Ứng dụng asparaginase để giảm lượng acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh bích quy

Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-----

-----

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:

ỨNG DỤNG ASPARAGINASE ĐỂ GIẢM LƯỢNG
ACRYLAMIDE TẠO THÀNH TRONG SẢN XUẤT
BÁNH BÍCH QUY

Người hướng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Hương Trà
Sinh viên thực hiện : Đỗ Thị Huệ
Lớp
: 12-01

Hà Nội - 2016

SV: Đỗ Thị Huệ

i

Lớp CNSH-1201

Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệp
ngành Công nghệ sinh học, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ từ phía thầy
cô, bạn bè và người thân.
Với tấm lòng chân thành và biết ơn sâu sắc, em xin được gửi lời cảm ơn
đặc biệt tới ThS. Nguyễn Thị Hương Trà, cùng các cán bộ trong Bộ môn
Nghiên cứu công nghệ sinh học sau thu hoạch – Viện Cơ điện Nông nghiệp
và Công nghệ Sau thu hoạch đã tạo điều kiện, giúp đỡ tận tình và hướng dẫn
em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học,
các giáo viên phụ trách đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cũng như dạy
dỗ và dẫn dắt em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Bên cạnh đó, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh ủng hộ,
động viên và giúp đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu.
Do thời gian thực hiện khóa luận có hạn nên bài khóa luận của em không
tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được sự góp ý, đánh giá chân
thành của thầy cô và các bạn để bài khóa luận của em được hoàn chỉnh hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 23 tháng 05 năm 2016
Người thực hiện
Đỗ Thị Huệ

SV: Đỗ Thị Huệ

i

Lớp CNSH-1201


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................. iv
DANH MỤC BẢNG.............................................................................. v
DANH MỤC HÌNH ............................................................................. vi
MỞ ĐẦU................................................................................................ 1
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................... 3
1.1. Giới thiệu chung về acrylamide .......................................................... 3
1.1.1. Khả năng gây bệnh của acrylamide. ................................................... 3
1.1.2. Cơ chế hình thành acrylamide ............................................................ 4
1.1.3. Mức độ nhiễm acrylamide trong thực phẩm.......................................... 6
1.1.4. Phương pháp giảm acrylamide trong sản xuất bánh nướng ................... 9
1. 2. Giới thiệu chung về asparaginase ...................................................... 10
1.2.1. Sự phân bố của asparaginase trong tự nhiên ....................................... 10
1.2.2. Đặc điểm cấu tạo và tính chất của asparaginase .................................. 11
1.2.3. Cơ chế xúc tác của asparaginase ......................................................... 13
1.3. Nghiên cứu ứng dụng của enzyme asparaginase ............................... 15
1.3.1. Ứng dụng trong y học ......................................................................... 15
1.3.2. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm ............................................. 16
1.4. Nguyên liệu và quy trình công nghệ sản xuất bánh bích quy ........... 19
1.4.1. Nguyên liệu ........................................................................................ 19
1.4.2. Quy trình công nghệ ........................................................................... 22
1.5. Thông tin về chế phẩm asparaginase của đề tài................................. 25

1.5.1. Công nghệ sản xuất asparaginase tái tổ hợp ........................................ 25
1.5.2. Đặc điểm kĩ thuật của chế phẩm ......................................................... 26
1.5.3. Nghiên cứu sản xuất asparaginase để làm giảm lượng asparagine trong
bột mì ......................................................................................................... 26

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 28
2.1. Vật liệu nghiên cứu.............................................................................. 28
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 28
2.1.2. Hóa chất ............................................................................................. 29
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................. 29
SV: Đỗ Thị Huệ

ii

Lớp CNSH-1201


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 30
2.2.1. Sản xuất bánh bích quy....................................................................... 30
2.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzym bổ sung đến hiệu quả giảm acrylamide ... 32
2.2.3. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hiệu quả giảm acrylamide trong
bánh bích quy ............................................................................................... 33
2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng asparagine tự do ............................ 34
2.2.5. Phương pháp xác định hàm lượng acrylamide .................................... 35
2.2.6. Phương pháp xác định độ ẩm .............................................................. 38
2.2.7. Đánh giá chất lượng cảm quan bánh bích quy..................................... 39

2.2.8. Xác định chỉ tiêu hóa lý của bánh bích quy......................................... 40
2.2.9. Xác định chỉ tiêu vi sinh vật ............................................................... 40

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................... 41
3.1. Đường chuẩn xác định nồng độ acrylamide....................................... 41
3.2. Xác định được tỷ lệ asparaginase bổ sung để giảm asparagine trong
bột nhào và lượng acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh bích quy . 42
3.2.1. Tỷ lệ asparaginase bổ sung để giảm asparagine trong bột nhào và lượng
acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh bích quy khi lên men ở 20oC ........... 43
3.1.2. Tỷ lệ asparaginase bổ sung để giảm asparagine trong bột nhào và lượng
acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh bích quy khi lên men ở 25oC ........... 44
3.1.3. Tỷ lệ asparaginase bổ sung để giảm asparagine trong bột nhào và lượng
acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh bích quy khi lên men ở 30oC ........... 46
3.1.4. Tỷ lệ asparaginase bổ sung để giảm asparagine trong bột nhào và lượng
acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh bích quy khi lên men ở 35oC ........... 47
3.3. Xác định được thời gian lên men để giảm asparagine trong bột nhào
và acrylamide tạo thành trong sản xuất bích quy .................................... 50
3.4. Đánh giá chất lượng bánh bích quy .................................................... 50
3.4.1. Đánh giá chất lượng cảm quan bánh bích quy..................................... 51
3.4.2. Xác định chỉ tiêu hóa lí trong bánh bích quy....................................... 52
3.4.3. Xác định chỉ tiêu vi sinh vật trong bánh bích quy ............................... 53
3.5. Xây dựng quy trình sử dụng asparaginase để giảm lượng acrylamide
tạo thành trong sản xuất bánh bích quy ................................................... 54

