Nghiên cứu đa dạng sinh học vùng gen s của virus viêm gan b tại một số vùng ở việt nam

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG SINH HỌC VÙNG GEN S CỦA VIRUS
VIÊM GAN B TẠI MỘT SỐ VÙNG Ở VIÊT NAM

Người hướng dẫn:

TS. Dương Tuấn Linh

Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Đức Hiếu

Lớp:

1202

HÀ NỘI - 2016


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học
LỜI CÁM ƠN

Trong suốt quá trình làm việc và nghiên cứu tại Khoa Vi sinh vật, Viện
Y học Dự phòng Quân đội và Phòng Độc học, Viện Y sinh Nhiệt đới,
Trung Tâm Nhiệt đới Việt - Nga, tôi đã nhận được nhiều sự quan tâm và
giúp đỡ của các anh chị, thầy cô, gia đình và bạn bè.
Trước hết em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến toàn thể thầy cô
giáo trong khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã trang
bị cho em kiến thức và kĩ năng để em có thể hoàn thành khóa luận này.
Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn chân thành đến TS. Dương
Tuấn Linh – Viện Y học Dự phòng Quân Đội đã giúp đỡ tận tình và hướng
dẫn em những kiến thức và phương pháp nghiên cứu trong suốt quá trình
thực hiện khóa luận này.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, các anh chị và các bạn,
những người luôn động viên và giúp đỡ tạo điều kiện vật chất cũng như
tinh thần giúp em hoàn thành khóa luận.
Trong quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài bản thân em còn có nhiều
thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp, phê bình của quý thầy
cô và anh chị trong lĩnh vực nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, Ngày 22 tháng 5 năm 2016
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Đức Hiếu


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học
MỤC LỤC

KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ................................................................. I
DANH MỤC HÌNH ............................................................................... II
DANH MỤC BIỂU ĐỒ ........................................................................... III
ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................... 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 3
1.1 Tình hình nhiễm bệnh viêm gan B .................................................. 3
1.1.1 Trên thế giới ............................................................................ 3
1.1.2 Tại Viêt Nam ......................................................................... .5
1.2 Một số đặc điểm sinh học của virus viêm gan B .............................. 7
1.2.1 Phân loại virus viêm gan B ..................................................... 7
1.2.2 Cấu trúc phân tử và hệ gen di truyền của virus viêm gan B ..... 8
1.2.3 Protein cấu trúc của virus viêm gan B.................................... 10
1.2.4 Các kháng thể trong huyết thanh sau khi nhiễm viêm gan B .. 13
1.2.5 Vai trò của kiểu gen viêm gan B ............................................ 14
1.3 Dự phòng virus viêm gan B ........................................................... 15
1.3.1 Phòng chủ động ..................................................................... 15
1.3.2 Phòng lây truyền từ mẹ sang con ........................................... 15
1.3.3 Phòng không đặc hiệu............................................................ 16
PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 17
2.1 Đối tượng ...................................................................................... 17
2.1.1 Chọn mẫu .............................................................................. 17
2.2.2 Bảo quản mẫu ........................................................................ 17
2.1.3 Địa điểm nghiên cứu.............................................................. 17
2.2 Vật liệu .......................................................................................... 18
2.2.1 Thiết bị và dụng cụ phòng thí nhiệm ..................................... 18


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

2.2.1.1 Thiết bị ............................................................................... 18
2.2.1.2 Dụng cụ .............................................................................. 19
2.2.2 Hóa chất sử dụng ................................................................... 19
2.3 Các phương pháp sử dụng ............................................................. 20
2.3.1 Tách DNA từ mẫu HBsAg dương tính................................... 20
2.3.2 Phương pháp PCR ................................................................. 23
2.3.3 Phương pháp điện di (Điện di agarose) .................................. 25
2.3.4 Phương pháp tinh sạch DNA (sản phẩm PCR-DNA) ............. 27
2.3.5 Phương pháp giải trình tự gen Sanger .................................... 28
2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu .................................................... 29
PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 30
3.1 Tổng số mẫu đã phân lập và xử lý..........................................30
3.2 Tỉ lệ nhiễm HBsAg theo vùng địa lý ........................................ 31
3.3 Tỉ lệ nhiễm HBV theo độ tuổi................................................... 32
3.4 Tỉ lệ nhiễm HBV theo giới tính ................................................ 34
3.5 Tỉ lệ phát hiện HBV - DNA bằng kĩ thuật PCR trong số mẫu
HBsAg dương tính ...........................................................................35
3.6 Phân tích cây phả hệ di truyền vùng gen S của HBV................ 36
KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................... 40


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
HBV

Hepatitis B Virus

dsDNA-RT virus

Double trands DNA reverse transcriptase

cccDNA

Covalently closed circular DNA

ORFs

Overlapping open reading frames

HBsAg

Hepatitis B surface Antigen

pHSA

Polymerized Human Serum Albumin

HBcAg

Hepatitis B core antigen

HBeAg

Hepatitis B evolope Antigen

PCR

Polymerase Chain Reaction

ddNTPs

Dideoxynucleotide

EtBr

Ethidium bromide


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học
DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Tỉ lệ nhiễm viêm gan B hàng năm nếu không tiêm vắc xin tại Việt
Nam ......................................................................................................... 6
Hình 2: Cấu tạo bộ gen HBV...................................................................... 9
Hình 3: Cấu trúc phân tử của kháng nguyên bề mặt (HBsAg) .................. 11
Hình 4: Ảnh điện di, kết quả PCR sử dụng cặp mồi FA3 chạy trên gel
Agarose 1% ở điều kiện 120V - 30P......................................................... 36
Hình 5: Cây sơ đồ phả hệ di truyền trình tự acid nucleic vùng gen S của các
chủng HBV được thu thập được từ mẫu huyết thanh HBsAg dương tính tại
4 tỉnh Hòa Bình, Quảng Trị, Kontum và Tp Hồ Chí Minh........................ 38


