Nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng bảo vệ gan của cây xáo tam phân(paramignya trimera) họ rutacea của việt nam

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

LỜI CẢM ƠN
Khóa luận nà được hoàn thành tại phòng Hoạt chất sinh học, Viện
Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam.
i đ u ti n tôi xin gửi l i cảm ơn sâu sắc đến PGS. TS Nguy n Mạnh
Cư ng đang công tác và làm việc tại phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học
các hợp chất thiên nhiên – ngư i th

đã dạy dỗ, chỉ bảo tôi tận tình trong

suốt quá trình thực hiện đề tài khóa luận.
ôi cũng xin gửi l i cảm ơn đến toàn thể các anh ch cán bộ trong
phòng thí nghiệm đã luôn giúp đỡ hướng dẫn nhiệt tình và tạo điều kiện cho
tôi trong quá trình nghiên cứu.
Tôi xin chân thành gửi l i cảm ơn đến các th y cô giáo khoa Công
Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã tru ền cho tôi những kiến thức
bổ ích trong suốt 4 năm học tập tại đâ .
Cuối cùng tôi gửi l i cảm ơn đến gia đình bạn bè đã luôn là điểm tựa
tinh th n vững chắc giúp đỡ tôi trong th i gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2016
Sinh viên thực hiện

Nguy n Th H n

gu n h

n

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

MỞ ĐẦU.......................................................................................................... 1
PHẦN I : TỔNG QUAN ................................................................................ 3
1.1. Tổng quan về chi Paramignya ............................................................. 3
1.1.1. Đặc điểm thực vật chi Paramignya ............................................... 3
1.1.2. Phân bố của chi Paramignya ......................................................... 3
1.1.3. Phân loại chi Paramignya.............................................................. 3
1.1.4. Tác dụng dược lý của chi Paramignya .......................................... 6
1.1.5. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của
chi Paramignya .......................................................................................... 7
1.1.5.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học ............................................ 7
1.1.5.2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học ............................................. 11
1.2. Tổng quan về cây Xáo tam phân (Paramignya trimera) ................... 12
1.2.1. Đặc điểm thực vật ........................................................................ 12
1.2.2. Phân bố ........................................................................................ 13
1.2.3. Tác dụng dược lý ......................................................................... 13
1.3. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu bảo vệ gan .......................... 14
1.3.1. Phương pháp gây độc bằng paracetamol ..................................... 14
1.3.2. Phương pháp xét nghiệm ............................................................. 15
1.3.3. Phương pháp kiêm tra trực quan.................................................. 15
1.3.4. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................... 15
PHẦN II: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU VÀ THỰC NGHIỆM ........ 16
2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu ............................................... 16
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu..................................................................... 16
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................ 16
2.1.2.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu.................................................... 16
2.1.2.2. Phương pháp phân lập ................................................................. 16
2.1.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học...................................... 19

gu n h

n


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
2.1.2.4. Phương pháp thử hoạt tính sinh học ............................................ 20
2.2. Thực nghiệm......................................................................................... 21
2.2.1. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị .......................................................... 21
2.2.2. Thu mẫu và tạo dịch chiết từ thân, rễ cây Xáo tam phân .............. 21
2.2.2.1. Thu mẫu và xử lý mẫu................................................................ 21
2.2.2.2. Tạo dịch chiết từ thân và rễ cây Xáo tam phân .......................... 21
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của dịch chiết
clorofom ................................................................................................... 23
2.2.3.1. Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết clorofom khi gây độc bằng
paracetamol .............................................................................................. 23
2.2.3.2. Xét nghiệm ................................................................................. 24
2.2.3.3 Làm tiêu bản mô bệnh học gan .................................................... 25
2.2.3.4. Xử lý số liệu ................................................................................ 27
2.2.4. Phân tích sắc ký TLC và phân tách phần chiết clorofom (B) ........ 27
2.2.4.1. Phân tích sắc ký TLC .................................................................. 27
2.2.4.2. Phân tách phần chiết clorofom (B) .............................................. 28
2.5. Dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được....................................... 29
2.5.1. Hợp chất MC-390........................................................................... 29
2.5.2. Hợp chất MC-392........................................................................... 30
2.5.3. Hợp chất MC-393........................................................................... 30
2.5.4. Hợp chất MC-424........................................................................... 31
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................... 32
3.1. Kết quả nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của dịch chiết clorofom
(HCTN106) từ thân và rễ Xáo tam phân ..................................................... 32

3.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết clorofom lên nồng độ
aminotransferase (AST, ALT) huyết thanh. ............................................. 32
3.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết clorofom lên nồng độ
protein toàn phần ...................................................................................... 33

gu n h

n


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
3.1.3.Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết clorofom lên nồng độ
cholesterol toàn phần ............................................................................... 34
3.1.4. Kiểm tra ảnh hưởng của dịch chiết clorofom đến khối lượng gan . 35
3.1.5. Kết quả kiểm tra trực quan của dịch chiết clorofom đến gan ....... 36
3.1.6. Kết quả làm tiêu bản mô bệnh học gan .......................................... 38
3.2. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ dịch chiết
clorofom ...................................................................................................... 40
3.2.1. Cấu trúc hợp chất MC – 390 (Chất mới) ........................................ 40
3.2.2. Cấu trúc hợp chất MC- 392 (Chất mới) ......................................... 41
3.2.3. Cấu trúc hợp chất MC–393 ............................................................ 43
3.2.4. Cấu trúc hợp chất MC- 424 ( Chất mới ) ....................................... 44
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 48

gu n h

n

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

DANH M C CÁC TỪ VIẾT TẮT

TLC

Thin Layer Chromatography

Sắc ký lớp mỏng

CC

Column Chromatography

Sắc ký cột

Mini - C

Mini Column Chromatography

Sắc ký cột tinh chế

1

Proton-Nuclear

H-NMR

13

C-NMR

proton

Carbon-13 Nuclear Magnetic
Resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
cacbon-13