PHẦN IV: KẾT LUẬN ................................................................. 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................ 57
SV: Đỗ Thị Huệ

iii

Lớp CNSH-1201


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ASPU/g

asparaginase unit/gram (đơn vị asparaginase/gam)

g/kg

microgram/kilogram (microgam/kilogam)

mg/kg

milligram/kilogram (milligam/kilogam)

ppm

parts per million (một phần triệu)

KPH

không phát hiện

Cfu/g

colony-forming unit/g (đơn vị hình thành khuẩn lạc/gam)

JECFA

(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) Hội đồng
chuyên gia chung của Tổ chức Nông lương (FAO) và Tổ chức Y
tế thế giới (WHO) vể phụ gia thực phẩm

SV: Đỗ Thị Huệ

iv

Lớp CNSH-1201


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Hàm lượng acrylamide trong một số thực phẩm..............................8
Bảng 1.2. Đặc điểm sinh hóa của asparaginase từ vi sinh vật.........................13
Bảng 1.3. Phân loại bột mì..............................................................................19
Bảng 2.1. Bảng mức chất lượng sản phẩm theo tổng số điểm trung bình của
thành viên trong hội đồng cảm quan...............................................................35
Bảng 3.1. Kết quả diện tích píc theo nồng độ chất chuẩn acrylamide............42
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzym bổ sung đến hiệu quả giảm asparagine
trong bột nhào và acrylamide trong bánh bích quy khi ủ bột ở 20oC.............44
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzym bổ sung đến hiệu quả giảm asparagine
trong bột nhào và acrylamide trong bánh bích quy khi ủ bột ở 25oC..............45

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzym bổ sung đến hiệu quả giảm asparagine
trong bột nhào và acrylamide trong bánh bích quy khi ủ bột ở 30oC..............47
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzym bổ sung đến hiệu quả giảm asparagine
trong bột nhào và acrylamide trong bánh bích quy khi ủ bột ở 35oC..............48
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của asparaginase đến chỉ tiêu hóa lý của bánh bích
quy...................................................................................................................52
Bảng 3.7. Kết quả kiểm tra vi sinh vật trong sản phẩm...................................53

SV: Đỗ Thị Huệ

v

Lớp CNSH-1201


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cơ chế hình thành acrylamide trong thực phẩm (David et al.,
2003).................................................................................................................6
Hình 1.2. Cấu tạo của asparaginase chiết tách từ Escherichia coli (Chanches et
al., 2007)..........................................................................................................11
Hình 1.3. Cơ chế chung của phản ứng xúc tác bởi asparaginase....................15
Hình 1.4. Quy trình công nghệ sản xuất bánh bích quy..................................22
Hình 2.1. Quy trình sản xuất bánh bích quy....................................................30
Hình 3.1. Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ
chất chuẩn acrylamide.....................................................................................42
Hình 3.2. Hiệu quả giảm hiệu quả giảm asparagine trong bột nhào và

acrylamide trong bánh bích quy theo tỷ lệ bổ sung khi ủ bột ở 20oC............44
Hình 3.3. Hiệu quả giảm hiệu quả giảm asparagine trong bột nhào và
acrylamide trong bánh bích quy theo tỷ lệ bổ sung khi ủ bột ở 25oC............46
Hình 3.4. Hiệu quả giảm hiệu quả giảm asparagine trong bột nhào và
acrylamide trong bánh bích quy theo tỷ lệ bổ sung khi ủ bột ở 30oC............47
Hình 3.5. Hiệu quả giảm hiệu quả giảm asparagine trong bột nhào và
acrylamide trong bánh bích quy theo tỷ lệ bổ sung khi ủ bột ở 35oC............49

SV: Đỗ Thị Huệ

vi

Lớp CNSH-1201


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

MỞ ĐẦU
Ở Việt Nam, bánh bích quy là loại bánh nướng phổ biến và rất tiện dụng.
Đây là loại bánh có giá trị gluxit cao do đó luôn giữ vị trí quan trọng trong
bảng xếp hạng những loại thực phẩm đáp ứng nhu cầu năng lượng cho cơ thể.
Các nhà khoa học cũng chỉ ra rằng, acrylamide có trong thực phẩm giàu
carbohydrate được chế biến ở nhiệt độ cao sẽ hình thành acrylamide
(Hendriksen et al., 2009 ; Yener and Kalipci, 2009; Lingnert et al., 2002).
Nguyên nhân hình thành acrylamide trong thực phẩm là do phản ứng của
asparagine và đường khử như glucose và fructose xảy ra ở nhiệt độ cao
(nướng hay chiên ở nhiệt độ lớn hơn 120oC ) và độ ẩm thấp. Đây là một phần
của phản ứng Maillard (phản ứng tạo màu sắc, hương vị và mùi thơm cho sản

phẩm) (Mottram et al., 2002). Acrylamide được cơ quan Hóa chất Châu Âu
liệt vào danh sách các chất đặc biệt nguy hiểm cho sức khỏe, cần phải loại bỏ
tối đa chúng ra khỏi thực phẩm nhằm ngăn chặn sự gia tăng ung thư. Do vậy,
việc giảm sự hình thành của acrylamide trong sản xuất bánh bích quy là điều
vô cùng cần thiết.
Có nhiều phương pháp để giảm lượng acrylamide trong thực phẩm. Phần
lớn các phương pháp mặc dù có làm hạn chế sự hình thành acrylamide nhưng
lại ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan của sản phẩm. Bổ sung asparaginase
trong quá trình sản xuất bánh là phương pháp đơn giản và hiệu quả để giảm
lượng acrylamide mà không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Xuất phát
từ đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Ứng dụng asparaginase để giảm lượng
acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh bích quy”.
Mục tiêu đề tài:
Xây dựng được quy trình sử dụng asparaginase để giảm lượng
acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh bích quy.

