Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn vibrio parahaemolyticus nhược độc phục vụ chế tạo vắc xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên cá biển

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-----

-----

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG VI KHUẨN VIBRIO
PARAHAEMOLYTICUS NHƯỢC ĐỘC PHỤC VỤ CHẾ TẠO
VẮC-XIN PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN THẬN TRÊN CÁ BIỂN

Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Phạm Thị Tâm
Sinh viên thực hiện : Hà Huy Tùng
Lớp: 12-02

Hà Nội – 2016


Khoa Công nghệ sinh học

Viện Đại Học Mở Hà Nội

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ
thuộc Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều
kiện thuận lợi nhất cho em có thể thực tập và hoàn thành đề tài này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS
Phạm Thị Tâm Giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại Học Mở
Hà Nội, người đã trực tiếp tận tình hướng dẫn và dìu dắt em trong suốt quá

trình em thực tập và hoàn thành đề tài.
Em không thể quên gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, những người
thân, các anh chị khóa trước, bạn bè đã luôn bên em, tận tình giúp đỡ, cổ
vũ động viên trong suốt thời gian em thực tập và hoàn thiện đề tài.
Trong quá trình thực tập không tránh khỏi được những sai sót, kính
mong các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn đóng góp ý kiến để em
tiếp thu và hoàn thiện.
Em xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, ngày

tháng năm 2015.
Sinh viên

Hà Huy Tùng


Khoa Công nghệ sinh học

Viện Đại Học Mở Hà Nội

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Nội dung

BHI broth

Brain Heart Infusion Broth

BHI

Brain Heart Infusion

bp

Base pair

DĐ

Di động

DH

Dung huyết

DNA

Deoxyribonucleotide Acid

Dntp

Deoxynucleotitde

ddNTP

Dideoxynucleotitde

EDTA

Ethyllene diamine tetra acetic acid

In.

Indol

Kb

Kilobase pairs

KIA

Kligler Iron Agar

Lac

lactose

LB

Lubria – Bertani

PCR

Polymerase Chain Reaction

Rif

Rifampicin

TAE

Tris - acetate – EDTA

TCBS

Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose

TDH

Thermostable direct haemolysin

TLH

Thermolabile haemolysin

TRH

Thermostable direct related haemolysin

UV

Ultrviolet light

Vp-toxRS

V. parahaemolyticus toxRS


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ......................................................................................................................1
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................3
1.1. Lịch sử phát hiện bệnh do vi khẩn Vibrio parahaemolyticus. ..........................3
1.1.1. Tình hình trên thế giới ...............................................................................3
1.1.2. Tình hình trong nước .................................................................................5
1.2. Tổng quan về bệnh hoại tử gan thận ở cá biển ................................................7
1.3. Tổng quan về Vibrio parahaemolyticus.............................................................9
1.3.1. Đặc điểm của Vibrio parahaemolyticus ......................................................9
1.3.2. Đặc tính sinh hóa của Vibrio parahaemoluticus ......................................12
1.3.4. Cơ chế gây bệnh của Vibrio parahaemolyticus ........................................14
1.4. Các phương pháp tạo chủng nhược độc........................................................15
1.4.1. Các phương pháp làm giảm độc vi khuẩn ...............................................15
1.4.2. Các tác nhân tạo chủng nhược độc..........................................................18
1.4.2.1. Tác nhân vật lý ................................................................................18
1.4.2.2. Tác nhân hóa học.............................................................................20
1.5. Đặc điểm hệ miễn dịch ở cá xương ................................................................24
1.5.1. Miễn dịch đặc hiệu ...................................................................................24
1.5.2. Miễn dịch tự nhiên ...................................................................................25
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................26
2.1. Vật liệu nghiên cứu .........................................................................................26
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...............................................................................26
2.1.2. Hóa chất....................................................................................................26
2.1.3. Môi trường và dung dịch nuôi cấy ..........................................................26
2.1.4. Thiết bị .....................................................................................................28
2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................29
2.3. Phương pháp nuôi cấy và giữ chủng vi sinh vật trên môi trường LB lỏng,rắn
và môi trường đặc hiệu .........................................................................................30
2.4. Phương pháp gây đột biến bằng kháng sinh rifampicin ...................................30
2.5. Phương pháp đánh giá mức độ nhược độc của chủng đột biến .......................31
2.5.1. Thử khả năng dung huyết của các dòng vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus đột biến nhược độc ...............................................................31

SV: Hà Huy Tùng - 1202


2.5.2. Phương pháp sinh học phân tử .................................................................32
2.5.2.1. Phương pháp tách DNA tổng số ......................................................32
2.5.2.2. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose .....................................33
2.5.2.3. Khuếch đại gen độc tố gây bệnh hoại tử thận bằng kỹ thuật
PCR(Polymerase Chain Reaction) ................................................................34
2.5.3. Phương pháp gây nhiễm trên động vật thí nghiệm ....................................36
PHẦN III: KẾT QUẢ ...............................................................................................38
3.1. Kết quả lựa chọn tác nhân đột biến bằng kháng sinh để gây đột biến chủng
V.parahaemolyticus. ...................................................................................................38
3.2. Kết quả đánh giá mức độ giảm độc lực của các dòng V. parahaemolyticus đôt
biến .........................................................................................................................41
3.2.1. Kết quả thử khả năng dung huyết của các dòng V. parahaemolyticus đột
biến .........................................................................................................................41
3.2.2. Kết quả chạy PCR xác định gen độc tố của các dòng V.parahaemolyticus
đột biến...................................................................................................................44
Chúng tôi tiến hành kiểm tra 4 gen độc tố Tox R, tdh, tlh, trh của 8 dòng đột biến
và chủng A3.13 tự nhiên. kết quả được thể hiện Bảng 3.3.Hình 3.4. ...................45
3.3. Kết quả xác định độc lực của các dòng V.parahaemolyticus trên cá .............46
3.4. Kết quả đánh giá chủng V.parahaemolyticus đột biến nhược độc theo định
hướng sản xuất vắc-xin..........................................................................................50
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................52
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................54

SV: Hà Huy Tùng - 1202

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hình thái vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ..............................................9
Hình 1.2. Tác động của tia tử ngoại tạo các dimer thymine ....................................19
Hình 1.3.Cấu trúc RNA polymerase (RNAP) ...........................................................22
Hình 1.4. Vùng kháng Rif của tiểu đơn vị β RNAP [13] ..........................................23
Hình 1.5. Đột biến kháng Rif ở vùng I của gen rpoB ...............................................23
Hình 2.1. Sơ đồ khối nghiên cứu ...............................................................................29
Hình 3.1. Khuẩn lạc chịu được trên môi trường TCBS có bổ sung kháng sinh .....40
Hình 3.2. Khả năng dung huyết của chủng A3.13 và Dòng 8 ..................................43
Hình 3.3. Sản phẩm điện di DNA tổng số của 8 dòng và chủng A3.13 ....................45
Hình 3.4: Sản phẩm PCR xác định 2 gen độc tố Tox R, tlh......................................46
Hình 3.5. Cá sau khi gây nhiễm các chủng đột biến, chủng đối chứng A3.13 và cá
khoẻ mạnh ..................................................................................................49