Polarization Transfer
Electron Spray Ionization-Mass

ESI-MS

Spectrometry

HR-ESI-MS

HSQC

Resonance

Distortionless Enhancement by Phổ DEPT

DEPT

HMBC

Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Phổ khối lượng ion hoá
phun mù điện tử

High Resolution Electronspray Phổ khối lượng phân giải
Ionization Mass Spectrum

Heteronuclear

Mutiple

Connectivity

cao phun mù điện tử

Bond Phổ tương tác dị hạt nhân
qua nhiều liên kết

Heteronuclear Single-Quantum Phổ tương tác dị hạt nhân
Coherence Spectroscopy

HCTN

qua một liên kết
Hợp chất thiên nhiên

AST

Aspartate aminotransferase

Enzym chuyển hóa aspartat

ALT

Alanine aminotransferase

Enzym chuyển hóa alanine

gu n h

n


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

DANH M C BẢNG BIỂU
Bảng 1: Hiệu suất thu nhận của quá trình chiết .............................................. 23
Bảng 2: Phân tích TLC phần chiết clorofom (B) ........................................... 27
Bảng 3: Ảnh hưởng của dịch chiết HCTN106, HCTN107 lên nồng độ
aminotransferase (AST, ALT) huyết thanh chuột BALB/c bị nhiễm độc
paracetamol (n=5) ........................................................................................... 32
Bảng 4: Ảnh hưởng của dịch chiết HCTN106, HCTN107 lên nồng độ protein
toàn phần huyết thanh chuột BALB/c bị nhiễm độc paracetamol (n=5) ........ 33
Bảng 5: Ảnh hưởng của dịch chiết HCTN106, HCTN107 lên nồng độ
cholesterol toàn phần huyết thanh chuột BALB/c bị nhiễm độc paracetamol
(n=5) ............................................................................................................... 34
Bảng 6: Khối lượng gan chuột ở các lô thí nghiệm ........................................ 35
Bảng 7: Quan sát hình thái trực quan gan chuột ở các lô thí nghiệm ............. 36
Bảng 8: Bảng tổng hợp kết quả các chất được phân lập................................. 47

gu n h

n


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

DANH M C HÌNH VẼ
Hình 1 : Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từ vỏ thân
P.monophylla .................................................................................................... 8
Hình 2: Cấu trúc hóa học 5 hợp chất được phân lập từ vỏ thân cây................. 9
Hình 3: Cấu trúc hóa học 5 hợp chất Glycosit được phân lập từ phần chiết
nước của cây P. scandens ............................................................................... 10
Hình 4: Cấu trúc hóa học cả Ostruthin ........................................................... 10
Hình 5: Cấu trúc hai hợp chất Tirucalane....................................................... 11
Hình 6: Thân và rễ Xáo tam phân................................................................... 13
Hình 7: Mô tả sắc ký bản mỏng...................................................................... 18
Hình 8: Mô tả sắc ký cột................................................................................. 19
Hình 9: Đồ thị biểu hiện khối lượng gan chuột sau thí nghiệm ..................... 36
Hình 10: Gan chuột khi cho uống NaCl 0.9% ................................................ 37
Hình 11: Gan chuột khi cho uống NaCl 0.9% +PAR 400mg/kg................... 37
Hình 12: Gan chuột khi cho uống SPO3 10g/kg+PAR 400mg/kg ................. 37
Hình 13: Gan chuột khi cho uống SPO4 10g/kg+PAR 400mg/kg ................. 37
Hình 14: Gan chuột khi cho uống Silymarin 50 mg/kg+PAR 400mg/kg ...... 37
Hình 15: Tiêu bản gan của mẫu đối chứng PAR ............................................ 38
Hình 16: Tiêu bản gan thử với dịch chiết HCTN106 ..................................... 39
Hình 17: Tiêu bản gan mẫu đối chứng dương Silymarin ............................... 39
Hình 18: Tiêu bản gan mẫu đối chứng âm ..................................................... 39
Hình 19: Cấu trúc hóa học của hợp chất MC-390 .......................................... 40
Hình 20: Tương tác trong phổ HMBC và NOESY của hợp chất MC-390 .... 41

