Ứng dụng kỹ thuật NAT (nucleic acid) phát hiện sớm sự có mặt của vi rút HIV, HBV, HCV ở người cho máu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-------------------

Trần Vân Chi

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NAT (NUCLEIC ACID)
ĐỂ PHÁT HIỆN SỚM SỰ CÓ MẶT CỦA VI RÚT
HIV, HBV, HCV Ở NGƯỜI CHO MÁU

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015

TrÇn V©n Chi

1

LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-------------------

Trần Vân Chi

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NAT (NUCLEIC ACID)
ĐỂ PHÁT HIỆN SỚM SỰ CÓ MẶT CỦA VI RÚT

HIV, HBV, HCV Ở NGƯỜI CHO MÁU
Chuyên ngành:
Mã số:

Vi sinh vật học
60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Bạch Khánh Hòa
TS. Trần Văn Tuấn
XÁC NHẬN HỌC VIÊN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG

Giáo viên hướng dẫn

Chủ tịch hội đồng chấm luận văn
thạc sĩ khoa học

TS. Trần Văn Tuấn

PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội - 2015

TrÇn V©n Chi

2

LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc

LI CM N
Li u tiờn, cho phộp tụi c by t lũng bit n sõu sc nht ti PGS.TS.
Bch Khỏnh Hũa; ngi thy ó tn tỡnh hng dn, giỳp tụi lm lun vn.
Ngi thy a tụi n vi Huyt hc Truyn mỏu, ngi thy ó truyn cho tụi
nim am mờ vi Huyt hc Truyn mỏu. Ngi thy ó bi dng cho tụi nhng
c tớnh trung thc, cn mn ca mt ngi lm cụng tỏc nghiờn cu t nhng ngy
u tiờn bc vo ngh.
Tụi xin by t lũng cm n sõu sc n BSCKII. Phm Tun Dng ngi
ó ng viờn cho tụi i hc cao hc v trong sut quỏ trỡnh hc. Ngi ó tn tỡnh
giỳp , dỡu dt tụi trong cụng tỏc.
Tụi by t lũng cm n sõu sc n TS. Trn Vn Tun ngi ó hng dn
ch dn, giỳp tụi lm lun vn.
Tụi cng xin chõn thnh cm n s giỳp on kt ca anh ch em ng
nghip trong Khoa Xột nghim sng lc mỏu ó giỳp tụi hon thin s liu, mi
iu kin thun li nht cho tụi trong sut quỏ trỡnh hc v lm lun vn.
Tụi xin gi li cm n ti: Ban lónh o Vin HHTMTW ó cp kinh phớ
cho tụi i hc, cỏc khoa phũng hnh chớnh ó giỳp tụi hon thnh th tc hc tp,
Khoa Di truyn v sinh hc phõn t, Khoa Thalassemia, Khoa Hemophilia, khoa
HIV vin v sinh dch t ó cho phộp v giỳp tụi xột nghim nh lng virus,
ton th Khi truyn mỏu ó to iu kin thun li cho tụi thc hin ti.
Tụi xin gi li cm n ti Phũng sau i hc, Khoa Sinh hc, B mụn Vi
sinh hc ca trng i hc Khoa hc T nhiờn ó giỳp tụi hon thnh cỏc th tc
lun vn.
Tụi xin by t lũng bit n ti cỏc bc b m , b m chng, chng con ó
giỳp ng viờn, dnh tỡnh cm v iu kin thun li cho tụi hon thnh lun vn.
Tụi xin by t lũng cm n n ngi hin mỏu ó cho tụi nhng s liu
quý bỏu.
Hc viờn. Trn Võn Chi

