Nghiên cứu môi trường nôi cấy và đánh giá một số hoạt tính sinh học từ chủng nấm cordyceps militaris
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (6.31 MB, 52 trang )
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn
àn thành khóa luận
lu này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ttới
PGS.TS Lê Mai Hương,
ương, TS Tr
Trần Thị Hồng Hà, Ths Nguyễn
ễn Đình Luyện
cùng toàn thể cán bộ
ộ đđang công tác tại phòng Sinh học thực
ực nghi
nghiệm – Viện
hóa học Các Hợp chất
ất Thiên
Thi Nhiên, Viện Khoa học vàà công ngh
nghệ Việt Nam
đã tận tình hướng dẫn,
ẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập tại
ại ph
phòng.
Tôi xin chân thành ccảm ơn các thầyy cô trong khoa Công ngh
nghệ Sinh học,
Viện Đại học Mở Hà N
Nội đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ tôi trong su
suốt quá
trình học tập tại khoa.
Tôi cũng
ng xin chân thành
th
cảm ơn gia đình và bạn bè đãã luôn giúp đỡ,
động viên
ên tôi hoàn thành bài khóa luận
lu này.
Xin chân thành ccảm ơn!
Hà nội, ngày 25 tháng 5 năm
m 2016
Sinh viên
Đỗ Thị Bảo
Đỗ Thị Bảo
i
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................
................................
..................................... ii
DANH MỤC BẢNG .....................................................................................
................................
..................... iv
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................
................................
...................... vi
DANH MỤC BIỂU ĐỒ ................................................................
............................................... vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT
VIẾ TẮT ................................................................
................................... viii
MỞ ĐẦU ................................................................................................
................................
....................................... 1
PHẦN 1: TỔNG
NG QUAN TÀI
T LIỆU ...............................................................
............................... 3
1.1.
Sơ lược lịch
ịch sử nghiên cứu về nấm Cordyceps militaris .................. 3
1.1.1. Trên thếế giớ
giới ................................................................
................................................. 3
1.1.2. Nghiên cứu
ứu về
v nấm Cordyceps militaris ở Việt Nam .................... 5
1.2.
Giá trị dược
ợc liệu
liệ ................................................................
.............................................. 8
1.2.1.
Giá trịị dược
d
liệu của một số chấtt có trong nấ
nấm Cordyceps
militaris ………………………………………………………………….
………………………………………………………………….9
1.2.2.
Đối với
ới hệ thống miễn dịch .....................................................
..................... 11
1.2.3.
Đối với
ới hệ hô hấp................................................................
.................................... 12
1.2.4.
Đối với
ới hệ tuần hoàn tim và não ................................
............................................. 12
1.2.5.
Đối với
ới hệ thống nội tiết .........................................................
......................... 12
2.1. Đối tượng, địa điể
điểm, hóa chất và thiết bị sử dụng
ng trong nghi
nghiên cứu .. 13
2.1.1. Đối tượng
ng nghiên
nghi cứu ................................................................
................................. 13
2.1.2. Địa điểm
m nghiên
nghi cứu ................................................................
................................... 13
2.1.3. Hóa chất vàà thiết
thi bị sử dụng trong nghiên cứu ............................ 13
2.2. Nội dung nghiên
ên cứu
c ................................................................
......................................... 14
Đỗ Thị Bảo
ii
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
2.3. Mục tiêu
êu nghiên ccứu ................................................................
.......................................... 14
2.4. Phương
ng pháp nghiên cứu
c ................................................................
................................... 15
2.4.1 Xác định
nh môi trường
tr
phù hợp dùng để nhân giống
ng cấp 1 ch
chủng nấm
Cordyceps militaris ................................................................
.............................................. 15
2.4.2. Nghiên cứ
ứu thành phần môi trường nuôi cấy
ấy chủng
ch
nấm
Cordyceps militaris trên môi trường lỏng ................................
............................................. 15
2.4.2.1. Ảnh hưởng
ởng của
c nguồn cacbon tới khả năng hình
ình thành và phát
triển của chủng
ng nấm Cordyceps militaris ................................
.............................................. 16
2.4.2.2. Ảnh hưởng
ởng nguồn
ngu nitơ đến khả năng hình
ình thành và phát tri
triển của
chủng nấm Cordyceps militaris ............................................................
............................ 16
2.4.2.3. Ảnh hưởng
ởng của
c nhiệt độ tới thời gian sinh trưởng
ởng và
v phát triển
của chủng nấm Cordyceps militaris ......................................................
...................... 16
2.4.2.4. Ảnh hưởng
ởng của
c giá trị pH môi trường tới sự sinh tr
trưởng và phát
triển của chủng
ng nấm Cordyceps militaris ................................
.............................................. 17
2.4.3. Nghiên cứ
ứu kỹ thuật nuôi trồng tạo quả thểể nấ
nấm Cordyceps
militaris trên môi trường
tr
rắn................................................................
................................. 17
2.4.3.1 Nghiên cứu
ứu ảnh hưởng của cơ chất đến khả năng
ăng hhình thành và
phát triển của quảả thể
th nấm Cordyceps militaris trên môi trư
trường rắn ..... 17
2.4.3.2. Nghiên cứ
ứu ảnh hưởng của cường độ chiếuu sáng tớ
tới sự phát triển
và ra quả thể của
ủa chủng
ch
nấm................................................................
................................. 18
2.4.3.3. Nghiên ccứu sự ảnh hưởng của công thức phối
ối trộ
trộn phụ gia đến
khả năng hình
ình thành và phát triển
tri của quả thể nấm Cordyceps militaris19
2.4.4. Phương
ng pháp thu thập
th và xử lí số liệu ................................
......................................... 20
2.4.5. Phương
ng pháp tách chi
chiết chủng nấm Cordyceps militaris trên hai
môi trường rắn vàà lỏng
l
với dung môi làà ethanol và etyl acetat .............. 21
Đỗ Thị Bảo
iii
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
2.4.6. Xác định
nh hoạt
hoạ tính sinh học của chủng nấm Cordyceps militaris 22
PHẦN 3: KẾT QUẢ
Ả NGHIÊN
NGHI
CỨU ...........................................................
........................... 27
3.1. Xác định
nh môi trường
tr
phù hợp dùng để nhân giống cấp
ấp 1 ch
chủng nấm
Cordyceps militaris ..................................................................................
................................
.................. 27
3.2. Kết quả nghiên
ên cứu
c thành phần môi trường nuôi cấy trên
ên môi tr
trường
lỏng ................................................................................................
................................
.......................................... 28
3.2.1. Ảnh hưởng
ởng của
củ nguồn cacbon .....................................................
..................... 28
3.2.2. Kết quả ảnh hưởng
h
của nguồn nitơ tới sự phát triển
ển của
củ sợi nấm. 30
3.2.3. Kết quả ảnh hưởng
h
của nhiệt độ tới sự phát triển của
ủa sợ
sợi nấm..... 32
3.2.4. Kết quảả ảnh hưởng
h
của pH.........................................................
......................... 34
3.3. Nghiên cứu kỹỹ thuật
thu nuôi trồng tạo quả thể nấm Cordyceps militaris
trên môi trường rắn...................................................................................
................................
................... 34
3.3.1. Nghiên cứu
ứu ảnh
ả hưởng của cơ chất đến khả năng
ăng hhình thành và
phát triển của quảả thể
th nấm Cordyceps militaris trên môi trư
trường rắn ..... 35
3.3.2. Ảnh hường
ờng của
c cường độ sáng đến khả năng hình
ình thành và phát
triển của nấm Cordyceps militaris ........................................................
