CÁC PHƯƠNG PHÁP sắc ký cột

TS: Ngô Đại Nghiệp
Lớp: SHO7B1
Nhóm 4

MSSV

 Nguyễn Đinh Diễm Thụy

30700514
 Huỳnh Thị Lệ Phương
 Nguyễn Anh Tôn
 Trần Quốc Nhẫn

30760857
30700536
30700342


 Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ

protein tinh sạch chúng ta có thể xác định được
trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa
các protein trong những cá thể khác nhau và khảo
sát các chức năng sinh hóa của các protein đó.
 Để tinh sạch protein, người ta thường dựa vào
các đặc điểm tương đồng và các tính chất khác
nhau vốn có của nó.
 Trong một số trường hợp, để dễ dàng hơn cho
việc tinh sạch, người ta gắn vào protein một đuôi
acid amin (tag) - tạo ra dạng protein dung hợp
(fusion protein).

Tủa protein
Thẩm tích
Siêu lọc
Sắc ký (Sắc ký giấy, sắc ký cột, Sắc ký lỏng – khí,
Sắc lý ái lực miễn dịch, Sắc ký ái lực, Sắc ký trao
đổi ion, Sắc ký cao áp lỏng…)
 Điện di protein (điện đi trên gel Agarose, điện di
trên gel Polyacrylamide, điện di protein theo
điểm đẳng điện… )
Phương pháp tốt nhất để phân đoạn protein là
sắc ký cột (column chromatography).






Sắc ký (Chromatography) là một phương
pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh
học phân tử vì nó thích hợp với nhiều loại
hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được
sử dụng ngay cho việc định lượng và định
danh.



Sắc ký cột là phương pháp mà chất nhồi
(là pha tĩnh: hấp phụ, trao đổi ion, phân bố

gen) được nhồi vào cột, dùng để phân chia
các chất trong hỗn hợp và tinh chế các
chất. Thông thường, người ta hoà tan hỗn
hợp chất nghiên cứu vào một dung môi
(pha động) với lượng vừa đủ, rồi nạp lên
cột theo cách phù hợp sao cho chất
nghiên cứu lan thành một lớp phẳng lên
cột; sau đó, tiến hành sắc ký.


Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân
bố khác nhau của các chất giữa hai pha
động và tĩnh. Có nhiều nguyên nhân đưa
đến sự phân bố khác nhau của các chất,
nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng
hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi
dòng pha động chuyển động qua pha
tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc
tách sắc ký.


K=Cs/Cm=Nồng độ của hợp chất trong pha
tĩnh/Nồng độ của hợp chất trong pha động.


 Dụng cụ:

 Cột sắc kí ( giống như cái buret), gồm 1 ống thủy

tinh và 1 cái khóa, nhưng không cần vạch chia

độ, kích thước lớn hoặc nhỏ tùy yêu cầu sử
dụng
 Chất nhồi cột (pha tĩnh, stationary phase,
thường dùng silicagel,) Chất nhồi cột quyết
định quá trình sắc kí.
 Dung môi: thông thường chọn dung môi phụ
thuộc vào chất nhồi cột.


 Thực hiện:

Bước 1 là nhồi cột: Sau khi đã chọn cột, làm khô
và cân silicagel cần dùng, pha dung môi chạy hệ
rồi thì hòa tan silicagel vào dung môi đó.
Bước 2 nạp mẫu chất vào: Có 2 loại nạp mẫu là
nạp mẫu khô và nạp mẫu ướt.
Bước 3: sau khi hoàn tất việc nạp mẫu rồi thì lót
1 miếng bông gòn ở bên trên mẫu chất để ổn
định hệ rồi tiếp tục châm dung môi vào, từ từ
thay đổi độ phân cực của hệ, Bước 4 mở khóa:
lúc này cột bắt đầu tách chất, hứng lượng dung
môi chảy ra, mỗi lần hứng khoảng 1/5 hũ .Sau đó đem

chấm bản các hủ bi, những hủ có vệt tương tự nhau sẽ
được gom lại, đó là 1 chất. Tiếp tục như vậy thì cuối cùng
ta sẽ tách được các chất mong muốn.


