Enzyme papain trong mủ đu đủ

▓ Trường ĐHBC Tôn Đức Thắng
▪Khoa: Khoa học ứng dụng
▪Môn: Công nghệ sinh học

Chuyên đề:

Enzyme Papain
trong mủ đu đủ
۩Giáo viên hướng dẫn:
Nguyễn Thò Thu Sang
۩ Nhóm thực hiện:
Trương Thò Diễm Châu
Huỳnh Thò Bé Cơ
Phạm Văn Cảnh
Trần Ngọc Trung

1


Mục lục
Lời mở đầu............................................................................................................. Tr3
Phần I. Enzyme là gì?........................................................................................... Tr4
1.
Bản chất............................................................................................. Tr4
...................................................................................................................
2.
Chức năng.......................................................................................... Tr4
...................................................................................................................
Phần II. Papain..................................................................................................... Tr4
I. Sơ lược về papain..................................................................................... Tr5
II. Phân loại- Tính chất papain........................................................................

II.1 Phân loại ..............................................................................Tr5 ->7
II.2 Tính chất vật lý..........................................................................Tr8
II.3 Tính chất hóa học...................................................................Tr8-9
III. Cấu trúc và cơ chế hoạt động...................................................................
III.1 Cấu trúc.............................................................................................. Tr9
III.1.1 Cấu trúc không gian............................................................Tr10
III.1.2 Trung tâm hoạt động...................................................................
III.2 Cơ chế hoạt động..............................................................................Tr10
III.2.1 Hoạt hoá...............................................................................Tr11
III.2.2 Cơ chế tác dụng...................................................................Tr12
III.2.3 Bất hoạt................................................................................Tr13
III.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính............................Tr13-14
IV. Thu nhận......................................................................................................
IV.1 Thu nhận nhựa đu đủ......................................................................
IV.1.1 Điều kiện thu nhận..............................................................Tr15
IV.1.2 Cách lấy................................................................................Tr15
IV.2 Phương pháp thu nhận papain bán tinh khiết................................Tr16
IV.3 Phương pháp thu nhận papain tinh khiết..............................Tr16 ->18
V. Tiêu chuẩn tinh khiết của enzyme.....................................................Tr18
VI. Ứng dụng............................................................................................. Tr19
VI.1 Trong y học....................................................................................... Tr19
VI.2 Trong công nghiệp............................................................................Tr19
VI.3 Trong mỹ phẩm................................................................................ Tr19
VII. Tình hình sản xuất ở Việt Nam và trên thế giới............................Tr20
2


Lời mở đầu
Trước nay chúng ta đã nghe nhiều về công dụng của quả đu đủ. Chúng giúp cho việc
tiêu hóa dễ dàng hơn, giúp da đẹp hơn……và còn là món sinh tố ngon miệng nữa. Quả

đu đủ không chỉ có giá trò khi nó đã chín mà còn có giá trò cao khi nó còn xanh. Trong
mủ quả đu đủ xanh chứa rất nhiều loại enzyme có giá trò kinh tế, quan trọng nhất là
papain. Papain được xếp vào loại protease, có tính chất cũng gần giống như pepsin và
các loại protease khác. Hiện nay người ta đã ứng dụng papain trong việc mở đóa đệm
trong phẫu thuật cột sống, sản xuất mỹ phẩm……Nứơc ta là nước có khí hậu nhiệt đới
thích hợp cho cây đu đủ phát triển, vậy thì tại sao chúng ta lại không khai thác lợi thế
này để thu lấy nguồn papain ,có giá trò cao hơn nhiều so với khi thu nhận quả đu đủ
chín. Nhưng trước hết chúng ta hãy cùng tìm hiểu 1 số điều cơ bản về papain.

3


Phần I. ENZYM LÀ GÌ ?
1. Bản chất
Enzym có bản chất là protein, được vi sinh vật tổng hợp nên, và tham gia vào
các phản ứng sinh học.Enzym được tạo ra trong tế bào sinh học.
2. Chức năng
Tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả ngay khi đã tách ra khoải tế
bào.
Tham gia phản ứng trong điều kiện ôn hoà .
Enzym tham gia phản ứng từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn
toàn năng lượng.
Phản ứng enzym là một phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít .
Enzym chụi sự điều khiển của gen và điều kiện phản ứng .
Một gen qui đònh một enzym , một enzym qui đònh một phản ứng sinh hoá.
Phần II. PAPAIN
I. SƠ LƯC VỀ PAPAIN:
Từ ngày xưa con người đã biết dùng đu đủ xanh nấu với thòt để làm mềm thòt
nhanh hơn và tăng hương vò thòt.nhưng họ không biết trong đu đủ có chất gì mà
làm cho thòt mềm nhanh như thế.