........................ 37
3.3.3. Kết quảả ảnh hưởng
h
của công thức bổ sung dưỡng
ỡng ch
chất đến khả
năng hình
ình thành và phát triển
tri của quả thể nấm Cordyceps militaris...... 39
3.4. Kết quả đánh
ánh giá hoạt
ho tính sinh học của các cặn chiết
ết củ
của chủng nấm
Cordyceps militaris trên hai môi tr
trường nuôi cấy rắn và lỏng .................. 41
PHẦN 4. KẾT LUẬN ..................................................................................
................................
.................. 45
DANH MỤC BẢNG
Đỗ Thị Bảo
iv
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
Bảng 2.1: Ảnh hưởng
ởng của
củ loại cơ chất đến khả năng hình
ình thành và phát tri
triển
của quả thểể nấm
nấ Cordyceps militaris ................................
............................................ 18
Bảng2.2: Ảnh hưởng
ng của
củ cường độ chiếu sáng tới sự phát triển và
v ra quả thể
của chủng
ng nấm Cordyceps militaris ................................
.............................................. 19
Bảng 2.3: Ảnh hưởng
ởng ccủa công thức phối trộn phụ gia đến kh
khả năng hình
thành và phát triển
tri của quả thể nấm Cordyceps militaris .............. 19
Bảng 3.1: Ảnh hưởng
ởng ccủa môi trường nhân giống cấp 2 lên
ên quá trình sinh
trưởng của
ủa khuẩn
khu lạc nấm Cordyceps militaris ............................. 27
Bảng 3.2: Kết quả ảnh
nh hưởng
h
của nguồn cacbon tới khả năng
ăng hhình thành và
phát triển của
ủa chủng
ch
nấm Cordyceps militaris .............................. 29
Bảng 3.3: Kết quả nghi
nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ tới
ới kh
khả năng hình
thành và phát triển
tri của chủng nấm Cordyceps militaris ................ 30
Bảng 3.4:Kết quả ảnh
nh hưởng
h
của nhiệt độ đến khả năng hình
ình thành và phát
triển củaa quả thể
th nấm Cordyceps militaris ....................................
................................ 32
Bảng 3.5: Kết quả ảnh
nh hhưởng của loại cơ chất đến khả năng
ăng hhình thành và
phát triển của
ủa quả
qu thể nấm Cordyceps militaris ............................ 35
Bảng 3.6: Kết quả ảnh
nh hưởng
h
của cường độ chiếu sáng tới sự
ự phát tri
triển và ra
quả thể của
ủa chủng
chủ nấm Cordyceps militaris................................
.................................. 37
Bảng 3.7: Kết quả ảnh
nh hưởng
h
của công thức phối trộn phụụ gia đến
đế khả năng
hình thành và phát triển
tri của quả thể nấm Cordyceps mil
militaris ...... 39
Bảng 3.8: Hoạtt tính kháng vi sinh vật
v kiểm định của các cặnn chiế
chiết............... 42
Bảng 3.9: Hoạtt tính chống
chố oxy hóa của dịch chiết các chủng nấm
ấm................ 42
Bảng 3.10: Hoạtt tính gây độc tế bào của cặn chiết các chủng nấm
ấm ............... 43
Đỗ Thị Bảo
v
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Quy trình thu nhận
nh căn chiết từ dịch nuôi cấyy củ
của chủng nấm
Cordyceps militaris................................................................
..................................... 22
Hình 3.1: Hệ sợi nấm
ấm Cordyceps militaris trên
tr các môi trường
ờng MT1, MT2 vvà
MT3 sau 10 ngày cấy................................................................
c
.................................... 28
Hình 3.2: Hệ sợi nấm
ấm Cordyceps militaris trên
tr môi trường
ng CT1 vvà CT3 sau 6
ngày cấy .......................................................................................
................................
....................... 30
Hình 3.3: Hệ sợi nấm
ấm Cordyceps militaris trên
tr môi trường
ng CT1, CT3, CT5
sau 11 ngày nuôi cấy
c ................................................................
.................................... 32
Hình 3.4: Hệ sợi nấm
ấm Cordyceps militaris trên
tr môi trường NĐ2
Đ2 vvà NĐ4 sau 7
ngày nuôi cấy
ấy ................................................................
............................................... 34
Hình 3.5: Quả thể nấm
ấm Cordyceps militaris ở công thứcc TN1 (A) vvà TN5 (B)
sau 50 ngày nuôi cấy
c ................................................................
.................................... 37
Hình 3.6: Quả thể nấm
ấm Cordyceps militaris ở công thức cường
ờng độ sáng 2000
lux ................................................................................................
................................
................................ 39
Hình 3.7: Quả thể nấm
ấm Cordyceps militaris ở công thức PT3 sau 40 ngày (A)
và 50 ngày (B) nuôi cấy
c ................................................................
................................ 41
Đỗ Thị Bảo
vi
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1: Ảnh hưởng
ởng của
c nguồn cacbon tới khả năng hình
ình thành và phát
triển củaa chủng
chủ nấm Cordyceps militaris ....................................
................................ 29
Biểu đồ 3.2: Ảnh hưởng
ởng của
c nguồn nitơ tới khả năng hình
ình thành và phát tri
triển
của chủng
ng nấm
nấ Cordyceps militaris ................................
............................................ 31
Biểu đồ 3.3: Ảnh hưởng
ởng của
c nhiệt độ đến khả năng hình
ình thành và phát tri
triển
của quả thểể nấm
n Cordyceps militaris ..........................................
................................
33
Biểu đồ 3.4: Ảnh hưởng
ởng của
c loại cơ chất đến khả năng hình
ình thành và phát
triển củaa quả thể nấm Cordyceps militaris ................................
.................................. 36
Biểu đồ 3.5: Ảnh hưởng
ởng của
c cường độ chiếu sáng tới sự phát tri
triển và ra quả
thể của chủng
ủng nnấm Cordyceps militaris ................................
...................................... 38
Biểu đồ 3.6: Ảnh hưởng
ởng của
c công thức phối trộn phụ gia đến kh
khả năng hình
thành và phát triển
tri của quả thể nấm Cordyceps militaris ............ 40
Đỗ Thị Bảo
vii
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
DANH MỤC
M
CHỮ VIẾT TẮT
CL
Cấy lỏng
CR
Cấy rắn
CS%
Cell survival % (% tế
t bào sống sót)
DMSO
Dimethyl sulfoxid (Dimetyl sulfoxit)
DPPH
1,1 – diphenyl - 2 – picrylhydrazyl
ĐTHT
Đông
ông trùng hạ
h thảo
EtOAc
Ethylacetat ( etyl axetat)
EtOH
Ethanol (Etanol)
MIC
Minimum inhibitory concentration (Nồng
(N
độ ức chếế tối thiểu)
OD
Optical Density (M
(Mật độ quang)
SC%
Scavenging capacity (% khả
kh năng bẫy các gốc tự do)
SRB
Sulforhodamine
forhodamine B ( Sunforodamin B)
TCA
Trichloacetic acid (Axit tricloaxetic)
VSVKĐ
Vi sinh vậật kiểm định
Đỗ Thị Bảo
viii
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
MỞ ĐẦU
ùng hhạ thảo (ĐTHT) là một loại nấm
m kí sinh tr
trên côn trùng,
Nấm Đông trùng
không chỉ đượcc các nhà
nh khoa học nghiên cứu, mà còn được
ợc cả xã hội quan
tâm đến, vì nấm là loại
ại ddược liệu quý, rất tốt cho sức khỏee con ng
người, phù hợp
với mọi lứa tuổi, từ
ừ trẻ con, phụ nữ mang thai, thanh thiếu
ếu ni
niên, cho đến
người già.