Hình 21: Cấu trúc hóa học của hợp chất MC-392 .......................................... 41
Hình 22: Tương tác trong phổ COSY, HMBC và NOESY của hợp chất MC392 .................................................................................................................. 43
Hình 23: Cấu trúc hóa học của hợp chất MC-393 .......................................... 43
Hình 24: Tương tác trong phổ COSY, HMBC, và NOESY của hợp chất ..... 44
Hình 25: Cấu trúc hóa học của hợp chất MC- 424 ......................................... 44
Hình 26: Tương tác trong phổ COSY, HMBC, NOESY của hợp chất MC-424
........................................................................................................................ 45

gu n h

n


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

DANH M

SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1: Quá trình chuyển hóa paracetamol tạo thành NAPQI .......................... 15
Sơ đồ 2: Quy trình tạo dịch chiết phân đoạn từ thân, rễ cây Xáo tam phân ....... 22
Sơ đồ 3: Quy trình phân lập các hợp chất từ phân đoạn Clorofom (B) .............. 29

gu n h

n


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

MỞ ĐẦU
Việc sử dụng thuốc Tây lâu dài hay dùng quá nhiều đều là nguyên nhân
làm cho các cơ quan trong cơ thể chúng ta chịu nhiều tác dụng không mong
muốn. Gan và thận chính là những cơ quan có chức năng chuyển hóa và thải
trừ các loại thuốc này sau khi đã hết tác dụng dược lý. Chính vì vậy hai cơ
quan này thường bị ảnh hưởng nhiều nhất dẫn đến việc chức năng của chúng
bị suy giảm.
Từ ngàn xưa, ông cha ta đã biết đến những bài thuốc cổ truyền được bào
chế từ thảo dược có tác dụng hữu hiệu trong phòng, trị bệnh. Tác dụng chữa
bệnh, tăng cường sức khỏe của thảo dược đối với con người chủ yếu là do các
hợp chất tự nhiên sẵn có mà chúng đã sinh tổng hợp, tích lũy trong quá trình
sinh trưởng và phát triển. Do vậy có thể sử dụng chúng để phòng trị bệnh
trong một thời gian dài mà không gây độc hại cho cơ thể và không xuất hiện
hiện tượng kháng thuốc. Đây chính là một trong những ưu điểm nổi bật của
những vị thuốc có nguồn gốc thảo dược tự nhiên.
Nhiều bài thuốc không chỉ có tác dụng chữa bệnh mà còn giúp cân bằng
lại âm dương. Ngoài công dụng chính là chữa những bệnh mạn tính, một số
bài thuốc còn chữa được những căn bệnh cấp tính, nan y như ung thư cổ tử
cung, ung thư gan, ung thư đại tràng, viêm gan siêu vi, viêm gan cấp tính…
có hiệu quả cao.
Việt Nam có lợi thế nằm trong khu vực nhiệt đới, là một trong những
nước có nền y học cổ truyền phát triển từ lâu đời. Việc đào sâu tìm kiếm và
phát hiện các cây thuốc, các hoạt chất trong cây thuốc đó có tác dụng hỗ trợ
và điều trị căn bệnh viên gan, ung thư gan đã và đang được các nhà khoa học
trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu.
Gần đây, trên báo điện tử tỉnh Khánh Hòa và một số báo in khác có
đăng tin về một loài cây Xáo tam phân (Paramignya trimera) ở xã Ninh Vân,
tỉnh Khánh Hòa có khả năng chữa bệnh xơ gan cổ trướng. Theo báo chí, một
số người bị bệnh xơ gan giai đoạn cuối đã sử dụng thuốc sắc từ rễ và thân cây
gu n h

n

1


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
thuốc trên và chữa được khỏi bệnh [1]. Loài cây này chưa từng được nghiên
cứu cụ thể cả ở trong nước và ngoài nước. Do vậy, trong đề tài này, chúng tôi
tiến hành nghiên cứu và xác định thành phần hóa học, hoạt chất có tác dụng
bảo vệ gan của cây thuốc Xáo tam phân (Paramignya trimera) họ Rutaceae
Việt Nam nhằm tạo tiền đề cho việc phát triển hiệu quả dược liệu này trong
việc điều trị bệnh gan nói riêng và các bệnh khác nói chung.
Theo hướng nghiên cứu ấy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cây Xáo tam phân (Paramignya
trimera) họ Rutacea của Việt Nam”.

Khóa luận gồm những nội dung chính sau:
- Thu mẫu thực vật và tạo dịch chiết các phân đoạn.
- Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của các dịch chiết thân và rễ cây Xáo
tam phân trên mô hình chuột BALB/c gây độc gan bằng
paracetamol.
- Phân lập các hợp chất từ phân đoạn CHCl3 của thân và rễ cây Xáo
tam phân.
- Kết quả xác định cấu trúc các hợp chất đã phân lập từ phân đoạn
CHCl3 của thân và rễ cây Xáo tam phân.

gu n h

n

2


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẦN I TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về chi Paramignya
Chi Paramignya Cựa gà, hay Xáo thuộc họ Cam (Rutaceae) được

Robert Wight đặt vào năm 1839 trong tác phẩm Illustrations of Indian
Botany, vol 1, dựa trên loài chuẩn là Paramignya monophylla Wight thu được
ở Ấn Độ. Ông cho rằng đặc tính “leo” của chi này cho thấy nó gần gũi với chi
Luvunga [2].
1.1.1. Đặc điểm thực vật chi Paramignya
Chi Paramignya là dạng cây gỗ trườn, có gai mọc ở lá nách. Lá dạng kép
một lá, mép lá nguyên, có nhiều tuyến tinh dầu.Cụm hoa mọc ở nách lá, hoa
lưỡng tính màu trắng. Đài có 4-5 thùy, thùy dính nhau ở gốc thành hình chén.
Tràng hoa có 4-5 cánh, tiền khai lợp. Bộ nhị có 8-10 nhị, chỉ nhị rời nhau, bao
phấn thuôn dài. Cuống bầu ngắn, các lá noãn dính nhau hoàn toàn, bầu 3-5 ô.
Quả mọng, hình cầu hoặc trứng, không có lông hình túi nước mọng (tép), vỏ
quả dày. Hạt to, dẹt hai bên, vỏ hạt mỏng, phồng lên [3].
1.1.2. Phân bố của chi Paramignya
Trên thực tế, việc phân loại chi Paramignya, năm 2008 Zhang và các cộng
sự cho rằng chi Paramignya có khoảng 15 loài và chi này phân bố chủ yếu ở
Nam Á, Đông Nam Á và miền Bắc nước Úc [4].
1.1.3. Phân loại chi Paramignya
Theo các dữ liệu thực vật học do nhiều tổ chức nghiên cứu và các nhà thực

