1 phương pháp sắc ký

BÀI 1: NHỮNG KHÁI NIỆM CHUNG
I. Định nghĩa
Sắc ký là quá trình tách liên tục
từng vi phân hỗn hợp các chất do
sự phân bố không đồng đều của
chúng giữa pha tĩnh và pha động
khi cho pha động đi xuyên qua
pha tĩnh.


II Phân loại
II.1 Phân loại theo trạng thái của pha động và pha tĩnh
SK lỏng (LG, HPLG)
Pha động:
SK khí (GC)
Chất rắn
Pha tĩnh:
Chất lỏng (mang trên
chất rắn)


II.2 Phân loại theo cơ chế của quá trình tách
a. Sắc ký hấp phụ: Sự tách do ái lực khác nhau của các chất
đối với chất hấp phụ rắn (pha tĩnh).
b. Sắc ký phân bố: Dựa vào độ tan khác nhau (sự phân bố
khác nhau) của các chất pha động vào
trong pha tĩnh lỏng.
c. Sắc ký trao đổi ion: Sự tách do ái lực khác nhau của các
ion trong dung dịch pha động với các
trung tâm trao đổi ion trên pha tĩnh rắn
(nhựa trao đổi ion).

d. Sắc ký rây phân tử: Dựa vào kích thước lỗ xốp nhất định
của vật liệu pha tĩnh rắn để rây chọn lọc
các cấu tử pha động.


II.3 Phân loại theo cách hình thành sắc đồ: Phương pháp
tiền lưu; Phương pháp đẩy; Phương pháp rửa giải

A+B
B
A


II.4 Phân loại theo thiết bị hình thành sắc đồ: Sắc ký cột
và sắc ký phẳng (giấy, lớp mỏng)

(Sắc đồ)
(Sắc phổ của B)
Sắc phổ
(Sắc đồ)

Sắc ký cột

Sắc ký lớp mỏng


BÀI 2: SẮC KÝ LỚP MỎNG
I. Nguyên tắc:
Quá trình tách hỗn hợp các chất xảy
ra khi cho pha động di chuyển qua

pha tĩnh.

A

B

-Pha tĩnh được rãi thành lớp mỏng
trên tấm kính hoặc tấm kim loại.
-Pha động thông thường đi từ dưới
lên dưới tác dụng của lực mao quản

C
A+B+C


II Các đại lượng đặc trưng
II.1 Hệ số di chuyển ( Rf )
Tuyến
dung môi

Rf = a/b
Rf = vct/vdm

b

0 ≤ Rf ≤ 1

a

Rx = Rf chất phân tích / Rf chất chuẩn

Tuyến (điểm)
xuất phát
Dung môi

= achất phân tích / achất chuẩn


II.2 Hệ số tách
∆Rf là hiệu Rf của 2 cấu tử lân cận. ∆Rf càng lớn độ chọn
−∆
lọc lớp mỏng càng tốt.
- Hệ số tách K:

KA
K=
KB

KA, KB: hệ số phân bố của 2 cấu tử A, B ứng với 2 vệt lân
cận


III Kỹ thuật tiến hành sắc ký lớp mỏng
III.1 Chuẩn bị bản mỏng, lớp mỏng (pha tĩnh)
-Làm sạch đế bản: rửa nước, rửa bằng sulfocromic, làm sạch
vết dầu mở, rửa bằng nước cất, sấy khô.
- Tạo lớp mỏng chất hấp phụ trên đế bản:
+ lớp mỏng không dính: lăn tạo lớp 0,5 – 1mm
+ lớp mỏng dính: trát, tưới, nhúng, phun
- Để khô trong không khí hoặc sấy 1100C

III.2 Đưa mẫu lên bản
Lượng mẫu không quá
nhiều, không quá ít. Thông
thường 0,001 – 0,005mL ở
dạng chấm, 0,1 – 0,2 mL ở
dạng vạch. Sau đó để khô
trong không khí.

1cm

0,8-1 cm

>1cm

1,5 cm


Quy tắc chọn hệ sắc ký
I

Phân cực

II

Hoạt tính hấp
phụ (silicagel,
nhôm oxit)

Dung môi

III
IV

Không phân
cực

V

Không phân
cực

Phân cực
Hỗn hợp tách

Hoạt tính silicagel
Lượng nước, %

I
0

II
10

III
12

IV
15

V
20


III.3 Triễn khai sắc đồ (phương pháp sắc ký đi lên)
-Bình sắc ký kín, cao hơn bản 3-5cm
-Đặt bản vào bình thẳng đứng hoạt nghiên 150 so với
phương thẳng đứng

150


-Bão hòa dung môi, đặc biệt những dung môi có độ nhớt
cao, khó bay hơi.
-Đoạn đường dung môi thấm không quá 10-12cm.
Ngoài ra còn có sắc ký đi xuống, sắc ký hai chiều (vuông
góc), sắc ký liên tục, sắc ký lặp, sắc ký đa bậc
III.4 Hiện sắc đồ
-Phương pháp hóa học: Phun lên bản các thuốc thử tương
ứng với chất phân tích.
-Phương pháp quang học: Phun dung dịch chất hiện huỳnh
quang, mẫu phân tích xuất hiện vệt sáng dưới tia tử ngoại.