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các thiết bị ................................................................................................28
Bảng 2.2.Thành phần phản ứng ................................................................................35
Bảng 2.3: Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR.................................................36
Biểu đồ 3.1: Kết quả đột biến 2 lần ...........................................................................40
Bảng 3.1. Kết quả tạo dòng vi khuẩn kháng kháng sinh .........................................41
Bảng 3.2. Kết quả khả năng dung huyết của các dòng V. ........................................42
parahaemolyticus đột biến .........................................................................................42
Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra sự có mặt các gen độc tố của các dòng
V.parahaemolyticus đột biến ......................................................................45
Bảng 3.4. Kết quả gây nhiễm cá sau 15 ngày tiêm các dòng V.parahaemolyticus đột
biến .............................................................................................................47
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá khă năng sinh kháng thể bảo hộ cho cá của các dòng vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến nhược độc so với chủng đối

chứng ..........................................................................................................51

SV: Hà Huy Tùng - 1202


Khoa Công nghệ sinh học

Viện Đại Học Mở Hà Nội

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Việt Nam là một quốc gia ven biển nằm bên bờ Tây của Biển Đông,
có bờ biển dài hơn 3.260 km trải dài từ Bắc tới Nam tạo điều kiện thuận lợi
cho sự hình thành và phát triển kinh tế, đặc biệt là nghề nuôi trồng thủy hải
sản. Nuôi trồng thủy sản là ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm phát
triển nhanh nhất trên thế giới, mang lại những tiềm năng to lớn để chúng ta
đẩy mạnh chiến lược phát triển kinh tế biển.
Theo thống kê của Tổng cục Thủy sản (Bộ Nông nghiệp và Phát triển
nông thôn) ước tính hết quý I/ 2016, Tổng sản lượng thủy sản ước đạt 1,27
triệu tấn, tăng 2,9% so với cùng kỳ. Trong đó, sản lượng khai thác thủy sản
722,1 nghìn tấn, tăng 3,7% và sản lượng nuôi trồng thủy sản ước đạt 549,6
nghìn tấn, tăng 1,9% so với cùng kỳ năm trước.Ngành thủy sản đang dần
hướng tới sự phát triển bền vững là một ngành xuất khẩu hàng hóa lớn, có
khả năng cạnh tranh cao và hội nhập vững chắc với thế giới.
Hiện nay, đối tượng nuôi và mô hình nuôi thủy sản ở Việt Nam khá
phong phú.Trong đó, mô hình nuôi cá lồng đang ngày càng khẳng định
được vị trí của mình. Đây là mô hình được áp dụng cho nhiều loài cá có giá
trị kinh tế cao. Cá khi nuôi trong lồng phải chịu rất nhiều yếu tố gây stress
do phải thích nghi với môi trường sống mới, tập quán sinh sản và kiếm ăn
bị đảo lộn, sức đề kháng bị ảnh hưởng. Vì thế, cá nuôi lồng thường mắc

một số bệnh do vi khuẩn và virus gây ra. Đáng lưu ý nhất là bệnh hoại tử
gan thận trên cá biển do chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra,
làm thiệt hại không nhỏ đến người nuôi cá biển.
Bệnh hoại tử gan thận xuất hiện ở hầu hết các loài cá biển (cá mú, cá
chẽm, cá giờ, cá hồng, cá bớp…), đặc biệt là cá nuôi lồng, xuất hiện ít ở cá
nước ngọt. Khi vi khuẩn V. parahaemolyticus xâm nhập vào cơ thể cá biển,
gây hoại tử lên các nội quan của cá (đặc biệt là gan, thận), lở loét lớp biểu
bì. Gan và thận bị hoại tử, gan từ màu xám nâu chuyển thành màu vàng,
làm cho cá biển chết hàng loạt. Bệnh thường xảy ra ở các giai đoạn của cá,

SV: Hà Huy Tùng - 1202

1


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

vì vậy tìm ra phương pháp phòng và trị bệnh có thể hạn chế những tổn thất
do dịch bệnh gây ra là hết sức cần thiết.
Thực tế trong nuôi trồng thủy sản, người dân thường sử dụng nhiều
hóa chất và kháng sinh để khống chế vi khuẩn này, song việc sử dụng
kháng sinh có thể gây hiện tượng nhờn thuốc và không mang lại hiệu quả
cao. Vi khuẩn này có khả năng tạo ra màng bảo vệ trước thuốc diệt khuẩn
và kháng sinh. Chính vì thế, dịch bệnh thường bùng phát trở lại rất nhanh
sau khi thuốc hết tác dụng. Mặt khác, dư lượng kháng sinh trong sản phẩm
từ cá biển có thể gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng thịt cá và sức khỏe của
con người.
Hiện nay phương pháp phòng bệnh hiệu quả nhất là sủ dụng vắc-xin.

Việc nghiên cứu ra một loại vắc-xin phòng bệnh là tương đối cần thiết. Một
trong những bước quan trọng để nghiên cứu ra vắc-xin là phải tạo được
chủng vi khuẩn nhược độc, làm cơ sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắcxin bệnh hoại tử gan thận ở cá biển.
Xuất phát từ lý luận và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhược độc
phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên cá biển.” làm cơ
sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắc-xin bệnh hoạt tử gan thận ở cá biển.
2. Mục tiêu đề tài
Tạo được dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhược độc để phục vụ
chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loại cá biển.
3. Nội dung nghiên cứu
Tạo dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhược độc bằng kỹ
thuật đột biến sử dụng kháng sinh rifampicine.
Đánh giá đặc tính của chủng đột biến:
+ Đánh giá lại khả năng dung huyết.
+ Đánh giá mức độ an toàn của chủng nhược độc trên cá.
Đánh giá khả năng tạo kháng thể bảo hộ cho cá sử dụng vi khuẩn
nhược độc.