vật của Vườn Thực vật Hoàng gia Kew (Anh) và Vườn Thực vật Missouri
(Hoa Kỳ), đến năm 2013, có 30 loài được cho là thuộc chi Paramignya.
Thực tế, tình trạng phân loại chi Paramignya chưa được thống nhất giữa
các nhà phân loại học thực vật. Gần đây, Zhang D. X. [4] cho rằng chi
Paramignya có khoảng 15 loài và phân bố ở Nam Á, Đông Nam Á và miền
Bắc nước Úc.
Tại Việt Nam, chi Paramignya được Phạm Hoàng Hộ ghi nhận 7 loài bao
gồm [5]:
gu n h

n

3


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
 Paramignya armata Oliv. var. andamanica King (Cựa gà, Gai xanh,
Quýt gai) [5]
Paramignya andamanica là dạng thân cây gỗ trườn, thân cao 1-4 m, cành
mảnh, khi non có lông, trưởng thành nhẵn, gai đơn, dài. Lá chét hình trứng
ngược, dai, có nhiều tuyến nhỏ, đỉnh nhọn, có mũi, gốc tròn, gân bên 10-12
đôi, cuống lá dài, có lông khi non. Cụm hoa mọc ở nách lá, có 1-2 hoa, mỗi
hoa có 2 lá bắc, nụ hoa mảnh, cuống hoa dài hơn cuống lá. Đài 5 thuỳ hình
tam giác tù, nhẵn hoặc mép có lông ngắn. Tràng 5 cánh hoa, nhẵn đỉnh tròn.
Bộ nhị có 10 nhị, chỉ nhị rời nhau, gốc chỉ nhị nhẵn hoặc có lông thưa, bao
phấn hình bầu dục thuôn. Bầu nhẵn có 5 ô, vòi nhụy mảnh, thuôn, không có
lông, đầu nhụy phồng 3 thuỳ. Quả hình tròn, khi chín có màu vàng. Cây nở
hoa vào tháng 8, có quả vào tháng 10 đến tháng 12.
Paramignya andamanica phân bố chủ yếu ở Đà Nẵng, Khánh Hoà (Nha
Trang, Phú Hữu), Đồng Nai và trồng ở Nam bộ.

Cây còn được tìm thấy ở Ấn Độ, Andaman, Lào, Campuchia.
Ngoài ra, quả của cây ăn được, lá và quả đun sôi uống có thể chữa viêm
phế quản, ho [6].
 Paramignya monophylla Wight (Xáo một hoa) [5]
Paramignya monophylla là cây gỗ nhỏ, leo hoặc trườn, cành nhỏ, có gai
cong, dài. Lá mọc cách, dai, hình thuôn, bầu dục, gốc tròn, mép nguyên,
cuống lá dài nhẵn. Cụm hoa có một hay vài hoa, mọc ở nách lá. Đài 5 thuỳ,
hình tam giác tù, dính nhau hình chén, mặt ngoài có lông.Tràng 5 cánh hoa,
gốc có lông, phía trên có lông thưa hoặc nhẵn, đầu nhụy phồng.Quả hình cầu,
giống quả cam nhỏ, khi chín có màu vàng.
Xáo một hoa là loại cây ưa sáng, ra hoa vào tháng 6, ra quả tháng 8 đến
tháng 10 [7].
Phân bố: Cây phân bố ở Vĩnh Phúc (Phúc Yên), Hà Nội (Ba Vì), Nghệ
An (Pù Mát). Còn có ở Ấn Độ [7].

gu n h

n

4


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
 Paramignya scandens (Griff) Craib (Xáo leo) [5]
Paramignya scandens là loại cây gỗ nhỏ, thân trườn, cành màu nâu có
lông mịn, có gai dài nhỏ, cong và có lông. Lá mọc cách, hình trứng, đỉnh lá có
khía rõ, gốc tròn, cuống lá có lông mịn. Đài 4-5 thuỳ nhỏ, hình tam giác nhọn,
gốc dính nhau thành hình chén, có lông. Tràng 4-5 cánh hoa, hình dải, nhẵn.
Bộ nhị có 8-10 nhị, chỉ nhị mảnh, nhẵn hay có lông, bao phấn ngắn hình bầu
dục, có tuyến nhỏ ở đỉnh. Bầu hình bầu dục, nhẵn hay có lông, 5 ô, mỗi ô