SV: Đỗ Thị Huệ

1

Lớp CNSH-1201


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

Nội dung đề tài:
- Ảnh hưởng của tỉ lệ enzym bổ sung đến hiệu quả giảm acrylamide trong
bánh bích quy khi lên men ở các nhiệt độ khác nhau.

- Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hiệu quả giảm acrylamide trong bánh
bích quy.
- Đánh giá chất lượng bánh bích quy (cảm quan, chỉ tiêu hóa lí và chỉ tiêu vi
sinh vật).
- Xây dựng được quy trình sử dụng asparaginase để giảm lượng acrylamide
tạo thành trong sản xuất bánh bích quy.
- Ước tính giá thành cho sản xuất bánh bích quy có bổ sung asparaginase.

SV: Đỗ Thị Huệ

2

Lớp CNSH-1201


PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về acrylamide
1.1.1. Khả năng gây bệnh của acrylamide.
Các nhà khoa học trên thế giới đã từng cảnh báo người tiêu dùng về nguy
cơ ung thư do ăn khoai tây chiên. Trên thực tế, nhiều loại thực phẩm tưởng
như vô hại khác như cà phê, bánh bích quy, bánh mì,…cũng có thể dẫn đến
ung thư. Nguyên nhân chính là do các thực phẩm trên có acrylamide.
Acrylamide hay còn gọi là 2-propenamide, ethylene carboxamide, acrylic acid
amide, vinyl amide, propenoic acid amide. Acrylamide là một monomer có
công thức phân tử C3H5NO (CH2=CH-CO-NH2), trọng lượng phân tử 71,08g,
phân cực, được tìm thấy cả trong người và động vật. Quá trình trao đổi của
acrylamide trong cơ thể như sau: Sau khi ăn, acrylamide trong thực phẩm sẽ
nhanh chóng chuyển đi khắp cơ quan trong cơ thể thông qua hệ tuần hoàn. Nó
được phát hiện trên gan, tim, não, thận, tuyến ức và thậm chí cả trong sữa mẹ.
Acrylamide chuyển hóa thành glycidamide ở trong gan thông qua cytochrome

P540. Khi nồng độ của acrylamide và glycidamide tăng cao, chúng có thể
tương tác với các đại phân tử như DNA, hemoglobin và các enzym (Claus et
al., 2008).
Những nghiên cứu trước đây đã chứng minh acrylamide có ảnh hưởng
xấu đến sức khỏe con người nhứ: gây ung thư và ảnh hưởng đến hệ thần kinh
(Sumner et al., 1992). Thông thường chỉ ở nồng độ cao nó mới ảnh hưởng
đến hệ thần kinh (liều không độc ≤ 0,5mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày), tuy
nhiên nồng độ này thường khó đạt được thông qua ăn uống. Khả năng gây
ung thư và đột biến gen của acrylamide và glycidamide đã được công bố ở
nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cũng như trên động vật. Những nghiên
cứu trên tế bào chuột và người cho thấy acrylamide và glycidamide có thể làm
gây nhiễm sắc thể, gây đột biến điểm dẫn đến sự khác thường trên nhiễm sắc
SV: Đỗ Thị Huệ

3

Lớp CNSH-1201


thể nên phá vỡ quá trình nguyên phân, tạo thể bội không chỉnh. Acrylamide
làm tăng tỉ lệ đột biến, đặc biệt là đột biến thay thế các nucleobase như denine
bằng guanine và guanine bằng cytosine. Đối với thí nghiệm trên chuột,
acrylamide thúc đẩy quá trình hình thức khối u trên não, phổi, tính bản và
tuyến vú. Khi chuột được xử lý với liều 2 mg acrylamide trên 1kg trọng lượng
cơ thể sẽ làm tăng đáng kể u não, tuyến ức, tử cung và những tế bào khác.
Tuy nhiên acrylamide được sử dụng với liều cao trong các nghiên cứu trên
động vật có thể không phản ánh trung thực những ảnh hưởng, tác động của
acrylamide hấp thụ được trong thức ăn. Do đó rất nhiều nghiên cứu về dịch tễ
học đã được thực hiện để đánh giá nguy cơ gây ung thư bóng đái, ruột, thận,
thanh quản, thực quản, vú và buồng trứng. Mặc dù vậy, Tổ chức y tế thế giới

(WHO), Tổ chức Nông nghiệp liên hiệp quốc (FAO), Tổ chức Hóa học Châu
Âu và Tổ chức Nghiên cứu ung thư thế giới (IARC) đều coi acrylamide là
chất có khả năng gây ung thư cho người, thuộc nhóm 2A (Vinei et al., 2011;
Hendrksen et al., 2009). Vì vậy, nồng độ của acrylamide trong thực phẩm
phải được kiểm soát ở mức độ cho phép (nguyên tắc của ALARA). Con
đường hình thành acrylamide cần phải được xác định để kiểm soát lượng
acrylamide hấp thu vào cơ thể. Tổ chức Bảo vệ môi trường Mỹ (EPA) và
WHO đã đưa ra hàm lượng acrylamide tối đa trong đồ uống là 0,5ppb hoặc
0,05µg/lít. Hiện nay, số liệu về lượng acrylamide vào cơ thể từ thức ăn và liều
gây chết còn hạn chế (Simonne and Archer, 2002).
1.1.2. Cơ chế hình thành acrylamide
Bột mì là nguyên liệu chính giàu cacbonhydrate được sử dụng trong quá
trình sản xuất các loại bánh nướng như bánh bích quy, bánh mỳ,… Các công
đoạn chính trong quá trình sản xuất bánh bích quy như trộn và nhào bột với
các nguyên phụ liệu (muối, nước, nấm men,…), tạo hình bánh, ủ bột, nướng,
làm nguội, phân loại và đóng gói sản phẩm. Nướng bánh là một công đoạn
quan trọng trong quá trình sản xuất bánh bích quy. Khi nướng, dưới tác dụng
của nhiệt, trong bột cùng lúc xảy ra các quá trình: lí - nhiệt, hóa - sinh và keo
SV: Đỗ Thị Huệ
4
Lớp CNSH-1201