SV: Hà Huy Tùng - 1202

2


Khoa Công nghệ sinh học

Viện Đại Học Mở Hà Nội

PHẦN I.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Lịch sử phát hiện bệnh do vi khẩn Vibrio parahaemolyticus.
1.1.1. Tình hình trên thế giới
Hiện nay trên thế giới ngành nuôi trồng thủy sản rất phát triển, có thể
kể đến các nước đứng đầu về sản lượng nuôi trồng thủy sản theo thứ tự
gồm: Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam, Thái Lan, Indonesia, Bangladesh,
Chile, Nhật Bản, Na Uy và Philippines. Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy
hải sản đang bị gây trở ngại bởi nạn dịch bệnh lây lan khắp nơi. Các dịch
bệnh thường xảy ra đối với thủy hải sản là bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng,
bệnh còi,… ở tôm nuôi, bệnh xuất huyết do virus, bệnh Indivirus… ở cá,
bệnh do nhóm Vibrio sp., nấm…gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi
trồng thủy hải sản [26] .
Một trong những tác nhân gây bệnh đáng quan tâm hiện nay đó là
bệnh do nhóm vi khuẩn Vibriosp. gây ra cho động vật thủy hải sản (tôm,
cá). Chúng có thể gây bệnh qua tất các giai đoạn của động vật thủy sản và
được xem là nguồn gốc gây thiệt hại nghiêm trọng trên giống thủy hải sản.
Nhiều trường hợp nhiễm bệnh đã được phát hiện ở Australia, Ấn Độ,
Indonesia, Philippines, Đài Loan, Thái Lan trên nhiều loài thủy hải sản
khác nhau. Các sự giảm sút gần đây trong ngành nuôi trồng thủy hải sản ở
Việt Nam, Ấn Độ, Bangladesh, Philippines và Trung Quốc chủ yếu là do
tác động của nhóm vi khuẩn Vibriosp [26] .
Nhóm vi khuẩn Vibrio được xác định là tác nhân gây bệnh phổ biến ở
các loài cá biển trên thế giới. Theo Peggy and Ruth (2009), tỷ lệ cá chết
khi nhiễm Vibrio có thể trên 50% trong một đợt dịch, cá có dấu hiệu hôn
mê, màu sắc cơ thể biến đổi và xuất hiện vùng hoại tử. Khi cá bệnh nặng
nội quan có thể xuất huyết hoặc bên trong chứa đầy dịch lỏng.

SV: Hà Huy Tùng - 1202

3

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

V. parahaemolyticus được Fujino phát hiện lần đầu tiên vào mùa hè
năm 1951 tại vùng ven biển Nhật Bản sau các vụ ngộ độc do ăn cá,
hàu…Người ta đã xác định đuợc 21 loài thuộc giống Vibrio, trong đó có 4
loài thuộc tác nhân gây bệnh cho người gồm V. cholera, V.
parahaemolyticus, V. vulnificus, V. Alginolyticus,V. cholera phân bố rộng
khắp với số lượng lớn lan tới cả chân Mỹ, gây bệnh dịch tả cho một số
vùng châu Á, Ấn Độ và Đông Nam Á. Chúng từng gây đại dịch do lây
truyền qua tiếp xúc, nước, sữa, thực phẩm và côn trùng [28].
V. parahaemolyticus là vi sinh vật biển, tồn tại tự nhiên trong nước
biển, thường gặp ở các loại hải sản loại nhuyễn thể và giáp sát trong nước
biển.
Năm 1883, vi khuẩn V. anguillarum lần đầu tiên được phát hiện thuộc
giống Vibrio gây bệnh trên cá và nó đã được phân lập từ cá chình nuôi ở
Địa Trung Hải bởi Canestrini.
Tuy nhiên, sự quan tâm ngày càng nhiều đối với nghề nuôi cá trên thế
giới đã giúp hiểu một cách rõ ràng hơn đối với dịch bệnh mỗi vùng nuôi,
từng hệ thống nuôi và loài vi khuẩn trong sự bùng nổ dịch bệnh. Chẳng
hạn, V. alginolyticus được xác định là tác nhân thứ cấp tham gia gây bệnh
đối với cá trap (Sparus aurata) nuôi ở Israel khi loài cá này bị thương tổn.
Trong khi đó theo Muroga và cộng sự (1979) và Bioscas (1991), vi khuẩn
V. vulnificus là tác nhân gây bệnh cho cá chình ở Nhật Bản, cùng với V.
anguillarum, V. ordalii và V. salmonicida đã xuất hiện và là những tác
nhân gây bệnh rất nguy hiểm cho cá hồi nuôi ở Thái Bình Dương và Đại
Tây Dương [29].
Năm 2001, Vibrio alginolyticus được xác định là tác nhân gây bệnh

trên cá bớp có dấu hiệu lở loét tại Đài Loan. Đến năm 2006 Vibrio
vulnificus được xác định chính là nguyên nhân gây bệnh trên cá bớp. Tuy
nhiên, chưa có nghiên cứu chính thức nào về cá bớp bị lở loét nuôi ở Đồng
Bằng Sông Cửu Long. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả phân
SV: Hà Huy Tùng - 1202

4


Khoa Công nghệ sinh học

Viện Đại Học Mở Hà Nội

lập, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn và xác định độ nhạy của
một số loại kháng sinh đối với vi khuẩn phân lập được nhằm cung cấp
thông tin cho việc phòng trị bệnh hiệu quả.
Ngoài ra, những người dân sống ven sông và vùng duyên hải tại
Canada thường có thú đào vớt nghêu sò. Tuy nhiên ít người ý thức rằng
các loại thủy sản này đôi khi là mối đe dọa về sức khỏe. Cũng như bất cứ
loài thủy sản nào khác, sò ốc cũng có thể bị nhiễm bởi các loại vi khuẩn
như

E.

coli

spp,

Salmonella

spp,

Vibrio

vulniculus,

Vibrio

parahaemolyticus và các loại virus như virus Norwalk ( Norovirus) và virus
bệnh viêm gan A.
Hiện nay, V. parahaemolyticus đã được xác nhận là nguyên nhân gây
ra nhiều vụ ngộ độc thức ăn do ăn cá biển và hải sản. Trong khoảng 50 năm
qua, người ta đã nghiên cứu nhiều về loại vi khuẩn này. Các nhà khoa học
lo ngại do biến đổi khí hậu, nhiệt độ tăng lên dẫn đến sự tăng vọt bất ngờ
và đột ngột của V. parahaemolyticus - loại vi khuẩn một thời có vẻ như chỉ
gây nhiễm khuẩn nhẹ. Dịch tễ học của vi khuẩn đã thay đổi và những týp
huyết thanh mới phát hiện đã được thừa nhận là nguyên nhân của sự thay
đổi này.
1.1.2. Tình hình trong nước
Việt Nam là một trong những quốc gia trên thế giới có nghề nuôi thủy
sản phát triển và cũng là nước có lịch sử nuôi trồng thủy hải sản lâu đời.
Nghề nuôi thủy sản truyền thống bắt đầu từ thập niên 1960, tuy nhiên trong
vòng 10 năm nay, nghề nuôi thủy sản có tốc độ phát triển rất nhanh
chóng. Trong những năm qua, ngành thủy sản luôn khẳng định là ngành
kinh tế mũi nhọn có những đóng góp quan trọng cho sự phát triển kinh tế xã hội nước nhà [26].
Hiện nay, đối tượng nuôi và mô hình nuôi thủy sản ở Việt Nam khá
phong phú. Đặc biệt những năm gần đây, người dân chú ý đến khả năng
nuôi cá mú, đặc biệt là cá mú chấm nâu là loài được nuôi phổ biến ở các
SV: Hà Huy Tùng - 1202