G.C.Roy là người đầu tiên phát hiện ra nhựa đu đủ là một nguồn enzym.Ông
công bố báo cáo của mình trong tạp chí “Calaitta Medical journal” .
Được tách từ nhưạ đu đủ xanh , papain thuộc nhóm enzym thuỷ phân có
nguồn gốc thực vật được nghiên cứu nhiều nhất về tính chất và cơ chế hoạt
động. Papain là một sulfhydryl protease , đầu tiên được tách bởi ông Bals và
cộng sự của ông, sau đó bởi Kimel vàSmith từ nhựa thô.
Đến năm 1879 Wrutz vàbouchet là những người đầu tiên sử dụng thuật ngữ
“papain” để diễn tả tính chất phân huỷ protein của enzym trong nhựa đu
đủ.ngày nay , thuật ngữ papain tiếp tục được sử dụng để miêu tả mủ đu đủ khô
được dùng rộng rãi trong công nghiệp và cả trong chế phẩm enzym thuỷ phân
dang kết tinh từ mủ.Chế phẩm enzym gồm hai enzym khác nhau được gọi là
papain peptidase 1 và papain peptidase 2 .
Theo danh pháp quốc tế , papain mang mã số 3.4.4.10, có hoạt tính xúc tác
tương tự như bromelin trong quả dứa.
II. PHÂN LOẠI- TÍNH CHẤT
II.1 Phân loại

4


Nhựa đu đủ là hỗn hợp enzym chứa các protease sau:papain, chymopapain
A,B,proteinase III,IV,thiolprotease. Trong đó papain có hàm lượng 5-8% và là
enzym có ý nghóa quan trọng nhất

Hình 1:Cấu tạo không gian của peptidase

Hình 2:Cấu tạo không gian của chymopapain
Thông thường chế phẩm thương mại chỉ chứa 5-8% papain, còn lại chymopapain và
peptidase. Chế phẩm thương mại thường là nhựu đu đủ (latex) sấy khô bằng các
phươgn pháp khác nhau, so với nhựa tươi và chế phẩm đông khô ở Việt Nam chúng có

hoạt tính kém hơn khoảng 3 lần (bảng 4.13), hàm lượng pro tein tan cùng nhỏ
hơn:175mg/g chế phẩm thương mại so vớ 675mg/g chế phẩm đông khô.
5


Bảng 3: Hoạt tính thủy giải protein của chế phẩm papain Việt Nam
Chế phẩm

Hoạt tính protease
Hoạt tính amidase
(UI/mg)
(UI/mg)
Thương mại (Merk)
19.9
1.5
Đông khô(VN)
53.5
3.1
Tươi (VN)
42.2
1.9
Các chế phẩm trên đều có thành phần tương tự nhau khi chạy điện di trên gel
polyacrylamide trong hệ B-amilane có pH4.3 (H.4.18).
Chúng có năm tiểu phần trong đó có một la p, ba tiểu phần là chymopapain va một
tiểu phần là peptidase A.

A
1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

3

4

5

B

C
1
2
Hình: điện di đồ các chế phẩm papain
A-chế phẩm thương mại

B-chế phẩm đông khô
C-chế phẩm tươi
1-papain
2,3,4-chymopapain
5-peptidase

6


Các kế quả thu được trình bày ở bảng trên cho thấy các loai enzym có hoạt tính
protease chúa trong nhựa đu đủ đều có chứa trong các chế phẩm thu nhận ở Việt
Nam, trong đó papain chiếm 4,7-9,6%; chymopapain chiếm 45,1-65,9%;
peptidase D từ 6,9-39,7%; peptidase a từ 5,5-9,6%.
Bảng 4: Thành phần các enzym thủy giải trong chế phẩm papain
Chế phẩm
Thành phẩm protein
Hoạt tính thủy giải
(%)
(%)
Chế phẩm thương mại
Papain
4,7
3,7
Chymopapain
66,2
40,5
Pepetidase A
15,2
32,9
Pepetidase B

