Nghiên cứu gen mã hóa enzyme tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi khuẩn ruột mối bằng kỹ thuật metagenomics

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Thảo

NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA ENZYME THAM GIA
THỦY PHÂN CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI KHUẨN TRONG
RUỘT MỐI BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - Năm 2015

1


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Thảo

NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA ENZYME THAM GIA
THỦY PHÂN CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI KHUẨN RUỘT
MỐI BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 01 21

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. GS. TS Trương Nam Hải
2. TS Đỗ Thị Huyền

Hà Nội - Năm 2015

2


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác
với các cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần
đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho
phép của các đồng tác giả.
Phần còn lại chưa được tác giả nào công bố trong bất kì công trình nào
khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Tác giả

Nguyễn Thị Thảo

3


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Trương Nam Hải và TS
Đỗ Thị Huyền phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã thu nhận, hướng dẫn tận tình, quan

tâm hết mực và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận án này.
Luận án được thực hiện tại phòng Kỹ thuật di truyền. Phòng Thí
nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam và được hỗ trợ bởi đề tài Nghị định thư với
Nhật Bản: “Phân lập hệ gen mã hóa cho enzyme thủy phân lignocellulose từ
khu hệ vi sinh ruột mối Việt Nam bằng kỹ thuật Metagenomics”.
Trong thời gian học tập và nghiên cứu tại phòng Kỹ thuật di truyền, tôi
đã nhận được sự giúp đỡ và sự chỉ bảo tận tình về chuyên môn của tập thể cán
bộ nghiên cứu của phòng. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó!
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến các thầy cô giáo trong Khoa
Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giảng
dạy và chỉ bảo cho tôi những kiến thức chuyên môn và kỹ năng cần thiết.
Để hoàn thành luận án, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu và
nhiệt tình của các đồng nghiệp công tác tại khoa Sinh học, Trường Đại học
Vinh, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó!
Với tất cả lòng biết ơn, tôi xin dành cho gia đình, bố mẹ, chồng và con,
những người thân đã thông cảm, động viên, tạo điều kiện và chia sẻ khó khăn
cùng tôi trong thời gian qua!

Nguyễn Thị Thảo

4


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................................. 14
1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................. 18
2. Mục tiêu của đề tài ......................................................................................... 20
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .................................................................. 20
4. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 20

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ....................................................... 20
6. Đóng góp mới của đề tài ................................................................................ 20
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................. 21
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LIGNOCELLULOSE ........................................................ 21

1.1.1. Cellulose .................................................................................................... 22
1.1.2. Hemicellulose ............................................................................................ 23
1.1.3. Lignin ......................................................................................................... 24
1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CELLULASE................................................................ 24
1.2.1. Cơ chế hoạt động của cellulase và sự thủy phân cellulose ........................ 24
1.2.2. Cấu trúc của cellulase ................................................................................ 26
1.2.2.1. Cấu trúc chung của cellulase ..................................................................... 26
1.2.2.2. Cellulosome thủy phân cellulose ............................................................. 27
1.3. CELLULASE CỦA VI KHUẨN .................................................................... 28
1.3.1. Sơ lược về họ cellulase ............................................................................... 28
1.3.2. Cellulase của vi khuẩn và vi khuẩn cổ ....................................................... 30
1.3.2.1. Cellulase vi khuẩn và vi khuẩn cổ ưa ấm ................................................ 30
1.3.2.2. Cellulase ở vi khuẩn và vi khuẩn cổ ưa nhiệt .......................................... 31
1.3.3. Ứng dụng của cellulase .............................................................................. 31
1.3.3.1. Ứng dụng của cellulase trong công nghệ sản xuất bia, rượu vang, chế
biến thực phẩm và thức ăn ......................................................................... 32
1.3.3.2. Ứng dụng cellulase trong dệt may ........................................................... 33
1.3.3.3. Ứng dụng cellulase trong chế biến bột giấy và giấy ............................... 33

5


1.3.3.4. Ứng dụng của cellulase trong sản xuất cồn sinh học .............................. 34
1.4. MỐI VÀ HỆ VI SINH VẬT RUỘT MỐI LIÊN QUAN ĐẾN SỰ THỦY PHÂN
LIGNOCELLULOSE .................................................................................................... 35

1.4.1. Sơ lược về mối và đa dạng mối ở Việt Nam .............................................. 35
1.4.2. Hệ vi sinh vật trong ruột mối bậc thấp ....................................................... 36
1.4.3. Sự tiêu hóa lignocellulose của mối ............................................................. 38
1.4.4. Tình hình nghiên cứu gen mã hóa cellulase của sinh vật trong đường
ruột mối bậc thấp ....................................................................................... 39
1.5. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ METAGENOMICS ............................................................ 41