Đây là phương pháp sắc ký đơn giản
nhất. ví dụ, hai chất A và B liên tục chảy

qua cột có nạp sẵn các các chất hấp phụ.
Người ta xác định nồng độ các cấu tử
trong dung dịch chảy ra khỏi cột và xây
dựng đồ thị theo hệ toạ độ: nồng độ cấu
tử- thể tích dung dịch chảy qua cột. đồ
thị này thường gọi là sắc ký đồ hay
đường cong thoát (có tác giả gọi là
đường cong xuất).



Trong phương pháp rửa giải, đầu tiên người
ta cho Vml dung dịch chứa hỗn hợp các cấu tử
(ví dụ, hỗn hợp hai cấu tử A và B, trong đó A
có ái lực với cột nhỏ hơn B) chạy qua cột. Các
cấu tử A, B chứa trong Vml trước hết sẽ bị giữ
lại ở phần trên của cột. Sau đó cho dung dịch
rửa (thường là dung môi hoà tan các cấu tử)
chảy qua cột. Lúc đó các cấu tử bị giữ ở phần
trên của cột sẽ bị dung môi “rửa” và đưa dẫn
xuống phía dưới. Cấu tử A có ái lực với cột
nhỏ hơn B nên chuyển động xuống phía
dưới nhanh hơn B.



Trong phương pháp rửa đẩy, sau khi
đưa mẫu vào cột, ta cho chảy qua cột một
dung dịch rửa chứa chất có ái lực với
pha tĩnh lớn hơn các cấu tử cần tách.

Các cấu tử cần tách sẽ bị chuyển dần
xuống phía dưới khi ta tiến hành quá
trình rửa cột và tuần tự thoát ra khỏi
cột. Cấu tử thoát ra khỏi cột đầu tiên là
cấu tử tương tác với pha tĩnh yếu nhất,
sau đó dần dần đến các cấu tử có ái lực
với cột mạnh dần.


V. PHÂN LOẠI CÁC
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ:


Pha tĩnh: có thể là chất rắn hoặc
chất lỏng.
 Pha tĩnh là chất rắn : thường là
alumin hoặc silica gel đã được xử
lý, nó có thể nạp nén vào trong một
cột
 Pha tĩnh là chất lỏng: có thể là một
chất lỏng được tẩm lên bề mặt một
chất mang rắn hoặc một chuỗi dây
carbon dài được gắn lên trên chất
mang rắn.


Pha động : có thể là chất lỏng hoặc
chất khí.
 Pha động là chất khí: thí dụ trong
kỹ thật sắc ký khí. Trong trường

hợp này chất khí được gọi là khí
mang hay khí vecto.
 Pha động là chất lỏng: thí dụ trong
kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp
mỏng, sắc ký cột. Trong trường hợp
này chất lỏng được gọi là dung môi
giải ly (eluant).


Sắc ký phân chia (Partition chromatography)
 Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc
ký khí).
 Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều

dày rất mỏng, chất lòng này được nối hóa học
lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn mịn và
có tính trơ.


Sắc ký hấp thu (Adsorption
chromatography)
 Pha động là chất lỏng hoặc chất khí
 Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt rắn

nhuyễn mịn, có tính trơ, được nhồi trong
một cái ống. bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha
tĩnh thường sử dụng là những hạt silica gel
hoặc alumin.

Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange
chromatography)
 Pha động chỉ có thể là chất lỏng.
 Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu

rất nhỏ, có cấu tạo hóa học là polymer nên
gọi là hạt nhựa. Bề mặt của hạt mang các
nhóm chức hóa học ở dạng ion. Có hai
loại nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa
trao đổi cation.




Sắc ký lọc gel ( Size exclusion
chromatography; gel filtration

chromatography)

 Pha động chỉ có thể là chất lỏng.
 Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt

hình cầu bằng polymer, trên bề mặt có
nhiều lỗ rỗng.