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học
DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 1: Số lượng mẫu thu thập phân bố theo giới tính và nhóm tuổi.... 30
Biểu đồ 2: Tỉ lệ nhiễm HBsAg dương tính ở 4 tỉnh và tỉ lệ chung ở cả 4
tỉnh nghiên cứu ........................................................................................ 31
Biểu đồ 3: Tỉ lệ nhiễm HBsAg dương tính theo độ tuổi ............................ 33
Biểu đồ 4: Tỉ lệ nhiễm HBV dương tính theo giới tính ............................ 34
Biểu đồ 5: Tỉ lệ phát hiện HBV - DNA bằng kĩ thuật PCR trong số mẫu
HBsAg dương tính ................................................................................... 36


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học
ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm gan do virus B (Hepatitis B Virus - HBV) là một bệnh phổ biến
trên toàn cầu, có diễn biến phức tạp, tỉ lệ chuyển sang mạn tính rất cao,
thường dẫn tới sơ gan và ung thư gan. Hiện nay có khoảng 2 tỷ người
nhiễm virus viêm gan B trên toàn Thế giới, trong đó có khoảng 6% nhiễm
viêm gan B cấp và 5 - 10% trong số đó chuyển sang mạn tính ở người lớn,
riêng đối với trẻ em tỷ lệ này lên đến 90%. Tỷ lệ tử vong giai đoạn cấp tính
là 1%, biến chứng của viên gan B cấp là viên gan mạn, xơ gan và ung thư
gan nguyên phát, dẫn đến tử vong vào khoảng một triệu người mỗi năm
(theo Tổ chức Y tế Thế giới WHO; 1994). Một số kết quả điều tra cho thấy
các nước Đông Nam Á, Trung Quốc và Châu Phi là những nơi có tỷ lệ
nhiễm HBV cao nhất trên thế giới (GLOBEDR VN; 4/12/2015).
Việt Nam nằm trong vùng có nguy cơ cao về nhiễm HBV và là một

trong những nước có tỷ lệ lưu hành cao trên thế giới. Tại Việt Nam có
khoảng 15% - 20% người nhiễm HBV trong đó xơ gan và ung thư gan
nguyên phát có nhiễm HBV chiếm 80 - 92% (theo WHO; 5/2007). Trước
đây, HBV được phân ra làm 4 kiểu huyết thanh (Serotypes): adr, adw, ayr,
và ayw dựa trên việc xác định các kiểu kháng nguyên của kháng nguyên bề
mặt của HBV, các kiểu huyết thanh này có thể phân loại thêm ra 9 kiểu phụ
(Subtypes) là ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq+, và adrq-.
Nghiên cứu dịch tễ cho thấy các vùng địa lý trên thế giới có sự phân bố của
các kiểu huyết thanh khác nhau. Tuy nhiên, cho đến nay có rất ít dữ liệu về
vai trò của kiểu huyết thanh HBV. Những tiến bộ của kỹ thuật sinh học
phân tử và tin sinh học vào những năm cuối thế kỉ 20 đã giúp khám phá và
phân tích sự đa dạng di truyền của HBV. Gần đây, tám kiểu gen (genotype)
của HBV đã được xác định (kí hiệu từ A đến H) dựa vào sự khác nhau trên
8% của toàn bộ trình tự chuỗi DNA của HBV. Các kiểu gen HBV có vai trò
rất quan trọng trong việc điều trị và theo dõi diễn biến của bệnh. Đặc biệt,
1


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

những thông tin về sự phân bố kiểu gen theo vùng địa lý có ý nghĩa trong
công tác quản lý và giám sát về mặt dịch tễ học phục vụ cho công tác
phòng chống bệnh viêm gan do HBV.
Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đa
dạng sinh học vùng gen S của virus viêm gan B (HBV) tại một số vùng
ở Việt Nam” từ đó đề xuất một số khuyến cáo giúp việc giám sát virus
viêm gan B tại các địa điểm nghiên cứu.

