Nghiên cứu gen mã hóa enzyme tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi khuẩn ruột mối bằng kỹ thuật metagenomics

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Thảo

NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA ENZYME THAM GIA
THỦY PHÂN CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI KHUẨN TRONG
RUỘT MỐI BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - Năm 2015

1


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Thảo

NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA ENZYME THAM GIA
THỦY PHÂN CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI KHUẨN RUỘT
MỐI BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 01 21

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. GS. TS Trương Nam Hải
2. TS Đỗ Thị Huyền

Hà Nội - Năm 2015

2


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác
với các cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần
đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho
phép của các đồng tác giả.
Phần còn lại chưa được tác giả nào công bố trong bất kì công trình nào
khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Tác giả

Nguyễn Thị Thảo

3


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Trương Nam Hải và TS
Đỗ Thị Huyền phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã thu nhận, hướng dẫn tận tình, quan

tâm hết mực và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận án này.
Luận án được thực hiện tại phòng Kỹ thuật di truyền. Phòng Thí
nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam và được hỗ trợ bởi đề tài Nghị định thư với
Nhật Bản: “Phân lập hệ gen mã hóa cho enzyme thủy phân lignocellulose từ
khu hệ vi sinh ruột mối Việt Nam bằng kỹ thuật Metagenomics”.
Trong thời gian học tập và nghiên cứu tại phòng Kỹ thuật di truyền, tôi
đã nhận được sự giúp đỡ và sự chỉ bảo tận tình về chuyên môn của tập thể cán
bộ nghiên cứu của phòng. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó!
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến các thầy cô giáo trong Khoa
Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giảng
dạy và chỉ bảo cho tôi những kiến thức chuyên môn và kỹ năng cần thiết.
Để hoàn thành luận án, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu và
nhiệt tình của các đồng nghiệp công tác tại khoa Sinh học, Trường Đại học
Vinh, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó!
Với tất cả lòng biết ơn, tôi xin dành cho gia đình, bố mẹ, chồng và con,
những người thân đã thông cảm, động viên, tạo điều kiện và chia sẻ khó khăn
cùng tôi trong thời gian qua!

Nguyễn Thị Thảo

4


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................................. 14
1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................. 18
2. Mục tiêu của đề tài ......................................................................................... 20
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .................................................................. 20
4. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 20

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ....................................................... 20
6. Đóng góp mới của đề tài ................................................................................ 20
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................. 21
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LIGNOCELLULOSE ........................................................ 21

1.1.1. Cellulose .................................................................................................... 22
1.1.2. Hemicellulose ............................................................................................ 23
1.1.3. Lignin ......................................................................................................... 24
1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CELLULASE................................................................ 24
1.2.1. Cơ chế hoạt động của cellulase và sự thủy phân cellulose ........................ 24
1.2.2. Cấu trúc của cellulase ................................................................................ 26
1.2.2.1. Cấu trúc chung của cellulase ..................................................................... 26
1.2.2.2. Cellulosome thủy phân cellulose ............................................................. 27
1.3. CELLULASE CỦA VI KHUẨN .................................................................... 28
1.3.1. Sơ lược về họ cellulase ............................................................................... 28
1.3.2. Cellulase của vi khuẩn và vi khuẩn cổ ....................................................... 30
1.3.2.1. Cellulase vi khuẩn và vi khuẩn cổ ưa ấm ................................................ 30
1.3.2.2. Cellulase ở vi khuẩn và vi khuẩn cổ ưa nhiệt .......................................... 31
1.3.3. Ứng dụng của cellulase .............................................................................. 31
1.3.3.1. Ứng dụng của cellulase trong công nghệ sản xuất bia, rượu vang, chế
biến thực phẩm và thức ăn ......................................................................... 32
1.3.3.2. Ứng dụng cellulase trong dệt may ........................................................... 33
1.3.3.3. Ứng dụng cellulase trong chế biến bột giấy và giấy ............................... 33

5


1.3.3.4. Ứng dụng của cellulase trong sản xuất cồn sinh học .............................. 34
1.4. MỐI VÀ HỆ VI SINH VẬT RUỘT MỐI LIÊN QUAN ĐẾN SỰ THỦY PHÂN
LIGNOCELLULOSE .................................................................................................... 35

1.4.1. Sơ lược về mối và đa dạng mối ở Việt Nam .............................................. 35
1.4.2. Hệ vi sinh vật trong ruột mối bậc thấp ....................................................... 36
1.4.3. Sự tiêu hóa lignocellulose của mối ............................................................. 38
1.4.4. Tình hình nghiên cứu gen mã hóa cellulase của sinh vật trong đường
ruột mối bậc thấp ....................................................................................... 39
1.5. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ METAGENOMICS ............................................................ 41

1.5.1. Phương pháp tiếp cận tìm gen mới bằng Metagenomics ........................... 42
1.5.2. Phân lập gen từ thư viện DNA đa hệ gen .................................................. 43
1.5.3. Khai thác và phân lập gen từ dữ liệu trình tự DNA đa hệ gen .................. 45
1.5.3.1. Phương pháp giải trình tự của một số hệ thống máy thế hệ mới ............ 45
1.5.3.2. Tập hợp các read thành contig ................................................................. 47
1.5.4. Ứng dụng của Metagenomics .................................................................... 50
1.5.4.1. Ứng dụng của Metagenomics trong khai thác gen mới và đánh giá sự
đa dạng vi sinh vật ..................................................................................... 50
1.5.4.2. Tiềm năng ứng dụng của Metagenomics ................................................. 53
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................ 55
2.1. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC ......................... 55

2.1.1. Đối tượng và vật liệu .................................................................................. 55
2.1.2. Hóa chất và thiết bị máy móc ..................................................................... 56
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................................... 58
2.2.1. Các phương pháp vi sinh ............................................................................ 59
2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử ............................................................ 59
2.2.2.1. Tách chiết DNA hệ gen của mối .............................................................. 59
2.2.2.2. Phương pháp thu nhận vi khuẩn ruột mối và tách chiết DNA đa hệ
gen của chúng ............................................................................................ 59
2.2.2.3. Tinh sạch DNA đa hệ gen bằng phương pháp máng đơn (troughing) .... 60