Trần Vân Chi

3

Luận văn Thạc sĩ Khoa học


M U
Vi rỳt l mt trong nhng nguyờn nhõn gõy ra mt s bnh nghiờm trng
ngi núi chung. Riờng vi rỳt viờm gan B gi tt l HBV (Hepatitis B virus ), vi rỳt
viờm gan C gi tt l HCV (Hepatitis C virus), vi rỳt gõy suy gim min dch ngi
HIV (Human immunodeficiency virus) l vi rỳt gõy bnh thụng qua ng mỏu. Cỏc vi
rỳt ny bin i liờn tc v cu trỳc v h gen trn thoỏt cỏc loi sinh phm xột
nghim hu qu l tng t l lõy nhim trong cng ng.
Phng phỏp xột nghim dựng cho sng lc HIV, HBV v HCV lõy qua ng
truyn mỏu l xỏc nh tỏc nhõn gõy bnh giỏn tip da trờn kt qu ca phn ng min
dch khỏng nguyờn-khỏng th. u im ca xột nghim l n gin, tn ớt thi gian,
giỏ thnh hp lý, song phng phỏp ny cú nhc im l trong giai on ca s khi
ú khỏng th hoc khỏng nguyờn cha t ngng phỏt hin, do vy xột nghim s cho
ra kt qu õm tớnh. Bờn cnh ú, tng tỏc khụng c hiu ca khỏng th hoc khỏng
nguyờn vi nhng bt thng protein khỏc trong mỏu cú cu trỳc gn ging vi khỏng
nguyờn hoc khỏng th cú th dn n kt qu dng tớnh gi. Cựng vi s phỏt trin
ca k thut sinh hc phõn t, k thut NAT ó c a vo s dng, k thut ny cú
nhy cao cho phộp phỏt hin v nhõn bn c hiu theo hm m cỏc trỡnh t ớch
ca tỏc nhõn gõy bnh t mt lng nh vi rỳt, do ú, cho phộp phỏt hin sm v chớnh
xỏc cỏc tỏc nhõn gõy bnh. Hn th na, NAT cú th c s dng phỏt hin ng
thi HIV, HBV v HCV thụng qua mt xột nghim trong thi gian l 4-5 gi, m bo
an ton cho n v mỏu truyn.
Trờn Th gii, cỏc nc phỏt trin, m bo sng lc mỏu Anh, Phỏp, M,
c thc hin xột nghim song song gia phng phỏp giỏn tip khỏng nguyờn khỏng

th v xột nghim NAT cho n v mỏu t cui nhng nm 1990 u nhng nm 2000.
Nm 1997, Hi ch thp c ó s dng PCR cho mc ớch sng lc HCV RNA
cho ngi hin mỏu, tip theo l Nht Bn v Scotland. Sau ú vo thỏng 3/1998 ngi
ta ó gii thiu NAT cho xột nghim HCV RNA[50].

Trần Vân Chi

4

Luận văn Thạc sĩ Khoa học


Vit Nam, hu ht cỏc phũng xột nghim sng lc HIV, HBV v HCV u s
dng phng phỏp xột nghim min dch khỏng nguyờn khỏng th hay cũn gi l xột
nghim huyt thanh hc, xột nghim NAT cha c s dng. Nm 2008 ti cp B
v ng dng NAT cho xột nghim sng lc mỏu t kt qu tt [3]. n nm 2015,
Vin HHTMTW thc hin theo Thụng t 26 TT-BYT ngy 16/9/2014 Hng dn hot
ng truyn mỏu, trin khai xột nghim NAT m bo an ton truyn mỏu.
Xut phỏt t thc t trờn, chỳng tụi tin hnh nghiờn cu ng dng k thut
NAT (nucleic acid) phỏt hin sm s cú mt vi rỳt HIV, HBV, HCV ngi cho mỏu
nhm hng ti cụng tỏc xột nghim sng lc sm cỏc tỏc nhõn lõy qua ng truyn
mỏu ny mt cỏch chớnh xỏc, m bo an ton, cht lng cho mỏu v ch phm s
dng trong iu tr.
2. Mc tiờu nghiờn cu ca ti
- Kho sỏt t l HBsAg, anti HCV, HIVAgAb phn ng trờn n v mỏu hin
c xột nghim min dch bng k thut CMIA, ECLIA. T l nhim HBV, HCV,
HIV bnh nhõn truyn mỏu nhiu ln.
- T l HBV, HCV, HIV phn ng phỏt hin bng k thut NAT (nucleic acid)
trờn n v mỏu hin m xột nghim min dch khụng phỏt hin c, theo dừi ngi
hin mỏu cú phn ng k thut NAT, phỏt hin sm h gen vi rỳt nhm b tr cho xột

nghim min dch khỏng nguyờn- khỏng th.