1.5.1. Phương pháp tiếp cận tìm gen mới bằng Metagenomics ........................... 42
1.5.2. Phân lập gen từ thư viện DNA đa hệ gen .................................................. 43
1.5.3. Khai thác và phân lập gen từ dữ liệu trình tự DNA đa hệ gen .................. 45
1.5.3.1. Phương pháp giải trình tự của một số hệ thống máy thế hệ mới ............ 45
1.5.3.2. Tập hợp các read thành contig ................................................................. 47
1.5.4. Ứng dụng của Metagenomics .................................................................... 50
1.5.4.1. Ứng dụng của Metagenomics trong khai thác gen mới và đánh giá sự
đa dạng vi sinh vật ..................................................................................... 50
1.5.4.2. Tiềm năng ứng dụng của Metagenomics ................................................. 53
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................ 55
2.1. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC ......................... 55

2.1.1. Đối tượng và vật liệu .................................................................................. 55
2.1.2. Hóa chất và thiết bị máy móc ..................................................................... 56
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................................... 58
2.2.1. Các phương pháp vi sinh ............................................................................ 59
2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử ............................................................ 59
2.2.2.1. Tách chiết DNA hệ gen của mối .............................................................. 59
2.2.2.2. Phương pháp thu nhận vi khuẩn ruột mối và tách chiết DNA đa hệ
gen của chúng ............................................................................................ 59
2.2.2.3. Tinh sạch DNA đa hệ gen bằng phương pháp máng đơn (troughing) .... 60

6


2.2.2.4. Giải trình tự DNA đa hệ gen bằng máy giải trình tự thế hệ mới
HiSeq2000 của Illumina ............................................................................ 61
2.2.2.5. Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào vi khuẩn E. coli bằng sốc nhiệt ... 62
2.2.2.6. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E. coli .......... 63
2.2.2.7. Phương pháp cắt và ghép nối gen ........................................................... 63
2.2.2.8. Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose bằng QIAquick Gel
Extraction kit.............................................................................................. 64
2.2.2.9. Kỹ thuật PCR ........................................................................................... 64
2.2.2.10. Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+) mang gen egc ............................. 66
2.2.2.11. Điện di DNA trên gel agarose ............................................................... 66
2.2.2.12. Phương pháp biểu hiện gen ................................................................... 66
2.2.2.13. Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide-SDS ....................... 67
2.2.2.14. Điện di protein trên gel polyacrylamide không SDS ............................. 68
2.2.3. Các phương pháp hóa sinh protein ............................................................. 68
2.2.3.1. Phương pháp tinh chế protein bằng sắc kí ái lực his-tag ...................... 68
2.2.3.2. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford ................................... 69
2.2.3.3. Định lượng đường khử bằng phương pháp DNS ..................................... 69
2.2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính endoglucanase .................................... 70
2.2.3.5. Phương pháp xác định hoạt tính β-glucosidase và β-xylosidase ............ 71
2.2.3.6. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, các ion kim loại và một số hóa
chất lên hoạt tính endoglucanase .............................................................. 72
2.2.3.7. Xác định độ bền của enzyme ................................................................... 72
2.2.3.8. Xác định thông số động học của enzyme ................................................. 72
2.2.4. Các phương pháp tin sinh học và xử lý số liệu bằng phần mềm sinh học. 73
2.2.4.1. Phân tích trình tự DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối .............................. 73
2.2.4.2. So sánh trình tự ORF của dữ liệu DNA đa hệ gen với CSDL của NCBI ..... 74
2.2.4.3. Thiết kế mồi bằng phần mềm FastPCR ................................................... 75

2.2.4.4. Kiểm tra vị trí của các enzyme hạn chế trên gen quan tâm bằng phần
mềm trực tuyến RestrictionMapper ........................................................... 75

7


2.2.4.5. Chuyển mã trình tự DNA sang trình tự axit amin bằng chương trình
dịch mã ExPASy ......................................................................................... 75
2.2.4.6. Xây dựng cây phát sinh loài của loài mối nghiên cứu với các loài mối
khác bằng phần mềm Genedoc và MEGA5 ............................................... 75
2.2.4.7. Dự đoán cấu trúc của EGC bằng phần mềm Phyre2 .............................. 76
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................... 77
3.1. KẾT QUẢ ĐỊNH LOÀI MỐI NGHIÊN CỨU BẰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TỬ . 77

3.1.1. Tách chiết DNA hệ gen của mối................................................................. 79
3.1.2. PCR khuếch đại đoạn DNA của gen mã hóa RNA ribosome 16S ti thể mối . 79
3.1.3. Phân tích sản phẩm PCR................................................................................76
3.2. TÁCH CHIẾT, ĐỌC VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ DNA ĐA HỆ GEN VI KHUẨN
RUỘT MỐI C. gestroi ..................................................................................................... 86