chứa 2 noãn, vòi nhụy nhẵn hoặc có lông, đầu nhụy phồng. Quả hình trứng
dài.
Xáo leo là cây ưa bóng, ưa ẩm [7].
Mùa ra hoa vào tháng 4- 6, có quả từ tháng 5 đến tháng 8.
Cây có ở tỉnh Hà Nam, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Lâm Đồng còn
có ở Lào, Thái Lan, Mianma.
 Paramignya hispida Pierre ex Guillaum (Cựa gà nhám) [5]
Loài Paramignya hispida là cây gỗ nhỏ, có gai cong xuống, dài đến 1
cm, nhánh mảnh, lúc non có lông. Lá phiến to, xoăn tròn dài, đáy hình tim,
gân phụ không rõ. Hoa đơn, 5 lá đài, có lông mặt ngoài, cánh hoa cao 1cm,
tiểu nhụy 10, rời nhau làm thành thư đài, không lông, 5 buồng, 2 noãn với
dạng sáo tròn, trái nhỏ.
Paramignya hispida sống theo dạng bụi leo.
Cựa gà nhám được tìm thấy ở Nghệ An, Quảng Trị, Đồng Nai [7].
 Paramignya griffithii Hook (Xáo Grifith) [5]
Paramignya griffithii là cây tiểu mộc leo. Có gai cong, cành mảnh, lá có
phiến bầu dục, rộng ở nửa trên, mỏng, hai mặt nâu lọt lúc khô. Gân phụ từ
năm đến bảy cặp, cuống dài, hoa có từ một đến ba hoa mọc ở nách lá, cong,
mảnh, đài hình đĩa, tiểu nhụy từ 6-10 rời nhau, chỉ ngắn hơn bao phấn, dĩa
mật, não sào có lông. Trái xanh, tròn to.
Xáo Grifith phân bố ở Khánh Hoà (Nha Trang), Lâm Đồng [7].

gu n h

n

5


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

 Paramignya petetotii Gruill (Xáo petelot) [5]
Paramignya petetotii là cây dạng tiểu mộc leo, cành già có xám, bì
khẩu nhỏ, nhiều, trăng trắng, gai nhỏ, cong. Lá có phiến bầu dục tròn dài, to,
hoa mọc ở nách lá, cánh hoa hẹp, tiểu nhụy 10, dài bằng cánh hoa, noãn sào,
có lông, 5 buồng..
Xáo petelot sống theo dạng bụi leo, cành già màu xám [7].
Phân bố: Hoà Bình (Dựa suối).
 Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum (Xáo tam phân) [5]
1.1.4. Tác dụng dược lý của chi Paramignya
Hầu hết dược tính của chi Paramignya được biết đến thông qua các
nghiên cứu trên loài P. monophylla vốn được biết là loài cây thuốc được sử
dụng trong dân gian ở nhiều nước châu Á [8].
Năm 1982, Jayaweera đã đề cập đến loài P. monophylla như một loại
thuốc bổ, lá được nghiền sơ dùng đắp bên ngoài vết thương do rắn cắn và
dùng cho vật nuôi ăn khi bị chứng huyết niệu hoặc mất máu từ bụng [9].
Nghiên cứu của Kumar và cộng sự cho thấy trong vỏ rễ của loài này có
chứa các hợp chất thuộc nhóm coumarin (những dẫn chất α- pyron có cấu
trúc C6-C3) và nhóm hợp chất này có những hoạt tính sinh học giá trị như đã
nói ở trên. Niyaz (1995) khi nghiên cứu các hợp chất hóa học của P.
monophylla đã phân lập được một số hợp chất coumarin như poncitrin,
nordentatin,… [10].
Ngoài ra, quả của P. monophylla chứa flindissone, deoxyfiindissone và
4 hợp chất tirucalladiene như 3-oxotirucalla-7,24-dien-23-ol, 3-oxotirucalla7,24-diene-21,23- diol cũng như dẫn xuất 3β-hydroxy của chúng nên cũng
cho thấy hoạt tính sinh học khá lý thú của loài này [11].
Wattanapiromsakul khi nghiên cứu vỏ thân cây P. griffithii ở Thái Lan
đã phân lập được 5 hợp chất, điển hình là: Amoradicin [12].
Ngoài ra, Wiart đề cập P. scandens có khả năng sinh tổng hợp các
prenylated flavanone như amoradicin. Cho đến nay, tính chất dược lý của
gu n h

n

6


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
nó vẫn chưa được làm rõ. Tuy nhiên, flavonoid nói chung có khả năng
kháng khuẩn hoặc gây độc tế bào (cytotoxic). Ở Malaysia, rễ của loài này
sắc uống có tác dụng làm giảm đau bụng dưới, còn toàn bộ cây sắc uống
để trị bệnh giang mai [13].
Theo Phạm Hoàng Hộ, các loài thuộc chi Paramignya ở Việt Nam
được dùng trong y học cổ truyền như sau:
Paramignya armata Oliv. var. andamanica King (Cựa gà) có lá và
quả đun sôi uống chữa viêm phế quản, ho…[6]
Paramignya monophylla Wight (Xáo một hoa) chống siêu khuẩn R.D
in vitro, trị bạch đái hạ [2].
1.1.5. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi
Paramignya
1.1.5.1. ghi n cứu về thành ph n hóa học
 Một số nghiên cứu trên thế giới
Chi Paramignya được nghiên cứu từ năm 1990, tập trung chủ yếu vào
2 loài P. monophylla và P. griffithii. Hầu hết các hợp chất tách ra từ lá, rễ, vỏ
thân và quả. Các hợp chất tách ra từ chi Paramignya thuộc các lớp chất phổ
biến như coumarin, flavonoit, tritecpenoit. Với các lớp chất phong phú đa
dạng như vậy, chúng có nhiều hoạt tính lý thú như chống ung thư, tác nhân
bảo vệ gan, kháng khuẩn.
Từ vỏ thân loài P. monophylla, năm 1995 V. Kuma và cộng sự đã phân
lập được các hợp chất [14]:


Poncitrin (1).