Trần Vân Chi

5

Luận văn Thạc sĩ Khoa học


KẾT LUẬN
1. Xét nghiệm sàng lọc kháng nguyên – kháng thể bằng kỹ thuật CMIA, ECLIA
với tỷ lệ HBsAg là 0,75%; 0,79%; anti HCV là 0,43%, 0,24%, HIV AgAb là
0,1%, 0,23%. Bệnh nhân nhận máu nhiều lần có tỷ lệ nhiễm HBV là 5,9%
nhiễm HCV là 23,89%.
2. Xét nghiệm NAT (nucleic acid) có tỷ lệ HBV, HCV, HIV tương ứng là 1:1086 ;
1:192221; 2:192221 (HBV 0,92‰, HCV 0,0052‰, HIV 0,01‰). Nghiên cứu
theo dõi được 2 người hiến máu mới nhiễm HIV giai đoạn cửa sổ huyết thanh, 1
người mới nhiễm HCV giai đoạn cửa sổ, 9 người nhiễm HBV giai đoạn cửa sổ.

TrÇn V©n Chi

6

LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc


KIẾN NGHỊ
1. Thực hiện xét nghiệm sàng lọc máu bằng kỹ thuật NAT bổ trợ cho kỹ thuật
miễn dịch kháng nguyên- kháng thể.
2. Nghiên cứu một số trường hợp nhiễm HBV thể ẩn OBI.

TrÇn V©n Chi

7

LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc


TI LIU THAM KHO
TI LIU TING VIT
1. V Thựy An v cng s (2012), Tỡnh hỡnh sng lc cỏc bnh nhim trựng qua
ng mỏu ngi hin mỏu tỡnh nguyn khu vc ụng-Nam b ti Trung tõm
truyn mỏu Ch Ry t 2009-2011, Tp chớ Y hc Vit Nam, tp 396, 272-280.
2. Phm Tun Dng v cng s (2014), Kt qu xột nghim sng lc HBV, HCV,
HIV, giang mai ngi hin mỏu ti Vin Huyt hc Truyn mỏu TW nm 20122013, Tp chớ Y hc Vit Nam, thỏng 10 s c bit, 45-50
3. Bch Khỏnh Hũa v cng s (2007), Xột nghim acid nucleic NAT trong phỏt
hin sm vi rỳt HIV, viờm gan B, viờm gan C ngi cho mỏu, Tp chớ nghiờn
cu y hc, 4/51, 41-43.
4. Nguyn Th Thu Hin v cng s (2012), Kt qu sng lc cỏc bnh nhim trựng
lõy qua ng truyn mỏu ngi hin mỏu ti Hi Phũng 2008-2011, Tp chớ Y
hc Vit Nam, tp 396, 280-286.
5. Lờ Th Hng v cng s (2012) Kt qu sng lc khỏng th HIV, khỏng th
HCV, HBsAg, giang mai, st rột ngi hin mỏu tỡnh nguyn ti Bnh vin a
khoa tnh Hũa Bỡnh 3/2007-3/2012, Tp chớ Y hc Vit Nam, tp 396, 286-292.
6. Phan Th Minh Hng v cng s (2009), Nghiờn cu tỡnh hỡnh nhim HIV, HBV,
HCV bnh nhõn truyn mỏu nhiu ln ti vin Huyt hc Truyn mỏu trung
ng nm 2009, Tp chớ Y hc Vit Nam, tp 373; 370-374
7. inh Duy Khỏng, Chu Hong H, Phm Thỳy Hng, Nguyn Thanh Thy, Nụng
Vn Hi, ỏi Duy Ban (1997), Phõn lp tỏch dũng v xỏc nh trỡnh t gen khỏng
nguyờn b mt ca vi rỳt viờm gan B t khi u ca bnh nhõn viờm gan, Y hc