3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C. gestroi ....... 86
3.2.2. Đọc và phân tích trình tự DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C. gestroi ............. 87
3.2.2.1. Tập hợp trình tự và xác định gen ............................................................. 87
3.2.2.2. Đa dạng vi sinh vật ruột mối C. gestroi ................................................... 90
3.3. GEN MÃ HÓA ENZYME THUỶ PHÂN CELLULOSE CỦA VI KHUẨN RUỘT
MỐI C. gestroi ................................................................................................................. 96

3.3.1. Dự đoán chức năng gen của DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C. gestroi..... 96
3.3.2. Gen mã hóa enzyme phân hủy cellulose .................................................... 98
3.3.3. Lựa chọn ORF cellulase để biểu hiện ....................................................... 100

3.4. TÁCH DÕNG GEN egc...................................................................................................104

3.4.1. Trình tự ORF GL0130684 ........................................................................ 105
3.4.2. Khuếch đại gen egc ................................................................................... 105
3.4.3. Ghép nối sản phẩm khuếch đại gen egc vào vector tách dòng
pJET1.2/blunt ......................................................................................... 106
3.4.4. Biến nạp sản phẩm ghép nối vào tế bào E. coli DH10b ........................... 107
3.4.5. Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme hạn chế ............................. 108

8


3.4.6. Phân tích trình tự gen wegc phân lập được từ DNA đa hệ gen vi khuẩn
ruột mối C. gestroi ................................................................................... 108
3.4.7. Khuếch đại gen egc không chứa tín hiệu tiết từ khuôn pJET-wegc ......... 111
3.4.8. Thiết kế vector biểu hiện gen egc ............................................................. 111
3.4.8.1. Ghép nối gen egc vào vector biểu hiện.................................................. 111
3.4.8.2. Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22-egc........................................... 113
3.5. BIỂU HIỆN GEN egc TRONG VI KHUẨN E. coli BL21(DE3) ................... 114

3.5.1. Chọn dòng biểu hiện gen egc trong tế bào E. coli BL21(DE3) ................ 114
3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự biểu hiện gen egc trong tế bào E. coli
BL21(DE3) .............................................................................................. 116
3.5.3. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến hiệu quả cảm ứng ............................. 117
3.5.4. Điện di và kiểm tra hoạt tính endoglucanase của EGC ............................... 119
3.5.5. Tinh chế protein EGC bằng cột sắc kí ái lực His-tag ............................... 120
3.5.6. Tính đặc hiệu cơ chất của EGC ................................................................ 124
3.5.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính endoglucanase của EGC ............. 126
3.5.8. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của EGC .............................................. 127
3.5.9. Độ bền nhiệt của EGC .............................................................................. 128

3.5.10. Ảnh hưởng của một số ion kim loại và hóa chất lên hoạt tính của EGC 128
3.5.11. Đặc điểm động học của EGC.................................................................. 132
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................................................135
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................138

9


DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt
BglB
BglF
BglG

Tên tiếng Anh
Beta-glucosidase B
Beta-glucosidase F
Beta-glucosidase G

BLAST

Basic Local Alignment
Search Tool

bp
BSA

Base pair
Bovine serum albumin

BWA

Burrows-Wheeler Aligner

CD

Carbohydrate binding
domain
Catalytic domain

cDNA

Complementary DNA

CBD

Cel12A
Cel45A
(EGV)
Cel48A
Cel5A
Cel6A
(CBHII)
Cel6B
(EGVI)
Cel7A
(CBHI)

Tên tiếng Việt
Beta-glucosidase B

Beta-glucosidase F
Beta-glucosidase G
Công cụ so sánh mức độ tương
đồng về trình tự nucleotide/axit
amin trực tuyến của NCBI
Cặp base
Albumin huyết thanh bò
Phần mềm kiểm tra các sai lệch
nhỏ trong quá trình giải trình tự các
đoạn DNA, cũng như quá trình tập
hợp so với hệ gene tham khảo lớn
Vùng liên kết với carbohydrate
Vùng xúc tác
DNA được tổng hợp từ khuôn
mRNA nhờ enzyme phiên mã
ngược reverse transcriptase

Endoglucanase glycoside
hydrolase family 12
Endoglucanase glycoside
hydrolase family 45
Exoglucanase glycoside
hydrolase family 5
Endoglucanase glycoside
hydrolase family 5
cellobiohydrolase cel6A
(cellobiohydrolase II)

Endoglucanase thuộc họ 12
Endoglucanase thuộc họ 45

Exoglucanase thuộc họ 48
Endoglucanase thuộc họ GH 5
Cellobiohydrolase II (exoglucanase
II) thuộc họ GH6

Endoglucanase EGVI

Endoglucanase thuộc họ GH 6

Cellobiohydrolase cel7A
(Cellobiohydrolase I)

Cellobiohydrolase I (exoglucanase
II) thuộc họ GH7

10