6


2.2.2.4. Giải trình tự DNA đa hệ gen bằng máy giải trình tự thế hệ mới
HiSeq2000 của Illumina ............................................................................ 61
2.2.2.5. Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào vi khuẩn E. coli bằng sốc nhiệt ... 62
2.2.2.6. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E. coli .......... 63
2.2.2.7. Phương pháp cắt và ghép nối gen ........................................................... 63
2.2.2.8. Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose bằng QIAquick Gel
Extraction kit.............................................................................................. 64
2.2.2.9. Kỹ thuật PCR ........................................................................................... 64
2.2.2.10. Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+) mang gen egc ............................. 66
2.2.2.11. Điện di DNA trên gel agarose ............................................................... 66
2.2.2.12. Phương pháp biểu hiện gen ................................................................... 66
2.2.2.13. Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide-SDS ....................... 67
2.2.2.14. Điện di protein trên gel polyacrylamide không SDS ............................. 68
2.2.3. Các phương pháp hóa sinh protein ............................................................. 68
2.2.3.1. Phương pháp tinh chế protein bằng sắc kí ái lực his-tag ...................... 68
2.2.3.2. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford ................................... 69
2.2.3.3. Định lượng đường khử bằng phương pháp DNS ..................................... 69
2.2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính endoglucanase .................................... 70
2.2.3.5. Phương pháp xác định hoạt tính β-glucosidase và β-xylosidase ............ 71
2.2.3.6. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, các ion kim loại và một số hóa
chất lên hoạt tính endoglucanase .............................................................. 72
2.2.3.7. Xác định độ bền của enzyme ................................................................... 72
2.2.3.8. Xác định thông số động học của enzyme ................................................. 72
2.2.4. Các phương pháp tin sinh học và xử lý số liệu bằng phần mềm sinh học. 73
2.2.4.1. Phân tích trình tự DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối .............................. 73
2.2.4.2. So sánh trình tự ORF của dữ liệu DNA đa hệ gen với CSDL của NCBI ..... 74
2.2.4.3. Thiết kế mồi bằng phần mềm FastPCR ................................................... 75

2.2.4.4. Kiểm tra vị trí của các enzyme hạn chế trên gen quan tâm bằng phần
mềm trực tuyến RestrictionMapper ........................................................... 75

7


2.2.4.5. Chuyển mã trình tự DNA sang trình tự axit amin bằng chương trình
dịch mã ExPASy ......................................................................................... 75
2.2.4.6. Xây dựng cây phát sinh loài của loài mối nghiên cứu với các loài mối
khác bằng phần mềm Genedoc và MEGA5 ............................................... 75
2.2.4.7. Dự đoán cấu trúc của EGC bằng phần mềm Phyre2 .............................. 76
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................... 77
3.1. KẾT QUẢ ĐỊNH LOÀI MỐI NGHIÊN CỨU BẰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TỬ . 77

3.1.1. Tách chiết DNA hệ gen của mối................................................................. 79
3.1.2. PCR khuếch đại đoạn DNA của gen mã hóa RNA ribosome 16S ti thể mối . 79
3.1.3. Phân tích sản phẩm PCR................................................................................76
3.2. TÁCH CHIẾT, ĐỌC VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ DNA ĐA HỆ GEN VI KHUẨN
RUỘT MỐI C. gestroi ..................................................................................................... 86

3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C. gestroi ....... 86
3.2.2. Đọc và phân tích trình tự DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C. gestroi ............. 87
3.2.2.1. Tập hợp trình tự và xác định gen ............................................................. 87
3.2.2.2. Đa dạng vi sinh vật ruột mối C. gestroi ................................................... 90
3.3. GEN MÃ HÓA ENZYME THUỶ PHÂN CELLULOSE CỦA VI KHUẨN RUỘT
MỐI C. gestroi ................................................................................................................. 96

3.3.1. Dự đoán chức năng gen của DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C. gestroi..... 96
3.3.2. Gen mã hóa enzyme phân hủy cellulose .................................................... 98
3.3.3. Lựa chọn ORF cellulase để biểu hiện ....................................................... 100

3.4. TÁCH DÕNG GEN egc...................................................................................................104

3.4.1. Trình tự ORF GL0130684 ........................................................................ 105
3.4.2. Khuếch đại gen egc ................................................................................... 105
3.4.3. Ghép nối sản phẩm khuếch đại gen egc vào vector tách dòng
pJET1.2/blunt ......................................................................................... 106
3.4.4. Biến nạp sản phẩm ghép nối vào tế bào E. coli DH10b ........................... 107
3.4.5. Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme hạn chế ............................. 108

8


3.4.6. Phân tích trình tự gen wegc phân lập được từ DNA đa hệ gen vi khuẩn
ruột mối C. gestroi ................................................................................... 108
3.4.7. Khuếch đại gen egc không chứa tín hiệu tiết từ khuôn pJET-wegc ......... 111
3.4.8. Thiết kế vector biểu hiện gen egc ............................................................. 111
3.4.8.1. Ghép nối gen egc vào vector biểu hiện.................................................. 111
3.4.8.2. Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22-egc........................................... 113
3.5. BIỂU HIỆN GEN egc TRONG VI KHUẨN E. coli BL21(DE3) ................... 114

3.5.1. Chọn dòng biểu hiện gen egc trong tế bào E. coli BL21(DE3) ................ 114
3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự biểu hiện gen egc trong tế bào E. coli
BL21(DE3) .............................................................................................. 116
3.5.3. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến hiệu quả cảm ứng ............................. 117
3.5.4. Điện di và kiểm tra hoạt tính endoglucanase của EGC ............................... 119
3.5.5. Tinh chế protein EGC bằng cột sắc kí ái lực His-tag ............................... 120
3.5.6. Tính đặc hiệu cơ chất của EGC ................................................................ 124
3.5.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính endoglucanase của EGC ............. 126
3.5.8. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của EGC .............................................. 127
3.5.9. Độ bền nhiệt của EGC .............................................................................. 128

3.5.10. Ảnh hưởng của một số ion kim loại và hóa chất lên hoạt tính của EGC 128
3.5.11. Đặc điểm động học của EGC.................................................................. 132
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................................................135
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................138

9


DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt
BglB
BglF
BglG

Tên tiếng Anh
Beta-glucosidase B
Beta-glucosidase F
Beta-glucosidase G

BLAST

Basic Local Alignment
Search Tool

bp
BSA

Base pair
Bovine serum albumin

BWA

Burrows-Wheeler Aligner

CD

Carbohydrate binding
domain
Catalytic domain

cDNA

Complementary DNA

CBD

Cel12A
Cel45A
(EGV)
Cel48A
Cel5A
Cel6A
(CBHII)
Cel6B
(EGVI)
Cel7A
(CBHI)

Tên tiếng Việt
Beta-glucosidase B

Beta-glucosidase F
Beta-glucosidase G
Công cụ so sánh mức độ tương
đồng về trình tự nucleotide/axit
amin trực tuyến của NCBI
Cặp base
Albumin huyết thanh bò
Phần mềm kiểm tra các sai lệch
nhỏ trong quá trình giải trình tự các
đoạn DNA, cũng như quá trình tập
hợp so với hệ gene tham khảo lớn
Vùng liên kết với carbohydrate
Vùng xúc tác
DNA được tổng hợp từ khuôn
mRNA nhờ enzyme phiên mã
ngược reverse transcriptase

Endoglucanase glycoside
hydrolase family 12
Endoglucanase glycoside
hydrolase family 45
Exoglucanase glycoside
hydrolase family 5
Endoglucanase glycoside
hydrolase family 5
cellobiohydrolase cel6A
(cellobiohydrolase II)

Endoglucanase thuộc họ 12
Endoglucanase thuộc họ 45

Exoglucanase thuộc họ 48
Endoglucanase thuộc họ GH 5
Cellobiohydrolase II (exoglucanase
II) thuộc họ GH6

Endoglucanase EGVI

Endoglucanase thuộc họ GH 6

Cellobiohydrolase cel7A
(Cellobiohydrolase I)

Cellobiohydrolase I (exoglucanase
II) thuộc họ GH7

10


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
[1]

Nguyễn Đức Khảm, Nguyễn Tân Vương, Trịnh Văn Hạnh, Nguyễn Văn
Quảng, Lê Văn Triển., Nguyễn Thuý Hiền, Vũ Văn Nghiệm, Ngô Trường
Sơn và Võ Thu Hiền (2007), Động vật chí Việt Nam: Mối. NXB KH và KT.