13,5
16,7
Chế phẩm đông khô(VN)
Papain
7,6
1,4
Chymopapain
65,9
33,0
Pepetidase A
16,9
39,7
Pepetidase B
9,6
13,2
Chế phẩm tươi (VN)
Papain
9,6
3,7
Chymopapain
45,1
40,2
Pepetidase A
39,7
43,0
Pepetidase B
5,5
10,3

7

II.2Tính chất vật lý.
Bảng 1:tính chất vật lý của papain
Điểm đẳng điện
Hằng số lắng S20
Hằng số phân tán D20(10
sec.cm2)
Phân tử lượng
Độ triền quang
Độ xoắn

Pi = 8.75
2.42 ± 0.04
10.27 ± 0.13
20.700
-66.7
17%

Vòng hiệu ứng coton
290mm
Thể tích riêng phần V(ml/g)
0.724
Trò số ma sát f/f0
1.16
 Bột màu vàng hay nâu nhạt tuỳ thuộc vào phương pháp sấy, không tan
trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong H2O hay
glycerine
Bền nhiệt.
II.3 Tính chất hoá học.

Cấu tạo hoá học
Papain là một endoprotease có chứa 16.1%N và 1.2%S.Papain là một
protease thiol, theo nghiên cứu của R.L. Hill và E. L.Smith, papain là
một chuỗi polypeptide gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử là
20.900 Dalton.
Bảng 2:Thành phần amino acid của papain.
Amino acid
Số lượng
Amino acid
Số lượng
Alanin
13
Lysine
9
Arginine
10
Phenylalanine
4
Aspartic acid 17
Proline
9
Hafl-cysteine 6
Serine
11
Glutamic acid 17
Threonine
7
Glicine
23
Tryptophan

5
Histidine
2
Tyrosine
17
Isoleucine
10
Valine
15
8


Leucine
10
Methionine
0
Tổng cộng : 185
Theo kết quả phân tích bằng tia X, phân tử papain được cấu tạo bởi
212 amino acid trong đó không chứa methionine. Phân tử lượng là 3.350Da,
phân tử của nó là một mạch polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là
asparagine, có 6 gốc cysteine tạo thành ba cầu disulfur ở các vò tri 22-63, 56-95,
153-200, không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính chất bền vững của cấu
trúc và một nhóm –SH tự do ở vò trí 25.
Thành phần chính của papain chứa hoạt hoá là hỗn hợp protein
disulfurcysteine.
Khi hoạt hoá papain bằng KCN sẽ giải phóng ra nhóm thiol của
enzym và β-thio cyanatalanine do sự tương tác giữa cyanur và cysteine. Sau đó,
β - thio cyanatalanine khép vòng tạo thành α-iminotiazolidin. Khi có oxy
không khí, cơ chế trên xảy ra theo chiều ngược lại, tức là cysteine kết hợp với
nhóm sulfurhydride của papain hoạt hoá tạo thành sản phẩm không hoạt hoá.

III. Cấu trúc và cơ chế hoạt động
III.1Cấu trúc
- Gồm 16% N, 1.2% S
- Có 212 aa, không chứa methionin
- Đầu N là Ile, đầu C là Asp
- Có 6 gốc cystein tạo thành 3 cầu nối disunfua ở các vò trí 22-63, 56-95 ,
153-200 nhưng chúng không có chức năng sinh học, chỉ giữ vững cấu trúc
- Có nhóm –SH tự do ở vò trí 25 giữ chức năng sinh học
III.1.1Cấu tạo không gian

Hình 3-4 : Cấu tạo không gian của papain
9


III.1.2 Trung tâm hoạt động
Gồm: –SH của cysteine 25 liên kết N bậc 3 của hystidine 159
-vòng imidazol của nhóm hystidine 159 liên kết với Asp 175 bởi liên
kết H

Hình 5: Trung tâm hoạt động của papain

III.2 Cơ chế hoạt động
Tác dụng : thuỷ phân protein thành các polypeptit và các axit amin, có vai trò
như endopeptidase (thuỷ phân protein thành peptide) và exopeptidase (thủy
phân protein thành aa)
Như vậy papain thủy phân sâu hơn so với các protease lấy từ nguồn động vật
và vi sinh vật khác. Do đó nó được dùng để thuỷ phân tiếp sau khi đã thủy
phân bằng trypsin hay chymotripsin
Tính đặc hiệu của papain rất rộng, nó thuỷ phân được hầu hết các liên kết
peptide trừ liên kết với prolin và a.glutamic