2


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học
PHẦN 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tình hình nhiễm bệnh viêm gan B
1.1.1 Trên thế giới
Bệnh viêm gan B (Hepatitis B Virus - HBV) là một căn bệnh mang
tính chất toàn cầu. Tổ chức Y tế Thế giới (1994) cảnh bảo đối với tất cả các
quốc gia trên toàn cầu về tác hại nghiêm trọng của bệnh viêm gan virus B
đối với sức khỏe của toàn nhân loại, viêm gan virus B đã lây nhiễm cho 2
tỷ người, mỗi năm loại virus viêm gan B đã gây ra cái chết cho hơn 1 triệu
người. Đây là một loại đại dịch âm thầm, lặng lẽ, diễn biến hết thập kỷ này
qua thập kỷ khác, gây ảnh hưởng nghiêm trọng không chỉ đối với sức khỏe
mà còn đối với đời sống xã hội của người dân trên Thế giới. Tuy nhiên
nhiều quốc gia, các nhà hoạch định chính sách vẫn chưa lưu tâm đúng mức
để có thể kiểm soát và phòng ngừa bệnh viêm gan virus, bên cạnh đó nhiều
người dân vẫn chưa có nhận thức đầy đủ về mức độ nguy hiểm của bệnh
viêm gan virus dẫn dến tử vong vì xơ gan hoặc ung thư gan, chưa biết được
cách tự bảo vệ, cách tự chăm sóc và phòng tránh nhiễm bệnh. Để huy động
mọi quốc gia, mọi người trên toàn Thế giới cảnh giác và tăng cường phòng
chống viêm gan virus, năm 2010 WHO quyết định lấy ngày 28/7 hàng năm
là ngày phòng chống viêm gan virus toàn Thế giới.
Mức độ nhiễm viêm gan B được chia thành 3 vùng mức độ khác nhau
(Anna S.F. Lok và Brian McMahon; 2007)
*Mức độ lưu hành cao (là những vùng có tỉ lệ người nhiễm viêm gan

B rất cao, HBsAg dương tính > 8%). Gần 45% dân số thế giới nằm trong
vùng này bao gồm hầu hết các nước thuộc khu vực Châu Á có cả Việt Nam
(trừ Nhật Bản, Ấn độ), Châu Phi, hầu hết các nước Trung Đông, vùng lưu
vực sông Amazon (Nam Mỹ), hầu hết các đảo thuộc khu vực Thái Bình
Dương, và một số dân tộc sống ở Bắc Cực như Eskimo, Maoris. Ở những
3


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

khu vực này nhiễm HBV xảy ra từ rất sớm, ngay từ khi mới sinh và trẻ
nhỏ. Phương thức lây truyền chính là từ mẹ sang con (nhiễm trong thời kỳ
chu sinh hay còn gọi là lây truyền dọc) hoặc lây truyền ngang trong lứa tuổi
nhỏ. Vì nhiễm trùng ở trẻ nhỏ thường là không phát hiện triệu chứng, do đó
tỷ lệ người mang virus và mắc các bệnh liên quan đến nhiễm virus viêm
gan B như viêm gan mạn tính, ung thư gan, xơ gan trong cộng đồng này rất
cao. Ngoài ra, tiêm chích ma tuý, quan hệ tình dục bừa bãi cũng đóng vai
trò quan trọng làm tăng tỷ lệ nhiễm HBV trong cộng đồng.
*Mức độ trung bình (chính là tỷ lệ số người nhiễm virus viêm gan B
nằm trong vùng có tỷ lệ lưu hành viêm gan B thấp hơn các nước trong khu
vực, HBsAg dương tính 2 - 7%). 43% dân số Thế giới nằm trong vùng này
bao gồm Ấn Độ, một phần Trung Đông, Tây Á, Nhật Bản, Nga, Đông Âu,
hầu hết các nước Nam và Trung Mỹ. Phương thức lây truyền tại đây rất đa
dạng, xảy ra ở tất cả các lứa tuổi từ trẻ sơ sinh đến người lớn. Trường hợp
nhiễm virus viêm gan B cấp tính phần lớn xảy ra ở lứa tuổi thanh niên và
người lớn tuổi. Đối tượng nhiễm virus viêm gan B trong thời kỳ chu sinh sẽ
trở thành người mang virus mạn tính có nguy cơ lây lan cao trong cộng
đồng.

* Mức độ lưu hành thấp (< 2%): Vùng nay bao gồm các nước như Mỹ,
Canada, Tây Âu, Úc, NewZealnd, và Nam Mỹ. Phương thức lây truyền
chính là lây truyền ngang ở lứa tuổi trưởng thành. Đối tượng có nguy cơ
cao thường gặp là những người tiêm chích ma tuý, đồng tính luyến ái, nhân
viên y tế, người được truyền máu hoặc lây nhiễm trong gia đình người
nhiễm virus viêm gan B.
Nói một cách tổng quát, tỷ lệ bệnh viêm gan B vẫn cao nhất ở các
nước kém phát triển với một hệ thống y tế thô sơ. Nước càng nghèo, càng
chậm tiến, con số bệnh nhân viêm gan B càng cao. Trong khi Trung Quốc
có tỷ lệ viêm gan B là 12,2%, Nhật Bản với nền kinh tế phồn thịnh hơn chỉ
có khoảng 2,6%. Ngay cả những nước chậm tiến nhất tại Phi Châu, như
4


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

Mozambique, Uganda, Zambia v.v., tỷ lệ bệnh viêm gan B cũng chỉ khoảng
12 đến 14% mà thôi. Với tỷ lệ 0,8%, nghĩa là khoảng 1,25 triệu bệnh nhân,
Hoa Kỳ là một trong những quốc gia có tỷ lệ viêm gan B thấp nhất thế giới
(theo Hội Ung thư Việt Mĩ; 2014).
1.1.2 Tại Viêt Nam
Việt Nam là 1 trong 9 quốc gia vùng tây Thái Bình Dương đang phải
đối mặt với đại dịch viêm gan virus vì tỷ lệ nhiễm virus cao, khoảng 25%
dân số Việt Nam nhiễm HBV (Blumberg và cộng sự, 2012). Theo một
trong những thống kê mới nhất thì tỷ lệ người mang bệnh đã giảm xuống
khoảng 17% (theo Hội Ung thư Việt Mĩ; năm 2012). Tuy trong những năm
vừa qua, khi tiêm phòng vắc xin phòng bệnh viêm gan B tại Việt Nam
được ứng dụng một cách quy mô hơn, con số bệnh nhân bị bệnh viêm gan

