Kỹ thuật sắc ký bản mỏng trong phân tích định lượng kháng sinh

Báo cáo thực hành công nghệ hóa sinh.
GVHD: ThS. Trịnh Đình Khá.
Bài 1: Kỹ thuật sắc ký bản mỏng trong phân tích
định lượng kháng sinh.
I.Tiến hành thí nghiệm.
Mẫu phân tích:
Kháng sinh chuẩn : 10 µl
Mẫu HT28: 50 µl
2 mẫu : 10µ/ 1 mẫu
II. Kết quả thí nghiệm.
Sau thực hiện các bước thí nghiệm ta thu được các kết quả như sau;
- Quãng đường di chuyển của dung môi: 13cm
- Quãng đường di chuyển của mẫu;
Mẫu 1: 10 cm
Mẫu 2: 8 cm
Mẫu 3: 11,5 cm
III. Tính toán kết quả.
Hệ số di chuyển Rf = a/b
Trong đó: a là quẫng đường di chuyển của mẫu.
b là quãng đường di chuyển của dung môi.
Ta có:
Hệ số di chuyển của mẫu 1: Rf = 10/13 = 0,77
Hệ số di chuyển của mẫu 2 : Rf = 8/13 = 0,62
Hệ số di chuyển của mẫu 3: Rf = 11,5/13 = 0,88
IV. Nhận xét:
Kết quả thí nghiệm có 1 bản sắc ký với kết quả không tốt vì:
* Lượng mẫu ít.
* Hệ dung môi chưa phải là hệ dung môi thích hợp.
* Mẫu hiện vết không rõ ràng do mẫu kháng sinh lẫn tá dược.
V. Định lượng đánh giá kháng sinh.
SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học.

1
Báo cáo thực hành công nghệ hóa sinh.
GVHD: ThS. Trịnh Đình Khá.
Kỹ thuật sắc ký bản mỏng trong phân tích định lượng kháng sinh là kỹ
thuật chỉ thực hiện trong nghiên cứu, không áp dụng nhiều trong công nghiệp.
Bản sắc ký sau khi kết thúc thí nghiệm ta sẽ tiếp tục sử dụng để:
+ Khoang vùng và cạo lấy phần kháng sinh ta quan tâm.
+ Thử hoạt tính kháng khuẩn.
+ Kết tinh, tinh sạch thu sản phẩm.
+ Xác đinh cấu trúc và 1 số hệ số lý hóa.
SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học.

2
Báo cáo thực hành công nghệ hóa sinh.
GVHD: ThS. Trịnh Đình Khá.
Bài 2: Tinh sạch protein bằng sắc ký lọc gel.
I. Nguyên tắc.
Dựa vào mức độ dịch chuyển khác nhau của các phân tử có kích thước
khác nhau trong hệ thống phân tử gel sắc ký hỗn hợp các phân tử có kích
thước khác nhau đi qua cột gel dưới tác dụng của lực kéo pha động.
Các phân tử có kích thước lớn sẽ chui ra trước, các phân tử có kích thước
nhỏ sẽ chui ra sau. Thu sản phẩm theo phương pháp phân đoạn.
Khi chuẩn bị cột sắc ký cần cân bằng cột để cho cấu trúc hạt gel ổn định,
kích thước lỗ đồng đều.
II. Kết quả thí nghiệm & nhận xét.
Thu được 18 phân đoạn.
Sau khi kết thúc thí nghiệm ta thu được 18 phân đoạn chứa trong các ống
nhỏ có bịt giấy bóng kín miệng và bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các
nghiên cứu tiếp theo.

SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học.

3
Báo cáo thực hành công nghệ hóa sinh.
GVHD: ThS. Trịnh Đình Khá.
Bài 3: Xác định hoạt độ Enzyme Amilase theo
phương pháp phân tích lượng đường khử tạo
thành.
I. Nguyên tắc.
Xác đinh hoạt độ thông qua phân tích sản phẩm đường khử tạo thành
bằng phương pháp xác định hoạt độ amilase nhờ DNS.
Đơn vị của hoạt độ là lượng enzyme làm thủy phân tinh bột thành sản
phẩm tương đương 1µmol glucose ở điều kiện thí nghiệm trong 1 phút.
II. Kết quả.
Sau khi đo độ hấp phụ ở bước sóng 575nm trên máy quang phổ ta thu
được kết quả ở bảng sau.
STT ống kiểm
tra
(giá trị
OD)
Hàm lượng
đường ống
kiểm tra(b)
Ống thí
nghiệm
(OD)
Hàm
lượng
đường
ống thí

nghiệm(a)
Đơn vị
hoạt dộ
Hoạt độ
riêng
1 - 0.179 - 1.677601 0.193 1.80881 0.464854
2 - 0.172 - 1.611996 0.184 1.724461 0.444860
3 0.083 0.796626 0.180 1.686973 0.118712
4 0.188 0.761949 0.209 1.958876 0.159575
5 0.158 1.480787 0.253 2.371134 0.118712
6 0.286 2.680412
7 0.256 2.39925
8 0.252 2.361762
9 0.205 1.921275
10 0.004 0.037488 0.197 1.846298 0.241174
11 0.048 3.823805 0.135 1.26523 -0.341143
12 - 0.016 - 0.14995 0.224 2.099344 0.299905
13 0.074 0.693533 0.285 2.67104 0.263667
14 0.067 0.627929 0.478 4.47985 0.313589
15 - 0.021 - 0.19681 0.188 1.761949 0.261167
SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học.

4
Báo cáo thực hành công nghệ hóa sinh.
GVHD: ThS. Trịnh Đình Khá.
16 0.175 1.640112 0.240 2.249297 0.081224
17 0.188 1.761949 0.161 1.508903 -0.033739
18 0.074 0.693533 0.201 1.883786 0.158700
4
19 0.083 0.777882 0.448 4.198688 0.456107

Phương trình đồ thị chuẩn y = 0.1067x (1)
Với y là giá trị của OD
x là hàm lượng đường µmol/ml
Từ (1) suy ra x = y/ 0.1067 (2)
Ta có công thức đơn vị hoạt độ ((a-b).c)/ (0.25.t) (3)
Trong đó: a số µmol đường trong ống thí nghiệm
b số µmol đường ở ống kiểm tra
c độ pha loãng dung dịch (1)
t thời gian phản ứng (30 phút).
Dựa vào phương trình (2) ta tính được hàm lượng đường ở ống kiểm tra
(a,b) dựa vào phương trình (3) ta tính được hoạt độ của từng phân đoạn.
Vậy qua bảng kết quả ta tính được đơn vị hoạt độ của phân đoạn 14 là
cao nhất .
Ở phân đoạn 14 có đơn vị hoạt độ là cao nhất có nghĩa là lượng enzyme
làm thủy phân tinh bột thành sản phẩm tương đương 1 µmol glucose điều kiện
thí nghiệm là 1 phút là cao nhất so với các phân đoạn khác.
Bài 4. Định lượng protein tan theo phương pháp
lowry.
I. Nguyên lý.
SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học.

5