Khả năng thuỷ phân của papain còn phụ thuộc vào trạng thái cơ chất có bò
biến tính hay không, nếu bò biến tính thì papain dễ tác dụng hơn
III.2.1 Hoạt hóa

10


Do trung tâm hoạt động của papain gồm
cysteine 25 và nytrogen bậc 3 của
histidine 159 có tính khử nên các chất
hoạt hóa là các chât có tính khử
như:cysteine,glutation axit,hydrocyanic….
Khi có mặt các nhóm này thì –SH ở
trung tâm hoạt động được phục hồi và
làm tăng hoạt tính. Khi có mặt các chất
có thể kết hợp với kim loại nặng trong
mủ đu đủ như EDTA thì hoạt tính càng
tăng

Hình 6: Cơ chế họat hóa và bất họat
papain

III.2.2Cơ chế tác dụng
Papain có thể xúc tác phản ứng thuỷ
phân các dẫn xuất acyl:
Hình 7:Phản ứng thủy phân các cơ chất
có liên kết –CO-NHRCOX + PAP-SH
PAP-S- C
O + HX
R

PAP-S- C O + H2O

PAP-SH + RCOOH
11


R
Phản ứng xảy ra do tính ái nhân của S trong –SH, C trong cơ chất có khuynh
hướng phản ứng với những nguyên tử có tính ái nhân
Papain có thể nhận biết 1 chuỗi 7 aa và ưu tiên cắt như sau:
 Nếu chuỗi có dạng :NH2- A-B –Phe –C-D-E-F-COOH
(trong đó A,B,C,D,E,F là các aa) thì papain sẽ cắt ngay tại đoạn C – D

N

C

Vò trí thuỷ phân

P4

S4

P3
S3

P1

S2

S1

,

P1

,
S
1

,
P

,

Cơ chất

3

P2

,

S2

,

S3

Hình 8: Vò trí cắt cơ chất của papain

Còn nếu chuỗi có nhóm Phe ở vò trí thứ 2 đầu tận cùng C thì papain không
thuỷ phân được mà nó còn là chất kìm hãm cạnh tranh với papain
III.2.3 Bất hoạt
papain bò kìm hãm bởi các chất oxy hóa như:oxy,ozone,H 2O2 …đặc biệt là H2O2,
do phản ứng với nhóm –SH làm phá vỡ cấu trúc trung tâm hoạt động
papain bò bất hoạt thuận nghòch bởi không khí,cysteine ở nồng độ thấp,ion kim
loại nặng như Cd+,Cu2+, Zn2+,Hg2+,Fe2+ ….

12


các aldehyde cũng ức chế papain,carborxy_L_ glutamic acid ức chế không cạnh
tranh ở pH = 3,9- 4.5
Chất có nhóm Phe ở vò trí thứ 2 kể từ đầu mạch C là chất kìm hãm cạnh tranh
mạnh ,do chiếm 1 phần trung tâm hoạt động
Các chế phẩm papain sau khi bảo quản vài tháng thì hoạt tính chỉ còn 30%
Đặc biệt papain rất bền với các tác nhân biến tính như dung môi hữu cơ: độ quay
cực của papain không đổi trong etanol 70% ,ure 6-8 M/l
III.2.4Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính
a)Nhiệt độ :papain chòu được nhiệt độ cao
+ ở dạng nhựa khô papain không bò biến tính trong 3h ,100oC
+ Ở dạng dung dòch ,bò bất hoạt sau 30’ ở 82.5oC do cấu trúc trung tâm hoạt
động bò phá huỷ
+ Ở dạng tinh thể thì độ bền nhiệt thấp hơn ở trong mủ nhựa do trong mủ nhựa
còn có những protein khác có tác dụng bảo vệ nó
+ Ở trong dung dòch NaCl 4o C, trong dung dòch dẫn xuất thuỷ ngân thì papain
được giữ bền trong nhiều tháng
Tuỳ loại protein mà có nhiệt độ thuỷ phân thích hợp.
VD : đối với casein là 37 o C
b)pH :

papain hoạt động được trong khoảng 4.5-8.5 , nhưng bò bất hoạt khi
pH<4.5 hay pH >12