hóa. Nướng bánh làm chín nguyên liệu, tạo cho bánh bích quy có màu, mùi và
hương thơm đặc trưng đồng thời tiêu diệt vi sinh vật. Quá trình nướng bánh
trải qua ba giai đoạn với ba nhiệt độ nướng là: 169oC, 190oC, 225oC, từ 10
đến 20 phút tùy theo yêu cầu về màu sắc và độ giòn của sản phẩm
(Hendriksen et al., 2009).
Tuy nhiên, nghiên cứu của các nhà khoa học Na Uy, Thụy Sĩ, Mỹ, Anh
đã cho thấy các loại thực phẩm có nguồn gốc thực vật giàu carbohydrate khi

được chế biến bằng những phương pháp đòi hỏi nhiệt độ cao (≥ 120oC) đều
sản sinh acrylamide (Hendriksen et al., 2009 ; Yener and Kalipci, 2009;
Lingnert et al., 2002). Nguyên nhân hình thành acrylamide trong thực phẩm
là do phản ứng của asparagine và đường khử như glucose và fructose xảy ra ở
nhiệt độ cao (nướng hay chiên ở nhiệt độ lớn hơn 120oC ) và độ ẩm thấp
(phản ứng Maillard) tạo thành hợp chất có màu vàng nâu (Mottram et
al., 2002).
Đầu tiên, nhóm R-amin của asparagine tự do phản ứng với một gốc
cacbonyl, tạo thành một Chiff Base. Dưới tác dụng của nhiệt độ tạo ra quá
trình decarboxyldecarboxylates Schiff Base tạo thành decarboxyllates Schiff
Base. Chất này tiếp tục tham gia phản ứng theo một trong hai cách: (1) thủy
phân để tạo thành 3-aminopropionamide, sau đó loại bỏ ammoniac để tạo
thành acrylamide ở nhiệt độ cao. (2) Decarboxylated Schiff Base có thể phân
hủy trực tiếp tạo thành acrylamide bằng cách loại bỏ một amin (hình 1.1)
(David et al., 2003). Một số cơ chế hình thành acrylamide khác cũng đã được
đưa ra. Tuy nhiên, các cơ chế này chưa được đánh giá một cách đầy đủ (Claus
et al., 2008). Cơ chế này cho thấy sự hình thành acrylamide là từ tiền chất
như axit acrylic, acrolein hay do phản ứng giữa axit amin khác (ví dụ: alanine,
arginine, cysteine,…) với các loại dường khác (galactose, lactose, sucrose).

SV: Đỗ Thị Huệ

5

Lớp CNSH-1201


Hình 1.1. Cơ chế hình thành acrylamide trong thực phẩm
(David et al., 2003)
1.1.3. Mức độ nhiễm acrylamide trong thực phẩm

Sự lo ngại về acrylamide trong thực phẩm đã thu hút sự quan tâm của
các nhà khoa học trên thế giới. Acrylamide trong các loại thực phẩm với hàm
lượng khác nhau. Các nhà nghiên cứu đã đưa ra số liệu về hàm lượng
acrylamide trong một sồ loại thực phẩm như sau: khoai tây chiên 600 - 4300
µg/kg, bánh bích quy 100 - 750 µg/kg, bánh mì 50 - 4000 µg/kg, ngũ cốc 50 1350 µg/kg; tuy nhiên hàm lượng dao động trong khoảng không phát hiện đến
3,5 mg/kg sản phẩm. Mức độ nhiễm acrylamide trong trong một số sản phẩm
thương mại cũng đã được Ủy ban Châu Âu báo cáo: bánh mì gừng lên tới
SV: Đỗ Thị Huệ

6

Lớp CNSH-1201


7834 µg/kg, trung bình là 303 µg/kg; trong bánh bích quy 3324 µg/kg, trung
bình là 145 µg/kg và ở bánh mì 2838 µg/kg, trung bình là 244 µg/kg
(Hendriksen et al., 2009).
Các nhà nghiên cứu nhận thấy acrylamide trong thực phẩm giàu protein
được chế biến ở nhiệt độ cao là thấp (5 - 50 µg/kg); phát hiện với liều cao ở
thực phẩm giàu carbohydrat (trung bình 150 - 4000 µg/kg) và không được tìm
thấy trong các loại thực phẩm chưa qua chế biến và thực phẩm luộc (Lingnert
et al., 2002). Các phát hiện này đã gây nên một làn sóng lo lắng và tranh luận
trong cộng đồng y tế cũng như toàn thể người tiêu dùng. Một loạt các hoạt
động nghiên cứu quốc tế về phạm vi phơi nhiễm acrylamide, nguồn gốc của
acrylamide trong thực phẩm, mức độ nguy hại của acrylamide tới sức khỏe
con người và cách thức giảm liều lượng acrylamide trong thực thẩm đã được
triển khai.