à. Theo các tài liệu
li ghi chép về đông dược cổ, ĐTHT là m
một vị thuốc
bồi bổ hết sứcc quý giá, có tác dụng
d
tích cực với các bệnh như
ư rối loạn tình
dục, thận hư, liệt dương,
ương, di tinh, đau lưng, mỏi gối, ho hen, vàà có tác ddụng tốt
đối với trẻ em còi xương
ương chậm
ch
lớn. Một số nghiên cứu hiện
ện đạ
đại gần đây đã
chỉ ra rằng nấm ĐTHT
THT có tác dụng làm tăng cường
ng công nă
năng của tuyến
thượng thận, nâng cao hệ miễn dịch, kháng khuẩn,
n, kháng virus, ch
chống ung
thư và chất phóng xạ.
ạ. Dùng
D
thường xuyên ĐTHT giúp tăng tu
tuổi thọ, ngăn
ngừa và hạn chế quá trình
tr
lão hóa, rất tốt cho người giàà và người
ngư suy nhược
cơ thể trong thờii gian dài
d [10, 7].
Do tác dụng dược
ợc lý rất
r tốt của nấm Đông trùng mà hiện
ện nay nhu cầu
c sử
dụng loại nấm này rất
ất lớn.
lớ Hiện nay trong tự nhiên nấm Đông
ông trùng bị khai
thác kiệt quệ, trữ lượng
ợng không đủ đáp ứng nhu cầu của người
ời sử dụng. Vì vậy
đã có nhiều nước tiến
ến hành
h
nghiên cứu để tìm ra kỹ thuậtt nuôi trồng
trồ loài nấm
này một cách hiệuu quả.
quả Ví dụ,, Công ty Biofact life (Malaysia) đã kết hợp
công nghệ tiên tiếnn của
củ Nhật và các nước khác nuôi cấy thành
ành công nnấm
Cordyceps trên môi trường
trư
nhân tạo để tạo ra hai hoạt
ạt ch
chất chính là
Copdycepin và Adenosin
nosine được tạo ra từ hệ sợi nấm. Các nư
ước như Trung
Quốc, Hàn Quốc, Mỹ,
ỹ, Nhật
Nh Bản, Malaysia đã sản xuất được
ợc nấ
nấm ĐTHT trên
quy mô công nghiệp
ệp từ những
nh
năm 1995, thế kỷ XX.
Ở Việt Nam việc
ệc nghiên
nghi cứu về nấm ĐTHT mới chỉỉ bắt
ắt đầ
đầu, cho nên
còn gặp nhiều khó khăn,
ăn, cả
c về cơ sở vật chất và kiến thức. Nấm
ấm ĐTHT
Đ
ở Việt
Nam có nhiều loạii khác nhau được tìm thấy ở các vùng khác nhau. Trong ssố
Đỗ Thị Bảo
1
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
các loài nấm Cordyceps được nuôi trồng và nghiên cứu ở Việt Nam vvà trên
thế giới có chủng nấm
ấm Cordyceps militaris có giá trị dược liệu
ệu cao vvà dễ nuôi
trồng hơn cả. Tuy nhiên
ên ở Việt Nam việc nuôi trồng còn hạn
ạn ch
chế do vậy giá
thành còn rất cao và khó phổ
ph biến đến người tiêu dùng.
Để góp phần vào
ào nghiên ccứu môi trường nuôi cấy thích hợ
ợp nấm ĐTHT
ở Việt Nam, mà cụ
ụ thể là
l chủng nấm Cordyceps militaris với
ới mụ
mục đích giảm
giá thành nuôi trồng,
ng, chi phí ssản xuất, nuôi trồng đơn giản, chúng tôi thực
th
hiện đề tài: “Nghiên
Nghiên cứu
c
môi trường nuôi cấy và đánh
ánh giá m
một số hoạt
tính sinh học từ chủng
ủng nấm
n
Cordyceps militaris”.
Đỗ Thị Bảo
2
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
PHẦN
PH
1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.
Sơ lược lịch sử
ử nghiên
nghi cứu về nấm Cordyceps militaris
Theo Holliday (2004), ĐTHT được phân loại theo hệệ thố
thống phân loại
như sau:
- Giới: Nấm
ấm (Fungi)
(
- Ngành: Ascomycota
- Lớp: Ascomycotes
- Bộ: Hypocreales
- Họ: Clavicipataceae
- Chi: Cordyceps
Theo các tài liệu
ệu của
c báo điện tử [8, 9] nấm ĐTHT chủủ yyếu tìm thấy
được vào mùa hè, ở vùng
ùng núi cao trên 4000m như cao nguyên Tây Tạng,
T
Tứ
Xuyên, Thanh Hải,
i, Cam Túc và
và Vân Nam…. Theo các nhà khoa hhọc thì chi
nấm Cordyceps có tới
ới 400 lo
loài khác nhau, tính riêng ở Trung Qu
Quốc đã tìm
thấy khoảng 60 loài ĐTHT.
ĐTHT Tuy nhiên cho đến nay, ngườii ta mớ
mới chỉ nghiên
cứu được 2 loài nấm
ấm Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris có giá trị
dược liệu tốt đối với
ới con người.
ng
1.1.1. Trên thế giới
Từ thời cổ xưa,
ưa, kho
khoảng mấy ngàn năm về trước ở Trung Qu
Quốc đã lan
truyền các câu chuyện
ện thần
th bí về một loại sinh vật khi làà cây,khi là con mà
người ta gọi là ĐTHT.. Tuy nhiên mãi đến năm 620
20 sau Công nguyên, ĐTHT
mới thực sự được biết
ết đến.
đế
Nấm ĐTHT được
ợc các nh
nhà khoa học Trung Quốc xác định m
mới đầu xuất
hiện từ vùng
ùng núi cao nguyên Tây Tạng,
T
loại dược liệu này thự
ực chất là hiện
tượng ấu trùng củaa các lo
loài bướm thuộc chi Thitarodess bịị nấ
nấm Cordyceps
sinensis (Berk) Sacc. ký
k sinh. Năm 1878, các nhà khoa học
ọc đđã phát hiện ra
Đỗ Thị Bảo
3
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
nấm này
ày ký sinh trên sâu non (ấu
( trùng) của một loài
ài côn trùng thu
thuộc chi
Thitarodess. Thường
ng dễ gặp nhất ở sâu non loài Thitarodess
tarodess baimaensis hoặc
Thitarodess armoricanus,
armoricanus ngoài ra còn 46 loài khác thuộc
ộc chi Thitarodess
cũng có thể bị Cordyceps sinensis ký sinh. Vào cuối mùa
ùa thu các chất
ch trên da
của sâu non bọ ngài đêm (Noctuidae)
(
tương tác với các bào tử
ử nấm
n
và tạo ra
các sợi nấm, các sợi
ợi nấm
nấ đã đâm sâu vào ấu trùng,
ùng, coi chúng là ch
chất dinh
dưỡng để phát triển.
ển. Đế
Đến đầu mùa hè năm sau,nấm
m phát sinh m
mạnh và gây
chết sâu, sau đó
ó chúng hình
h
thành chồi, phát triển chui ra khỏi
ỏi mặ
mặt đất, nhưng
gốc vẫn dính vào đầu
ầu sâu. Do đó nhiều người gọi là nấm ĐTHT bởi vì mùa
đông nấm sống
ng trong cơ
c thể côn trùng, mùa hè thì nấm
m phát triể
triển ra ngoài cơ
thể giống như cây cỏ
ỏ [8, 99].