Hình 9: Mức độ ảnh hưởng của pH đến họat độ của papain
13


tuỳ thuộc vào bản chất của cơ chất mà có pH tối ưu sẽ khác nhau.VD
: với casein là 7-7.5, với albumin là 4.5-7.1
papain ở dạng ổn đònh (tức là ổn đònh về cấu trúc) thì có thể chòu pH
từ 1.5- 8.5
c)Dung môi :
papain không thay đổi độ quay quang học trong methanol 70%
không thay đổi độ nhớt trong methanol 50%
không bò giảm hoạt tính trong ure 8M
bò biến tính thuận nghòch trong TCA 10%, guanidin hydrochloride 6M
IV.Thu nhận enzym papain
IV.1 Thu nhận nhựa đu đủ
IV.1.1 Điều kiện lấy nhựa
Câây: đang sinh trưởng tốt, không bò sâu bệnh, thân cây mập mạp cho nhựa
nhiều.
Quả: lấy những quả đang còn xanh, quả vỏ mòn, có trọng lượng từ 0.3-1kg
là tốt nhất. Quả non quá cho ít nhựa, quả già quá hoặc quả to vừa cho nhựa ít vừa
không sánh sệt, hoạt tính enzym không cao. Qua có vỏ sần sùi, chia thùy cũng
cho ít nhựa. Để thu chế phẩm enzym có hoạt tính cao nhất, nên lấy nhựa ở quả có
độ 10 tuần tuổi.
Thời gian lấy nhựa : sáng sớm, kết thúc vào giữa buổi sáng (giai đoạn độ
ẩm không khí cao). Khi độ ẩm không khí thấp, dòng nhựa chảy chậm và đặc, khó
thu nhận.
-Mùa khô: nhựa ít, đặt, nồng độ protein cao.

-Mùa mưa: nhựa nhiều loãng, nồng độ protein thấp.
IV.1.2 Tiến hành
-Nhựa đu đủ lấy ở quả xanh còn trên cây.
- Dùng dao inox rạch vài đường dọc theo quả ở chỗ có đường kính quả to nhất,
các látư khía cách nhau 3-5cm (không rạch sâu quá 2cm, nếu không dòch nước và
tinh bột từ quả sẽ trộn lẫn vào nhựa và làm giảm chất lượng nhựa thu được).
-Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thủy tinh màu miệng rộng trong 4-6 phút, sau khi
lấy nhựa xong đậy nắp kín để trong tối .
-Bảo quản lạnh, mang về phòng thí nghiệm. Mục đích của giai đoạn này là tránh
không cho nhựa tiếp xúc với không khí và để đảm bảo hoạt tính papain có trong
nhựa.
-Khi lấy nhựa cần tránh không cho các chất bẩn hoặc côn trùng lẩn vào.
14


-Không nên trộn nhựa tươi với nhựa khô vì nó làm giảm chất lượng.
-Quả có thể được rút nhựa trong suốt khoảng thời gian từ 4-7 ngày. Lần đầu tiên
có thể chỉ cần một rạch là đủ, ở những lần thu nhựa sau, rạch 2-3 đường giữa
những đường rạch trước đó.
-Khi tiến hành các thao tác với nhựa tươi tránh không cho nhựa tiết xúc vào da vì
nó sẽ gây bỏng. Đồng thời cũng không nên để nhựa tiếp xúc vơi dụng cụ làm từ
kim loại nặng như sắt, đồng … vì nó làm biến màu và giảm hoạt tính enzym. Lo,
dao, muỗng,… phải được làm bằng thép không rỉ.
-Nhựa tươi không bền, vì thế nên sấy khô tới 5% độ ẩm.
-Sau 2-3 tháng, quả đu đủ chín, có thể lấy ra khỏi cây. Đu đủ chín có thể ăn được
nhưng khó bán vì bề ngoài không đẹp. Tuy nhiên quả đu đủ chín xanh có chứa
khoảng 10% pectin, do đó có thể dùng quả để thu nhận pectin.