5


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

tỉnh Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu, Quảng Ninh, Hải Phòng, do đặc
điểm lớn nhanh, thịt thơm ngon và nguồn giống cung cấp cho người nuôi
ổn định. Mặc dù nghề nuôi cá mú đã mang lại hiệu quả kinh tế cao cho
người nuôi cá biển nhưng rủi ro do dịch bệnh xảy ra cũng gây ảnh hưởng
không nhỏ đến nghề nuôi cá mú. Có nhiều nguyên nhân gây thiệt hại cho
nghề nuôi cá mú, trong đó có nguyên nhân bệnh do vi khuẩn Vibrio sp. gây
chết cá nuôi. Cá mú bị bệnh do vi khuẩn Vibrio sp. gây ra thường có các
biểu hiện khác nhau như: Hiện tượng mắt lồi và mù mắt hay hiện tượng lở
loét, xuất huyết cơ thể. Ngoài ra, vi khuẩn Vibrio sp. còn gây bênh phổ biến
trên một số loài cá khác như cá hồng, cá giò, cá chẽm, cá bớp…Trong đó,
hiện tượng lở loét, xuất huyết cơ thể ở cá là chủ yếu với các biểu hiện da cá
sẫm màu, xuất hiện các đốm đỏ trên thân và tại các đốm đỏ này bắt đầu lở
loét dần dần và lan rộng ra xung quanh. Cùng với đó là sự xuất huyết
miệng, vây, hậu môn và đuôi cá. Cá thường bơi gần mặt nước, sát bờ ao
hay lưới lồng nuôi. Khi giải phẫu nội tạng có thể nhìn thấy gan cá có màu
nhợt nhạt hay có chất dịch trong xoang bụng ở một số trường hợp cá bị
bệnh nặng.
V. parahaemolyticus có thể gây ra viêm đường tiêu hóa, nhiễm trùng
vết thương và nhiễm trùng huyết ở người. Nhiễm trùng huyết là mối đe dọa
nghiêm trọng vì sinh vật gây bệnh lây lan nhanh hoặc các độc tố của chúng
sinh ra có thể tồn tại lâu dài và lưu thông trong máu. Tác nhân vi
khuẩn Vibrio gây xuất huyết cơ thể, xuất hiện các vết lở loét ở thân, cuống
đuôi và vây thối rữa ở cá mú giống và cá mú thịt là do vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus, V. alginolyticus, gây hội chứng đường ruột ở cá mú là
do vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V. Carchariae, gây triệu chứng mắt lồi
và mù mắt ở cá mú là do nhóm vi khuẩn Vibrio gây ra, chúng phá hủy cấu
trúc đặc trưng của mắt, làm khả năng bắt mồi của cá kém đi, từ đó làm cá
yếu dần và chết [30].

SV: Hà Huy Tùng - 1202

6


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Bệnh lở loét được ghi nhận đã xuất hiện và làm chết cá vào mùa hè
năm 2008 - 2009 ở một số cơ sở nuôi cá mú tại Sông Cầu, thuộc tỉnh Phú
Yên và Cam Ranh thuộc tỉnh Khánh Hòa. Trong năm 2010 và đầu năm
2011, bệnh cũng xuất hiện nhiều ở các vùng nuôi cá mú trong ao và trong
lồng nổi trên biển thuộc các tỉnh Phú Yên, Khánh Hòa và Vũng Tàu. Bệnh
xuất hiện nhiều vào mùa hè và nhất là vào lúc giao mùa, gây tỉ lệ chết cao.
1.2. Tổng quan về bệnh hoại tử gan thận ở cá biển
Vi khuẩn V. parahaemolyticus có thể kí sinh trên rất nhiều loài cá
biển có giá trị kinh tế phân bố ở các vùng biển khác như các loài cá ở vùng
biển ấm như cá chẽm (Lates calcarifer), cá hồng (Lutjanus spp.), cá giò
(Rachycentron canadum), cá mú (Epinephelus spp.). Bệnh do vi khuẩn V.
parahaemolyticus gây ra được báo cáo đã gây thiệt hại kinh tế cho nghề
nuôi cá biển ở nhiều nước trên thế giới [3],[5],[12],[19].
Bệnh do vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ra đặc trưng bởi sự xuất
hiện các đốm đỏ, xuất huyết (bên ngoài hoặc nội quan bên trong). Vẩy cá bị

tróc, rụng, tạo nên các vết loét ngày càng lan rộng và sâu. Vây cá có thể bị
mòn cụt, xơ xác. Giải phẫu mẫu cá bệnh cho thấy hiện tượng xuất huyết nội
tạng (đặc biệt là gan và thận) và xuất huyết trong cơ của cá. Cá bị bệnh có
thể chết hàng loạt khi bị cấp tính, hoặc chết rải rác khi ở thể thứ cấp tính.
Đặc điểm bệnh hoại tử ở cá mú chấm cam với các triệu chứng ban đầu
là cá thường bơi gần mặt nước hoặc bơi sát vào lưới, da cá sẫm màu, xuất
hiện các đốm đỏ trên thân. Sau đó, các đốm này tạo thành vết loét rộng ra
xung quanh, kèm theo biểu hiện xuất huyết ở vây, miệng, hậu môn, đuôi.
Giải phẫu nội quan thường thấy gan nhợt nhạt, thận đen bầm, đôi khi tích
dịch trong xoang bụng ở một số trường hợp bệnh nặng.
Bệnh hoại tử gan thận xảy ra ở khắp mọi nơi có nghề nuôi động vật
thủy sản nước lợ và nước mặn. Bệnh lây lan rất nhanh, nếu không phát hiện
kịp thời có khả năng gây chết rất cao. Bệnh thường xuất hiện vào mùa nóng
và đầu mùa mưa, khi môi trường thay đổi đột ngột, làm cá dễ bị sốc. Hơn
SV: Hà Huy Tùng - 1202