Đầu thế kỷ XVIII, những
nh
người truyền giáo Châu Âu đã đưa
đư ĐTHT đến
Pháp để nghiên cứu.
u. Vì
V Pháp là quốc gia có nền Y họcc phát triển
triể và hiện đại
nhất lúc bấy giờ. Đến nay rất
r nhiều nước đã nghiên cứu, điều
ều tra vvà thu thập
nấm ĐTHT ngoài tự
ự nhiên
nhi để làm nguyên liệu sản xuấtt ra thự
thực phẩm chức
năng phục vụ cho con người
ng
[7].
Từ năm
m 1995 nhiều
nhiề nước như Trung Quốc, Hàn Quốc,
ốc, Nhật
Nh Bản, Mỹ,
Malaysia… đã sản
n xuất đđược ĐTHT nhân tạo trên
ên quy mô công nghi
nghiệp mang
lại giá trị kinh tế to lớn nhờ
nh dựa vào những đặc tính cơ bản
ản củ
của ĐTHT. Cụ
thể:
Trung Quốc làà quốc
qu gia đi tiên phong trong lĩnh vựcc nuôi tr
trồng ĐTHT
trên rất nhiều dạng
ng môi trường
tr
nhân tạo, từ sâu bọ, côn trùng đếến các loại hạt
ngũ cốc… Họ cũng làà quốc
qu gia có sản lượng ĐTHT đứng đầu thế giới với các
sản phẩm nổi tiếng vềề chất
ch lượng cũng như giá thành và chủng
ủng loạ
loại.
Công ty Aloha
loha Medicinals của
c Mỹ cũng đã nuôi trồng thành
ành công ĐTHT
nhân tạo trong môi trường
trư
có thành phần tự nhiên
ên trên ccả 2 loại nấm
Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris. Bằng việc điềuu khiể
khiển môi trường
Đỗ Thị Bảo
4
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
nuôi cấy ở nhiệt độ thấp,
thấ lượng oxy thấp, họ đã tạo ra môi trư
trường có thành
phần tự nhiên và rất
ất gần
gầ với môi trường tự nhiên mà 2 chủng
ủng nnấm trên sinh
sống. Hơn thế, họ cũng
ũng đã nuôi trồng thành công ĐTHT
THT trên ngu
nguồn cơ chất
gạo, lúa mạch, lúa mạch
ạch đen [1].
Công ty Biofact Life (Malaysia) cũng
c
đã nghiên cứu vàà nuô
nuôi trồng thành
công nấm Cordyceps trên môi trường
tr
nhân tạo phục vụ công nghi
nghiệp sản xuất
thực phẩm chức năng.
1.1.2. Nghiên cứu về nấm
n
Cordyceps militaris ở Việt Nam
Hiện nay nước
ớc ta chưa
ch
có nhiều công trình
ình nghiên ccứu về nấm
Cordyceps.. Các công trình nghiên cứu về Đông trùng Hạ thảo
ảo đđã được công
bố mới chỉ mang tính chất
ch điều tra, phát hiện sự phân bố vàà thu th
thập chúng
trong điều kiện Việt
ệt Nam.
Năm
m 2009, GS. Phạm
Ph
Thị Thùy – Viện Bảo vệ Thực vật
ật cũng
cũ tìm được
thêm 2 giống là Cordyceps nutans ở Vườn quốc gia Cúc Phương
ương (Ninh B
Bình)
Và Cordyceps militaris ở Vũ Quảng (Hà Tĩnh) [6].
Trần Ngọcc Lân, Thái Thị
Th Ngọc Lam, Nguyễn Thị Thúy, Trầ
Trần Văn Cảnh
và Nguyễn Thị Thu (2011), nghiên
nghi cứu đặc điểm sinh họcc của nnấm ký sinh
côn trùng Isaria tenuipes (Peck) Samson ở vườn quốc gia Pùù Mát và khu bảo
b
tồn thiên nhiên Pù Huống,
ống, tỉnh
t
Nghệ An.
Năm 2009, Viện
ện Khoa học
h Lâm nghiệp Việt Nam đã tiến
ến hhành điều tra
thu mẫu nấm ĐTHT
THT tại
tạ khu bảo tồn Tây Yên Tử - Sơn Động
ộng – Bắc Giang.
Tác giả Phạm
m Quang Thu đã phát hiện được loài nấm ĐTHT và được giám
định là loài Cordyceps nutans.
nutans Đây là loài nấm đầu tiên được
ợc mô ttả và ghi
nhận có phân bố tạii Việt
Việ Nam [3].
Cũng trong năm
ăm 2009, PGS. Phạm
Ph
Quang Thu thuộc
ộc Việ
Viện Khoa học
Lâm nghiệp Việtt Nam đưa
đ ra công bố phát hiện thêm 2 chủng
ủng Cordyceps là
Đỗ Thị Bảo
5
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
Cordyceps gunni tại
ại Vườn
V
quốc gia Tam Đảo (Vĩnh
nh Phúc) vvà Cordyceps
militaris tại Vườn quốc
ốc gia Ho
Hoàng Liên (Lào Cai) [3].
Năm 2009, Phạm
ạm Thị
Th Thùy đã thu thập nấm Cordyceps ttại Vườn quốc
gia Cúc Phương, tỉnh
ỉnh Ninh Bình.
B
Tác giả đã xác định đượcc lo
loài Đông trùng
Cordyceps militaris,, đây là loài đầu tiên được phát hiện vàà mô ttả ở Việt Nam
[2, 3]. Loài nấm này
ày phân bố
b ở rừng tự nhiên có độ cao từ 1900m đến 2100m
so với mực nướcc biển.Ký chủ
ch của loài này là nhộng thuộc
ộc bbộ cánh vẩy
Lepidoptera, nấm dài
ài 2 – 6,5 cm, hình chùy, phần thân và cuốống nhỏ, phần
đầu phình to có chiều
ều rộng
rộ đến 0,6 cm. Màu sắc của phần cuống
ống nnấm và phần
sinh sảnn khác nhau, phần
phầ cuống nấm nhẵn có màu da cam nhạt,
ạt, ph
phần sinh sản
có màu da cam đậm
ậm vvà có nhiều mụn nhỏ.Quả thể dạng
ng chai đđược cắm rất
lỏng lẻo hoặc cắm
m sâu một
m phần vào mô của nấm ở phầnn sinh sả
sản. Túi bào tử
có kích thước 300 – 510µm
510
x 3,5 - 5µm, phần mũ gắn trên
ên túi qu
quả thể có kích
thước 3,5 - 5µm [4].
Một số khu vực
ực khác cũng
c
đang được triển khai tìm kiếm
ếm vvà nghiên cứu
nấm Cordyceps, thường
ờng thì Cordyceps ở Việt Nam phân bố ở những
nhữ khu rừng
nhiệt đới thường
ng xanh, có độ cao từ 800 m đến 2000 m.
Trong chương trình
ình nghiên cứu
c nghị định thư giữa Việt
ệt Nam và
v Trung
Quốc cấp nhà nướcc về nghi
nghiên cứu nấm ĐTHTCordyceps
Cordyceps militaris – PGS.TS
Phạm Thị Thùy, Viện
ện bảo
bả vệ thực vật đã chủ trì đề tài phát triểển nấm ĐTHT
làm nguyên liệu thực
ực phẩm
ph
chức năng cho người. Kết quả đãã nghiên ccứu và
xác định được 3 loài nấm
ấm ĐTHT đó là:
- Cordyceps nutans ở Cúc Phương, Ninh Bình và Tam Đảo
ảo – Vĩnh Phúc.