IV.2.Mố số phương pháp thu nhâïn papain bán tinh khiết
Vấn đề tinh sạch papain đã được nghiên cướu rộng rãi từ trước tới nay, chủ

yếu dùng dung môi hữu cơ đẻ tinh sạch papain.
Nhựa đu đủ đủ tuổi sau khi lấy về được chiết rửa 2-3 lần bằng cồn 90 0, lọc
lấy cặn và lam bay hơi cồn.Cặn được hòa tan trong nước cất, sau đó dùng
cồn để xác đònh lại, sấy ở 30-400C, Thu nhận papain.
Ngâm papain trong thể tích nước cất nhất đònh trong vài giờ hoặc hòa tan
nhựa tươi trong nước cất, có thể bổ sung một ít glyxerine cho tạo thành dòch
nhủ tan đều, lọc lấy dòch qua vài lớp vải màn. Dùng acetone lạnh với tỷ lệ
1:2 so với thể tchs dung dòch lọc.sau đó ly tâm lạnh và thu lấy kết tủa. Sấy
kết tủa ở nhiệt độ 450C, có thể sấy chân không hoặc phơi khô, sau đó
nghiền thành bột.
Tinh chế papain bằng phương pháp kết tủa phân đoạn sửu dụng (NH 4)2SO4
và NaCl.
Để nâng cao mức độ tinh sạch với papain, người ta sử dụng phương pháp
sắc ký cột vói CMC.
IV.3. Phương pháp thu nhận papain tinh khiết
a. Chuẩn bò: thành phần nhựa đu đủ tươi ngoài enzym papain,
chymopapain còn chứa một số loại enzyme, protein, chất nhựa, chất cao su, chất
béo,… và các chất tạp khác. Để có được quy trình tách và làm sạch papain từ
nhựa đu đủ có hiểu quả thì phải có quy trình hòa tan nhựa đu đủ, mục đích là để
15


hòa tan các chất nhựa, cặn, tạp lớn,… trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g celite và
150g cát sạch, nghiền kỹ trong cối ở nhiệt độ phòng với 200-300 ml dung dich
cysteine 0,04 M 9 hòa tan 6,3g cysteine hydrochloride trong 1000 ml dung dòch
NaOH 0,045 M, kiềm được sử dụng để đưa pH dòch chiết tới 5,70. khi dòch nhựa
tạo thành thể huyền phù, gan bỏ lớp nổi ở trên. Quá trình nghiền và trích được
lặp lại với 300 ml dung dòch cysteine. Sau đó rửa cối với dung dòch cysteine để
điều chỉnh thể tích dòch chiết lên 1l. dòch huyền phù sau cùng được lọc lạnh (có
thể hút nhẹ) trên giấy lọc Whatman số 1. thời gian lọc phụ thuộc vào nhựa khô

được sử dụng và quá trình này có thể rất chậm. Nước lọc có màu trắng sữa hoặc
vàng xanh, pH gần 5,7. Các bước còn lại của quá trình làm tinh sạch enzyme
được tiến hành trong điều kiện lạnh.
b.Loại bỏ các chất không tan ở pH 9
Dòch chiết thu được ở bước 1 được đều chỉnh lên pH 9 bằng cách thêm từ từ và
khuấy đều một lượng khoảng 110 ml dung dòch NaOH 1M. Tủa xám tạo thành có
thể được loại ra bằng cách lọc hoặc ly tâm ở 2600 rpm trong 1 giờ. Dòch trích
phải trong do các tủa gây biến tính protein đã được loại bỏ.
c. Quá trình phân đoạn bằng amonium sulfate
Cho mamonium sulfate vào dòch enzym đến 40% dòch bão hòa, sau 1-2 giờ, ly
tâm ở 2500rpm, Thu nhận tủa, bỏ dòch lỏng hoặc có thể giữu lại để lấy
chymopapain. Tủa được rửa một lần với 400-500ml dung dòch ammonium sulfate
41% bão hòa.
d. Quá trình phân đọan bằng NaCl
Hòa tan tủa trong 600 ml dung dòch cysteine 0,02M (pH7-7,5), Tủa papain tạo
thành khi thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau 1 giờ ly tâm ở 2500rpm trong một giờ để
thu tủa, bỏ dòch lỏng.
e. Kết tinh
Tủa được thành dòch huyền phù với 400 ml dung dòch cysteine 0,002M, pH6,5 ở
nhiệt độ phòng. pH của dung dòch huyền phù được điều chỉnh lại đến 6,5 sau khi
cho protein vào. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể tạo thành sau đó
duy trì ở 40C qua đêm sau đó ly tâm lạnh ở 2500rpm trong 4-5 giòe để thu nhận
tinh thể.
f.Tái kết tinh
Hòa tan tinh thể thu được ở bước 5 trong nước cất (tạo dung dòch có nồng độ
protein khoảng 1%) ở nhiệt độ phòng. Sau đó cho vào từ từ (đồng thời khuấy
đều) dung dòch NaCl bão hòa (10ml/300ml) dung dòch protein).Khi 75% thể tích
16