SV: Đỗ Thị Huệ

7

Lớp CNSH-1201


Bảng 1.1. Hàm lượng acrylamide trong một số thực phẩm
(Gharbia et al., 2004)
Hàm lượng acrylamide (µg/kg)
Thực phẩm

Trung

Trung vị

bình

Mức thấp -

Số lượng

cao nhất

mẫu

Khoai tây chiên

1312

1343

170 – 2287

38

Chip khoai tây

537

330

< 50 – 3500

39

Sản phẩm làm từ bột

36

36

< 30 – 42

2

Bánh nướng

112

< 50

< 50 – 450

19

Bánh quy giòn, bánh

423

142

< 30 – 3200

58

Ngũ cốc ăn sáng

298

150

< 30 – 1346

29

Bắp rang

218

167

34 – 416

7

Bánh mì mềm

50

30

< 30 – 162

41

Sản phẩm từ cá và hải

35

35

30 – 39

4

Thịt gia cầm tẩm gia vị

52

52

39 – 64

2

Thức uống từ mạch

50

50

< 50 – 70

3

Bột socola

75

75

< 50 – 100

2

Bột cà phê

200

200

170 – 230

3

Bia

< 30

< 30

< 30

1

nhào

mì nướng

sản

nha

SV: Đỗ Thị Huệ

8

Lớp CNSH-1201


1.1.4. Phương pháp giảm acrylamide trong sản xuất bánh nướng

Do việc loại bỏ acrylamide khỏi thực phẩm đã được xử lý nhiệt là không
thực tế, do vậy các nhà nghiên cứu thường quan tâm đến hướng làm giảm sự
hình thành acrylamide trong quá trình chế biến thực phẩm có hàm lượng tinh
bột cao (Vinci el al., 2011; Claus el al., 2008; Friedman and Levin, 2008), cụ
thể như sau:
a, Lựa chọn giống khoai tây, nhũ cốc có hàm lượng tiền chất của acrylamide
như asparagine và glucose thấp. Hàm lượng asparagine trong ngũ cốc cũng
biến đổi phụ thuộc vào độ màu của đất, chế độ chăm bón…Bột lúa mì của cây
trồng trong điều kiện đất thiếu sulfat có hàm lượng asparagine cao 2600-5200
µg/kg.
b, Loại bỏ các tiền chất trước khi chế biến: Sodium bicarbonate (NH4HCO3)
tăng lượng acrylamide hình thành trong bánh ngọt. Lượng acrylamide giảm
khi thay thế chất này bằng NaHCO3.
c, Lựa chọn phương pháp chế biến (pH, nhiệt độ, thời gian chế biến và môi
trường bảo quản). Tránh nướng bánh quá lâu ở nhiệt độ cao vì lượng
acrylamide hình thành có mối tương quan với thời gian và nhiệt độ nướng
bánh. PH thấp trong bột nướng bánh cũng làm giảm sự hình thành
acrylamide. Kéo dài thời gian lên men bột nướng cũng làm giảm lượng
acrylamide (77-87%) vì trong quá trình lên men asparagine bị chuyển hóa
thành các sản phẩm khác. Bảo quản lạnh thường tăng hàm lượng đường trong
củ nên lượng acrylamide tăng.
d, Bổ sung các thành phần thực phẩm (axit hữu cơ, axit amin, chất chống
oxy hóa, cacbonhydrat không khử, chitosan, hợp chất từ tỏi, protein và muối
kim loại). Axit min giúp giảm lượng acrylamide như lysine (88), glycine (91),
glutamine (70), alanine (50)…Đường khử là tiền chất cho acrylamide (mật
ong, fructose, glucose) do đó thay thế chúng bằng đường không khử như
SV: Đỗ Thị Huệ

9

Lớp CNSH-1201


sucrose và trehalose. Muối kim loại: Ca2+, Fe3+, Na+ ngăn cản sự hình thành
các chất trung gian dẫn tới hình thành acrylamide (Kukurová et al., 2009).
e, Vi khuẩn lactic
Các nhà nghiên cứu Thụy Điển đã tìm ra phương pháp hạn chế sự hình
thành acrylamide trong quá trình sản xuất khoai tây và cà phê bằng cách sử
dụng vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic sẽ loại bỏ các hợp chất đường nên ức
chế sự hình thành acrylamide (Blom et al., 2002). Bằng hàng loạt các thí
nghiệm, các nhà nghiên cứu chỉ ra rằng, chỉ cần ngâm thực phẩm vào môi
trường chứa vi khuẩn lactic 10-15 phút trước khi chiên, nướng có thể giảm sự
hình thành acrylamide đến 90% trong sản phẩm cuối cùng.
f, Sử dụng asparaginase để thủy phân asparagine thành axit aspartic và
amoni
Có nhiều phương pháp để giảm lượng acrylamide trong thực phẩm. Phần
lớn các phương pháp mặc dù có làm hạn chế sự hình thành acrylamide nhưng
lại ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan của sản phẩm. Bổ sung asparaginase
trong quá trình sản xuất bánh là phương pháp đơn giản và hiệu quả để giảm
lượng acrylamide mà không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Bên cạnh
đó, chế phẩm sinh học là asparaginase hoàn toàn không gây độc cho người sử
dụng vì nó sẽ bị mất hoạt tính trong quá trình chế biến (DSM Food
Specialties, 2006; Hendriksen et al., 2009).
1. 2. Giới thiệu chung về asparaginase
1.2.1. Sự phân bố của asparaginase trong tự nhiên
Asparaginase (L- asparaginase amidohydrolase) là enzym thủy phân Lasparagine thành axit aspartic và amoniac. Asparaginase có mặt trong giới
thực vật, động vật và vi sinh vật. Ở thực vật, phần lớn các nghiên cứu về
asparaginase từ cây đậu. Ở động vật, enzym này được tìm thấy trong gan gà
(Clemanti et al., 2009). Việc sản xuất asparaginase từ vi sinh vật đã được
SV: Đỗ Thị Huệ