- Cordyceps militaris ở Vũ Quảng, Hà Tĩnh.
- Cordyceps spl ở Sơn
S Động, Bắc Giang.
Đỗ Thị Bảo
6
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
Tác giả cũng đãã xác định được một số giá trị dược liệu củủa nấm ĐTHT
Cordyceps militaris ở Việt
Vi Nam gồm chất Cordycepin,, HEAA, một
m số
vitamin và một số nguyên
nguy tố vi lượng [5].
Một số nghiên cứu
ứu về
v nuôi trồng và sản xuất Đông trùng
ùng ở Việt Nam
cũng được công bố.
ố. Năm
Nă 2008, TS. Nguyễn Mậu Tuấnn thuộ
thuộc trung tâm
nghiên cứu thựcc nghiệm Lâm nghiệp
nghi Lâm Đồng đã nghiên cứ
ứu và sản xuất
ĐTHT dòng Paecilomyces tenuipes trên gia thể nhộng tằm
m (B
(Bombyx mori)
xong chỉ dừng lại trên
ên quy mô thử
th nghiệm.
Năm
m 2009, GS. Đái
Đ Duy Ban và cộng sự cũng công bốố phát hi
hiện mới
của mình về loài ĐTHT lần
l đầu tiên được tìm thấy ở Việt
ệt Nam đó là loài
ĐTHT có tên là Isaria cerambycidae.
cerambycidae Loài ĐTHT này được tìm
ìm th
thấy trên ấu
trùng xén tóc. Đây cũng
ũng chính llà những gợi ý giúp Giáo sư
ư và cộng
c
sự nuôi
cấy thành công chủng
ủng ĐTHT
Đ
này trên môi trường nuôi cấy tự
ự nhi
nhiên thuận lợi
cho sự phát triển của
ủa chúng. Ngoài
Ngo ra, ông cũng là ngườii phát hiện
hi được một
loài khác thuộc ĐTHT
THT ký sinh trên châu chấu.
Hiện nay trướcc xu hướng
h
và nhu cầu tiêu thụ ĐTHT ngày
ày càng cao ccủa
thị trường trong nước
ớc một
mộ số công ty và một số nhà khoa học
ọc trong nnước cũng
đang tiến hành đảy mạnh
ạnh nghiên
nghi cứu và sản xuất ĐTHT cả dạng
ạng sinh kh
khối và
dạng quả thể. Đã có nhiều
nhi nghiên cứu thực hiên nuôi trồng ĐTHT trên
tr các giá
thể khác nhau điển hình
ình như
nh trên xén tóc của GS. Đái
ái Duy Ban, tr
trên nhộng
tằm của TS. Nguyễn
ễn Mậu
M Tuấn. Ở trong nước GS. Phạm
m Quang Thu thực
th
hiện nghiên cứuu nuôi trồ
trồng ĐTHT dạng sinh khối trong đó sử
ử dụng
d
cơ chất là
gạo và các chất bổ sung, xong hiện
hi tại vẫn chưa thấyy có công bbố chính thức
nuôi trồng quả thể thành
ành công từ
t nguồn cơ chất này. Việc sử
ử dụng
ụng ccơ chất gạo
trong nuôi trồng tạoo quả thể ở nước ngoài mặc dù đã được đề cậ
cập từ lâu xong
về chi tiết công nghệệ nuôi trồng
tr
vẫn còn đang được giữ bí m
mật. Như vậy
Đỗ Thị Bảo
7
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
ởtrong nước nếu
u nuôi trồng
trồ quả thể ĐTHT trên cơ chất gạo thành
ành công ssẽ mở
ra triển vọng cho việc
ệc triển
tri khai nuôi cấy quy mô công nghiệp.
Năm
m 2010 công ty Dược
D
Thảo Thiên Phúc đã nghiên cứu
ứu vvà phát triển
thành công cơ chất tổng
ổng hhợp trên cơ sở nguyên liệu là gạo lứt,
ứt, nnước dừa, bột
nhộng tằm và bổ sung th
thêm lượng nhỏ chất vi lượng.
ng. Công ty cổ phần Dược
Thảo Thiên Phúc đã sử
ử dụng cơ chất tổng hợp này để phụcc vụ ssản xuất sinh
khối ĐTHT chủng Cordyceps sinensis
sin
– sản phẩm hiện đang
ang bán khá chạy
ch
trên thị trường Việt
ệt Nam. Điểm đặc biệt là trong thành phần
ần của
củ các nguyên
liệu trên chứa nhiềuu các chất
ch dinh dưỡng và các nguyên tố vi lư
ượng nên thành
phần của cơ chất tổng
ổng hợp
h tỏ ra khá phù hợp cho sự phát triển
triể của ĐTHT.
Hơn nữa các nguyên
ên liệu
li trên hiện trong nước sẵn có, dồi dào
ào có th
thể dự trữ
quanh năm do đóó hoàn toàn có thể
th chủ động thích hợp cho việc
ệc triển
tri khai sản
xuất số lượng lớn.
Năm 2011 với sự
ự nnỗ lực trong việc nghiên cứu điều chỉnh
ỉnh m
một số yếu tố
về nhiệt độ, độ ẩm,
m, ánh sáng một
m cách thích hợp nhóm nghiên
ên ccứu thuộc công
ty Dược Thảo Thiên
ên Phúc đã tạo ra được quả thể ĐTHT
THT nhân tạo
tạ trên nguồn
cơ chất tổng hợp
p trong điều
đ kiện nuôi cấy phòng thí nghiệm.
Trên đây là một
ột số kết quả về việc nghiên cứu nấm ĐTHT
THT Cordyceps ở
Việt Nam. Vì vậy việc
ệc nghiên
nghi cứu nấm này cần thiết đượcc tiếp ttục để đi sâu
và phát triển những nấm
ấm Cordyceps để làm nguyên liệu thựcc phẩ
phẩm chức năng
cho người.
Như vậy nghiên cứ
ứu nấm ĐTHT Cordyceps militaris ở Việt Nam llà hoàn
toàn cần thiết, đáp ứng nhu ccầu đòi hỏi là bảo vệ sức khỏee con ng
người ở Việt
Nam.
1.2.
Giá trị dượcc liệu
Năm 1993, ĐTHT
THT đã làm cả thế giới kinh ngạcc qua sự kiện
ki thể thao
quốc tế. Một nữ vận
ận độ
động viên người Trung Quốc đã liên tục
ục phá kkỷ lục thế
Đỗ Thị Bảo
8
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
giớ nội dung chạy cự
ự ly 1000m, 3000m và 10000m.
m. Thành công của
c người nữ
vận động viên này một
ột phần
ph nhờ vào dùng ĐTHT trong bữa ăn hhàng ngày.
Tập đoàn Dược
ợc phẩm
phẩ Tasly đã nhân giống ĐTHT đầu tiên
ên ở vùng đầm
lầy cao nguyên có độộ cao trên
tr 4000m. Nhờ đó, Tasly đãã phân llập và chiết
xuất được các hoạtt chất sinh học có giá trị dược liệu của ĐTHT,
THT, ttạo nên viên
nang Tasly Hoàng trùng thảo
th với hàm lượng Polysaccharide cao. H
Hướng đi
này đã cho Trung Quốc
ốc có thương
th
hiệu ĐTHT đã xuất khẩu đi toàn cầu.
c
1.2.1. Giá trị dượcc liệu của
c một số chất có trong nấm Cordyceps militaris
Các phân tích hóa học
h cho thấy, trong sinh khốii (biomass) của
c ĐTHT
chứa 17 loạii acid amin khác nhau. Ngoài
Ngo ra còn có D-mannitol,
mannitol, lipid và nhi
nhiều
nguyên tố vi lượng
ng (Al, Si, K, Na…).