Vit Nam, 8: 12-17.
8. Trnh Th Minh Liờn (1998), Xỏc nh ADN ca vi rỳt viờm gan B trong huyt
thanh bng phn ng chui Polymerase (PCR), Y hc thc hnh, 3: 26-28.
9. Nguyn ng Mnh, Bựi i, Nguyn Trng Chớnh, Lờ Vn Don (2001), Tỡnh
hỡnh nhim vi rỳt viờm gan C (HCV) cỏc bnh nhõn viờm gan, x gan v ung
th gan, Tp chớ thụng tin Y dc, 10: 30-33.

Trần Vân Chi

8

Luận văn Thạc sĩ Khoa học


10. Vũ Tường Vân, Nguyễn Thị Hạnh, Nguyễn Xuân Quang, Nguyễn Ngọc Diệp, Lê
Khánh Trâm (2003), “ Bước đầu đánh giá tình hình nhiễm trùng phối hợp vi rút
viêm gan B và vi rút viêm gan C trên bệnh nhân HIV (+) tại bệnh viện Bạch Mai”,
Tạp chí nghiên cứu Y học, 23: 64-69.
11. Đào Ngọc Tuyền và cộng sự (2010), “Tình hình xét nghiệm các tác nhân lây qua
đường truyền máu tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học tp.HCM”, Tạp chí y học
Việt Nam, tập 373, 543-547.
12. Viêm gan và các bệnh liên quan đến gan. Từ trang web: www.cimsi.org.vn.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
13. Abe A., Inoue K., Tanaka T., Kato J., Kajiyama N., Kawaguchi R., Tanaka S.,
Yoshiba M., Kohara M. (1999), “Quantitation of hepatitis B virus genomic ADN
by real-time detection PCR”, J Clin Microbiol, 37: 2899-903.
14. Barbara R., Michelina N. (2005), “ Immunology of Hepatitis B virus and Hepatitis
C virus infection”, Nat Immunol, 5: 215-229.
15. Bukh J., Purcell RH., Miller RH. (1992), “Importance of primer selection for the
detection of hepatitis C virus ARN with the polymerase chain reaction assay”,

Proc Nat Acad Sci USA, 89: 187–191.
16. CDC (2008), Viral Hepatitis. ( />17. Choo QL., Richman KH., Han JH. (1991), “Genetic organization and diversity of
the hepatitis C virus”, Proc Natl Acad Sci USA, 88: 2451–2455.
18. C.Giachetti, J.M.Linnen, et all (2002), “Highly Sensitive Multiplex Assay for
detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 and Hepatitis C virus RNA”,
Journal of clinical microbiology, p 2408-2419.
19. Daar ES, Little S., Pitt J., Santagelo J., Ho P, Harawa N, Kemdt P, Giogi JV, Bai
J, Gaut P, Richman DA, Mandel S, Nicholas S (2001), “Diagnosis of Primary
HIV-1 Infection”, Annul Interl Med, 134: 25-29.
20. Defoort J., Martin M., Casano B.(2000), “Simultaneous detection of multiplexamplified human immunodeficiency virus type 1 ARN, hepatitis C virus ARN,
and hepatitis B virus ADN using a flow cytometer microsphere-based
hybridization assay”, J Clin Microbiol, 38:1066–1071.

TrÇn V©n Chi

9

LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc


21. Dong Hee Seo, et all (2015) “Occult hepatitis B virus infection and blood
transfusion”, World Journal of Hepatology;7(3):600-606.
22. Feinberg MB. (1996), “Changing the natural history of HIV disease”, The Lancet,
348: 239-246.
23. Glick BR., Pasternak JJ (2003), “Molecular Biotechnology: Principle and
Applifications of Recombinant ADN”, 3rd Edition, ASM Press, 199-212.
24. Guidotti LG., Chisari FV (2006), “Immunology and Pathogenesis of Viral
Hepatitis”, Annul Rev Pathol, 1: 23-61.
25. Hoffman C., Rockstroh J, Kamps BS, HIV Medicine 2006 from www.
HIVMedicine.com.