SẮC KÝ ĐỒ SẮC KÝ LỚP MỎNG CÁC MẪU Ô DƯỢC

A. Sắc ký đồ dưới ánh sáng tử ngoại 254nm
B. Sắc ký đồ dưới ánh sáng tử ngoại 366nm
C. Sắc ký đồ dưới ánh sáng thường. Hiện màu bằng Vanilin/ H 2SO4

Sắc đồ dịch chiết dược liệu
1. Khổ sâm
2. Ma hoàng
3. Vông nem
4. Ba gạc (rễ)
5. Thạch hộc
6. Mã tiền


III.5 Phân tích định tính
- Nhận biết chất qua màu đặc trưng của vệt sắc ký
- Đối chiếu giá trị Rf với mẫu chuẩn
Hình ảnh sắc ký đồ của
thuốc phiện
B1: mẫu thử
mẫu chuẩn: Mor - Morphin,
Co - Codein, He - Heroin,
Na - Nacotin, Pa papaverin


III.6 Phân tích định lượng
-Định lượng trực tiếp trên sắc đồ thông qua việc đánh giá
diện tích vệt hoặc cường độ màu của vệt bằng mắt thường
hoặc máy đo màu (sai số 5-20%).
- Tách chất khỏi sắc đồ: chuyển vệt chất cần phân tích vào
bình, xác định hàm lượng bằng phương pháp khác.


BÀI 3: SẮC KÝ CỘT

I. SẮC KÝ HẤP PHỤ LỎNG
I.1 NGUYÊN TẮC: Sự tách do khả năng bị hấp phụ khác
nhau của các cấu tử trong hỗn hợp cần tách (mẫu) với chất
hấp phụ (pha tĩnh)
Pha tĩnh phân cực, hấp phụ cấu tử phân cực > cấu tử không
phân cực.
Pha tĩnh và cấu tử đều phân cực, cấu tử bị hấp phụ trong
dung môi không phân cực > trong dung môi phân cực.


Các loại lực hấp phụ:
- Lực Van Der Waals: lực vật lý
- Hấp phụ hóa học: hình thành liên kết hóa học
- Liên kết hydro: hình thành liên kết hydro
I.2 CÁC CÁCH HÌNH THÀNH SẮC ĐỒ
- Phương pháp tiền lưu (ít dùng)
- Phương pháp đẩy
- Phương pháp rửa giải (thường dùng)


I.3 CHỌN HỆ SẮC KÝ HẤP PHỤ
I.3.1 CHỌN CHẤT HẤP PHỤ (pha tĩnh)
-Không tương tác hóa học với chất cần tách, không có hoạt
tính xúc tác
-Tính chọn lọc cao, tức là có ái lực hấp phụ với các cấu tử
trong mẫu khác nhau càng nhiều càng tốt
-Diện tích bề mặt riêng và kích thước hạt phải thích hợp.
Khi ∆Rf lớn có thể dùng cỡ hạt thô và ngược lại
-Độ ổn định cao nhằm thu được kết quả trùng lặp.
Các chất hấp phụ thường gặp: Silicagen (SiO2.xH2O),

Nhôm oxit (γ-Al2O3), than hoạt tính, điatonit …


I.3.2 CHỌN DUNG MÔI (pha động) – PP rửa giải
-Hòa tan tương đối tốt tất cả các cấu tử trong mẫu
-Bị hấp phụ tốt thiểu trên pha tĩnh
-Không phản ứng hóa học với cấu tử trong mẫu và chất hấp
phụ
-Độ tinh khiết của dung môi.
Thông thường rửa liên tiếp bằng các dung môi có khả
năng giải hấp cấu tử phân tích tăng dần.
Có thể chọn dung môi theo dãy elutrop sau:


Dung môi

Hằng số Dung môi
điện môi

Hằng số
điện môi

Nước

81,0

Cloroform

5,2

Axit axetic

31,2

Benzen

2,3

Ancol metylic

31,2

Toluen

2,3

Ancol etylic

25,8

Cacbon tetraclotua

2,2

Ancol n-propylic

22,8

Xiclohexan

2,0

Aceton

21,5

Ete dầu hỏa

1,9

Đicloetan

10,4

Ete etylic

4,4

Hằng số điện môi giảm, khả năng giải hấp giảm đối với
chất hấp phụ phân cực, chất hấp phụ không phân cực thì
ngược lại


I.4 CỘT SẮC KÝ
- Vật liệu làm cột: thủy tinh,
thép, nhôm, đồng, nhựa …
-Cột không quá ngắn, không quá
dài, thông thường chiều dài gấp
40-100 lần đường kính.
- Dùng phương pháp đi lên hoặc

đi xuống để tách, có hoặc không
có tạo áp suất chân không, áp
suất cao.


I.5 LẤY MẪU VÀ PHÂN TÍCH MẪU
-Phân tích trực tiếp các lớp trên cột
-Phân tích dung dịch chảy ra khỏi cột: đo chỉ số khúc
xạ, mật độ quang, độ dẫn điện, độ phóng xạ …


II. SẮC KÝ RÂY PHÂN TỬ (SẮC KÝ GEN)
II.1 NGUYÊN TẮC
Dựa vào khả năng thẩm thấu của các phân tử
chất tan vào trong khung gen hoặc chui vào lỗ
của các rây phân tử.
Mức độ xâm nhập của các phân tử chất tan phụ
thuộc vào kích thước và cấu hình của chúng.

Chất tan
Pha động

Pha tĩnh