10

Lớp CNSH-1201


nghiên cứu từ năm 1972. Asparaginase được sinh ra từ rất nhiều loại vi sinh
vật khác nhau như Escherichia coli, Serretia marcescens, Pseudomonas
aeruginosa,

Aerobacter

aerogens,

Aeromanas

hydrophila,

Erwinia

amylovora, Bacillus subtinis (John et al., 1970; Mukherjee et al., 2000;
Sarhan et al., 2004). Nấm mốc và nấm men cũng có khả năng sinh
asparaginase như Aspergillus niger, A. oryzae, A. tamari, A. terreus,
Penicillium granulatum, P. digitatum, Candida utilis, Saccharomyces
cerevisiae (Broome et al., 1965; Wriston et al.,1964).
1.2.2. Đặc điểm cấu tạo và tính chất của asparaginase
1.2.2.1. Đặc điểm cấu tạo của asparaginase
Với mỗi nguồn gốc khác nhau, asparaginase có cấu trúc phân tử và tính
chất đặc hiệu cơ chất khác nhau. Tuy nhiên, chỉ có L - asparaginase chiết xuất
từ Escherichia coli, Erwinia chrysanthemy được sử dụng trong điều trị ung

thư, nhất là asparaginase chiết tách từ Escherichia coli.

Hình 1.2. Cấu tạo của asparaginase chiết tách từ Escherichia coli
(Chanches et al., 2007)
Escherichia coli gồm có 2 loại asparaginase. Asparaginase loại I được
định vị trong cytosol. Asparaginase loại II được định vị trong vùng
periplasmic của vi khuẩn và có tính đặc hiệu với L - asparaginase cao hơn
SV: Đỗ Thị Huệ

11

Lớp CNSH-1201


asparaginase loại I. Do vậy, asparaginase loại II được sử dụng để điều trị ung
thư bạch cầu cấp dòng lympho. Asparaginase loại II có khối lượng phân tử
khoảng 140 kDa, là một homotetramer gồm có 4 tiểu phân có cấu trúc khác
nhau (A, B, C, D) và có 222 cấu trúc đối xứng, mỗi tiểu phân có khoảng 330
acid amin. Các tiểu phân tương tự về mặt cấu trúc. L - asparaginase loại II có
4 trung tâm hoạt động hoạt động độc lập với nhau. Hai tiểu phân A, C và B, D
tạo thành 1 dimer, mỗi dimer của tetramer và cấu trúc tetramer là một điều
kiện thiết yếu để enzym hoạt động.

1.2.2.2. Tính chất của asparaginase
Asparaginase có thể được tổng hợp nội bào hoặc ngoại bào, hầu hết
chủng các sản sinh ra asparaginase ngoại bào thuộc nấm sợi. Asparaginase
sinh ra từ vi sinh vật khác nhau có khối lượng phân tử khác nhau: từ 40 - 200
kDa. Tính chịu nhiệt của asparaginase khác nhau thường khác nhau.
Asparaginase của một số vi khuẩn như là P. earuginosa 50071, P. stutzeri
MB - 405, Erwinia carotovoca và P. aeruginosa hoạt động tối ưu ở 37oC,

trong khi asparaginase của Chrombacteriaceae có nhiệt độ tối ưu chỉ là 20oC.
Asparaginase từ A. oryzae hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ từ 15oC đến
70oC, đạt cực đại ở 60oC. Tính bền của asparaginase từ A. oryzae chỉ đạt được
trong 2 giờ ở 37oC, pH 4 - 8, hầu như không bị bất hoạt ở nồng độ muối cao.
Asparaginase từ A. niger có hoạt tính trong dải nhiệt độ từ 20 - 65, nhiệt độ
tối ưu khoảng 50oC và bị bất hoạt rất nhanh khi nhiệt độ trên 70oC.

Bảng 1.2. Đặc điểm sinh hóa của asparaginase từ vi sinh vật
(Devarai and Kota, 2012; Hendriksen et al., 2009; DSM Food Specialties,
2006)
SV: Đỗ Thị Huệ

12

Lớp CNSH-1201


Chủng vi sinh
vật

pH tối Nhiệt
ưu
độ tối
ưu

Km (M)

pI

Hoạt tính

riêng
(µmol/min
/mg)

Khối
lượng
phân tử
(kDa)

(oC)
P. aeruginosa
P. stutzeri
P. fluorescens
A. vinelandii
E. coli
S. marcescens
Tetrahymena
pyriformis
Erwinia aroideae
Erwinia
carotovoca
Saccharomyces
cerevisiae
Corynebacterium
glutamicum
Cylindrocarpon
obtusisporum
Mycobacterium
phlei
Bacillus

coagulans
Fusarium
tricinctum
Vibro
succinogenes
Proteus vulgaris
A. niger
A. oryzae

Với :

9
9
8-9
8,6
7-8
6,8
8,6

37
37
48
37
-

0,147x10-3
1,45x10-4
4,1x10-4
1,1x10-4
1,25x10-5

1x10-4
2,2x10-3

6,38
4,5
4,9
5,2
6,8

732,3
2,47
2,47
-

160
34
70
84
141
171-180
230

7,5
8

50

3x10-3
1,8x10-5

6,8
-

256
-

155
125-145

8,5

-

7,4x10-3

-

-

400

7

40

2,5x10-3

-

-

80

7,4

37

1x10-3

5,5

-

216

8,8-9,2

-

0,7x10-3

-

-

126

8,5-9,5

55

4,7x10-3

-

10,9

85

7,5-8,7

-

5,2x10-4

5,18

-

161-170

7,3

-

4,78x10-5

8,74

202

146

7-8
4-5
6-7

57
50
60

2,6x10-5
-

5,08
3,6
-

300
-

40-42
36

pI : điểm đẳng điện
Km : hằng số Michaelis-Menten

1.2.3. Cơ chế xúc tác của asparaginase
Các nhà khoa học trên thế giới đã giải thích tác động của enzym
asparaginase để giảm lượng acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh bích