26. Highleyman L. (2008), “ World Health Organization, UNAIDS, and UNICEF
release
new
report
on
global
HIV/AIDS
treatment”
www.hivandhepatitis.com/recent/2008/060608,1-7.
27. Hu Y., Shahidi A., Park S., Guilfoyle D., Irvin Hirshfield I. (2003), “Detection of
extrahepatic Hepatitis C virus replication by a novel, highly sensitive, single-tube
nested polymerase chain reaction”, Am J Clin Pathol, 119: 95-100.
28. Hwang SJ., Lee SD. (1996), “Hepatitis C in Southeast Asia”, Medical Progress,
23: 98-201.
29. José Eduardo Levi, Ricardo Antonio D’Almeida Pereira (2013), “One window –
period donation in two years of individual donor – nucleic acid test screening for
hepatitis B, hepatitis C and human immunodeficiency virus”, Revista Brasileira de
Hematologia e Hemoterapia;35(3):167-170.
30. K. Malm, et all (2009),” Performance of three automated fourth-generation
combined HIV antigen/antibody assays in large-scale screening of blood donors
and clinical samples”, Transfusion Medicine, 19,78-88.
31. Kao JH., Chen PJ., Lai MY., Chen DS. (2002), “Genotypes and Clinical
Phenotypes of Hepatitis B virus in patients with Chronic Hepatitis D virus
Infection”, J Clin Microbiol, 40: 1207-1209.
32. Kato N. (2001), “Molecular virology of hepatitis C virus”, Acta Medica Okayama
55: 33-159.
33. Khalili M. (2006), “Coinfection with hepatitis viruses and HIV”, HIV Insite
Knowledge Base Chapter.-Nguồn www.hivinsite.ucsf.edu

TrÇn V©n Chi

10

LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc


34. Kidd-Ljunggren K., Miyakawa Y., Kidd AH. (2002), “Genetic variability in
hepatitis B viruses”, J Gen Virol, 83: 1267-80.
35. Krekulova L., Rehak V., Riley LW. (2006), “Structure and function of hepatitis C
virus proteins: 15 years after”, Folia Microbiol, 51: 665-680.
36. Kuo G., Choo QL., Alter HJ., Gitnick GL., Redeker AG, Purcell RH, Miyamura
T., Dienstag JL, Alter MJ, Stevens CE, Tegtmeier GE, Bonino F, Colombo WS,
Lee WS, Kuo C, Berger K, Shuster JR, Overby LR, Bradley DW and Houghton M
(1989), “An assay for circulating antibodies to a major etiologic virus of human
non-A, non-B hepatitis”, Science, 244: 362-364.
37. Locarnini S, M.D, (2004), “Molecular virology of Hepatitis B virus”, Serminars in
liver disease, 24: 3-10.
38. Mahoney FJ. (1999), “Update on Diagnosis, Management, and Prevention of
Hepatitis B virus infection”, Clin MicrobioL Rev, 12: 351-36.
39. Marion Vermeulen, Nico Lelie (2009), “Impact of individual-donation nucleic
acid testing on risk of human immunodeficiency virus, hepatitis B virus, and
hepatitis C virus transmission by blood transfusion in South Africa”, Transfusion;
49: 1115-1125.
40. Mercier B., Burlot L., and Ferec C.(1999), “Simultaneous screening for HBV
ADN and HCV ARN genomes in blood donations using a novel TaqMan PCR
assay”, J Virol Methods, 77: 1-9.
41. Michael NL, Herman SA, Kwok S, Dreyer K, Wang J, Christopherson C, Spadoro
JP, Young KK, Polonis V, McCutchan FE, Carr J, Mascola JR, Jagodzinski LL,
Robb ML (1999), “Development of calibrated viral load standards for group M
subtypes of human immunodeficienvy virus type 1 and performance of an

improved AMPLICOR HIV-1 MONITOR test with isolates of diverse subtypes”,
J Clin Microbiol, 37: 2557-2563.
42. Michael K.Hourfar, Christine Jork, et all (2008) “Experience of German Red
Cross blood donor services with nucleic acid testing: results of screening more
than 30 million blood donations for human immunodeficiency virus-1, hepatitis C
virus, and hepatitis B virus”, Transfusion; 48:1558-1566.