[2]

Nguyễn Đức Khảm, Trịnh Văn Hạnh, Lê Văn Triển, Nguyễn Tân Vương, Vũ
Văn Nghiêm, Ngô Trường Sơn, Võ Thu Hiền, Nguyễn Thuý Hiền và Nguyễn

Văn Quảng (2002), "Thành phần loài của khu hệ mối Việt Nam", Báo cáo
hội nghị côn trùng toàn quốc lần thức IV, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr.
225–228.

Tài liệu tiếng Anh
[3]

[4]

Altermann E. and Klaenhammer T.R. (2005), "PathwayVoyager: pathway
mapping using the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)
database", BMC Genomics 6(1), pp. 60.
Amann R.I., Ludwig W. and Schleifer K.H. (1995), "Phylogenetic
identification and in situ detection of individual microbial cells without
cultivation", Microbiol. Rev. 59(1), pp. 143–169.

[5]

[6]

Arantes V. and Saddler J.N. (2010), "Access to cellulose limits the efficiency
of enzymatic hydrolysis: the role of amorphogenesis", Biotechnol. Biofuels
3(1), pp. 4.
Arumugam M., Raes J., Pelletier E., Le Paslier D., Yamada T., Mende D.R.,
Fernandes G.R., Tap J., Bruls T., Batto J.-M., Bertalan M., Borruel N.,
Casellas F., Fernandez L., Gautier L., Hansen T., Hattori M., Hayashi T.,
Kleerebezem M., Kurokawa K., Leclerc M., Levenez F., Manichanh C.,
Nielsen H.B., Nielsen T., Pons N., Poulain J., Qin J., Sicheritz-Ponten T.,
Tims S., Torrents D., Ugarte E., Zoetendal E.G., Wang J., Guarner F.,
Pedersen O., de Vos W.M., Brunak S., Doré J., MetaHIT Consortium, Antolín

M., Artiguenave F., Blottiere H.M., Almeida M., Brechot C., Cara C.,
Chervaux C., Cultrone A., Delorme C., Denariaz G., Dervyn R., Foerstner
K.U., Friss C., van de Guchte M., Guedon E., Haimet F., Huber W., van
Hylckama-Vlieg J., Jamet A., Juste C., Kaci G., Knol J., Lakhdari O., Layec
S., Le Roux K., Maguin E., Mérieux A., Melo Minardi R., M’rini C., Muller

138


J., Oozeer R., Parkhill J., Renault P., Rescigno M., Sanchez N., Sunagawa S.,
Torrejon A., Turner K., Vandemeulebrouck G., Varela E., Winogradsky Y.,
Zeller G., Weissenbach J., Ehrlich S.D. and Bork P. (2011), "Enterotypes of
the human gut microbiome", Nature 473(7346), pp. 174–180.
[7]

Berlemont R. and Martiny A.C. (2013), "Phylogenetic distribution of potential
cellulases in bacteria", Appl. Environ. Microbiol. 79(5), pp. 1545–1554.

[8]

Bhat M.K. (2000), "Cellulases and related enzymes in biotechnology",

[9]

Biotechnol. Adv. 18(5), pp. 355–383.
Bijender K B., Himani P., Masood A W., Priyanka S. and Ajay S. (2009),
"Partial purification and characterization of a highly thermostable and pH
stable endoglucanase from a newly isolated Bacillus strain M-9", Indian J.

Chem. Technol. 16, pp. 382–387.

[10] Blake R.D. (2005), Informational Biopolymers of Genes and Gene
Expression: Properties and Evolution. University Science Books.
[11] Bradford M.M. (1976), "A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding"
Anal. Biochem. 72(1–2), pp. 248–254.
[12] Breitbart M., Salamon P., Andresen B., Mahaffy J.M., Segall A.M., Mead D.,
Azam F. and Rohwer F. (2002), "Genomic analysis of uncultured marine viral
[13]
[14]

[15]

[16]

communities", Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 99(22), pp. 14250–14255.
Breznak J.A. (2002), "Phylogenetic diversity and physiology of termite gut
spirochetes" Integr. Comp. Biol. 42(2), pp. 313–318.
Brune A. (2010), Methanogens in the digestive tract of termites.
(Endo)symbiotic Methanogenic Archaea. J.H.P. Hackstein, ed. Springer
Berlin Heidelberg, p. 81–100.
Brune A. (2011), Microbial symbioses in the digestive tract of lower termites.
Beneficial microorganisms in multicellular life forms. E. Rosenberg and U.
Gophna, eds. Springer Berlin Heidelberg, p. 3–25.
Brune A. (2014), "Symbiotic digestion of lignocellulose in termite guts", Nat.

Rev. Micro. 12(3), pp. 168–180.
[17] Cai S., Li J., Hu F.Z., Zhang K., Luo Y., Janto B., Boissy R., Ehrlich G. and
Dong X. (2010), "Cellulosilyticum ruminicola, a newly described rumen
bacterium that possesses redundant fibrolytic-protein-encoding genes and