dung dòch NaCl đã cho vào, papain bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng. Dòch huyền
phù được giữ ở 4oC qua đêm, Sau đó ly tâm thu tủa ở bước 5. Hoạt độ rêng của
enzym có thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như trên.
g. Sấy chân không
Sấy chân không ở nhiệt độ phòng khoảng 400C thu nhận papain tinh chế. Để tăng
hoạt tính enzym, trước khi tái kết tinh có thể hòa tan tinh thể enzym trong dung
dòch đệm photphate chứa cysteine,sau đó tiến hành siêu lọc với màng lọc
4000Ao. Kết tinh dìch lỏng thu được sau siêu lọc.
VI. Những tiêu chuẩn tinh khiết của ezyme
Để xác đònh xem protein được chiết tách ra có phải là ezyme tinh khiết hay
không hay còn chứa những tạp chất protein không họat động, người ta sử dụng 1
số phương pháp chủ yếu dựa trên việc nghiên cứu những tính chất vật lý của
protein
Làm lắng(kết tủa) dung dòch protein trong phần quay phân tích của máy siêu ly
tâm: phát hiện một đỉnh của protein thì đó là protein thuần nhất. Tuy nhiên 1 số
protein khác nhau nhưng có cùng 1 lượng phân tử và có hình dạng tiểu phân(hoặc
có khi có sự bù phụ của các ảnh hưởng của khối lượng và hình dạng)thì có hằng
số lắng trùng nhau. Vì thế khi siêu ly tâm, chúng có thể lắng với một tốc độ như
nhau và cho 1 đỉnh chung.
Điện di( phương pháp ranh giới di động):phương pháp này rất hiệu quả.Tuy nhiên
khó mong phân biệt được các protein giống nhau về trò số di động điện di. Dung
dòch enzyme khi được điện di khu vực trong jela tinh bột hoặc thạch chỉ ra 1 đỉnh
cân đối thì đó là dấu hiệu của enzyme thuần nhất. Thế nhưng khi hàm lượng
protein tạp nhỏ(<=1%) thì khó phát hiện ra đúng.
Xác đònh hoạt độ riêng, mật độ quang học riêng trong những đỉnh quang phổ đặc
trưng cùng hàm lượng các nhóm ngoại đặc hiệu.
Biện pháp khá nhạy cảm để xác đònh mức độ thuần nhất của enzyme cũng như
protein khác là kết hợp sự phân tích điện di và những phản ứng miễn dòch hoá
học đặc hiệu,đặc biệt điện di trên thạch theo grabar.
Biện pháp nghiên cứu có triển vọng nhưng tương đối ít nhạy cảm về độ thuần

nhất của protein là sự xác đònh độ hoà tan của nó theo Norchrop.
Thường để xác đònh độ thuần nhất của enzyme, người ta dựa trên sự so sánh
những kết quả thu được từ 1 vài phương pháp khác nhau. Cần lưu ý rằng, những
chế phẩm enzyme càng tinh khiết thì càng dễ hỏng và khi bảo quản trong các
dung dòch ở 4 0C đều nhanh chóng mất hoạt tính. Vì thế khi tái kết tinh enzyme
17


lặp lại ta thường thấy có sự giảm hoạt độ riêng vì các tinh thể đã bò ô nhiễm bởi
phần enzyme bò ức chế
V.