Na… Quan trọng hơnn là trong sinh khối
kh
ĐTHT còn có nhiềuu chất
chấ mang hoạt tính sinh học cao đang được
ợc các nh
nhà khoa
học dầnn khám phá ra nhờ
nh các tiến bộ của ngành hóa họcc các hhợp chất tự
nhiên. Nhiềukể đến cordyceptic
cord
acid, cordycepin, adenosine và nhóm ho
hoạt
chất HEAA (Hydroxy-E
Ethyl-Adenosine-Analogs) [1].
- Cordiceptic acid:: là một dạng D-manitol, chất này
ày có tác ddụng giảm ho
và hen suyễn,
n, giả
giảm đường huyết và kháng lại vi khuẩn
ẩn nnên rất tốt cho
hệ miễn dịch cũng
ũng như
nh người mắc bệnh tiểu đường.
- Cordycepin:: là một
m dạng analoge của Adenosine (3’-deoxyandenosine).
deoxyandenosine).
Chất này
ày có tác dụng
d
ngăn chặn vi khuẩn, chống sự
ự xâm nhi
nhiễm của
virus, ngăn ngừa
ừa ung thư
th và rất tốt cho những người mắc
ắc bệ
bệnh lao.
- Adenosine:: có vai trò quan trọng
tr
trong quá trình
ình chuy
chuyển hóa năng
lượng của cơ thể,
ể, giúpc
giúpcải thiện tuần hoàn ngoại biên
ên và tim m
mạch, phục
hồi năng lực cơ
ơ bắp,
b
ức chế sự tăng sinh của các tế bào
ào ung thư,
th tăng
cường khả năng
ăng vận
vậ chuyển oxi trong máu…
- Nhóm hoạt chất
ất HEAA (Hydroxy-Ethyl-Adenosine-Analogs)
(Hydroxy
Analogs): đây là
nhóm các hợp
ợp chấ
chất có hoạt tính sinh học rất mạnh, đang đđược các nhà
Đỗ Thị Bảo
9
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
khoa học đặcc biệt quan tâm
t do khả năng hỗ trợ hệ miễn
ễn dị
dịch, chống lại
sự xâm nhiễm
m của
củ một số retrovirus như virus HIV…
Ngoài ra ĐTHT còn
òn ch
chứa nhiều loại vitamin. Ví dụ trong 100g ĐTHT có
0,12g vitamin B12; 29,19mg vitamin A; 116,03mg
mg vitamin C, vitamin B2
(riboflavin), vitamin E,, vitamin K, cũng
c
như một loạt các loại
ại đđường (monodi và oligosaccharides). Hơn
H nữa,rất nhiều loạii polysaccharides và
v một loạt
các nguyên tố hóa học
ọc (K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi,Se,
Pi,Se, Al, Si, Ni, Sr,
Ti, Cr, Ga, V) cũng
ũng được tìm thấy trong loài nấm này.
y. Hàm lượng
Polysaccharide ở Đông
ông trùng hạ
h thảo thiên nhiên là 94,6mg/g,
mg/g, có tác ddụng gia
tăng hệ miễn dịch,
ch, chống
chố ung thư, điều trị các bệnh về tim ph
phổi, viêm phế
quản mãn tính ở tuổi
ổi gi
già cũng như cải thiện khả năng giải
ải độ
độc gan [7, 8].
Đây quả là một sự phức
phứ tạp đáng ngạc nhiên, độc nhấtt vô nhị m
mà con người
chưa tìm thấy ở bất cứ
ứ một
m sinh vật nào trên trái đất [1].
Trong một loạt
ạt các hợp
h chất nêu trên, có rất nhiều hợpp chấ
chất có hoạt tính
sinh học cao, đặc biệt
ệt có tác dụng
d
rất tốt đối với sức khỏee con người.
ng
Các nghiên cứu
ứu y học
h và dược học đã chứng minh được
ợc nnấm ĐTHT
Cordyceps có những
ng tác ddụng sau:
+ Chống lại
ại tác dụng
d
xấu của các tân dược đối với
ới thận,
thậ ví dụ đối
với độcc tính của
c Cephalosporin A.
+ Bảo vệệ thận trong tr
trường hợp tổn thương do thiếu
ếu máu.
+ Chống lại
ại sự suy thoái của thận, xúc tiến việcc tái sinh vvà phục hồi
các tế bào
ào tiểu
ti quản ở thận.
+ Làm hạạ huyết
huyế áp ở người cao huyết áp.
+ Chống lại
ại hiện
hi tượng thiếu máu ở cơ tim.
+ Giữ ổn định nhịp
nh đập của tim.
+ Tăng cường
ờng mi
miễn dịch không đặc hiệu.
+ Điều tiết
ết tính miễn
mi dịch đặc hiệu.
Đỗ Thị Bảo
10
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
+ Tăng cường
ờng nnăng lực thực bào của các tế bào miễn
ễn dị
dịch.
+ Tăng cường
ờng tác dụng
d
của nội tiết tố tuyến thượng
ợng th
thận và làm
trương nở
ở các nhánh khí quản.
qu
+ Làm chậm
ậm quá tr
trình lão hóa của cơ thể.
+ Hạn chếế bệnh tật
t của tuổi già.
+ Nâng cao khả
kh năng chống ung thư của cơ thể.
+ Chống lại
ại tình
t
trạng thiếu oxy của cơ thể.
+ Tăng cường
ờng tác ddụng lưu thông máu trong cơ thể.
+ Hạn chếế tác hại
h của tia gamma đối với cơ thể.
+ Tăng cường
ờng tác ddụng an thần, trấn tĩnh thần kinh.
+ Tăng cường
ờng vi
việc điều tiết nồng độ đường trong máu.
+ Làm giảm cholesterol trong máu và chống xơ vữa
ữa động
độ mạch.
+ Xúc tiến
ến tác ddụng của các nội tiết tố (hoocmon).
+ Tăng cường
ờng ch
chức năng tiêu hóa và hấp thu các chất
ất dinh ddưỡng.
+ Ức chếế vi sinh vật
v có hại, kể cả vi khuẩn lao.
+ Kháng viêm và tiêu viêm.
+ Có tác dụng
ụng cường
c
dương và chống liệt dương
Với những tác dụng
ụng trên
tr thì nấm ĐTHT còn trực tiếp ảnh hhưởng đến một
số hệ thống quan trọng
ọng trong cơ
c thể.
1.2.2. Đối với hệ thống
ống miễn
mi dịch
Những nghiên cứu
ứu th
thực nghiệm Trung Quốc đã chứng
ng minh ĐTHT có
tác dụng tăng cường
ng hoạt
hoạ động miễn dịch bằng
ng cách nâng cao khả năng hoạt
động của đại thực bào,, điều tiết các phản ứng đáp lại của tếế bbào lympho B.
Ngoài ra, tăng cường
ng một
mộ cách chọn lọc hoạt tính của các tế bào
ào ức chế, tăng
nồng độ kháng thểể IgM, IgG trong huyết
huy thanh, chống lại sự
ự llão hóa của tế
bào.