139


degrades lignocellulose with multiple carbohydrate- borne fibrolytic
enzymes", Appl. Environ. Microbiol. 76(12), pp. 3818–3824.
[18] Carson M., Johnson D.H., McDonald H., Brouillette C. and Delucas L.J.
(2007), "His-tag impact on structure", Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr.
63(Pt 3), pp. 295–301.
[19] Chien-Huang L., Hsing-Ren W. and Tsong-Rong Y. (2012), "Cloning,
purification, and characterization of a heat- and alkaline-stable endoglucanase
B from Aspergillus niger BCRC31494", Molecules. 17, pp. 9774–9789.
[20] Cho M.-J., Kim Y.-H., Shin K., Kim Y.-K., Kim Y.-S. and Kim T.-J. (2010),
"Symbiotic adaptation of bacteria in the gut of Reticulitermes speratus: low
endo-beta-1,4-glucanase activity", Biochem. Biophys. Res. Commun. 395(3),
pp. 432–435.
[21] Cole J.R., Wang Q., Cardenas E., Fish J., Chai B., Farris R.J., Kulam-SyedMohideen A.S., McGarrell D.M., Marsh T., Garrity G.M. and Tiedje J.M.
(2009), "The ribosomal database project: improved alignments and new tools
for rRNA analysis", Nucleic. Acids. Res. 37(Database issue), pp. D141–145.
[22] Coleman J., Inukai M. and Inouye M. (1985), "Dual functions of the signal
peptide in protein transfer across the membrane", Cell. 43(1), pp. 351–360.
[23] Costa-Leonardo A.M. and Haifig I. (2014), Termite communication during
different behavioral activities. Biocommunication of Animals. G. Witzany, ed.
Springer Netherlands, pp. 161–190.
[24] Culligan E.P., Sleator R.D., Marchesi J.R. and Hill C. (2014), "Metagenomics
and novel gene discovery: promise and potential for novel therapeutics"
Virulence 5(3), pp. 399–412.
[25] Dai X., Zhu Y., Luo Y., Song L., Liu D., Liu L., Chen F., Wang M., Li J.,
Zeng X., Dong Z., Hu S., Li L., Xu J., Huang L. and Dong X. (2012),
"Metagenomic insights into the fibrolytic microbiome in yak rumen", PLoS
ONE, 7(7), pp. e40430.

[26] Dashtban M., Maki M., Leung K.T., Mao C. and Qin W. (2010), "Cellulase
activities in biomass conversion: measurement methods and comparison",
Crit. Rev. Biotechnol. 30(4), pp. 302–309.
[27] Dietrich C., Kohler T. and Brune A. (2014), "The cockroach origin of the
termite gut microbiota: Patterns in bacterial community structure reflect major
evolutionary events", Appl. Environ. Microbiol. 80(7), pp. 2261–2269.

140


[28] Dimitriu (2005), Hydolysis of celulose and hemicellulose. Polysaccharides
structural diversity and fuctionnal versatility second edition. Marcel Dekker.
[29] Doi R.H. and Kosugi A. (2004), "Cellulosomes: plant-cell-wall-degrading
enzyme complexes", Nat. Rev. Microbiol. 2(7), pp. 541–551.
[30] Do T.H., Nguyen T.T., Nguyen T.N., Le Q.G., Nguyen C., Kimura K. and
Truong N.H. (2014), "Mining biomass-degrading genes through Illuminabased de novo sequencing and metagenomic analysis of free-living bacteria in
the gut of the lower termite Coptotermes gestroi harvested in Vietnam", J.
Biosci. Bioeng. 118(6), pp. 665–671.
[31] Duan C.-J., Xian L., Zhao G.-C., Feng Y., Pang H., Bai X.-L., Tang J.-L., Ma
Q.-S. and Feng J.-X. (2009), "Isolation and partial characterization of novel
genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens", J.
Appl. Microbiol. 107(1), pp. 245–256.
[32] Eichhorn S.J., Dufresne A., Aranguren M., Marcovich N.E., Capadona J.R.,
Rowan S.J., Weder C., Thielemans W., Roman M., Renneckar S., Gindl W.,
Veigel S., Keckes J., Yano H., Abe K., Nogi M., Nakagaito A.N., Mangalam
A., Simonsen J., Benight A.S., Bismarck A., Berglund L.A. and Peijs T.
(2010), "Review: current international research into cellulose nanofibres and
nanocomposites", J. Mater. Sci. 45(1), pp. 1–33.
[33] Estela R. and Luis J. (2013), Hydrolysis of biomass mediated by cellulases for
the production of sugars. Sustainable degradation of lignocellulosic biomass techniques, applications and commercialization. A. Chandel, ed. InTech.

[34] Feng Y., Duan C.-J., Pang H., Mo X.-C., Wu C.-F., Yu Y., Hu Y.-L., Wei J.,
Tang J.-L. and Feng J.-X. (2007), "Cloning and identification of novel
cellulase genes from uncultured microorganisms in rabbit cecum and
characterization of the expressed cellulases", Appl. Microbiol. Biotechnol.
75(2), pp. 319–328.
[35] Fujita A., Hojo M., Aoyagi T., Hayashi Y., Arakawa G., Tokuda G. and
Watanabe H. (2010), "Details of the digestive system in the midgut of
Coptotermes formosanus Shiraki" J Wood Sci 56(3), pp. 222–226.
[36] Georgiou G. and Valax P. (1996), "Expression of correctly folded proteins in
Escherichia coli" Curr. Opin. Biotechnol. 7(2), pp. 190–197.

141


[37] Ge W., Xiaowen Z., Keke W., Fanglin P. and Linsong W. (2012), "The
activity and kinetic properties of cellulases in substrates containing metal
ions and acid radicals", Adv Biol Chem 2(4), pp. 390–395.
[38] Gill S.R., Pop M., DeBoy R.T., Eckburg P.B., Turnbaugh P.J., Samuel B.S.,
Gordon J.I., Relman D.A., Fraser-Liggett C.M. and Nelson K.E. (2006),
"Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome", Science
312(5778), pp. 1355–1359.
[39] Gírio F.M., Fonseca C., Carvalheiro F., Duarte L.C., Marques S. and BogelŁukasik R. (2010), "Hemicelluloses for fuel ethanol: A review", Bioresour.
Technol. 101(13), pp. 4775–4800.
[40] Glenn T.C. (2011), "Field guide to next-generation DNA sequencers", Mol.
Ecol.Resour. 11(5), pp. 759–769.
[41] Guo Y., Zhu N., Zhu S. and Deng C. (2007), "Molecular phylogenetic
diversity of bacteria and its spatial distribution in composts", J. Appl.
Microbiol. 103(4), pp. 1344–1354.
[42] Haft D.H., Selengut J.D. and White O. (2003), "The TIGRFAMs database of
protein families", Nucl. Acids Res. 31(1), pp. 371–373.

[43] Hahn-Hägerdal B., Galbe M., Gorwa-Grauslund M.F., Lidén G. and Zacchi
G. (2006), "Bio-ethanol--the fuel of tomorrow from the residues of today",
Trends. Biotechnol. 24(12), pp. 549–556.
[44] Handelsman J. (2004), "Metagenomics: Application of genomics to
uncultured microorganisms", Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68(4), pp. 669–685.
[45] Hanh T.V., Hien N.T., Yen N.H. and Huyen T.T. (2010), Diversity of termite
species in Vietnam. In: The seventh conference of the pacific rim termite
research group . Singapore.
[46] Harnpicharnchai P., Thongaram T., Sriprang R., Champreda V.,
Tanapongpipat S. and Eurwilaichitr L. (2007), "An efficient purification and
fractionation of genomic DNA from soil by modified troughing method",
Lett. Appl. Microbiol. 45(4), pp. 387–391.
[47] Henne A., Daniel R., Schmitz R.A. and Gottschalk G. (1999), "Construction
of environmental DNA libraries in Escherichia coli and screening for the
presence of genes conferring utilization of 4-hydroxybutyrate", Appl. Environ.
Microbiol. 65(9), pp. 3901–3907.