Nordentatin (2).



5-hydroxy- 8,8-dimethyl- 10-(3',7'- direct hylocta- l',6'- dien-3'-yl)-

2H,8H-benzo[ 1,2-b:5,4-b']dipyran-2-one] (3).


5-methoxy-8,8-dimethyl-10-(3',7'-di-methylocta-l',6'-

dienyl)pyranocoumarin (4).

gu n h

n

7


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP


5-methoxy-8,8-dimethyl-10-(7-hydroxy-3,7-dimethylocta-1,5-dien-3-

yl) pyranocoumarin(5).



5-hydroxy-8,8-dimethyl-10-(7-hydroxy-3,7-dimethylocta-1,5-dien-3-

yl) pyranocoumarin(6).

Hình 1: Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từ vỏ thân
P.monophylla
Từ quả loài này, nhóm tiếp tục phân lập được flindissone (7), và hai
triterpen mới có công thức phân tử là C30H48O2 (7), C30H50O2 (8) [12].
Năm 2000, Wattanapiromsakul khi nghiên cứu vỏ thân cây P. griffithii
ở Thái Lan đã phân lập được 5 hợp chất là [12]:


Amoradicin (9).



3,4- Dihydroxy-7- methoxy-8-(3-methylbut-2-enyl)-furano flavone (10)



3,4-Dihydroxy-7-methoxy-8-(3-methylbut-2-enyl)-2-(1-hydroxy-1-

methylethyl)-furano flavanone (11).


3-Oxo-tirucalla-7,24-diene-21-al (12).



6-(2-Hydroxyethyl)-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran (13).

gu n h

n

8


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Hình 2: Cấu trúc hóa học 5 hợp chất được phân lập từ vỏ thân cây
P. griffithii
 Một số nghiên cứu trong nước
Ở nước ta, năm 2014, nhóm nghiên cứu Nguyễn Hữu Toàn Phan cùng
các cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc 5 hợp chất Glycosit từ phần
chiết nước của cây Xáo leo (P. scandens) [15].

gu n h

n

9


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Hình 3: Cấu trúc hóa học 5 hợp chất Gl cosit được phân lập từ ph n chiết
nước của cây P. scandens

Năm 2013, khi nghiên cứu thành phần hoá học, độc tính cấp, tác dụng
bảo vệ gan và tác dụng gây độc tế bào ung thư của cây Xáo tam phân Viện
Dược liệu đã chỉ ra rằng cây có chứa hợp chất có tên là Ostruthin (19), qua
các thử nghiệm lâm sàng trên chuột cho thấy hợp chất này có hoạt tính bảo vệ
gan tốt nhưng chưa có khả năng ức chế 5 dòng tế bào ung thư [16].

Hình 4: Cấu trúc hóa học cả Ostruthin
Năm 2014, nhóm nghiên cứu của GS Châu Văn Minh đã tìm ra được hai
dẫn xuất tirucalane từ cây Paramignya scandens là paramignyol A (20) và

gu n h

n

10


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
paramignyol B (21), hai hợp chất này có khả năng ức chế đáng kể các dòng tế
bào ung thư như KB, SK-Mel-2, LU-2 và MCF-7 [17].

20 R1 = OMe, R2 = H
21 R1 = H, R2 = OMe

Hình 5: Cấu trúc hai hợp chất Tirucalane
1.1.5.2. ghi n cứu về hoạt tính sinh học
Sau khi nhóm tác giả Nguyễn Mạnh Cường công bố kết quả ban đầu
về thành phần hóa học rễ cây Xáo tam phân gồm ninhvanin, ostruthin [18],
Viện Dược liệu đã công bố trên Tạp chí Dược liệu về nghiên cứu nghiên cứu
thành phần hoá học, độc tính cấp, tác dụng bảo vệ gan và tác dụng gây độc tế

bào ung thư của cây Xáo tam phân [16].
Viện Dược liệu đã chỉ ra rằng loài cây này có chứa hợp chất có tên là
ostruthin (19), qua các thử nghiệm in vitro trên chuột cho thấy hợp chất này
có khả năng ức chế trung bình năm dòng tế bào ung thư: ung thư gan Hep-G2,
ung thư đại tràng HTC116, ung thư vú MDA MB231, ung thư buồng trứng
OVCAR-8 và ung thư cổ tử cung Hela [16].
Nhóm nghiên cứu Nguyễn Hữu Toàn Phan và cộng sự đã công bố kết quả
về thử nghiệm trên các dòng tế bào người KB, SK-Me-2, LU-1 và MCF7 đối
với hai dẫn xuất mới tirucallane, Paramignyol A và B phân lập từ cây P.
scandens [19].
Paramignyol B cho giá trị IC50 3.55 µM với dòng tế bào SK-Me-2, trong
khi Paramignyol A cho IC506.02 µM. Giá trị IC50 5.25-10.50 µM đối với các
dòng tế bào KB, LU-1 và MCF7 cho cả hai hợp chất.
gu n h

n

11


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
1.2.