7


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

nữa, vi khuẩn tổng số trong nước có xu hướng tăng khi nhiệt độ tăng. Đây
là điều kiện tốt cho vi khuẩn xâm nhập gây bệnh và đặc biệt gây chết nhiều
đối với cá giống mới thả nuôi. Vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ảnh
hưởng nghiêm trọng đến nghề nuôi thủy sản của hơn 14 nước và gây bệnh
trên khoảng 48 loài cá biển.
Bệnh do vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ra được chẩn đoán dựa
vào những dấu hiệu bệnh lý đặc trưng như đã mô tả ở trên. Nuôi cấy phân

lập Vibrio trên môi trường chọn lọc và phân tích đặc điểm hình thái, sinh
lý, sinh hóa [4]
Ngoài ra, nhận biết V. parahaemolyticus bằng các phương pháp sinh
học phân tử như phân tích trình tự gen 16S ribosomal DNA (rDNA) [13]
hoặc các gen độc tố đặc trưng [7].
Để điều trị được bệnh hoại tử gan thận ở cá biển, một số nghiên cứu
đã đề xuất biện pháp trị bệnh Vibriosis cho cá biển bằng cách cho ăn, tắm
hoặc tiêm kháng sinh. Biện pháp trộn kháng sinh vào thức ăn như trộn
tetracyline 75-100 mg/kg cá, streptomycine 50-75 mg/kg cá, oxolinic acid
10 mg/kg cá và cho ăn liên tục trong 7 đến 10 ngày cũng cải thiện được
tình trạng nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio [5].
Nhìn chung, kháng sinh là phương pháp chọn lựa đầu tiên dùng trị
bệnh do vi khuẩn. Mặc dù kháng sinh đã đem lại hiệu quả điều trị nhất định
trong một số trường hợp, nhưng việc lạm dụng kháng sinh đã tạo ra các
chủng vi khuẩn kháng thuốc gây khó khăn cho quá trình điều trị. Nghiên
cứu của Shyne và cộng sự (2008) về khả năng nhạy cảm với kháng sinh của
vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập từ cá mú bệnh. Kết quả cho thấy
hầu hết các chủng đều kháng lại sulphadiazine và amoxicillin, 87% kháng
lại gentamycine, 89% kháng lại kanamycine và oxytetracycline [20].
Ngoài ra, tồn dư kháng sinh trong sản phẩm thủy sản còn ảnh hưởng
đến an toàn vệ sinh thực phẩm và môi trường. Vì vậy, việc sử dụng kháng
sinh để trị bệnh cho vật nuôi thủy sản vẫn không nên khuyến khích và cần
SV: Hà Huy Tùng - 1202

8


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

cân nhắc thận trọng trong từng trường hợp. Chính vì những mặt trái do sử
dụng kháng sinh, việc phòng bệnh cho cá nuôi vẫn luôn được chú ý trong
suốt quá trình nuôi. Phương pháp phòng bệnh tổng hợp thường được các
trại nuôi áp dụng như sát trùng bể, ao và dụng cụ trước mỗi đợt sản xuất,
xử lý nguồn nước trước khi đưa vào sử dụng. Thả cá nuôi với mật độ thích
hợp, tránh làm cá bị tổn thương trong quá trình vận chuyển, tắm định kỳ để
phòng các loại bệnh ký sinh trùng và chú ý chất lượng thức ăn. Tuy nhiên,
đây chỉ là những biện pháp phòng bệnh đơn giản với mục đích giảm thiểu
nguy cơ nhiễm bệnh, những thiệt hại do bệnh vẫn đang tiếp tục diễn ra và
gây ảnh hưởng lớn cho nghề nuôi cá biển. Hiện nay, giải pháp nâng cao sức
đề kháng cho vật nuôi bằng cách sử dụng các chất gây kích thích miễn
dịch và vắc-xin phòng bệnh là phương pháp phòng bệnh chủ động mang
lại hiệu quả cao, đã và đang được tập trung nghiên cứu ở nhiều nước trên
thế giới. Song, để chế tạo ra các loại vắc-xin đặc hiệu hay chọn lựa được
các hoạt chất kích thích miễn dịch đem lại hiệu quả bảo hộ cao cho vật nuôi
vẫn là một thử thách không nhỏ đối với khoa học hiện nay.
1.3. Tổng quan về Vibrio parahaemolyticus
1.3.1. Đặc điểm của Vibrio parahaemolyticus
Vibrio parahaemolyticus là một loại vi khuẩn Gram âm, hình dấu
phẩy, có tiêm mao ở một đầu, kích thước 0,3- 0,5 x 1,4- 2,6 µm, di động,
kỵ khí và ưa môi trường kiềm mặn, thời gian thế hệ 8-9 phút [9], thường
sống ở các cửa sông và ven biển của hầu hết các vùng trên thế giới, đã phân
lập được trong cát, bùn và nước biển, cũng như ở hải sản [21].

A

B

Hình 1.1. Hình thái vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

SV: Hà Huy Tùng - 1202

9


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

A: Hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học
B: Hình thái khuẩn lạc trên môi trường TCBS
Vị trí phân loại:
Giới: Vi khuẩn
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma Proteobacteria
Bộ: Vibrionales
Họ: Vibrionaceae
Chi: Vibrio
Loài: Vibrio parahaemolyticus
Các đặc tính sinh hóa đặc trưng cho V. parahaemolyticus theo như mô
tả trên gồm phản ứng oxydase, khả năng sử dụng lysin, ornithin, arginine,
khả năng lên men đường arabinose, lactose, sucrose, mannitol, mannose,
sống được trong phạm vi muối từ 3-8%, không mọc ở môi trường không có
muối (0%) hoặc muối quá cao (10%).
Các chủng V. parahaemolyticus phân lập có thể phân biệt nhau bằng
kiểu huyết thanh (serotyping). Hệ thống để xác định các kiểu huyết thanh
của V. parahaemolyticus dựa trên các cấu trúc kháng nguyên khác nhau của
các nhóm lipopolysaccharides (gọi tắt là nhóm O) và các loại nang (gọi tắt
là các loại K) [15]. Theo nguồn từ FDA, có 12 nhóm O và 65 loại K đã
được xác định.

Các chủng V. parahaemolyticus được phân lập cùng một kiểu huyết
thanh có thể giống nhau hoặc phân biệt với nhau.
Không phải tất cả các chủng V. parahaemolyticus đều gây bệnh ở
người. Thực tế, phần lớn các chủng phân lập từ môi trường hoặc từ các loài
cá biển không gây bệnh. Các chủng gây bệnh thì sản xuất ra thermostable
direct hemolysin (TDH). TDH là một enzyme có thể làm tan các tế bào
hồng cầu trên môi trường thạch máu Wagatsuma, được gọi là hiện tượng
Kanagawa.
SV: Hà Huy Tùng - 1202