142


[48] He S., Ivanova N., Kirton E., Allgaier M., Bergin C., Scheffrahn R.H.,
Kyrpides N.C., Warnecke F., Tringe S.G. and Hugenholtz P. (2013),
"Comparative metagenomic and metatranscriptomic analysis of hindgut
paunch microbiota in wood- and dung-feeding higher termites", PLoS ONE.
8(4), pp. e61126.
[49] Hess M., Sczyrba A., Egan R., Kim T.-W., Chokhawala H., Schroth G., Luo
S., Clark D.S., Chen F., Zhang T., Mackie R.I., Pennacchio L.A., Tringe S.G.,
Visel A., Woyke T., Wang Z. and Rubin E.M. (2011), "Metagenomic
discovery of biomass-degrading genes and genomes from cow rumen",
Science. 331(6016), pp. 463–467.

[50] Hogan M.E., Schulz M.W., Slaytor M., Czolij R.T. and O’Brien R.W. (1988),
"Components of termite and protozoal cellulases from the lower termite,
Coptotermes lacteus froggatt", Insect. Biochem. 18(1), pp. 45–51.
[51] Hongoh Y. (2010), "Diversity and genomes of uncultured microbial symbionts
in the termite gut", Biosci. Biotechnol. Biochem. 74(6), pp. 1145–1151.
[52] Hongoh Y., Deevong P., Inoue T., Moriya S., Trakulnaleamsai S., Ohkuma
M., Vongkaluang C., Noparatnaraporn N. and Kudo T. (2005), "Intra- and
interspecific comparisons of bacterial diversity and community structure
support coevolution of gut microbiota and termite host", Appl. Environ.
[53]

[54]

[55]
[56]

Microbiol. 71(11), pp. 6590–6599.
Hongoh Y., Ohkuma M. and Kudo T. (2003), "Molecular analysis of bacterial
microbiota in the gut of the termite Reticulitermes speratus (Isoptera;
Rhinotermitidae)", FEMS Microbiol. Ecol. 44(2), pp. 231–242.
Hongoh Y., Yuzawa H., Ohkuma M. and Kudo T. (2003), "Evaluation of
primers and PCR conditions for the analysis of 16S rRNA genes from a
natural environment", FEMS Microbiol. Lett. 221(2), pp. 299–304.
Huson D.H., Auch A.F., Qi J. and Schuster S.C. (2007), "MEGAN analysis of
metagenomic data" Genome Res 17(3), pp. 377–386.
Huson D.H., Richter D.C., Mitra S., Auch A.F. and Schuster S.C. (2009),

"Methods for comparative metagenomics" BMC Bioinformatics 10(Suppl 1),
pp. S12.
[57] Iida T., Ohkuma M., Ohtoko K. and Kudo T. (2000), "Symbiotic spirochetes

in the termite hindgut: phylogenetic identification of ectosymbiotic
spirochetes of oxymonad protists" FEMS. Microbiol. Ecol. 34(1), pp. 17–26.

143


[58] Immanuel G., Dhanusha R. and Palavesam P.P. and A. (2006), "Effect of different
growth parameters on endoglucanase enzyme activity by bacteria isolated from
coir retting effluents of estuarine environment", IJEST. 3(1), pp. 25–34.
[59] Inoue T., Moriya S., Ohkuma M. and Kudo T. (2005), "Molecular cloning and
characterization of a cellulase gene from a symbiotic protist of the lower
termite, Coptotermes formosanus", Gene. 349, pp. 67–75.
[60] Jabbar A., Rashid M.H., Javed M.R., Perveen R. and Malana M.A. (2008),
"Kinetics and thermodynamics of a novel endoglucanase (CMCase) from
Gymnoascella citrina produced under solid-state condition", J. Ind.
Microbiol. Biotechnol. 35(6), pp. 515–524.
[61] Jørgensen H., Kristensen J.B. and Felby C. (2007), "Enzymatic conversion of
lignocellulose into fermentable sugars: challenges and opportunities",
Biofuels. Bioprod. Bioref. 1(2), pp. 119–134.
[62] Joshi B., Bhatt M.R., Sharma D., Joshi J., Malla R. and Sreerama L. (2011),
"Lignocellulosic ethanol production: current practices and recent
developments", Biotechnol. Mol. Biol. Rev. 6(8), pp. 172–182.
[63] Jurkowski A., Reid A.H. and Labov J.B. (2007), "Metagenomics: A Call for
Bringing a New Science into the Classroom (While It’s Still New)", CBE
Life. Sci. Educ. 6(4), pp. 260–265.
[64] Kambhampati S. and Smith P.T. (1995), "PCR primers for the amplification of
four insect mitochondrial gene fragments", Insect. Mol. Biol, 4(4), pp. 233–236.
[65] Kato S., Haruta S., Cui Z.J., Ishii M. and Igarashi Y. (2004), "Effective
cellulose degradation by a mixed-culture system composed of a cellulolytic
Clostridium and aerobic non-cellulolytic bacteria" FEMS Microbiol. Ecol.

51(1), pp. 133–142.
[66] Kato S., Haruta S., Cui Z.J., Ishii M., Yokota A. and Igarashi Y. (2004),
"Clostridium straminisolvens sp. nov., a moderately thermophilic,
aerotolerant and cellulolytic bacterium isolated from a cellulose-degrading
bacterial community", Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54(6), pp. 2043–2047.
[67] Kennedy J., Marchesi J.R. and Dobson A.D. (2008), "Marine metagenomics:
strategies for the discovery of novel enzymes with biotechnological
applications from marine environments", Microb. Cell Fact. 7, pp. 27.

144


[68] König H. and Varma A. (2006), Cellulose digestion in the termite gut.
Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates. Springer
Science & Business Media, pp. 225–227.
[69] Kudo T. (2009), "Termite-microbe symbiotic system and its efficient
degradation of lignocellulose", Biosci. Biotechnol. Biochem. 73(12), pp.
2561–2567.
[70] Kuhad R.C., Gupta R. and Singh A. (2011), "Microbial cellulases and their
industrial applications", Enzyme. Res. 2011, pp. e280696.
[71] Kumar S., Mishra B.K. and Subramania P. (2011), Biotechnological
applications of microbial cellulases. Cellulase: Types and action, mechansim,
and use. Nova Science Pub Inc.
[72] van der Lelie D., Taghavi S., McCorkle S.M., Li L.-L., Malfatti S.A.,
Monteleone D., Donohoe B.S., Ding S.-Y., Adney W.S., Himmel M.E. and
Tringe S.G. (2012), "The metagenome of an anaerobic microbial community
decomposing poplar wood chips", PLoS ONE. 7(5), pp. e36740.
[73] Li C.-H., Wang H.-R. and Yan T.-R. (2012), "Cloning, purification, and
characterization of a heat- and alkaline-stable endoglucanase B from
Aspergillus niger BCRC31494", Molecules. 17(8), pp. 9774–9789.

