Bài thuyết trình Các phương pháp sắc kí cột ppt

TS: Ngô Đại Nghiệp
Lớp: SHO7B1
Nhóm 4 MSSV


Nguyễn Đinh Diễm Thụy
30700514

Huỳnh Thị Lệ Phương 30760857

Nguyễn Anh Tôn 30700536

Trần Quốc Nhẫn 30700342

Đỗ Minh Trí 30760942

Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein
tinh sạch chúng ta có thể xác định được trình tự acid
amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các protein trong
những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng
sinh hóa của các protein đó.

Để tinh sạch protein, người ta thường dựa vào
các đặc điểm tương đồng và các tính chất khác nhau
vốn có của nó.

Trong một số trường hợp, để dễ dàng hơn cho việc
tinh sạch, người ta gắn vào protein một đuôi acid
amin (tag) - tạo ra dạng protein dung hợp (fusion
protein).


Tủa protein

Thẩm tích

Siêu lọc

Sắc ký (Sắc ký giấy, sắc ký cột, Sắc ký lỏng – khí, Sắc
lý ái lực miễn dịch, Sắc ký ái lực, Sắc ký trao đổi ion,
Sắc ký cao áp lỏng…)

Điện di protein (điện đi trên gel Agarose, điện di trên
gel Polyacrylamide, điện di protein theo điểm đẳng
điện… )
Phương pháp tốt nhất để phân đoạn protein là sắc
ký cột (column chromatography).
Sắc ký (Chromatography) là một phương pháp
phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân
tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và
sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay
cho việc định lượng và định danh.


Sắc ký cột là phương pháp mà chất nhồi (là
pha tĩnh: hấp phụ, trao đổi ion, phân bố gen)
được nhồi vào cột, dùng để phân chia các chất
trong hỗn hợp và tinh chế các chất. Thông
thường, người ta hoà tan hỗn hợp chất
nghiên cứu vào một dung môi (pha động) với
lượng vừa đủ, rồi nạp lên cột theo cách phù
hợp sao cho chất nghiên cứu lan thành một

lớp phẳng lên cột; sau đó, tiến hành sắc ký.
Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố
khác nhau của các chất giữa hai pha động
và tĩnh. Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự
phân bố khác nhau của các chất, nhưng
chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ -
phản hấp phụ của các chất khi dòng pha
động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên
nhân chủ yếu của việc tách sắc ký.



K=Cs/Cm=Nồng độ của hợp chất trong pha
tĩnh/Nồng độ của hợp chất trong pha động.

Dụng cụ:

Cột sắc kí ( giống như cái buret), gồm 1 ống thủy
tinh và 1 cái khóa, nhưng không cần vạch chia độ,
kích thước lớn hoặc nhỏ tùy yêu cầu sử dụng

Chất nhồi cột (pha tĩnh, stationary phase, thường
dùng silicagel,) Chất nhồi cột quyết định quá trình
sắc kí.

Dung môi: thông thường chọn dung môi phụ thuộc
vào chất nhồi cột.
Thực hiện:
Bước 1 là nhồi cột: Sau khi đã chọn cột, làm khô và
cân silicagel cần dùng, pha dung môi chạy hệ rồi thì