B, chỉ thuyên giảm một cách chậm chạp. Trong quá trình điều tra cộng
đồng trong khoảng 1350 người dân đang sinh sống tại Thanh Hóa, tỉ lệ
HBsAg ở các nhóm tuổi khác nhau là: khoảng 12,5% bé sơ sinh (từ 9 đến
18 tháng), 18,4% trẻ em (từ 4 đến 6 tuổi), 20,5% thanh niên (từ 14 đến 16
tuổi) và 18,8% người trưởng thành (từ 25 đến 40 tuổi) đang bị nhiễm viêm
gan B, và có khoảng 15 - 25% bệnh nhân viêm gan B mạn tính dẫn đến ung
thư gan và xơ gan (Hipgrave và cộng sự; 2003). Ðây là một con số rất đáng
ngại cho một nước xấp xỉ 100 triệu dân.
Ước tính số trẻ có khả năng nhiễm viêm gan B mạn tính nếu không
tiêm vắc xin viêm gan B hàng năm tại Việt Nam như hình 1 (Phan Trọng
Lân và cộng sự; cập nhật 20/4/2015):

5


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

Hình 1: Tỉ lệ nhiễm viêm gan B hàng năm nếu không tiêm vắc xin
tại Việt Nam (2015)
Tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B từ 15% - 20% dân số, nhiễm virus viêm
gan C từ 2% - 6% (Trần Đắc Phu và cộng sự; 2015). Nhiều trường hợp tử
vong ở các nước châu Á, trong đó có Việt Nam nguyên nhân do xơ gan và
ung thư gan có liên quan đến viêm gan B và C. Tổ chức Y tế Thế giới
khẳng định viêm gan B có thể kiểm soát một cách hiệu quả thông qua tiêm
chủng vắc xin. WHO khuyến cáo gia đình cần cho trẻ sơ sinh tiêm liều vắc
xin viêm gan B đầu tiên càng sớm càng tốt sau khi sinh (trong vòng 24 giờ
đầu). Việc tiêm vắc xin thực hiện càng sớm thì hiệu quả càng cao, với mũi
tiêm trong 24 giờ có khả năng phòng được 85 - 90% các trường hợp lây

truyền từ mẹ sang con. Hiệu quả phòng ngừa sẽ giảm dần theo từng ngày từ
50 - 57% và không đạt được nếu tiêm sau 7 ngày. Kể từ khi đưa vắc xin
này vào sử dụng năm 2002, Việt Nam đã đạt được những tiến bộ lớn trong
6


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

công cuộc phòng chống bệnh viêm gan B, đã đưa tỷ lệ nhiễm virus viêm
gan B có HBsAg dương tính ở nhóm trẻ dưới 5 tuổi xuống dưới 2% vào
năm 2014 và tiếp tục hướng tới mục tiêu giảm xuống dưới 1% vào năm
2017 (Đoàn Anh Tuấn; 2015).
1.2 Một số đặc điểm sinh học của virus viêm gan B
1.2.1 Phân loại virus viêm gan B
Nhóm: Nhóm VII: virus sợi kép, sao chép phiên mã ngược (dsDNART virus - Double trands DNA reverse transcriptase)
Bộ (ordo):

Chưa xác định

Họ (famillia):

Hepadnaviridae

Chi (genus):

Orthohepadnavirus

Loài (species):

Hepatitis B virus

Có 2 cách phân loại HBV: theo kiểu huyết thanh (serotype) và theo
kiểu gen (genotype).
Trước đây người ta phân HBV thành 4 kiểu huyết thanh adr, adw, ayr,
và ayw dựa trên việc xác định các kiểu kháng nguyên của kháng nguyên bề
mặt virus B, các kiểu huyết thanh này có thể phân loại thêm ra 9 kiểu phụ
(Subtypes) là ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq+, và adrq(Lieven Stuyver và cộng sự; 2000, Kramvis và cộng sự; 2005). Tuy nhiên
những ý nghĩa của kiểu huyết thanh chưa được nghiên cứu nhiều. Với sự
phát triển của sinh học phân tử, ngày nay người ra phân loại HBV dựa trên
nghiên cứu trên bộ gen của HBV và phân loại thành 8 kiểu gen được đặt
tên từ A đến H dựa vào sự khác biệt 8% của toàn bộ gene HBV (Kidd Liunggren và cộng sự, 2002; Kramvis và cộng sự, 2005; Norder và cộng
sự, 2004; Okamoto và cộng sự, 1988; Schaefer, 2005).
Sự phân bố kiểu gen dựa vào các vùng địa lý khác nhau
+ Kiểu gen A chủ yếu ở Mỹ, bắc và trung Âu.
+ Kiểu gen B và C chủ yếu ở Châu Á.
7


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

+ Kiểu gen D chủ yếu ở Nam Âu, Địa Trung Hải và Ấn Độ.
+ Kiểu gen E chủ yếu ở Châu Phi đặc biệt ở vùng hạ Sahara.
+ Kiểu gen F chủ yếu ở Nam Mĩ và Polynesia.
+ Kiểu gen G chủ yếu ở Mỹ, châu Âu bao gồm các nước Pháp, Đức, Hà
Lan.
+ Kiểu gene H chủ yếu ở Nam và Trung Mỹ.