[74] Li L., Fröhlich J. and König H. (2006), Cellulose digestion in the termite gut.
Intestinal microorganisms of termites and other invertebrates. P.D.H. König
and P.D.A. Varma, eds. Springer Berlin Heidelberg. 221–241.
[75] Lineweaver H. and Burk D. (1934), "The determination of enzyme
dissociation constants", J. Am. Chem. Soc. 56(3), pp. 658–666.
[76] Lin L., Kan X., Yan H. and Wang D. (2012), "Characterization of
extracellular cellulose-degrading enzymes from Bacillus thuringiensis
strains", Electron. J. Biotechnol. 15(3) .
[77] Liu L., Li Y., Li S., Hu N., He Y., Pong R., Lin D., Lu L. and Law M. (2012),
"Comparison of next-generation sequencing systems", Biomed. Res. Int.
2012,pp. e251364.
[78] Lu S.-C. and Lin S.-C. (2012), "Recovery of active N-acetyl-D-glucosamine
2-epimerase from inclusion bodies by solubilization with non-denaturing
buffers", Enzyme. Microb. Technol. 50(1), pp. 65–70.

145


[79] Mahmoud Y.A.-G. and Mohamed T.M. (2011), Cellulases uses or
application. cellulase: Types and action, mechansim, and use. Nova Science
Pub Inc, pp.211–231.
[80] Maki M., Leung K.T. and Qin W. (2009), "The prospects of cellulaseproducing bacteria for the bioconversion of lignocellulosic biomass", Int. J.
Biol. Sci. 5(5), pp. 500–516.
[81] Marston F.A. (1986), "The purification of eukaryotic polypeptides
synthesized in Escherichia coli", Biochem. J. 240(1), pp. 1–12.
[82] Martínez-Alonso M., González-Montalbán N., García-Fruitós E. and
Villaverde A. (2009), "Learning about protein solubility from bacterial
inclusion bodies", Microb. Cell. Fact. 8(1), pp. 4.
[83] Martínez-Alonso M., González-Montalbán N., García-Fruitós E. and
Villaverde A. (2008), "The functional quality of soluble recombinant

polypeptides produced in Escherichia coli is defined by a wide
conformational spectrum", Appl. Environ. Microbiol. 74(23), pp. 7431–7433.
[84] Martins L.F., Antunes L.P., Pascon R.C., de Oliveira J.C.F., Digiampietri
L.A., Barbosa D., Peixoto B.M., Vallim M.A., Viana-Niero C., Ostroski E.H.,
Telles G.P., Dias Z., da Cruz J.B., Juliano L., Verjovski-Almeida S., da Silva
A.M. and Setubal J.C. (2013), "Metagenomic analysis of a tropical
composting operation at the São Paulo zoo park reveals diversity of biomass
degradation functions and organisms", PLoS ONE, 8(4), pp. e61928.
[85] Mattéotti C., Haubruge E., Thonart P., Francis F., De Pauw E., Portetelle D.
and Vandenbol M. (2011), "Characterization of a new β-glucosidase/βxylosidase from the gut microbiota of the termite (Reticulitermes
santonensis)", FEMS Microbiol. Lett. 314(2), pp. 147–157.
[86] Mattéotti C., Thonart P., Francis F., Haubruge E., Destain J., Brasseur C.,
Bauwens J., De Pauw E., Portetelle D. and Vandenbol M. (2011), "New
glucosidase activities identified by functional screening of a genomic DNA
library from the gut microbiota of the termite Reticulitermes santonensis",
Microbiol. Res. 166(8), pp. 629–642.
[87] McGavin M. and Forsberg C.W. (1988), "Isolation and characterization of
endoglucanases 1 and 2 from Bacteroides succinogenes S85", J. Bacteriol.
170(7), pp. 2914–2922.

146


[88] Miller G.L. (1959), "Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of
reducing sugar", Anal. Chem. 31(3), pp. 426–428.
[89] Miller G.L., Blum R., Glennon W.E. and Burton A.L. (1960), "Measurement
of carboxymethylcellulase activity", Anal. Biochem. 1(2), pp. 127–132.
[90] Mitra S., Rupek P., Richter D.C., Urich T., Gilbert J.A., Meyer F., Wilke A.
and Huson D.H. (2011), "Functional analysis of metagenomes and
metatranscriptomes using SEED and KEGG", BMC Bioinformatics 12(Suppl

1), pp. S21.
[91] Morana A., Maurelli L., Ionata E., La Cara F. and Ross M. (2011), Cellulose
from fungi and bacteria and their biotechnological applications. Cellulase:
types and action, mechansim, and use. Nova Science Pub Inc, pp. 1–80.
[92] Nakashima K.I., Watanabe H. and Azuma J.I. (2002), "Cellulase genes from
the parabasalian symbiont Pseudotrichonympha grassii in the hindgut of the
wood-feeding termite Coptotermes formosanus", Cell. Mol. Life Sci. 59(9),
pp. 1554–1560.
[93] Noguchi H., Taniguchi T. and Itoh T. (2008), "MetaGeneAnnotator: detecting
species-specific patterns of ribosomal binding site for precise gene prediction in
anonymous prokaryotic and phage genomes", DNA Res. 15(6), pp. 387–396.
[94] Ohkuma M. (2008), "Symbioses of flagellates and prokaryotes in the gut of
lower termites", Trends. Microbiol. 16(7), pp. 345–352.
[95] Pang H., Zhang P., Duan C.-J., Mo X.-C., Tang J.-L. and Feng J.-X. (2009),
"Identification of cellulase genes from the metagenomes of compost soils and
functional characterization of one novel endoglucanase", Curr. Microbiol.
58(4), pp. 404–408.
[96] Partanen P., Hultman J., Paulin L., Auvinen P. and Romantschuk M. (2010),
"Bacterial diversity at different stages of the composting process", BMC
Microbiology 10(1), pp. 94.
[97] Pol D., Laxman R.S. and Rao M. (2012), "Purification and biochemical
characterization of endoglucanase from Penicillium pinophilum MS 20",
Indian J. Biochem. Biophys. 49(3), pp. 189–194.
[98] Powell S., Szklarczyk D., Trachana K., Roth A., Kuhn M., Muller J., Arnold
R., Rattei T., Letunic I., Doerks T., Jensen L.J., von Mering C. and Bork P.
(2012), "eggNOG v3.0: orthologous groups covering 1133 organisms at 41
different taxonomic ranges", Nucleic. Acids. Res. 40(D1), pp. D284–D289.