Tổng quan về cây Xáo tam phân (Paramignya trimera)

1.2.1. Đặc điểm thực vật áo tam phân
Xáo tam phân có tên khoa học là Paramignya trimera (Oliv.)
Guillaum., thuộc chi Paramignya và họ Cam (Rutaceae) [3].
Tên đồng nghĩa (Synonyms): Atalantia trimera Oliv., 1861; Triphasia
monophylla DC., 1824; Severinia trimera Oliv., Luvunga monophylla (DC.)

Mabb.
Tên gọi khác: Cây thần dược, cây rễ mọi, cây rễ lạ, cây thần xạ.
Cây gỗ nhỏ, bụi leo hay trườn, thân dài tới 4-5 m; có gai nhọn, hơi cong
hay ngang, dài 0.4-1.2 cm. Lá mọc so le. Phiến lá đơn, dày, hình bầu dục
thuôn, kích thước khoảng 2.3-5 x 1,8-2 cm; đỉnh lá có khía nhỏ, gốc lá tròn,
mép lá có khía ở phía trên; mặt trên xanh đậm, mặt dưới nhạt và bóng, có 810 đôi gân bên; cuống lá dài khoảng 4-8 mmm, nhẵn. Cụm hoa dạng chùm
mọc ở nách lá, gồm 2-8 hoa. Hoa mẫu 3; cuống hoa ngắn, nhẵn, có lá bắc; đài
tồn tại trên quả, 3 lá đài dính nhau, có tuyến rõ, mép có lông; 3 cánh hoa nhỏ,
dài 4mm; nhị 6, ngắn hơn cánh hoa, chỉ nhị dày và dẹt; bao phấn hình bầu
dục; bầu 2-3 ô, mỗi ô chứa 1 noãn, vòi nhụy dày, có tuyến, đầu nhụy dẹt, có 3
gờ. Quả gần hình cầu, có đài và vòi nhụy tồn tại, đường kính quả chỉ khoảng
1,5cm.
Gỗ thân cứng, màu vàng. Rễ màu nâu sẫm hay vàng. Lõi rễ màu vàng
ngà. Toàn thân chứa tinh dầu, nhất là ở rễ.
Cây có mùa hoa quả khoảng tháng 5-10.

gu n h

n

12


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Hình 6: Thân và r Xáo tam phân
1.2.2. Phân bố áo tam phân
Cây thường mọc ở sờn núi đá hoặc núi đất lẫn đá ở nơi khô cằn.
Trên thế giới, Xáo tam phân được tìm thấy chủ yếu ở Châu Á. Một số
quốc gia có sự xuất hiện của Xáo tam phân là: Philippin, Indonesia (Java),

Đông Timor, Ấn Độ, Australia.
Ở Việt Nam, Xáo tam phân được tìm thấy ở các tỉnh: Phan Thiết, Tây
Ninh, Khánh Hòa (Ninh Vân), Phú Yên và một số đảo dọc bờ biển Nam
Trung Bộ.
1.2.3. Tác dụng dược lý của áo tam phân
Giữa năm 2012, nhiều tờ báo ở Việt Nam đăng tin về một cây thuốc ở
xã Ninh Vân, tỉnh Khánh Hòa được người dân sử dụng để trị một số bệnh như
xơ gan cổ chướng, viêm gan siêu vi, ung thư gan, ung thư đại tràng và ung
thư cổ tử cung. Dựa trên các thông tin thu thập và một số mẫu vật (cành, lá),
các nhà thực vật học đã xác định rằng đây là loài Paramignya trimera, tức
Xáo tam phân, có trong bộ Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ [5]
Xáo tam phân đã được người dân địa phương biết đến và sử dụng từ
lâu, vị thuốc Xáo tam phân được bào chế kết hợp với các vị thuốc khác điều
trị những bệnh nan y như ung thư máu, ung thư gan, ung thư vú, ung thư đại
tràng, viêm gan siêu vi và sử dụng để bồi bổ sức khỏe.
gu n h

n

13


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Viện Dược liệu đã bước đầu nghiên cứu cho thấy loài P. trimera có
các thành phần flavonoit, saponin, ankaloit và chủ yếu là courmarin và
triterpenoid có tác dụng ức chế tốt viêm gan cấp ở thí nghiệm trên chuột nhắt
trắng, ức chế, tiêu diệt 5 dòng tế bào ung thư: Ung thư gan Hep-G2, ung thư
đại tràng HTC116, ung thư vú MDA MB231, ung thư buồng trứng OVCAR-8
và ung thư cổ tử cung Hela (ức chế mạnh nhất với ung thư gan Hep- G2 và
ung thư cổ tử cung). Thí nghiệm cũng cho thấy với độc tính thấp, Xáo tam

phân khá an toàn khi sử dụng [16].
1.3.

Tổng quan về phƣơng pháp nghiên cứu bảo vệ gan

1.3.1. Phương pháp gây độc bằng paracetamol
-

Tác nhân: Paracetamol liều cao (cấp tính).