1.2.2 Cấu trúc phân tử và hệ gen di truyền của virus viêm gan B
1.2.2.1 Cấu trúc phân tử
HBV Có 3 kiểu cấu trúc chính:
*Cấu trúc hình cầu và dạng hình ống: Dạng hình cầu có đường kính
dao động từ 17 – 25 nm, dạng ống có đường kính khoảng 22 nm với chiều
dài thay đổi. Có chứa các kháng nguyên bề mặt nhưng có lõi không mang
hệ gen di truyền nên không có khả năng gây bệnh.
*Cấu trúc hình hạt Dane hay còn gọi là hạt virus hoàn chỉnh có khả
năng lây nhiễm: Đường kính 42 nm, gồm 3 lớp là:
- Vỏ ngoài: Dày 7 nm, cấu tạo bởi 3 chuỗi polypeptide. Chuỗi có kích
thước bé nhất là kháng nguyên bề mặt HBsAg
- Vỏ capsid chứa 2 loại polypeptide: có cấu trúc đối xứng hình hộp,
bao quanh lõi, chứa các enzim DNA - polymerase, proteinkinase
+ Chuỗi ngắn: Chứa kháng nguyên lõi của virus viêm gan B
(HBcAg)
+ Chuỗi dài: Chứa kháng nguyên E của virus HBV (HBeAg)
- Lõi: là DNA vòng và có một phần sợi kép. Một sợi dài (L) gần như
khép kín có 3.200 nucleotide và một phần sợi ngắn (S) thay đổi từ 50 –
100% độ dài so với sợi dài. Trọng lượng phân tử gần 2.106.000 Dalton.
1.2.2.2 Hệ gen di truyền của virus viêm gan B

8


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

Với bộ gen chỉ gồm 3200 cặp base. Khi xâm nhập vào cơ thể qua
đường máu, HBV cởi bỏ lớp vỏ protein, HBV DNA đi vào nhân tế bào gan

người, tạo nên các DNA vòng gắn chặt đồng hóa trị được gọi là cccDNA
(Covalently closed circular DNA). Các cccDNA này gồm bốn đoạn khung
đọc mở che phủ lẫn nhau ORFs (Overlapping open reading frames): Gen S,
Gen X, Gen C, Gen P.

Hình 2: Cấu tạo bộ gen HBV (Phạm Thị Thủy, Hồ Tấn Đạt; 2005)
Bộ gen HBV là phân tử DNA dạng vòng, xoắn kép, chứa khoảng 3200
nucleotide, gồm 2 sợi đơn dài khác nhau được nối với nhau bằng liên kết
Hydro:
- Chuỗi dài còn gọi là sợi âm tạo thành vòng tròn 3,2 kb, mã hóa tất cả
thông tin di truyền.
- Chuỗi ngắn còn gọi là sợi dương chiều dài thay đổi từ 50-100%
chiều dài của bộ gen.
Bộ gene có cấu trúc gồm 4 gen được xác định rõ:

9


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

Gen S: là nằm trong phần protein chính của vỏ, bao gồm vùng S,
preS1, preS2, gen S mã hóa tổng hợp các kháng nguyên bề mặt HBsAg (s:
surface)
Gen C: mã hoá protein chính của lõi C hay kháng nguyên HBcAg và
một phần protein E của kháng nguyên HBeAg.
Gen X: Mã hoá protein xuất hiện trong tế bào gan bị nhiễm HBV và
liên quan tới cơ chế gây ung thư, có vai trò quá trình nhân đôi của virus.
Gen P: Hoạt động nhân đôi của HBV nhờ hoạt tính của enzyme

polymerase (Pol protein), đây là một protein lớn, phức tạp, và đa chức
năng. Trên vùng gen P (Polymerase) được chia làm 4 vùng, mỗi vùng có
một chức năng riêng: Terminal protein, Spacer, RT domains và RNAase H
(Xem hình 2). Trong đó, vùng sao mã ngược (RT domains: Reverse
Transcription) chịu trách nhiệm cho việc tổng hợp enzyme RNA dependent DNA và DNA - dependent DNA được chia ra thành 7 vùng đặt
tên từ A – G (Xem hình 2). Vì vùng RT là đích tác động của thuốc
Lamivudine nên những đột biến của vùng này trong quá trình phát triển tự
nhiên của virus viêm gan B cũng như dưới tác động của thuốc điều trị sẽ
dẫn tới vấn đề đột biến kháng thuốc.
1.2.3 Protein cấu trúc của virus viêm gan B
*Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg - Hepatitis B surface
Antigen):
HBsAg là kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B. Nó là dấu ấn
miễn dịch quan trọng trong các nghiên cứu dịch tễ học để xác định yếu tố
nguy cơ và phân loại HBV cũng như có vai trò quan trọng trong chẩn đoán
viêm gan B cấp và mạn tính.
Kháng nguyên HBsAg là thành phần của vỏ bọc lipoprotein của HBV
giúp cho sự bám dính của virus vào tế bào gan.