SV: Đỗ Thị Huệ

13

Lớp CNSH-1201


quy là do sự thủy phân axit amin asparagine. Enzym asparaginase sẽ xúc tác
thủy phân axit amin asparagine thành axit aspartic và amoni, do đó không cho
asparagine tham gia vào phản ứng Maillard để hình thành acrylamide. Việc
bổ sung chế phẩm sinh học này không làm ảnh hưởng đến tính chất cảm quan
của bánh bích quy vì vẫn còn những axit amin khác tham gia phản ứng
Maillard để tạo màu vàng cho bánh mà không sinh ra các hợp chất gây ung
thư như acrylamide. Phản ứng thủy phân L-asparagine được xúc tác bởi
asparaginase gồm 2 bước như sau:
• Bước 1: Ban đầu, một nucleophile được kích hoạt thông qua một cầu nối
liên kết hydro OH…B với gốc base liền kề. Sau đó, nguyên tử C của
amide bị tấn công dẫn đến hình thành một chất trung gian là acyl-enzym
(chuyển tiếp tứ diện). Sự ổn định tích điện âm trên nguyên tử O trong
nhóm amide là do lỗ hổng oxyanion hình thành nhờ tương tác với chất cho
liên kết hydrogen liền kề (các nhóm N-H chuỗi chính). Kết thúc bước 1,
một phân tử NH3 được tạo ra.
• Bước 2: Phản ứng xảy ra như bước 1, tuy nhiên có điểm khác là nguyên tử
C ở nhóm ester asparagine bị tấn công bởi một nucleophile ưa nước. Kết
thúc phản ứng, một phân tử L-aspartate được tạo ra.

SV: Đỗ Thị Huệ

14

Lớp CNSH-1201


Hình 1.3. Cơ chế chung của phản ứng xúc tác bởi asparaginase
1.3. Nghiên cứu ứng dụng của enzyme asparaginase
1.3.1. Ứng dụng trong y học
Asparaginase được ứng dụng trong sản xuất thuốc điều trị bệnh bạch
cầu cấp (kể cả trường hợp bệnh bạch cầu mãn chuyển sang cấp), đặc biệt là
bệnh bạch cầu cấp dòng lympho. Asparaginase thủy phân asparagine là một
acid amin thiết yếu trong huyết thanh, do đó làm mất đi một yếu tố cần thiết
để tổng hợp protein của các tế bào lympho ác tính. Trong bệnh bạch cầu cấp,
đặc biệt bệnh bạch cầu cấp dòng lympho, tế bào ác tính phải phụ thuộc vào
nguồn asparagine từ bên ngoài để tồn tại; còn các tế bào bình thường lại có
thể tổng hợp được asparagine và do đó bị ảnh hưởng ít hơn khi thiếu
asparagine do điều trị asparaginase. Sự suy giảm asparagine dẫn đến thiếu
dinh dưỡng và làm ức chế sinh tổng hợp protein, dẫn đến tế bào bạch cầu
limpho T bị chết (Avramis and Tiwari, 2006).
SV: Đỗ Thị Huệ

15

Lớp CNSH-1201


Tính chất ức chế khối u của asparaginase được phát hiện vào những
năm 1950 khi các nhà khoa học quan sát thấy khối u limpho trong chuột đã
suy thoái sau khi điều trị với huyết thanh trong chuột lang. Sau đó người ta
phát hiện do asparaginase chứ không phải là huyết thanh tác động làm suy
thoái khối u. Những nghiên cứu sử dụng asparaginase trong điều trị ung thư
bạch cầu ác tính đã giúp kéo dài sự sống của bệnh nhân trong 20-30 năm

qua. Asparaginase là nền tảng của tất cả các phương pháp điều trị kể từ cuối
những năm 1970. Hiện nay, asparaginase đã được nghiên cứu và sản xuất
bằng công nghệ DNA tái tổ hợp đã cho hiệu suất cao hơn và tương đương
sinh học với asparaginase tự nhiên.
1.3.2. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm
Asparaginase được ứng dụng trong sản xuất thuốc điều trị bệnh bạch
cầu cấp (kể cả trường hợp bệnh bạch cầu mãn chuyển sang cấp), đặc biệt là
bệnh bạch cầu cấp dòng lympho. Ung thư bạch cầu cấp dòng lympho là căn
bệnh phổ biến nhất trong tất cả các loại ung thư ở trẻ em. Hàng năm ở Hoa
Kỳ có khoảng 2400 trẻ em và thiếu niên dưới độ tuổi 20 được chẩn đoán
mắc căn bệnh này. Ở Việt Nam, năm 2009 có khoảng 1163 ca mắc bệnh. Số
lượng bệnh nhân đang tăng nhanh trong những năm gần đây ở trên thế giới
nói chung và ở Việt Nam nói riêng. Asparaginase thủy phân asparagine là
một acid amin thiết yếu trong huyết thanh, do đó làm mất đi một yếu tố cần
thiết để tổng hợp protein của các tế bào lympho ác tính. Trong bệnh bạch
cầu cấp, đặc biệt bệnh bạch cầu cấp dòng lympho, tế bào ác tính phải phụ
thuộc vào nguồn asparagine từ bên ngoài để tồn tại; còn các tế bào bình
thường lại có thể tổng hợp được asparagine và do đó bị ảnh hưởng ít hơn khi
thiếu asparagine do điều trị asparaginase. Sự suy giảm asparagine dẫn đến
thiếu dinh dưỡng và làm ức chế sinh tổng hợp protein, dẫn đến tế bào bạch
cầu limpho T bị chết (Avramis and Tiwari, 2006).