147

[99] do Prado H.F.A., Ribeiro Leite R.S., Bocchini Martins D.A., Gomes E. and da
Silva R. (2011), Cellulolytic enzymesisolated from Brazilian areas: Production,
characterization and applications. Nova Science Pub Inc. pp.183–210.
[100] Price N.C. (1985), "The determination of Km values from lineweaver-burk
plots", Biochem. Educ. 13(2), pp. 81–81.
[101] Qin J., Li R., Raes J., Arumugam M., Burgdorf K.S., Manichanh C., Nielsen
T., Pons N., Levenez F., Yamada T., Mende D.R., Li J., Xu J., Li S., Li D.,
Cao J., Wang B., Liang H., Zheng H., Xie Y., Tap J., Lepage P., Bertalan M.,
Batto J.-M., Hansen T., Le Paslier D., Linneberg A., Nielsen H.B., Pelletier
E., Renault P., Sicheritz-Ponten T., Turner K., Zhu H., Yu C., Li S., Jian M.,
Zhou Y., Li Y., Zhang X., Li S., Qin N., Yang H., Wang J., Brunak S., Doré
J., Guarner F., Kristiansen K., Pedersen O., Parkhill J., Weissenbach J.,
Antolin M., Artiguenave F., Blottiere H., Borruel N., Bruls T., Casellas F.,
Chervaux C., Cultrone A., Delorme C., Denariaz G., Dervyn R., Forte M.,
Friss C., Guchte M. van de, Guedon E., Haimet F., Jamet A., Juste C., Kaci
G., Kleerebezem M., Knol J., Kristensen M., Layec S., Roux K.L., Leclerc
M., Maguin E., Minardi R.M., Oozeer R., Rescigno M., Sanchez N., Tims S.,
Torrejon T., Varela E., Vos W. de, Winogradsky Y., Zoetendal E., Bork P.,
Ehrlich S.D. and Wang J. (2010), "A human gut microbial gene catalogue
established by metagenomic sequencing", Nature 464(7285), pp. 59–65.
[102] Radek R. (1999), "Flagellates, bacteria, and fungi associated with termites:
Diversity and function in nutrion - A review", Ecotropica. 5, pp. 183–196.
[103] Ratanakhanokchai K., Waeonukul R., Pason P., Tachaapaikoon C., Lay K.,
Sakka K., Kosugi A. and Mori Y. (2013), Paenibacillus curdlanolyticus strain
B-6 multienzyme complex: A novel system for biomass utilization. Biomass
Now - Cultivation and Utilization. M.D. Matovic, ed. InTech.
[104] Ray R.C. (2011), Solid-state fermentation for production of microbial
cellulase: An overview. Cellulase: Types, actions, mechanisms and uses.
Nova Science Pub Inc, pp.135–158.

[105] Reece J.B., Urry L.A., Cain M.L., Wasserman steven B., Minorsky P.V. and
Jackson R.B. (2011), Campbell biology. Benjamin Cummings / Pearson.
[106] Rho M., Tang H. and Ye Y. (2010), "FragGeneScan: predicting genes in short
and error-prone reads", Nucl. Acids. Res. 38(20), pp. e191–e191.

148


[107] Rubin E.M. (2008), "Genomics of cellulosic biofuels", Nature 454(7206), pp.
841–845.
[108] Sadhu S. and Maiti T.K. (2013), "Cellulase production by bacteria: A
review", Br. Microbiol. Res. J. 3(3), pp. 235–258.
[109] Sadhu S., Saha P., Sen S.K., Mayilraj S. and Maiti T.K. (2013), "Production,
purification and characterization of a novel thermotolerant endoglucanase
(CMCase) from Bacillus strain isolated from cow dung", SpringerPlus 2(1),
pp. 10.
[110] Sambrook J. and Russell D. (2001), Molecular cloning: a laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory Press. I (5.4–5.17).
[111] Scharf M.E. and Tartar A. (2008), "Termite digestomes as sources for novel
lignocellulases", Biofuels. Bioprod. Bioref. 2(6), pp. 540–552.
[112] Schiffmann R., Heine A., Klebe G. and Klein C.D.P. (2005), "Metal ions as
cofactors for the binding of inhibitors to methionine aminopeptidase: a critical
view of the relevance of in vitro metalloenzyme assays", Angew. Chem. Int.
Ed. Engl. 44(23), pp. 3620–3623.
[113] Sethi S., Datta A., Gupta B.L. and Gupta S. (2013), "Optimization of cellulase
production from bacteria isolated from soil", ISRN .2013, pp. e985685.
[114] Shinzato N., Muramatsu M., Matsui T. and Watanabe Y. (2005), "Molecular
phylogenetic diversity of the bacterial community in the gut of the termite
Coptotermes formosanus", Biosci. Biotechnol. Biochem. 69(6), pp. 1145–1155.
[115] Shuangqi T., Zhenyu W., Ziluan F., Lili Z. and Jichang W. (2011),

"Determination methods of cellulase activity", AJB, 10(37), pp. 7122–7125.
[116] Simon C., Storrs C., Frati F., Beckenbach A., Crespi B., Liu H. and Flook B.
(1994), "Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene
sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction
primers", Ann. Ent. Soc. Am. (87), pp. 651–701.
[117] Singh P., Sharma L., Kulothungan S.R., Adkar B.V., Prajapati R.S., Ali P.S.S.,
Krishnan B. and Varadarajan R. (2013), "Effect of signal peptide on stability and
folding of Escherichia coli thioredoxin", PLoS ONE 8(5), pp. e63442.
[118] Siqueira G., Bras J. and Dufresne A. (2010), "Cellulosic bionanocomposites: A
review of preparation, properties and applications", Polymers 2(4), pp. 728–765.
[119] Sleator R. d., Shortall C. and Hill C. (2008), "Metagenomics", Lett. Appl.
Microbiol. 47(5), pp. 361–366.

149


[120] Smith H.D. (1937), "Structure of Cellulose", Ind. Eng. Chem. 29(9), pp.
1081–1084.
[121] Streit W.R. and Schmitz R.A. (2004), "Metagenomics--the key to the
uncultured microbes", Curr. Opin. Microbiol. 7(5), pp. 492–498.
[122] Sukumaran R.K., Singhania R.R. and Pandey A. (2005), "Microbial cellulases
-productions, applicatons and challenges", JSIR, 64(11), pp. 832–844.
[123] Sun Y. and Cheng J. (2002), "Hydrolysis of lignocellulosic materials for
ethanol production: a review", Bioresour. Technol. 83(1), pp. 1–11.
[124] Sydney O U. and Shireesh P A. (2004), Effect of buffer on protein
comformational stability. Phamaceutial Technology, pp. 86–113.
[125] Szalanski A.L., Austin J.W., Scheffrahn R.H. and Messenger M.T. (2004),
"Molecular diagnostics of the Formosan subterranean termite (Isoptera:
Rhinotermitidae)", Fla. Entomol. 87, pp. 145–151.
[126] Talebnia F., Karakashev D. and Angelidaki I. (2010), "Production of