10


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

Cấu trúc phân tử của HBsAg gồm 3 loại protein là protein nhỏ (S),
trung bình (M) và lớn (L), các protein này được sinh tổng hợp (dịch mã) từ
các mRNA pre-S1 và mRNA S2/S sao chép từ gen S của cccDNA, theo các
con đường khác nhau.

Hình 3: Cấu trúc phân tử của kháng nguyên bề mặt (HBsAg) (Trần
Thị Khánh Tường; 2011)
Protein S (Small) có chiều dài 24 kD gồm 226 acid amin. Protein này
được mã hóa bởi vùng gen S gồm hai thành phần là p24 và Gp27
(Glycoprotein) đây là protein chủ yếu vì nó chiếm đa số.
Protein M (Medium) được tổng hợp nhờ đoạn S và Pre-S2 có chiều dài
33 kD gồm 281 acid amin. Protein này gồm hai loại Glycoprotein là Gp33
và Gp36. Vùng Pre-S2 có vai trò giúp cho HBV bám dính và xâm nhập vào
trong tế bào gan nhờ nó liên kết với một loại albumin trùng hợp trong huyết
thanh người, đồng thời trên tế bào gan cũng có các thụ thể gắp với albumin
trùng hợp trong huyết thanh người pHSA (Polymerized Human Serum
Albumin). Nếu trên tế bào gan thiếu các thụ thể này thì có thể làm cho tế
bào gan có khả năng đề kháng với sự nhiễm HBV (Qingrun Zhang; 2007)
11


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

Gen S, Pre-S1 và Pre-S2 tổng hợp protein L (Large) có chiều dài 39
kD gồm 2 loại p39 và Gp42. Chuỗi protein Pre-S1 có chiều dài thay đổi tùy
theo từng phân typ khác nhau; đây là vùng chủ yếu mà các thụ thể trên bề
mặt của tế bào gan sẽ liên kết với virus, giúp virus xâm nhập vào trong tế
bào.
Cả 3 loại protein này hiện diện với số lượng khác nhau trên bề mặt của
virion, trong đó protein S chiếm đa số. Protein M chiếm 5 đến 10% và
Protein L chiếm 20% trong vỏ bọc của hạt virus, protein bề mặt hay
HBsAg.

Các quyết định kháng nguyên HBsAg:
Người ta phát hiện vùng S có ít nhất 5 quyết định kháng nguyên của
HBsAg. Tùy theo sự phân bố của các quyết định kháng nguyên này mà
người ta phân biệt ra các phân typ khác nhau. Mỗi phân typ đều có chung
phần quyết định kháng nguyên a và khác nhau tùy theo sự ghép cặp của các
quyết định kháng nguyên d hoặc y ghép với w hoặc r để tạo nên các phân
typ như adw, ayw, adr, ayr. Chính vùng a có liên quan đến tính miễn dịch
vì nó quyết định cho sự tổng hợp kháng thể HBsAg.
Ý nghĩa chẩn đoán và điều trị bệnh của HBsAg:
HBsAg dương tính: Khẳng định chắc chắn bệnh nhân nhiễm HBV.
HBsAg dương tính kéo dài trên 6 tháng thì khẳng định là nhiễm HBV
mạn tính.
Ở bệnh nhân viêm gan virus B cấp, HBsAg đạt cao nhất khi các triệu
chứng lâm sàng xuất hiện và mất đi sau 4 – 8 tuần, định lượng HBsAg nếu
không giảm dưới 25% sau 4 – 6 tuần thì nhiều khả năng chuyển nhiễm
HBV mạn tính. HBsAg âm tính gặp trong giai đoạn điều trị HBsAg, hoặc
dưới ngưỡng phát hiện hoặc trong các trường hợp đột biến trốn thoát
(mutant escape). Ở bệnh nhân viêm gan virus B, nếu HBsAg chuyển sang
âm tính, thì có thể bệnh đang được điều trị thuyên giảm.

12


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

*Kháng nguyên lõi của virus viêm gan B (HBcAg - Hepatitis B core
antigen):
Đây là kháng nguyên chủ yếu của nucleocapside trong virus viêm gan