Đỗ Thị Bảo
11
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
1.2.3. Đối với hệ hô hấp
hấ
Nấm ĐTHT
THT có tác dụng
d
bình xuyễn, trừ đờm vàà phòng ch
chống khí phế
thũng. Điều này
ày làm sáng tỏ
t quan điểm của cổ nhân xa xưa
ưa cho rằng
r
nấm
ĐTHT có khả năng
ng “bảo phế,
ph ích thận” và “dĩ lao khái” [10].
1.2.4. Đối với hệ tuần
ần ho
hoàn tim và não
ĐTHT có tác dụng
ụng làm
l
giãn mạch, tăng lưu lượng tuần
ần ho
hoàn tim, não
nhờ cơ chế gây hưng
ng phấn
ph thực thể M ở cơ trơn thành mạch.
ch. Ngo
Ngoài ra, còn có
khả năng điều chỉnh
ỉnh hhàm lượng Lipid máu, giảm
m Cholesterol, Lipoprotein,
ngăn ngừa xơ vữa thành
ành mạch…
m
1.2.5. Đối với hệ thống
ống nội
n tiết
Theo các tác giảả Chen L.T, Cao H.F Huang W.F (2009) cho bi
biết, ĐTHT
có tác dụng tốt đối với
vớ tuyến trên vỏ thượng thận làm tăng
ăng ttổng hợp các
hormone do tuyến này
ày tiết
ti ra. Nấm có tác dụng như hormone nam tính
testosterol làm tăng sản
ản xuất
x
tinh trùng, cải thiện chất lượng
ợng tinh ddịch, cải
thiện đời sống tình dục
ục [10].
[10
Ngoài ra, vớii các thử
th nghiệm lâm sang đã được tiến hành,
ành, các nhà khoa
học cũng
ng khám phá ra khả
kh năng kỳ diệu của ĐTHT
THT trong việc ph
phòng chống
và điều trị ung thư,, chống
ch
sự tăng sinh của các tế bào khối
ối u, điều tiết hệ
thống miễn dịch, tăng
ăng cường
c
giải độc gan, rất tốt trong quá trình
ình ccấy ghép cơ
quan ở người cũng như
ư đặc biệt tốt với những người bị bệnh
nh tiể
tiểu đường, tim
mạch…
Đỗ Thị Bảo
12
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà Nội
N
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
PHẦN 2: NỘI
ỘI DUNGVÀ
DUNG
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C
CỨU
2.1. Đối tượng, địa điểểm, hóa chất và thiết bị sử dụng
ng trong nghiên ccứu
2.1.1. Đối tượng
ng nghiên cứu
c
Chủng nấm Cordyceps militaris được lưu giữ từ phòng
òng sinh học
h thực
nghiệm Viện hóa học
ọc các Hợp
H chất Thiên nhiên
2.1.2. Địa điểm
m nghiên cứu
c
Nghiên cứu được
ợc thực
th hiện tại Phòng Sinh học Thựcc nghiệm – Viện Hóa
học các Hợp chất thiên
ên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học vàà Công ngh
nghệ Việt
Nam.
2.1.3. Hóa chất và thiếết bị sử dụng trong nghiên cứu
a. Các hóa chất được
ợc sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:
Nguồnn Carbon (gạo,
(gạ đường glucose), nguồn Nitơ (nhộng
ộng tằm,
t
cao nấm
men, peptone), nước
ớc cố
cốt dừa, nước chiết khoai tây, nước chiết
ết ngô, KNO3, K2
HPO4, MgSO4.7H2O,, vitamin B1,…
b. Các dụng cụ thiếtt bị đđược sử dụng trong nghiên cứu gồm:
Ống nghiệm, bình
ình tam giác, cốc
c thủy tinh, ống đong,
ong, bình
b
định mức,
phễu thủyy tinh, pipet, que cấy,
c đèn cồn…
Hệ thống đèn
èn chiếu
chi sáng, máy điều hòa, nồi hấp vàà kh
khử trùng môi
trường, tủ cấy, tủ lạnh,
ạnh, cân điện tử…
Hệ thống bình
ình nuôi cấy,
c giàn khuôn, khay đựng chuyên dụụng…
Các thiết bị nêu
êu trên đều đảm bảo tiêu chuẩn, hoạt động
ng tốt vvà được cung
cấp bởii các công ty chuy
chuyên cung cấp đồ dùng và thiết bị phòng
òng thí nghi
nghiệm có
uy tín trong nước vàà qu
quốc tế.
Đỗ Thị Bảo
13
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
2.2. Nộii dung nghiên cứu
c
- Nghiên cứu đặc điểm
đ
của hệ sợi chủng nấm Cordyceps militaris
militaristrên đĩa
thạch.
nh môi tr
trường phù hợp dùng để nhân giống cấp
ấp 2 ch
chủng nấm
- Xác định
Cordyceps militaris.
- Nghiên cứu thành
ành phần
ph môi trường nuôi cấy tối ưuu trên môi tr
trường
lỏng.
- Nghiên cứu ảnh hưởng
h
của cơ chất đến khả năng hình
ình thành và phát
triển của quả thể nấm Cordyceps militaris trên môi trường rắn.
- Nghiên cứu ảnh hưởng
h
của nhiệt độ, ánh sáng, thờii gian vvà độ ẩm, tới
hình thành và phát triển
ển qu
quả thể của Cordyceps militaristrên
trên hai môi tr
trường
rắn và lỏng.
Nuôi cấy, lên
ên men trên môi trường
tr
tối ưu đã nghiên cứu là rắn
ắn vvà lỏng.
Tách chiết và đánh giá hoạt
ho tính sinh học (Hoạtt tính kháng vi sinh vật,
v
hoạt tính gây độc tế bào,
ào, hoạt
ho tính chống oxy hóa), của chủng
ng nấ
nấm Cordyceps
militaris.
Xác định hàm
àm lượng
lư
adenosine và cordycepin của chủng
ủng nnấm trên hai
môi trường nghiên cứu
ứu rắn
rắ và lên men lỏng.
2.3. Mụcc tiêu nghiên cứu
c
Đánh giá hiệu
u suất hình thành quả thể trên môi trường rắn
ắn và
v môi trường
lỏng.
Nghiên cứuu các yếu
yế tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng vàà phát tri
triển của hệ
sợi và quả thể nấm, tìm
ìm môi tr
trường nuôi cấy tối ưu trên hai lo
loại môi trường
rắn và lỏng.
Xác định hoạtt tính sinh học
h của chủng trên môi trường rắn
ắn vvà lỏng.
Đỗ Thị Bảo
14
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
2.4. Phương
ng pháp nghiên cứu
c
2.4.1 Xác định
nh môi trường
trư
phù hợp dùng để nhân giống cấp
p 1 chủng nấm
Cordyceps militaris
Để xác định được
ợc môi trường
tr
phù hợp dùng để nhân gi
giống cấp 1 từ
chủng giống ban đầu,, chúng tôi
tô đã tiến hành thí nghiệm trên 3 lo
loại môi trường
là Czapek-Dox
Dox (môi trường
trư
1), PDA (môi trường 2) vàà SDA (môi tr
trường 3).
Môi trường
ng Czapek – Dox: Agar: 15g; Saccaroza: 30g; NaNO3: 2g;
MgSO4.7H2O: 0.5g; K2HPO4: 1g; KCl: 0.5g; Nước vừa đủ:: 1000ml.
Môi trường
ng PDA (Potato Dextrose Agar): Agar: 15g; Glucose: 20g;
Khoai tây: 200g; Nước
ớc vừa
v đủ: 1000ml.