Những phương pháp xác định độ tinh khiết của
enzym
Để xác định enzym được chiết tách ra có thật sự tinh khiết hay
khơng,ta áp dụng một số phương pháp chủ yếu dựa trên tính
chất vật lý của protein
Làm lắng,kết tủa dung dịch protein trong phần quay phân tích
của máy siêu ly tâm,phát hiện một đỉnh protein thì đó là protein
thuần nhất.Tuy nhiên một số protein khác nhau có cùng trọng
lượng phân tử và có hình dạng tiêu phân thì có hằng số lắng trùng
nhau .Vì thế khi siêu ly tâm chúng có thể lắng với tốc độ như nhau
và có cùng đỉnh chóp.
Điên di(phương pháp ranh giới di động)rất hiệu quả.Tuy nhiên
khó mà phân biệt những protein giống nhau về trị số điện di.Khi
được điện di trong jela tinh bột hay thạch chỉ ra một đỉnh cân đối
thì đó là dấu hiệu của protein thuần nhất.Thế nhưng khi hàm lượng
những protẹn tạp nhỏ(<1%)thì khó phát hiện ra đúng.
Xác định hoạt độ riêng ,mật độ quang học riêng trong những
đỉnh quang phổ đặc trưng cùng hàm lượng các nhóm ngoại đặc

hiệu.
Thơng thường người ta so sánh những kết quả thu được từ các
phương pháp khác nhau./.
VI.Ứng dụng:
• Hằng ngày nên ăn từ 100-200g đđu đủ để cung cấp đủ lượng papain
(30mg) cho cơ thể,giúp cơ thể dễ tiêêu hóa thức ăn.
• Các bà nội trợ bỏ đđu đủ xanh vào hầm chung với thịt, xương cho mau
chín
VI.1Trong y học:
• Nhựa papain thô về tinh chế đđược sử dụng thay thế pepsin và pancreatin
trong đđiều trị rối loạn tiêu hóa do thiếu men
• Làm thuốc tẩy nhiều loại giun (trừ giun móc ankylostome).
• Có thể tạo ra một loại chế phẩm hỗn hợp pancreatin-papain có nhiều ưu
đđiểm trong việc phân giải protid thực phẩm, đđể ứng dụng trong điều trị
suy dinh dưỡng protein nǎng lượng ở trẻ em.

18


• Dùng trong phẫu thuật cột sống ,là một loại "dao phẫu thuật tự nhiêên" đđể
mở đĩa đệm).
• Đđiều trị lở loét
• Làm tiêêu giả mạc trong bệnh bạch hầu
• Chống kết dính sau phẫu thuật
VI.2Trong công nghiệp:
• Để tinh chế bia
• Xử len và lụa trước khi nhuộm
• Là phụ gia trong công nghệ chế biến cao su
• Khi tinh chế dầu cá Tuna ,người ta cho thêm papain vào để thành phẩm
giàu Vitamin A và D hơn

VI.3 Trong mỹ phẩm
- Quả đu đủ xanh nghiền nát với nước, dùng bơi để chữa các vết tàn nhang ở
mặt và tay, còn dùng chữa chai chân và bệnh eczema...

VII.Vài nét về tình hình sản xuất papain ở Việt Nam và trên thế giới
Thò trường quốc tế hiện nay có nhu cầu rất lớn về papain. Để đáp ứng đòi
hỏi và để có thêm ngọai tệ ,từ hai thập kỷ qua, khoa làm vườn trường đại học
Tamil (n Độ) đã tổ chức nghiên cướu và kết quả đã được một giống cây đu đủ
mới từ giống CP-15 có hàm lượng papain cao và đặt tên CO-5. CO-5 là giống đặt
biệt thích hợp để lấy papain. Trong bốn mùa liên tiếp nó cho papain đạt mức kỷ
lục (mỗi quả 14-15 g papain thô). Đây thật sự là một bước khai thông trong cây
đu đủ và là mức kỷ lục của thế giới về sản xuất papain.

19


Giá trò xuất khẩu của papain tren thò trường quốc té rát cao, theo giá thò
trường 1990-1991:
-Loại từ 0.2-0.4UI/mg (phương pháp kuznit)
500mg:159Fg=26.5USD
-Loại từ 10-20 UI/mg (phương pháp kuznit)
250mg:285Fg=47.5USD.
Nhu cầu về papain hàng năm ước tính là 600.000 tấn trong khi thò trường
chỉ có khả năng cung cấp 300.000 tấn. Trong nhiều năm liền Mỹ luôn là quốc gia
thống trò thò trường papain. Gần đây thò trường chính của papain là khu vực Châu
u.

1.
2.
3.

4.

Tài liệu tham khảo
Nguyễn Đức Lượng- Công nghệ enzyme-NXB ĐH Quốc gia
www.biomedcentral.com/ 1472-6807/1/4/figure/F12
store.nordstrom.com/ category/cat_medium.asp?c...
www.google.com( papain, peptidase,chymopapain)

20


21