10


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Loài vi khuẩn này là một trong những tác nhân gây rất nhiều bệnh cho
ngành thủy sản (bệnh lở loét ở cá, bệnh hoại tử gan thận ở cá biển, hội
chứng chết sớm -EMS ở tôm sú và tôm thẻ…). Bên cạnh đó, nó được phát
hiện là nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm khi ăn những hải sản
chưa được nấu chín.
Vi khuẩn này có khả năng hình thành màng bao sinh học, sự hình
thành các màng bao sinh học bắt đầu khi vi khuẩn bám trên bề mặt vật chủ.
Sau đó, vi khuẩn tiết ra các chất hình thành nên một lớp keo giúp cho
chúng gắn chặt vào bề mặt vật chủ. Khi đã hình thành các màng bao sinh
học chắc chắn trên dạ dày tôm, các vi khuẩn bắt đầu nhân lên, màng bao là
hợp chất exopolysaccharides sẽ hình thành có tác dụng bảo vệ vi khuẩn với
tác dụng của các loại kháng sinh, chất khử trùng, các chất chiết xuất từ thảo
dược và các phương pháp điều trị khác, trong khi các hoạt động trao đổi

chất ở tế bào của chúng vẫn diễn ra bình thường.
Sự phân bố của V. parahaemolyticus có mối liên quan chặt chẽ với
nhiệt độ nước. Ở những vùng nước có nhiệt độ trên 15ºC, chúng có mặt
quanh năm trong nước, chất lắng cặn và có mật độ tăng cùng với sự tăng
lên của nhiệt độ nước [8],[14].
Ngoài ra, pH của môi trường cũng có ảnh hưởng đến hoạt động của vi
khuẩn này.
Nghiên cứu của Kazuyuki và cộng sự (1979) cho thấy cả 20 chủng V.
parahaemolyticus thí nghiệm đều phát triển được trên môi trường NB với
pH biến thiên từ 6,0 - 9,0. Tuy nhiên, ở pH 9,0 vi khuẩn không tiết ra
hemolysin trong khi ở các pH khác đều có hiện tượng này. Hơn nữa, khả
năng vận động bằng tiên mao của vi khuẩn bị ức chế trong môi trường
kiềm nhưng không bị ảnh hưởng ở môi trường tru ng tính và axit. Kết quả
nghiên cứu này cho thấy pH của môi trường có ảnh hưởng đến quá trình
trao đổi chất và khả năng vận động của V. parahaemolyticus [16]. Nghiên
cứu của Christopher và cộng sự (2011) cho thấy khi ở độ mặn thích hợp và
SV: Hà Huy Tùng - 1202

11


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

pH 8,0, vi khuẩn V. parahaemolyticus có khả năng di động bằng tiên mao
với vận tốc 60 µm/s [8].
1.3.2. Đặc tính sinh hóa của Vibrio parahaemoluticus
Đặc điểm sinh hóa là một chỉ tiêu quan trọng để phân lập một loài vi
khuẩn cụ thể. Đặc điểm sinh hóa dựa trên khả năng sử dụng một số hợp

chất, khả năng tiết enzyme để thủy phân các chất có trong môi trường của
vi khuẩn. V. paraheamolyticus khi được nuôi trong môi trường tổng hợp
hoặc bán tổng hợp sẽ sử dụng các hợp chất có sẵn để phục vụ cho nhu cầu
sinh trưởng và phát triển. Người ta đã xác định được một số đặc tính sinh
hóa của V. parahaemolyticus như: phản ứng dương tính với oxidase và
catalase, khả năng sử dụng lysine, ornithine, arginine, khả năng lên men
đường glucose, có khả năng di động, dung huyết dạng β, sống được trong
phạm vi muối từ 3- 8%, không mọc ở môi trường không có muối (0%)
hoặc muối quá cao (10%), kỵ khí tùy tiện và ưa môi trường kiềm mặn [27].
1.3.3. Độc tố của Vibrio parahaemolyticus
Vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho vật chủ thông qua các loại độc tố
(toxin), đây là các hoạt chất sinh học có bản chất protein hoặc không phải
protein do vi khuẩn tiết ra nhằm gây độc cho tế bào chủ. Quá trình gây
bệnh của chúng diễn ra theo trình tự bám dính, xâm nhập vào tế bào vật
chủ và tiết ra các độc tố phá vỡ màng tế bào và gây độc cho tế bào vật chủ.
Vi khuẩn V. parahaemolyticus vào tế bào vật chủ thông qua phân tử gắn
kết đa trị (Multivalent Adhesion Molecule – MAM) chứa 6 hoặc 7 vùng
gắn kết [14].
Hoạt tính dung huyết, phân giải protein, lipid, phospholipid, cytotoxin,
yếu tố gây bám dính, ngưng kết đều liên quan tới khả năng gây bệnh của
nhiều loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio và được quy định bởi các gen độc tố
đặc trưng [16]. Cũng như các loài vi khuẩn khác thuộc giống Vibrio, vi
khuẩn V. parahaemolyticus cũng tồn tại rất nhiều chủng mang các yếu tố
gây độc khác nhau. Haemolysin là ngoại độc tố, chuyển các dạng ion liên
SV: Hà Huy Tùng - 1202

12


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

kết với protein như haemolysin, transferrin, lactoferrin thành dạng tự
do.Trong nhiều trường hợp, phạm vi tấn công của haemolysin không dừng
ở các tế bào hồng cầu mà còn mở rộng đến các tế bào biểu mô, tế bào thần
kinh và các tế bào nhân đa hình làm tăng cường độc tố và gây phá hủy các
mô. Kết quả của sự phân giải này là giải phóng beta – haemolysin (phân
hủy hoàn toàn haemoglobin) và alpha – haemolysin (phân hủy không hoàn
toàn haemoglobin) [16].
Chủng vi khuẩn V. parahemolyticus trên môi trường thạch máu
Wagatsumar đã sản xuất beta – haemoglobin.
Ngày nay, người ta đã phát hiện có 4 nhóm protein độc tố gây ra hiện
tượng dung huyết ở vi khuẩn Vibrio bao gồm TDH, Hly A (E1 Tor
haemolysin), TLH, TRH [22].
Trong đó, TDH, TLH và TRH thường gặp ở V. parahaemolyticus
trong khi Hly A thường gặp ở V. cholera [16].
Vi khuẩn V. parahaemolyticus có ba gen độc tố haemolysin bao gồm
tdh và trh mã hóa các haemolysin bền nhiệt TDH, TRH và tlh mã hóa
haemolysin không bền nhiệt TLH. Cả hai gen tdh và trh đều nằm trên
operon độc tố Vp- toxRS, được điều hòa bởi gen toxR có trình tự bảo tồn
cao trong loài [25].
Protein TDH và TRH được mã hóa bởi gen tdh và trh tương ứng được
coi là yếu tố độc tính quan trọng trong quá trình gây bệnh của V.
parahaemolyitcus [19],[24]. Gen tdh, trh lần lượt có kích thước 250 và 251
bp, cùng nằm trong operon độc tố V. parahaemolyticus toxRS (Vp- toxRS),
được điều hòa bởi gen toxR. Giữa các chủng V. parahaemolyticus có các
đoạn gen độc tố khác nhau. Hầu như tất cả các mẫu lâm sàng có tdh hoặc
trh, hoặc cả hai, trong khi gần như tất cả các mẫu từ môi trường không có
hoặc có tỉ lệ thấp 1- 5% [25].