TrÇn V©n Chi

11

LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc


43. Peter M. (2004), “Coinfection with HIV and HBV: Diagnosis and Therapy”, The
PRN notebook, 9: 14-23.
44. Prasun Bhattacharya (2007), “Significant increase in HBV, HCV, HIV and
syphilis infections among blood donors in West Bengal, Eastern India. 2004-2005:
Exploratory screening reveals high frequency of occult HBV infection”, World J
Gastroenterol; 13(27):3730-3733.
45. Roche, Cobas Taq screen MPX test.
46. Raymond D., Swan T (2004), Hepatitis C virus (HCV) and HIV/HCV coinfection:
A critical review of research and treatment, Treatment Action Group, New York,
16: 266-288.
47. Rekha Hans and Neelam Marwaha (2014), “Nucleic acid testing- benefits and
constraints”, Asian Journal Transfusion Science; 8(1):2-3.
48. R.N.Makroo, N.Choudhury, et all (2008) “Multicenter evaluation of individual
donor nucleic acid testing (NAT) for simultaneous detection of human
immunodeficiency virus-1&hepatitis B&C viruses in Indian blood donors”, Indian
Journal Medical Res 127, pp 140-147.

49. Satyam Arora, Veena Doda (2014), “Sensitivity of individual donor nucleic acid
testing (NAT) for the detection of hepatitis B infection by studying diluted NAT
yield samples”, Blood transfusion; 13(2):227-232.
50. Silvano Wendel et al (2007), “Primary screening of blood donors by NAT testing
for HCV-RNA: Development of an “in-house” method and results”, Rev.
Inst.Med.trop.S.Paulo 49(3):177-185.
51. Soisaang Phikulsod (2009), “One-year experience of nucleic acid technology
testing for human immunodeficiency virus Type 1, hepatitis C virus, and hepatitis
B virus in Thai blood donations”, Transfusion;49:1126-1135.
52. Triques K., Coste J., Perret JL., Segarra C., Mpoudi E., Reynes J, Delaporte E,
Butcher A, Dreyer K, Herman S, Spadoro J, Peeters M (1999), “Efficiencies of
four versions of the AMPLICOR HIV-1 MONITOR test for quantification of
different subtypes of human immunodeficiency virus type 1”, J Clin Microbiol,
37: 110-116.
53. UNAIDS in Vietnam, from www.unaids.org.vn.

TrÇn V©n Chi

12

LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc


54. Vermeulen M, Coleman C, et al (2013), “Sensitivity of individual-donation and
minipool nucleic acid amplification test options in detecting window period and
occult hepatitis B virus infection”, Transfusion 53:10, 2459-2466
55. Yaseen SG., et al (2013), “Evaluation of serological transfusion-transmitted viral
diseases and mutliplex nucleic acid testing in malaysian blood donors”,
Transfusion Apheresis Scientic, 49(3), 647-510.
56. Warner C., Greene(2007), “A history of AIDS: Looking back to see ahead”, Eur J

Immunol, 37: 94-102.
57. WHO (2000), Hepatitis C virus Fact sheet, No 164.
58. World Health Organization (2002), Hepatitis B. Department of Communicable
Disease Surveillance and Response.
59. WHO (2012), “The Immunological Basis for Immunization Series”, Module 22:
Hepatitis B.
60. WHO (2014), “Guidelines for the screening, care and treatment of persons with
hepatitis C infection”.
61. WHO (2015), “Guidelines for the prevention, care and treatment of persons with
chronic hepatitis B infection”.
62. www.foundation.org.vn.
63. www.hivandhepatitis.com
64. />
TrÇn V©n Chi

13

LuËn v¨n Th¹c sÜ Khoa häc