bioethanol from wheat straw: An overview on pretreatment, hydrolysis and
fermentation", Bioresour. Technol. 101(13), pp. 4744–4753.
[127] Tamaru Y. and M. A. (2013), Lignocellulosic biomass utilization toward
biorefinery using meshophilic Clostridial species. Cellulose - biomass
conversion. J. Kadla, ed. InTech.
[128] Tamerler C.Y., Önsan Z.İ. and Kirdar B. (1998), "Optimization of starting
time and period of induction and inducer concentration in the production of
the restriction enzyme EcoRI from recombinant Escherichia coli 294", Turk.
J. Chem. 22(3), pp. 221–226.
[129] Tartar A., Wheeler M.M., Zhou X., Coy M.R., Boucias D.G. and Scharf M.E.
(2009), "Parallel metatranscriptome analyses of host and symbiont gene
expression in the gut of the termite Reticulitermes flavipes", Biotechnol.
Biofuels. 2(1), pp. 25.
[130] Tatusov R.L., Fedorova N.D., Jackson J.D., Jacobs A.R., Kiryutin B., Koonin
E.V., Krylov D.M., Mazumder R., Mekhedov S.L., Nikolskaya A.N., Rao
B.S., Smirnov S., Sverdlov A.V., Vasudevan S., Wolf Y.I., Yin J.J. and
Natale D.A. (2003), "The COG database: an updated version includes
eukaryotes", BMC Bioinformatics, 4(1), pp. 41.

150


[131] Tatusov R.L., Galperin M.Y., Natale D.A. and Koonin E.V. (2000), "The
COG database: a tool for genome-scale analysis of protein functions and
evolution", Nucleic. Acids. Res. 28(1), pp. 33–36.
[132] Terpe K. (2003), "Overview of tag protein fusions: from molecular and
biochemical fundamentals to commercial systems", Appl. Microbiol.
Biotechnol. 60(5), pp. 523–533.
[133] Thomas T., Gilbert J. and Meyer F. (2012), "Metagenomics - a guide from
sampling to data analysis", Microb, Inform, Exp. 2(1), pp. 3.

[134] Thompson C.E., Beys-da-Silva W.O., Santi L., Berger M., Vainstein M.H.,
Guima raes J.A. and Vasconcelos A.T.R. (2013), "A potential source for
cellulolytic enzyme discovery and environmental aspects revealed through
metagenomics of Brazilian mangroves", AMB Express. 3, pp. 65.
[135] Tipayarom D. and Oanh N.T.K. (2007), "Effects from open rice straw burning
emission on air quality in the Bangkok Metropolitan region", 33, pp. 339–345.
[136] Todaka N., Moriya S., Saita K., Hondo T., Kiuchi I., Takasu H., Ohkuma M.,
Piero C., Hayashizaki Y. and Kudo T. (2007), "Environmental cDNA analysis
of the genes involved in lignocellulose digestion in the symbiotic protist
community of Reticulitermes speratus", FEMS Microbiol. Ecol. 59(3), pp.
592–599.
[137] Tokuda G. and Watanabe H. (2007), "Hidden cellulases in termites: revision
of an old hypothesis", Biol. Lett. 3(3), pp. 336–339.
[138] Tolia N.H. and Joshua-Tor L. (2006), "Strategies for protein coexpression in
Escherichia coli", Nat. Meth. 3(1), pp. 55–64.
[139] Trimble W.L., Keegan K.P., D’Souza M., Wilke A., Wilkening J., Gilbert J.
and Meyer F. (2012), "Short-read reading-frame predictors are not created
equal: sequence error causes loss of signal", BMC Bioinformatics 13, pp. 183.
[140] Tripodi A.D., Austin J.W., Szalanski A.L., McKern J., Carroll M.K., Saran
R.K. and Messenger M.T. (2006), "Phylogeography of Reticulitermes termites
(Isoptera: Rhinotermitidae) in California inferred from mitochondrial DNA
sequences", Annals of the Entomological Society of America 99(4), pp. 697–
706.
[141] Tyson G.W., Chapman J., Hugenholtz P., Allen E.E., Ram R.J., Richardson
P.M., Solovyev V.V., Rubin E.M., Rokhsar D.S. and Banfield J.F. (2004),

151


"Community structure and metabolism through reconstruction of microbial

genomes from the environment", Nature 428(6978), pp. 37–43.
[142] Valenzuela L., Chi A., Beard S., Orell A., Guiliani N., Shabanowitz J., Hunt
D.F. and Jerez C.A. (2006), "Genomics, metagenomics and proteomics in
biomining microorganisms", Biotechnol. Adv. 24(2), pp. 197–211.
[143] Venter J.C., Remington K., Heidelberg J.F., Halpern A.L., Rusch D., Eisen
J.A., Wu D., Paulsen I., Nelson K.E., Nelson W., Fouts D.E., Levy S., Knap
A.H., Lomas M.W., Nealson K., White O., Peterson J., Hoffman J., Parsons
R., Baden-Tillson H., Pfannkoch C., Rogers Y.-H. and Smith H.O. (2004),
"Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso sea", Science
304(5667), pp. 66–74.
[144] Vera A., González-Montalbán N., Garcia-Fruitós E., Arís A. and Villaverde
A. (2006), "Low growth temperatures improve the conformational quality of
aggregation prone recombinant proteins in both soluble and insoluble E. coli
cell fractions", Microb. Cell. Fact. 5(Suppl 1), pp. P7.
[145] Wang C., Zhou X., Li S., Schwinghammer M., Scharf M.E., Buczkowski G.
and Bennett G.W. (2009), "Survey and identification of termites (Isoptera:
Rhinotermitidae) in Indiana", Annals of the Entomological Society of America
102(6), pp. 1029–1036.
[146] Wang W., Archbold T., Kimber M.S., Li J., Lam J.S. and Fan M.Z. (2012),
"The porcine gut microbial metagenomic library for mining novel cellulases
established from growing pigs fed cellulose-supplemented high-fat diets", J.
Anim. Sci. 90(Supplement 4), pp. 400–402.
[147] Warnecke F., Luginbühl P., Ivanova N., Ghassemian M., Richardson T.H.,
Stege J.T., Cayouette M., McHardy A.C., Djordjevic G., Aboushadi N., Sorek
R., Tringe S.G., Podar M., Martin H.G., Kunin V., Dalevi D., Madejska J.,
Kirton E., Platt D., Szeto E., Salamov A., Barry K., Mikhailova N., Kyrpides
N.C., Matson E.G., Ottesen E.A., Zhang X., Hernández M., Murillo C.,
Acosta L.G., Rigoutsos I., Tamayo G., Green B.D., Chang C., Rubin E.M.,
Mathur E.J., Robertson D.E., Hugenholtz P. and Leadbetter J.R. (2007),
"Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a woodfeeding higher termite", Nature 450(7169), pp. 560–565.

[148] Wenzhu T., Xiaoyi C., Hui Z., Fang C. and Xianzhen L. (2011), Limitation of
the developmenttion cellulose hydrolysis by cellulase assay and search for the

152