Các chủng V. parahaemolyticus có chứa các đoạn gen tdh và trh mã
hóa các protein độc tố TDH và TRH cùng nằm trong operon độc tố V.
SV: Hà Huy Tùng - 1202

13


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

parahaemolyticus tox RS (Vp – toxRS), được điều hòa bởi gen toxR. Gen
toxR là gen điều hòa kiểm soát sự biểu hiện của các gen mã hóa cho các
nhân tố độc lực ngoại bào quan trọng và các gen liên quan đến các độc tố
khác. Gen toxR có kích thước 368 bp tồn tại ở tất cả các chủng V.
parahaemolyticus [28].
Gen toxR kiểm soát sự biểu hiện của nhiều gen mã hóa của nhiều loài
Vibrio, có trình tự bảo tồn đặc trưng cho loài nên thường được sử dụng làm
gen đích để xây dựng phương pháp phát hiện nhanh V. parahaemolyticus
trong mẫu thủy sản bằng kỹ thuật PCR.
Gen tlh có kích thươc 451 bp mã hóa một haemolysin không bền nhiệt
TLD có trình tự amino acid bảo thủ trong họ Vibrionaceae, nên có tiềm
năng làm vaccine diều trị bệnh thủy sản và marker chẩn đoán bệnh Vibrio.
Hầu hết các nghiên cứu về độc tố và cơ chế gây độc của Vibrio, nhất
là với V. parahaemolyticus đã được nghiên cứu tương đối sâu, chủ yếu là
nghiên cứu các chủng phân lập từ người. Kết quả đạt được mang lại nhiều
ý nghĩa quan trọng trong y học, giúp chẩn đoán và điều trị bệnh do vi
khuẩn này gây ra. Tuy nhiên, số lượng công trình nghiên cứu cơ bản vè các
loại vi khuẩn gây bệnh cho đối tượng thủy sản vẫn còn hạn chế. Việc tìm
hiểu đặc điểm, cơ chế gây độc và tác hại của chúng trên đối tượng nuôi là

rất cần thiết nhằm tìm ra các giải pháp hạn chế thiệt hại do vi khuẩn gây ra
cho đối tượng thủy sản.
1.3.4. Cơ chế gây bệnh của Vibrio parahaemolyticus
Vi khuẩn V. parahaemolyticus có khả năng hình thành màng bao sinh
học, sự hình thành các màng bao sinh học bắt đầu khi vi khuẩn bám trên bề
mặt vật chủ. Sau đó, vi khuẩn tiết ra các chất hình thành nên một lớp keo
giúp cho chúng gắn chặt vào bề mặt vật chủ. Các vi khuẩn bắt đầu nhân
lên, màng bao là hợp chất exopolysaccharides sẽ hình thành có tác dụng
bảo vệ vi khuẩn với tác dụng của các chất kháng sinh, chất khử trùng, các

SV: Hà Huy Tùng - 1202

14


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

chất chiết xuất từ thảo dược và các phương pháp điều trị khác, trong khi
các hoạt động trao đổi chất ở tế bào của chúng vẫn diễn ra bình thường.
Khi vi khuẩn V. parahaemolyticus xâm nhập vào cơ thể cá biển, vi
khuẩn lấy ion Fe2+ từ tế bào hồng cầu hình thành enzyme protease phục vụ
vho quá trình tổng hợp protein của chúng.
1.4.

Các phương pháp tạo chủng nhược độc

1.4.1. Các phương pháp làm giảm độc vi khuẩn
Vi sinh vật giảm độc lực là những vi sinh vật đã được làm giảm độc

lực không còn khả năng gây bệnh nhưng có khả năng tạo đáp ứng miễn
dịch mạnh, thời gian duy trì đáp ứng miễn dịch dài.
Các phương pháp giảm độc lực
Giảm độc lực bằng nhiệt độ
Vi sinh vật gây bệnh thường mẫn cảm với yếu tố nhiệt độ, nếu nuôi
chúng ở nhiệt độ không phù hợp, vi sinh vật sẽ giảm độc lực nhưng vẫn giữ
được tính kháng nguyên.
Vaccine nhiệt thán được tạo ra từ phương pháp giảm độc lực bằng
nhiệt độ. Vi khuẩn nhiệt thán được nuôi ở nhiệt độ 42,5 – 43oC từ 15- 20
ngày, vi khuẩn mất khả năng hình thành giáp mô, độc lực giảm, sử dụng
làm giống gốc sản xuất vaccine.
Vaccine Sabin dạng uống chống bại liệt được tạo thành bằng cách
chọn các chủng virus bại liệt đã đột biến, cho nhân lên nhiều lần trong tế
bào thận khỉ, nuôi cấy ở nhiệt độ thấp. Virus có thể nhân lên trong tuyến
nước bọt đường tiêu hóa nhưng không xâm nhập được vào mô thần kinh do
đó không gây chứng bại liệt nữa.
Giảm độc bằng yếu tố hóa học.
Vaccine BCG (Bacillus Calmette Guerin) là chủng trực khuẩn lao bò
Mycobacterium tuberculosis bovis có độc lực cao, nuôi cấy trong môi
trường có mật bò trong 13 năm sau 231 lần cấy chuyển, vi khuẩn đã không

SV: Hà Huy Tùng - 1202

15


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

còn độc, được sử dụng để sản xuất vaccine BCG phòng bệnh lao cho con
người.
Vaccine nhiệt thán nhược độc giáp mô được chế bằng cách.Vi khuẩn
nhiệt thán nuôi cấy trong môi trường CO2, vi khuẩn không có khả năng
hình thành giáp mô. Nếu đem vi khuẩn đó nuôi cấy tiếp ở môi trường có đủ
O2 thì vi khuẩn lại hình thành giáp mô, nhưng độc lực yếu không có khả
năng gây bệnh được sử dụng làm vaccine.
Giảm độc bằng phương pháp sinh vật học.
Đây là phương pháp giảm độc vi sinh vật cổ điển, phần lớn vaccine
virus sử dụng cho người, động vật được sản xuất theo phương pháp này. Vi
sinh vật gây bệnh được cấy chuyển nhiều đời qua môi trường ít mẫn (động
vật thí nghiệm hoặc môi trường nuôi tế bào hoặc phôi gia cầm). Vi sinh vật
không đủ điều kiện để thực hiện đầy đủ chu kỳ sống nên thay đổi hệ gen để
thích nghi với điều kiện sống mới, do đó vi sinh vật thay đổi về độc lực và
khả năng gây bệnh.
Giảm độc bằng các kỹ thuật gen
Tái tổ hợp hệ gen (genome)
Virus tái tổ hợp hệ gen được tạo ra bới kỹ thuật gây nhiễm đồng thời
hai chủng virus khác nhau vào cùng một cơ thể vật chủ, virus mới tạo thành
sẽ có bộ gen chứa cả gen của hai chủng virus bố mẹ. Ví dụ, chủng
Rotaviruses tái tổ hợp sử dụng làm vaccine tiêm phòng cho con người được
tạo thành từ sự trao đổi gen của các chủng gay bệnh trên động vật, hoặc
virus cúm tái tổ hợp được tạo ra từ một chủng virus cúm cung cấp các gen
mã hóa các glycoprotein bề mặt miễn dịch (hemagglutinin và
neuraminidase) và một chủng nhược độc. Tuy nhiên, vaccine Rotavirus tái
tổ hợp theo phương pháp này có khả năng gây hội chứng lồng ruột với tỷ lệ
cao (1/ 10 000) ở người được tiêm phòng, vì vậy vaccine này đã bị ngừng

