Kỹ thuật SAC KY COT

II. SẮC KÝ CỘT
1. KHÁI NIỆM:
Sắc kí cột là phương pháp dùng để tách
các chất (cấu tử) ra khỏi hỗn hợp dựa vào tính phân
cực của từng chất.


II. SẮC KÝ CỘT
NGUYÊN TẮC:
 Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách riêng
các thành phần trong một hỗn hợp bằng cách phân
chia chúng thành 2 pha: pha động và pha tĩnh.
 Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống thủy
tinh thẳng đứng gọi là “cột” với chất hấp phụ
đóng ai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai
trò pha động chảy qua chất hấp phụ.


II. SẮC KÝ CỘT
NGUYÊN TẮC:
 Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp tùy
theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của
nó đối với dung môi rửa cột để được lấy ra lần
lượt trước hoặc sau.
 Chất hấp phụ trong sắc ký cột thường dùng oxid
nhôm, silicagel,CaCO3, than hoạt tính,
polyamid,… các chất này phải được tiêu chuẩn
hóa.
 Dung môi dùng có thể là 1, 2 hoặc 3 loại dung
môi có tỉ lệ thích hợp.

II. SẮC KÝ CỘT
NGUYÊN TẮC:
 Với các chất hấp phụ cổ điển dung môi sử
dụng có độ phân cựa tăng dần.
 Cột là những ống làm bằng thủy tinh, đầu dưới
có khóa, đầu trên có mút mài để nối với nhiều
loại kích cỡ lớn nhỏ.
 Việc lựa chọn kích thước cột rất quan trọng.
Thông thường cột có đường kính nhỏ và chiều
dài càng dài thì sự tách càng tốt.


II. SẮC KÝ CỘT
2. ĐIỀU KIỆN:
• Sắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất khí
quyển.
• Pha tĩnh là những hạt có kích thước tương đối
lớn (50-150um), được nạp trong cột thủy tinh.


II. SẮC KÝ CỘT
2. ĐIỀU KIỆN:
• Mẫu chất cần phân tích được đặt trên đầu cột,
phía trên pha tĩnh (có một lớp thủy tinh che chở
để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung
môi giải ly được đặt phía trên cao.
• Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột
được hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn ra

của cột


II. SẮC KÝ CỘT
3. ƯU – NHƯỢC ĐIỂM:
 Ưu điểm:
 Sắc ký cột cũng có ưu điểm là pha tĩnh và các dụng
cụ rẻ tiền, dễ kiếm.
 Có thể triển khai với một lượng mẫu tương đối lớn.

 Nhược điểm:
Tuy vậy, phương pháp này thường làm cho quá trình
tách bị chậm, hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao áp
(HPLC).


II. SẮC KÝ CỘT
4. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:
Lựa chọn chất hấp thu
Lựa chọn dung môi
Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột
Nạp mẫu


II. SẮC KÝ CỘT
4. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:
(1) Lựa chọn chất hấp thu:
Pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chất không
phân cực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân
cực được giải ly sau.

Với 2 phân tử không phân cực, phân tử nào có
trọng luợng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh
hơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên
di chuyển ra khỏi cột chậm hơn so với các phân tử
nhỏ, và cũng có khi nóở lại lâu hơn trong cột so với
phân tử tuy có tính phân cực.


II. SẮC KÝ CỘT
•4.  CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:
(2) Lựa chọn dung môi:
Mẫu cần sắc ký đuợc hoà tan hoàn toàn trong
dung môi phù hợp với nồng độ 10mg/ml, gọi là
dung dịch mẫu (A).
Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2,5x10cm. Chấm
lên những tấm bản này mỗi tấm khoảng 2-5l dd(A).
Mỗi bản mỏng được triển khai với một loại dung
môi giải ly khác nhau, kế đó phát hiện bằng đèn
UV hay thuốc thử.


II. SẮC KÝ CỘT
4. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:
(2) Lựa chọn dung môi:
Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung
môi nào phù hợp.
Từ kết quả đó, cố gắng tìm một hỗn hợp dung
môi, trong đó một dung môi phân cực và một dung
môi kém phân cực thí dụ như ete dầu hỏa: etyl
acetate.

II. SẮC KÝ CỘT
4. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:
(3) Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột:
Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho
dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3
chiều cao cột.
Cho chất hấp thu dạng khô vào thẳng trong cột,
đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa khỏ
nhẹ vào thành cột.


II. SẮC KÝ CỘT
4. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:
(3) Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột:
Khi lớp chất hấp thu đạt được chiều cao khoảng
2cm trong cột, thì mở nhẹ khoá ở bên dưới để cột
để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher
trống để bên dưới cột, dung môi này dẽ được rót lại
lên đầu cột.
Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua chất
hấp thu vài lần đến khi chất hấp thu trong cột đồng
nhất.


II. SẮC KÝ CỘT
4. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:
(4) Nạp mẫu:
Mẫu ở dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc

ký. Nếu mẫu ở dạng rắn thì hoà tan mẫu chất vào
trong một lượng nhỏ dung môi, loại dung môi cho
khởi đầu sắc ký.



II. SẮC KÝ CỘT
5. THỰC HIỆN NẠP MẪU LÊN CỘT:
Gồm 7 bước như sau:
• Bước 1: Mở khoá cho dung môi chảy ra khỏi cột để
hạ mức dung môi trong cột xuống sao cho vừa sát
với mặ thoáng của chất hấp thu trong cột.
• Bước 2: Đóng khoá lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu
cột. Muốn nạp mẫu, sử dụng một pipet hút dung dịch
mẫu chất, đặt đầu pipet gần sát mặt thoáng cảu chất
hấp thu trong cột, vừa bóp vừa rây pipet dọc quanh
thành cột cho dung dịch chảy ra theo thành trong của
cột, chạm xuống bề mặt chất hấp thu.


II. SẮC KÝ CỘT
5. THỰC HIỆN NẠP MẪU LÊN CỘT:
• Bước 3: Mở khoá bên dưới cho dung môi chảy ra
khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu được thấm hết
vào chất hấp thu trên đầu cột, cần canh chừng
không cho chất hấp thu đầu cột bị khô.
• Bước 4: Dùng pipet cho một luợng nhỏ dung
môi mới lên đầu cột, đồng thời dùng dung môi
này để rửa sạch ống mà dung dịch dính trên
thành cột.

II. SẮC KÝ CỘT
5. THỰC HIỆN NẠP MẪU LÊN CỘT:
• Bước 5: Mở khoá cho dung môi chảy ra. Lặp laị
vài lần giúp cho dung dịch mẫu thấm sâu vào
chất hấp thu, dung môi trong suốt không lây màu
của chất mẫu.
• Bước 6: Sử dụng bông thủy tinh, bông gòn, cát
hay giấy lọc đặt nhẹ lên mặt thoáng chất hấp thu
để bảo vệ mặt cột.
• Bước 7: Cho dung môi vào đầy cột để tiến hành
giải ly trên cột.



II. SẮC KÝ CỘT
6.