Môi trường
ng SDA (Sabouraud Dextrose Agar): Glucose: 40g; pepton:
10g; Agar: 15g; Nước
ớc vừ
vừa đủ: 1000ml.
Trong 3 môi trường
ờng trên
tr chúng tôi điều chỉnh pH=7 bằng
ằng HCl 1M vvà
NaOH 1M, các môi trường
trư
trên khử trùng ở 121ºC
ºC trong 20 phút.
Cấy chủngvào 3 môi trường
tr
đã được chuẩn bị trên đĩa
ĩa petri. Theo dõi
hình thái, màu sắc và sự
ự sinh trưởng của khuẩn lạc nấm bằng
ng mắ
mắt thường ở cả
mặt trước và mătt sau đĩa
đ petri. So sánh sự sinh trưởng củaa khu
khuẩn lạc trên 3
môi trường và kết luận
ận về
v môi trường phù hợp nhất trong nhân gi
giống cấp 1
chủng nấm Cordyceps militaris.
militaris
2.4.2. Nghiên cứu
u thành phần
ph môi trường nuôi cấy chủng nấấm Cordyceps
militaristrên môi trườ
ờng lỏng
Song song với
ới việc
việ nghiên cứu nuôi trồng trên cơ chất
ất rắ
rắn, chúng tôi
tiến hành nghiên cứu
ứu nuôi trồng
tr
trên môi trường lỏng. Việcc nuôi trồng
tr
trên cơ
chất rắn thời gian nuôi
ôi tr
trồng rất dài và đòi hỏi độ ẩm phòng
òng nuôi rất khắt
khevà hiệu suấtt sinh hoạt
hoạ tính sinh học không cao, nuôi cấy trên
ên môi tr
trường
lỏng là lựa chọn hợp
ợp lý cho nuôi cấy
c vớii quy mô công nghiệp vvà thời gian
Đỗ Thị Bảo
15
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
ngắn hơn rất nhiều. Trên
ên cơ
c sở đó chúng tôi tiến hành
ành nghiên ccứu thành phần
môi trường nuôi cấy
ấy trện
trệ dịch thể, các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng
và phát triển cũng như
ư hoạt
ho tính sinh học sinh ra từ môi trường
ờng ccơ bản, và tiến
hành thay đổi các thành
ành phần
ph nitơ và nguồn cacbon cũng
ng nh
như các yếu tố
khoáng, tìm ra thành ph
phần môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng
ởng và
v phát triển.
2.4.2.1. Ảnh hưởng củ
ủa nguồn cacbon tới khả năng hình
ình thành và phát
triển của chủng nấm Cordyceps militaris
Giống nấmCordyceps
Cordyceps militarisđược
militaris
nuôi trênmôi trường thích hợp
h nhất
được xác định từ thí nghiệm
nghi trên vàcó các hàm lượng đường
ng khác nhau llà 10,
20, 30, 40 g/l trong.. Theo dõi hình thái, màu sắc và sự phát triển của sợi nấm
trên các môi trường và đo sinh khối của chúng trên thành phần
ần ttương ứng. So
sánh và tìm ra hàm lượ
ợng đường thích hợp nhất cho sự phát triển
triể của chủng
nấm.
2.4.2.2. Ảnh hưởng
ng nguồn
ngu nitơ đến khả năng hình
ình thành và phát triển
tri
của chủng nấm Cordyceps militaris
Đánh giá sự ảnh hhưởng của nguồn nitơ chúng tôi căn cứ
ứ vvào hàm lượng
pepton có trong thành phần
ph môi trường cơ bản và thay đổi với
ới các giá tr
trị từ 5,
6, 7, 8, 10 g/l.Theo
Theo dõi hình thái, màu sắc
s và xác định
nh sinh khố
khối trên các môi
trường. So sánh vàà tìm ra hàm lượng
l
pepton thích hợp nhất choo ssự phát triển
của nấm.
2.4.2.3. Ảnh hưởng củ
ủa nhiệt độ tới thời gian sinh trưởng
ng và phát triển
tri
của chủng nấmCordyceps
Cordyceps militaris
Bình môi trường
ờng PDA có hàm lượng đường vàà pepton ttối ưu được
nghiên cứu từ thí nghiệm
nghiệ trên, được cấy giống vào nuôi cấy
ấy tại
tạ các nhiệt độ
khác nhaulà 20, 25, 30, 35ºC.
35 Theo dõi hình thái, màu sắc và sự
ự phát tri
triển của
sinh khối nấm nấm trên
ên các môi trường.
tr
So sánh và tìm ra nhiệt
ệt độ thích hợp
nhất cho sự phát triển
ển của
củ chủng nấm.
Đỗ Thị Bảo
16
CNSH 12
12-02
Viện Đại học Mở Hàà N
Nội
Khoa Công Nghệ
Ngh Sinh Học
2.4.2.4. Ảnh hưởng củ
ủa giá trị pH môi trường tới sự sinh trư
trưởng và phát
triển của chủng nấmCordyceps
Cordyceps militaris
Dùng môi trường
ờng có hàm lượng đường, hàm lượng
ng pepton và
v điều kiện
nhiệt độ phù hợp nhất nhất làm gốc, chúng tôi làm bước tiếp
ếp theo đó là tìm
khoảng pH thích hợp
ợp cho sự
s phát triển của chủng nấm,dải pH lựa chọn thử
nghiệm từ 5, 6, 7, 8. Theo dõi hình thái, màu sắc
s và sự phát triển ccủa sợi nấm
trên các môi trường.
ng. So sánh và tìm ra pH thích hợp nhấtt cho sự phát triển
tri của
chủng nấm.
2.4.3.Nghiên cứu kỹ thuật
thu nuôi trồng tạo quả thể nấm Cordyceps militaris
trên môi trường rắn
Trong công nghệệ nuôi cấy quả thể nấm Cordyceps militaris giai đoạn
tạo thành quả thể làà giai đoạn hết sức quan trọng. Nhằm
m giúp hhệ sợi nấm
Cordyceps militaris phát triển
tri thành quả thể, ngoài sự tác động ccủa điều kiện
nuôi cấy (nhiệt độ, độ ẩm,
ẩ ánh sáng) còn chịu sự ảnh hưởng
ng của ccơ chất nuôi
cấy và các phụ gia bổổ sung vào
v cơ chất đó.
Các thí nghiệm
ệm nghiên
nghi cứu sự ảnh hường của cơ chất vàà công th
thức phối
trộn phụ gia đến sự
ự ăn lan của
c hệ sợi Cordyceps militaris tiếp
ếp ttục được sử
dụng để thực hiện tiếp
ếp các nghiên
nghi cứu sự ảnh hưởng của cơ chất
ất và
v công thức
phối trộn phụ gia đến khả năng hình thành và phát triển củaa quả th
thể Nấm.
2.4.3.1 Nghiên cứu ảnh
nh hưởng
h
của cơ chất đến khả năng hình
ình thành và
phát triển của quả thểể nấm Cordyceps militaris trên môi trườ
ờng rắn
Chúng tôi lựaa chọn
chọ các loại cơ chất nuôi trồng chính là:
à: G
Gạo tẻ trắng
(Khang dân); Gạo lứt;; G
Gạo nếp thơm.
Các loại gạo này được
đư cho vào các bình nuôi trồng bằng th
thủy tinh/nhựa
(đường kính 6cm vàà chi
chiều cao 10-12cm). Các bình được cho ccơ chất với
lượng như nhau,cấy
ấy giống
giố nấm Cordyceps militaris vào các bình
bìn với lượng
Đỗ Thị Bảo
17
CNSH 12
12-02
