của enzyme Bromelin:
1. Vai trò hỗ trợ tiêu hóa
Bromelin là enzyme phân hủy chất protid ly trích từ thơm bao gồm một
nhóm enzyme tiêu hóa, có đặc tính giúp tiêu hóa nhanh các chất protein. Bromelin
có thể ly trích từ thơm dưới dạng tinh khiết hoặc cung cấp cho cơ thể từ các loại
thực phẩm có thêm thơm trong thực đơn nấu nướng. Vì vậy thơm được đưa vào thực
phẩm để làm mềm thòt. Trái ngược với một số enzyme khác, thường bò phân hủy
trong môi trường tiêu hóa, bromelin được hấp thu từng phần và đi vào máu, tạo nên

tác động tiêu hóa protein. Khi dùng thuốc viêm bromelin cải thiện việc tiêu hóa thì
nên dùng giữa bữa ăn.
2. Giảm đau và phù nề sau phẫu thuật hoặc sau chấn thương
Theo một nghiên cứu được công bố vào năm 1995 tại Đức trên 59 người thử
nghiệm bò đau do giập cơ, người ta thấy có giảm đáng kể hiện tượng sưng phồng và
đau. Dùng bromelin điều trò ở xoang mũi và quanh hố mũi. Từ 1960, với thí
nghiệm lâm sàng đối chiếu với giả dược trên 146 võ só quyền anh bò giập mũi và tụ
máu đã đi đến kết luận rằng: 78% được được trò bằng bromelin qua đường tiêm tónh
mạch hoàn toàn khỏi trong vòng bốn ngày đối lại 14% được dùng giả dược.
Nhiều nghiên cứu khác trên các sưng viêm sau phẫu thuật giảm nếu bệnh
nhân được cho sử dụng 40mg bromelin, 4 lần/ngày, dùng hai ngày trước khi phẫu
thuật và năm ngày sau đó. Bromelin ngăn chặn việc
phóng thích prostaglandin là nguyên nhân gây sưng viêm.
Vì vậy nên giải thích được cơ chế tác động chống viêm
của thơm. Vì thế bromelin còn được dùng để chống bệnh
viêm khớp.
Tuy nhiên cũng có hai nghiên cứu trên 254 người
không cho được kết quả mong đợi trên việc sưng phù sau
phẫu thuật.
3. Làm mau lành vết thương
Việc đắp lại tại chỗ bromelin làm gia tăng tiêu hủy các mô hoại tử.
4. Giảm đau nhức cơ
Một nghiên cứu công bố vào năn 2002, với 30 đối tượng thử nghiệm đã thực
các động tác thể lực gạy đau cơ tay, so sánh giữa việc dùng bromelin 900mg/ngày
với dùng 1600mg ibuprofen (thuốc trò đau nhức) cho kết quả tương đương.

18


Công nghệ enzyme

Enzyme Bromelin

5. Chống rối loạn tim mạch
Các quan sát lâm sàng cho phép kết luận rằng việc dùng bromelin với liều
400mg - 1000mg giúp làm giảm đau thắt ngực sau khi ngưng dùng các thuốc trò đau
thắt ngực. Việc kết hợp Bromelin với potassium và magnesium làm giảm tai biến
nhồi máu cơ tim. Bromelin làm sạch máu giúp giải thích tác động chống kết tập
tiểu cầu. Một nghiên cứu khác trên 73 người tình nguyện bò viêm tónh mạch cấp
tính thì thấy việc sử dụng bromelin với thuốc kháng viêm giảm đau giúp làm giảm
các triệu chứng của bệnh này trên hệ tónh mạch.
6. Các nghiên cứu khác
Ngoài ra bromelin còn được dùng để điều trò sung huyết đường hô hấp, cải
thiện việc tiêu hóa và hấp thu một số thuốc. Bromelin dùng cho các bệnh nhân bò
rối loạn tiêu hóa do cắt bỏ tụy tạng hoặc thiếu enzym tuyến tụy. Từ đó người ta
nghó đến việc dùng bromelin để gia tăng hấp thu hoạt chất thuốc như glucosamin,
kháng sinh, thuốc an thần làm tăng thời gian tác dụng của thuốc.
Ngoài ra bromelin còn tác động lên hệ miễn dòch, nên có thể giúp gia tăng
khả năng phòng chống một số bệnh do hệ tự miễn yếu kém của con người vì lão
hóa cũng như chống lại sự thành lập các khối u. Các chế phẩm có bromelin được
dùng ngoài giúp mau lành vết thương dưới dạng kem bôi da.
Vì thế việc ăn tráng miệng bằng thơm sau các bữa ăn nặng sẽ giúp mau
“nhẹ bụng”.
Hình 12 - Một số sản phẩm bromelin trên thị trường

19