B. HBcAg hiếm khi xuất hiện trong huyết thanh mà chủ yếu xuất hiện
trong nhân tế bào gan. Sự có mặt của HBcAg với hàm lượng cao chứng tỏ
có hoạt động sao chép của HBV trong viêm gan cấp. Việc sinh tổng hợp
protein lõi dài 185 acid amin được bắt đầu với một mã di truyền AUG ở
đầu 5’ của RNA thông tin. Hệ gen của HBV – DNA của hạt virus khi xâm
nhập vào nhân tế bào bị nhiễm sẽ biến đổi thành một vòng khép kín đồng
hoá trị có thể do một enzym sửa chữa DNA của tế bào; DNA này là khuôn
cho mARN và sẽ được dịch mã cho protein lõi và protein polymerase.
*Kháng nguyên E của virus viêm gan B (HBeAg - Hepatitis B evolope
Antigen):
Kháng nguyên E của virus viêm gan B (HBeAg) được coi là một phần
của kháng nguyên lõi, là một dạng protein virus do các tế bào HBV tiết ra.
HBeAg là kháng nguyên hoà tan, có mặt trong huyết tương ở các hình thái
vật lý khác nhau và xuất hiện trong quá trình phân tách nucleocapside của
HBV in vitro. HBeAg được xem như là dấu ấn biểu thị sự nhân lên của
HBV và liên quan đến tình trạng nhiễm và mức độ nặng của bệnh. Thường
một tuần hay một tháng sau khi nhiễm HBV thì HBsAg xuất hiện trong
máu, tiếp theo là HBeAg và các kháng thể IgM, IgG. Khi HBsAg biến mất
thì kháng thể Anti - HBs mới xuất hiện.
Trong suốt giai đoạn HBeAg dương tính, bệnh nhân bị nhiễm virus B có
nguy cơ cao truyền nhiễm bệnh cho những người tiếp xúc với họ qua còn
đường máu. Trong viên gan B mãn tính, sự hiện diện của HBeAg chứng tỏ
bệnh đã diễn biến tương đối lâu, nhất là có thể chuyển sang giai đoạn sơ
gan và ung thư gan nguyên phát.
1.2.4 Các kháng thể trong huyết thành sau khi nhiễm viêm gan B
13


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

* Kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt (anti – HBs): xuất hiện sau 1 –
3 tháng kể từ khi HBV xâm nhập cơ thể, lúc này nồng độ kháng nguyên
HBsAg giảm thậm trí dưới ngưỡng có thể phát hiện của một số bộ sinh
phẩm chẩn đoán. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong quá trình phòng
bệnh bằng vắc xin cho bệnh nhân chưa nhiễm HBV. Vì vậy nguyên lý làm
vắc xin viêm gan B là lấy HBsAg làm kháng nguyên.
*Kháng thể kháng kháng nguyên lõi (anti – HBc): anti - HBc được sản
sinh trong thời gian đầu của nhiễm trùng cấp tính và tiếp tục tồn tại trong
nhiều năm, có thể là suốt đời. Nếu anti - HBc có hàm lượng cao thì chứng
tỏ HBV đang phát triển, đang hoạt động và đang ở dạng viêm gan B cấp.
Anti - HBc không có giá trị bảo vệ cơ thể chống tái nhiễm HBV, không có
vai trò điều hoà miễn dịch cũng như miễn dịch bệnh sinh. Nó có tác dụng
như một dấu hiệu chứng tỏ sự có mặt của HBcAg. Xét nghiệm phát hiện
anti - HBc có thể có giá trị trong quá trình nghiên cứu ở trẻ nhỏ và người
lớn, vì nó là thử nghiệm đơn giản nhất để phát hiện người nhiễm HBV mà
không được tiêm chủng. Tiêm chủng bằng văc xin viêm gan không tạo ra
đáp ứng anti - HBc. Vì vậy sự có mặt của anti - HBc ở người đã được tiêm
chủng có thể là do họ đã bị nhiễm HBV trước đó.
*Kháng thể kháng kháng nguyên HBeAg (anti – HBe): Sự xuất hiện
của anti - HBe cho thấy đây là dấu hiệu của sự lui bệnh và hàm lượng
HBsAg sẽ giảm dần xuống. Những người có kết quả xét nghiệm HBsAg
dương tính mà có anti - HBe dương tính thì ít có khả năng lây truyền hơn
những người có đồng thời HBsAg dương tính và HBeAg dương tính.
1.2.5 Vai trò của kiểu gen viêm gan B
Vai trò của kiểu gen virus viêm gan B cho đến nay vẫn chưa được biết
rõ ràng. Nhiều câu hỏi về vai trò của kiểu gen HBV đã được đặt ra và các
nhà chuyên môn vẫn đang cố gắng để trả lời:
(1) Có hay không sự liên quan giữa kiểu gen HBV và khả năng nhân đôi

của virus, sự khỏi bệnh, và đáp ứng với điệu trị
14


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

(2) Sự phân bố kiểu gen HBV theo các vùng địa lý có liên quan với dịch tễ
nhiễm HBV
(3) Ảnh hưởng của kiểu gen HBV trong diễn tiến đến viêm gan B mạn tính
(4) Khi nhiễm với một kiểu gen này thì có được bảo vệ khỏi nhiễm với kiểu
gen khác không
Cho đến hiện nay, các nghiên cứu về kiểu gen HBV vẫn còn rải rác, số
liệu không được nhiều cũng như các kết quả chưa được thống nhất hoàn
toàn. Kiểu gen HBV ở vùng Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam, chủ yếu
là kiểu gen B và C (Theo phân bố dịch tễ HBV toàn cầu của WHO; 1994).
Có nhiều nghiên cứu cho thấy có mối liên quan giữa kiểu gen HBV và các
đột biến ở vùng Precore và Core Promoter: Kiểu gen B, C và D thường có
tỉ lệ đột biến nhiều hơn kiểu gen A (Phạm Thị Thu Thủy và Hồ Tấn Đạt;
2015). Về nồng độ HBeAg với kiểu gen HBV, các nghiên cứu trên bệnh
nhân Châu Á cho thấy ở kiểu gen B có nồng độ HBeAg cao hơn so với
kiểu gen C. Mối quan hệ giữa kiểu gen virus viêm gan B và diễn tiến của
bệnh cũng được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Rối loạn chức năng gan
hình như ít gặp ở kiểu gen B so với kiểu gen C, và kiểu gen C thì thường
gặp ở bệnh nhân xơ gan. Vai trò của kiểu gen HBV và đáp ứng điều trị
cũng được quan tâm. Trong điều trị với Interferon, kiểu gen A có đáp ứng
điều trị tốt nhất, kiểu gen B có đáp ứng điều trị tốt hơn kiểu gen C. Đối với
Lamivudine, kiểu gen B dễ phát triển kháng thuốc hơn (Phạm Thị Thu
Thủy và Hồ Tấn Đạt; 2015).