-

Cơ chế gây tổn thương gan của paracetamol thông qua sự tạo thành quá

nhiều chất chuyển hóa hoạt động N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI).
+ NAPQI là một sản phẩm chuyển hóa paracetamol do hệ enzym
cytochrome P-450 ở gan giải phóng.
+ Glutathione của gan là chất chống ôxy hóa chủ yếu, chất này gắn và
trung hòa NAPQI tạo thành axit mercapturic vô hại và bị thải ra ngoài qua
thận. Khi đó NAPQI không gắn được vào màng tế bào gan và không làm tổn
thương tế bào.
Tuy nhiên, khi sử dụng liều cao paracetamol sẽ gây rối loạn phản ứng
trên. Kho dự trữ glutathione bị cạn kiệt dần và khi thiếu hụt mất trên 70% số
lượng bình thường thì NAPQI không bị trung hòa và sẽ liên kết với protein và
DNA của tế bào gan, gây tổn thương gan.

gu n h

n

14


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ơ đồ 1: Quá trình chuyển hóa paracetamol tạo thành NAPQI
1.3.2. Phương pháp xét nghiệm
Xét nghiệm chức năng gan qua định lượng aminotransferase (AST,
ALT), cholesterol toàn phần và protein toàn phần trong huyết thanh chuột
được định lượng bằng phương pháp so màu, thực hiện trên máy định lượng
sinh hóa bán tự động AU680 của hãng Beckman Counter. Thực hiện tại
Phòng thử nghiệm sinh học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam.
1.3.3. Phương pháp kiêm tra trực quan
Kiểm tra trực quan: Sau toàn bộ thí nghiệm và sau khi lấy máu xét
nghiệm, chuột được mổ để kiểm tra trực quan. Chụp ảnh gan động vật thí
nghiệm.
1.3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được sử lí trên Excel, thuật toán thống kê student t’test,
F’test và phương pháp phân tích phương sai một nhân tố ngẫu nhiên (One
way ANOVA) và sử dụng hệ số LSD (Least-significant difference) để kiểm
tra sự sai khác có ý nghĩa so với đối chứng âm, với đối chứng paracetamol
(PAR), với Silymarin. Nếu p<0.05 được coi là sai khác có ý nghĩa, nếu
p>0.05 sự sai khác là không có ý nghĩa thống kê.
gu n h

n

15

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẦN II
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU VÀ THỰ NGHIỆ
2.1. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu thân và rễ loài Xáo tam phân được thu hoạch vào tháng 2 năm
2013 tại xã Ninh Vân – Khánh Hòa. Tên khoa học được TS. Nguyễn Văn
Bách, Viện Sinh Thái và Tài nguyên sinh vật giám định. Mẫu tiêu bản (C499) được lưu tại Phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
2.1.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.1.2.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu
Mẫu thực vật sau khi thu về được phơi hoặc sấy khô, có thể nghiền
nhỏ. Sau đó, được bảo quản trong bao bì ở nơi khô thoáng hoặc điều kiện
lạnh, tránh vi sinh vật hay nấm mốc phát triển, đảm bảo chất lượng mẫu để
tiến hành nghiên cứu thực nghiệm.
2.1.2.2. Phương pháp phân lập
 Phương pháp chiết dung môi

Rễ Xáo tam phân được chiết bằng hai pha rắn – lỏng với MeOH ở nhiệt
độ phòng.
 Phương pháp chiết lỏng – lỏng

Phần chiết MeOH được phân bố giữa nước và các dung môi hữu cơ
khác nhau nhằm làm giàu các lớp chất theo độ phân cực tăng dần.
 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sắc ký lớp mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60
F254 (Merch, 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện vệt chất bằng đèn tử

ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm, sau đó dùng thuốc thử là dung dịch
H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi nung nóng trên bếp
điện ở 250OC đến khi hiện màu.
gu n h

n

16


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Sắc ký cột (CC): Sắc ký cột được tiến hành với các chât hấp phụ khác
nhau: silica gel pha thường hoặc pha đảo YMC, diaion HP-20, sephadex-LH20…
Phương pháp sắc ký lớp mỏng là phương pháp hiện đang được sử dụng
rất rộng rãi trong các ngành khoa học hóa học, sinh học, hóa dược với nhiều
mục đích khác nhau do các đặc tính ưu việt như:
- Độ nhạy cao, lượng mẫu phân tích nhỏ (từ 1 – 100 µg).
- Tốc độ phân tích nhanh.
- Kỹ thuật phân tích dễ thực hiện.
Phương pháp sắc ký lớp mỏng có thể được dùng để phân tích định tính
hay định lượng hoặc kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất cũng như hỗ trợ
cho các phương pháp sắc ký cột để sác định điều kiện phân tách.
Chuẩn b mẫu phân tích:
Hòa tan mẫu trong dung môi thích hợp (1mg/ml), sau đó dùng capilla
hút dịch mẫu bằng lực mao quản chuyển dung dịch mẫu lên trên lớp hấp phụ
ở vị trí của tuyến xuất phát.
Dung môi triển khai:
Các dung môi dùng trong TLC đều được làm khan và chưng cất lại khi
sử dụng. Các hệ dung môi được pha theo tỷ lệ phù hợp. Khi pha phải lắc kỹ
cho các dung môi trong hệ trộn đều rồi cho vào bình triển khai sắc ký. Để yên

đến khi bình bão hòa dung môi mới triển khai bản mỏng.
Triển khai bản mỏng:
Bản mỏng được cắt có kích thước phù hợp, có hai tuyến dung môi là
tuyến trên và tuyến dưới. Dùng kẹp sắt đưa nhanh bản mỏng đã được tẩm
mẫu vào bình chạy sắc ký, đậy nắp kín và quan sát vệt dung môi. Khi quan sát
thấy dung môi đã chạy đến tuyến dung môi trên, dùng kẹp sắt lấy bản mỏng
ra khỏi bình và tiến hành nhận biết vết chất trên bản mỏng.
Phát hiện vệt chất trên bản mỏng:

gu n h

n

17