SV: Hà Huy Tùng - 1202

16


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

cấp phép sản xuất. Tác dụng không mong muốn này cho thấy an toàn là
một thách thức lớn trong quy trình sản xuất vaccine sống.
* Xóa hoặc cắt gen độc
Chủng nhược độc tái tổ hợp được tạo ra bằng cách sửa đổi hoặc xóa
bỏ các gen độc tố vì vậy khó có khả năng tái trở lại tính độc. Đây là giải
pháp khắc phục được nhược điểm của vi sinh vật được gây nhược độc bằng
phương pháp truyền thống. Các kỹ thuật tạo chủng vi khuẩn nhược độc tái
tổ hợp phức tạp hơn so với virus do kích thước lớn hoen của hệ gen vi
khuẩn.
* Tạo vector tái tổ hợp
Vector tái tổ hợp được tạo ra trên nguyên lý sử dụng một chủng virus
làm vector để gắn đoạn gen mã hóa polypeptide từ các tác nhân gây bệnh
khác.Polypeptid tái tổ hợp được biểu hiện trong các tế bào bị nhiễm virus
và được vận chuyển đến bề mặt tế bào để kích thích sản xuất kháng thể
dịch thể hoặc bị phá vỡ thành các mảnh peptid để trình diện cho tế bào
lympho T độc. Mục đích của việc tạo ra vector là để trình diện kháng
nguyên với hệ thống miễn dịch thông qua việc gây nhiễm với một vi sinh
vật tái tổ hợp sống, từ đó kích thích hệ thống miễn dịch đáp ứng mạnh hơn,
bao gồm cả miễn dịch dịch thể và tế bào.
Nguyên mẫu của vector virus là virus dậu bò, virus này được cắt các
gen gây độc để không có khả năng gây bệnh cho người. Hàng chục các
kháng nguyên tái tổ hợp khác nhau được biểu hiện bằng virus này, ví dụ
kháng nguyên của vi khuẩn Brucella abortus, Listeria monocytogenes,

thậm chí là các kháng nguyên khối u. Bên cạnh đó, một số loài virus khác
cũng được sử dụng để làm vector tái tổ hợp biểu hiện kháng nguyên như
Adenovirus, Alphaviruses. Adenovirus được sử dụng để thiết kế các vector
tái tổ hợp phục vụ sản xuất vaccine phòng các bệnh hô hấp cấp tính.
Vi khuẩn gây bệnh cũng có thể được thiết kế thành vector sống tái tổ
hợp để biểu hiện các kháng nguyên có bản chất polypeptide. Các loài vi
SV: Hà Huy Tùng - 1202

17


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

khuẩn được sử dụng làm vector là Salmonella typhimurium, V. cholera và
S. flexneri chủ yếu để sản xuất các vaccine đường uống. Vaccine tái tổ hợp
nhược độc được sản xuất theo công nghệ này đòi hỏi phải có hai đặc tính:
1) giữ được khả năng lây nhiễm trong đường ruột và 2) biểu hiện ở mức
thích hợp các polypeptide kháng nguyên để kích thích tạo ra đáp ứng miễn
dịch bảo hộ vật chủ. Bên cạnh đó, một số các loài vi khuẩn nội bào cũng
đang được nghiên cứu để thiết kế thành vector tái tổ hợp, tạo đáp ứng miễn
dịch tế bào.
1.4.2. Các tác nhân tạo chủng nhược độc
1.4.2.1. Tác nhân vật lý
Tác nhân vật lý bao gồm tia bức xạ không gây ion hóa. Tia bức xạ ion
hóa.Tia có bản chất sóng điện từ với bước sóng cực ngắn. Tia rơntgen (tia
X) và tia gama (γ). Tia có bản chất là các hạt gồm tia alpha (α), tia beta (β)
và cá proton, nơtron, nhiệt độ [1].
* Tia cực tím

Tia cực tím (hay tia tử ngoại, tia UV – Ulatraviolet). Là sóng điện từ
có bước sóng ngắn hơn ánh sáng nhìn thấy nhưng dài hơn tia X. Phổ tia cực
tím có thể chia ra thành tử ngoại gần (có bước sóng từ 380 đến 200 nm) và
từ ngoại xa hay tử ngoại chân không (có bước sóng từ 200 đến 10nm) [28].
Tia cực tím có thể khử khuẩn vì tác dụng rất mạnh trên nucleoprotein
của vi khuẩn, nó có thể làm biến dạng hoặc giết chết vi khuẩn. Hiệu lực tiệt
khuẩn của tia cực tím không những tùy thuộc mật độ, thời gian chiếu tia,
điều kiện môi trường mà còn tùy thuộc vào sức chịu đựng của vi khuẩn.
Ngoài ra, do tác dụng của tia cực tím, không khí có thể sinh ra Ozone cũng
có khả năng tiêu diệt vi khuẩn.
Trong tế bào, các chất hữu cơ có mạch vòng chủ yếu như purin và
pyrimidin hấp thu trực tiếp tia tử ngoại. Mối liên quan chặt chẽ giữa tia tử
ngoại và các cấu phần của DNA đã được chứng minh. DNA hấp thu tia tử

SV: Hà Huy Tùng - 1202

18


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

ngoại mạnh nhất ở bước sóng 2537 Ǻ ( 254nm), đay chính là bước sóng
làm tăng tần số đột biến [28].
Tia UV gây ra sự biến đổi quang oxy hóa các gốc purin và pirimidin.
Tác động của tia UV làm cho adenine (A) bị biến thành hypoxantin, dẫn
đến những thay đổi hóa học của DNA. Tia UV làm cho các base thymin (T)
gần nhau trên phân tử DNA liên kết với nhau tạo thành dimer thymine
(T:T), gây méo mó phân tử DNA. Nếu phân tử DNA có nhiều dimer

thymine có thể làm mất khả năng tái bản của DNA [1].

Hình 1.2. Tác động của tia tử ngoại tạo các dimer thymine
Dưới tác động của tia tử ngoại, cytosine gắn thêm phân tử nước vào
liên kết C= C của mạch vòng (Hình 1.2) và thymine bị đứt liên kết C =C
mạch vòng nối 2 phân tử thành thymine dimer.
Ston và các cộng sự đã nhận thấy tần số đột biến tăng lên ở
Staphylococcus aureus khi môi trường nuôi chúng được chiếu tia UV trong
thời gian ngắn trước khi cấy vào. Đây là tác động gián tiếp của tia tử ngoại.
Có thể khi hiện diện oxy, tia tử ngoại tạo ra nhiều hơn các gốc peroxit
H*+O2 →HO*
HO2 + H→ H2O2

SV: Hà Huy Tùng - 1202

19