1.3 Dự phòng virus viêm gan B (bộ Y tế; 30/12/2014)
1.3.1 Phòng chủ động:
Tiêm vắc xin viêm gan virus B cho tất cả trẻ em trong vòng 24h sau
sinh và các mũi tiếp theo lúc 2, 3 và 4 tháng tuổi theo chương trình tiêm
chủng mở rộng.

15


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

Tiêm vắc xin viêm gan virus B cho các đối tượng chưa bị nhiễm HBV.
Cần xét nghiệm HBsAg và anti - HBs trước khi tiêm phòng vắc xin.
Tiêm vắc xin viêm gan virus B cho nhân viên y tế.
1.3.2 Phòng lây truyền từ mẹ sang con:
Nếu mẹ mang thai có HBsAg dương tính: Tiêm vắc xin viêm gan virus
B liều sau sinh cho trẻ theo chương trình tiêm chủng mở rộng và phối hợp
với tiêm kháng thể kháng HBV cho trẻ. Nên tiêm cùng thời điểm nhưng ở
hai vị trí khác nhau. Sau đó tiêm đầy đủ các liều vắc xin viêm gan virus B
cho trẻ theo quy định của chương trình tiêm chủng mở rộng.
Nếu mẹ mang thai có HBV - DNA > 106 bản sao/ml (200.000 IU/mL):
Dùng thuốc kháng virus (Lamivudine hoặc Tenofovir) từ 3 tháng cuối của
thai kỳ. Xét nghiệm lại HBV DNA sau sinh 3 tháng để quyết định ngừng
thuốc hoặc tiếp tục điều trị nếu mẹ đủ tiêu chuẩn điều trị. Theo dõi sát
người mẹ để phát hiện viêm gan bùng phát.
1.3.3 Phòng không đặc hiệu:
Sàng lọc máu và chế phẩm máu
Không dùng chung kim tiêm và các dụng cụ xuyên chích qua da khác

Tình dục an toàn
Tránh tiếp xúc với máu và các dịch tiết của bệnh nhân nhiễm HBV
Thực hiện phòng ngừa chuẩn giống các bệnh lây truyền qua đường máu

16


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

PHẦN 2
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng:
2.1.1 Chọn mẫu:
Trong quá trình điều tra chúng tôi thu thập được các mẫu huyết Thanh
trong cộng đồng tại các tỉnh Hòa Bình, Quảng trị, KonTom, và thành phố
Hồ Chí Minh (tp HCM) trong khoảng thời gian từ 2012 - 2013. Những mẫu
này sẽ được chúng tôi xét nghiệm HBsAg và DNA – HBV.
Hòa Bình: 93 mẫu
Quảng Trị: 188 mẫu
Kontom: 183 mẫu
Thành phố Hồ Chí Minh: 200 mẫu
Tổng số: 664 mẫu
2.2.2 Bảo quản mẫu:
Những mẫu huyết thanh thu được từ các bệnh nhân viêm gan B được
bảo quản dưới 48 giờ ở nhiệt độ 2- 8oC
Những mẫu huyết thanh thu được từ những bệnh nhân được bảo quản
dài hạn ở nhiệt độ -20oC và -80oC

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu:
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu Viện Y sinh Nhiệt Đới, Trung tâm
Nhiệt đới Việt - Nga (Đường Nguyễn Văn Huyên, Cầu Giấy, Hà Nội).

17


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

2.2 Vật liệu:
2.2.1 Thiết bị và dụng cụ phòng thí nhiệm
2.2.1.1 Thiết bị:
Máy

Tên

dụng

cụ, Seri máy

Hãng sản xuất

thiết bị
Máy PCR

22331 Hamburg

Máy chạy Real Rotor Gene Q

6325AN314502

Eppendorf,

6325AN014504

Đức

R0612166

QIAGEN,

Time PCR
Máy

điện

Đức
di Consort - EV222

DNA
Lò vi sóng

101180

Bỉ

101181
Sanyo

EM_G475AW

Sanyo,

Nhật

Bản
Cân điện tử

TẺ612

Máy chụp ảnh UV
gel

27509412

Sartorius, Đức

TO12312-010

UVP,

trandilluminator

Campridge
Mỹ

Máy vortex

IAK-MS3

EN60529

Máy li tâm lạnh

Centrifuge 5415R 5426A1335700

IAK
Eppendorf,
Đức

Tủ thao tác PCR UV4PCR

157239

Máy hút dịch OM-1

Vtec

nổi
Máy ly tâm chân Concentrator plus 5305NL120756

Eppendorg,

không

Đức

Tủ lạnh âm 20oC LFG 530 W PRO MDF-U334

Evermed, Ý

18