hòa tan silicagel vào dung môi đó.
Bước 2 nạp mẫu chất vào: Có 2 loại nạp mẫu là nạp
mẫu khô và nạp mẫu ướt.
Bước 3: sau khi hoàn tất việc nạp mẫu rồi thì lót 1
miếng bông gòn ở bên trên mẫu chất để ổn định hệ
rồi tiếp tục châm dung môi vào, từ từ thay đổi độ
phân cực của hệ, Bước 4 mở khóa: lúc này cột bắt
đầu tách chất, hứng lượng dung môi chảy ra, mỗi lần
hứng khoảng 1/5 hũ .Sau đó đem chấm bản các hủ bi,
những hủ có vệt tương tự nhau sẽ được gom lại, đó là 1
chất. Tiếp tục như vậy thì cuối cùng ta sẽ tách được các
chất mong muốn.
Đây là phương pháp sắc ký đơn giản nhất.
ví dụ, hai chất A và B liên tục chảy qua cột
có nạp sẵn các các chất hấp phụ. Người ta
xác định nồng độ các cấu tử trong dung
dịch chảy ra khỏi cột và xây dựng đồ thị
theo hệ toạ độ: nồng độ cấu tử- thể tích
dung dịch chảy qua cột. đồ thị này thường
gọi là sắc ký đồ hay đường cong thoát (có
tác giả gọi là đường cong xuất).
Trong phương pháp rửa giải, đầu tiên người ta
cho V
ml
dung dịch chứa hỗn hợp các cấu tử (ví
dụ, hỗn hợp hai cấu tử A và B, trong đó A có ái
lực với cột nhỏ hơn B) chạy qua cột. Các cấu tử
A, B chứa trong V
ml

trước hết sẽ bị giữ lại ở phần
trên của cột. Sau đó cho dung dịch rửa (thường
là dung môi hoà tan các cấu tử) chảy qua cột.
Lúc đó các cấu tử bị giữ ở phần trên của cột sẽ
bị dung môi “rửa” và đưa dẫn xuống phía dưới.
Cấu tử A có ái lực với cột nhỏ hơn B nên chuyển
động xuống phía dưới nhanh hơn B.
Trong phương pháp rửa đẩy, sau khi đưa
mẫu vào cột, ta cho chảy qua cột một dung
dịch rửa chứa chất có ái lực với pha tĩnh lớn
hơn các cấu tử cần tách. Các cấu tử cần tách
sẽ bị chuyển dần xuống phía dưới khi ta tiến
hành quá trình rửa cột và tuần tự thoát ra
khỏi cột. Cấu tử thoát ra khỏi cột đầu tiên là
cấu tử tương tác với pha tĩnh yếu nhất, sau
đó dần dần đến các cấu tử có ái lực với cột
mạnh dần.
V. PHÂN LOẠI CÁC
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ:
Pha tĩnh: có thể là chất rắn hoặc chất
lỏng.

Pha tĩnh là chất rắn : thường là alumin
hoặc silica gel đã được xử lý, nó có thể
nạp nén vào trong một cột

Pha tĩnh là chất lỏng: có thể là một
chất lỏng được tẩm lên bề mặt một
chất mang rắn hoặc một chuỗi dây

carbon dài được gắn lên trên chất
mang rắn.
Pha động : có thể là chất lỏng hoặc
chất khí.

Pha động là chất khí: thí dụ trong kỹ
thật sắc ký khí. Trong trường hợp này
chất khí được gọi là khí mang hay khí
vecto.

Pha động là chất lỏng: thí dụ trong kỹ
thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc
ký cột. Trong trường hợp này chất
lỏng được gọi là dung môi giải ly
(eluant).
Sắc ký phân chia (Partition chromatography)

Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký
khí).

Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày
rất mỏng, chất lòng này được nối hóa học lên bề
mặt của những hạt rắn, nhuyễn mịn và có tính
trơ.
Sắc ký hấp thu (Adsorption
chromatography)

Pha động là chất lỏng hoặc chất khí

Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt rắn nhuyễn

mịn, có tính trơ, được nhồi trong một cái ống.
bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thường sử
dụng là những hạt silica gel hoặc alumin.
Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange
chromatography)

Pha động chỉ có thể là chất lỏng.

Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất
nhỏ, có cấu tạo hóa học là polymer nên gọi là
hạt nhựa. Bề mặt của hạt mang các nhóm chức
hóa học ở dạng ion. Có hai loại nhựa: nhựa
trao đổi anion và nhựa trao đổi cation.
Sắc ký lọc gel ( Size exclusion
chromatography; gel filtration
chromatography)

Pha động chỉ có thể là chất lỏng.

Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt
hình cầu bằng polymer, trên bề mặt có
nhiều lỗ rỗng.