SV: Đỗ Thị Huệ

16

Lớp CNSH-1201


Tính chất ức chế khối u của asparaginase được phát hiện vào những

năm 1950 khi các nhà khoa học quan sát thấy khối u limpho trong chuột đã
suy thoái sau khi điều trị với huyết thanh trong chuột lang. Sau đó người ta
phát hiện do asparaginase chứ không phải là huyết thanh tác động làm suy
thoái khối u. Những nghiên cứu sử dụng asparaginase trong điều trị ung thư
bạch cầu ác tính đã giúp kéo dài sự sống của bệnh nhân trong 20-30 năm
qua. Asparaginase là nền tảng của tất cả các phương pháp điều trị kể từ cuối
những năm 1970. Hiện nay, asparaginase đã được nghiên cứu và sản xuất
bằng công nghệ DNA tái tổ hợp đã cho hiệu suất cao hơn và tương đương
sinh học với asparaginase tự nhiên.
Trong công nghiệp thực phẩm, asparaginase được sử dụng như là chất
phụ gia bổ sung vào quá trình chế biến thực phẩm nhằm giảm sự hình thành
acrylamide.
Hãng Novozymes (Đan Mạch) và DSM đã sản xuất và thương mại hóa
thành công asparaginase tái tổ hợp từ các chủng nấm sợi biến đổi gen tương
ứng A. oryzae và A. niger để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm nhằm
giảm sự hình thành acrylamide trong thực phẩm. Tên thương mại của sản
phẩm asparaginase từ A. oryzae là Acrylaway@, còn asparaginase từ A. niger
là PreventASeTM. Hiện nay các sản phẩm này được cấp phép sử dụng ở Mỹ,
Úc, New Zealand, Đan Mạch, Canada,…Asparaginase tái tổ hợp được tiết ra
ngoài môi trường ở quy mô nhỏ với hoạt tính ezym là 14,28 APSU/g, còn ở
quy mô công nghiệp là 3500 APSU/g.
Nghiên cứu của các nhà khoa học tại Đại học Unide, Italya hợp tác với
các nhà khoa học tại Ireland (2010) đã cho kết quả hết sức khả quan về việc
sử dụng asparaginase để giảm sự hình thành acrylamide trong bánh bích
quy. Hàm lượng bổ sung enzym vào công thức làm bánh từ 100 ASPU/kg
đến 900 ASPU/kg bột mì. Sau khi trộn tất cả các thành phần với nhau, khối
bột được để ổn định nhằm tạo điều kiện cho enzym hoạt động. Kết quả cho
SV: Đỗ Thị Huệ

17

Lớp CNSH-1201


thấy, mẫu bích quy có hàm lượng 500 ASPU/kg bột mỳ được nướng ở nhiệt
độ vừa phải (tức là thấp hơn nhiệt độ nướng bánh thông thường là 180oC)
làm giảm acrylamide tốt nhất (Monica et al., 2011). Nghiên cứu ứng dụng
chế phẩm trong mô hình chế biến bánh quy cho thấy với liều enzym bổ sung
là 100 APSU/kg bột mì và 500 APSU/kg bột mì đã cho hiệu quả giảm
asparagine trong bội nhào lên tới 96% và 97% so với mẫu đối chứng
(Kukurová et al., 2009). Liều sử dụng asparaginase đối với một số thực
phẩm đã được hãng Novozymes (Novozymes, 2006) đưa ra như sau: Đối
với khoai tây (khoai tây chiên, khoai tây chiên cắt nát mỏng) cần liều lượng
xấp xỉ 2000 APSU/kg; sản phẩm có nguồn gốc từ bột cần liều sử dụng từ
200 - 2000 APSU/kg bột mì, tương ứng 60 - 700 mg chế phẩm Acrylaway@
trên 1 kg bột mì. . Công ty DSM đã khuyến cáo lượng enzym cần sử dụng
phụ thuộc vào chất lượng của từng loại nguyên liệu, hàm lượng asparagine,
thời gian và nhiệt độ áp dụng trong quá trình làm bánh. Đối với bánh làm từ
bột mì thì cần sử dụng asparaginase với liều từ 77 - 385 U/kg bột mì, còn
bánh làm từ bột ngũ cốc như bột ngô thì cần liều dùng 20 - 850 U/kg bột và
từ bột khoai tây thì liều dùng cần là 500 - 15000 U/kg. Khi bổ sung
asparaginase vào bột mì ướt đã cho thấy hàm lượng acrylamide trong vỏ
bánh mì giảm từ 36% đến 75%. Ngoài ra sự hình thành acrylamide từ các
sản phẩm bánh bích quy, bánh nướng, bánh đậu phộng đã giảm tới trên 80%
sau khi bổ sung asparaginase vào bột nguyên liệu trước khi nướng bánh.
Hơn thế nữa, các sản phẩm từ bột khoai tây đã được phát hiện có hàm lượng
acrylamide rất cao, lên tới 2500 ppb, nhưng sau khi bổ sung asparaginase
vào bột khoai tây ướt đã giảm trên 80% lượng asparagine tự do. Sau quá
trình nướng, asparaginase bị mất hoàn toàn hoạt tính, dư lượng chất rắn hữu
cơ trong sản phẩm thực phẩm sau cùng là từ 2 - 13 mg/kg (0,0002 0,00013%) đối với bánh mì; 0,2 - 30 mg/kg (0,00002 - 0,003%) đối với các

sản phẩm có nguồn gốc từ ngũ cốc; 4 - 526 mg/kg (0,0004 - 0,0562%) đối
với các sản phẩm từ khoai tây và 3 - 5 mg/kg (0,0003 - 0.0005%) đối với
SV: Đỗ Thị Huệ
18
Lớp CNSH-1201