Nghiên cứu, tách chiết và tinh sạch enzyme acety esterase từ nấm aureobasidium pullulans vả, namibiae

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp
LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
TS. Đỗ Hữu Nghị, NCS. Ths Vũ Đình Giáp, Ths Đỗ Thị Nhuân cùng toàn thể
cán bộ công tác tại phòng Sinh học Thực nghiệm – Viện Hóa học các Hợp
chất Thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mọi
người đã yêu quý, tận tình hướng dẫn, bảo ban, giúp đỡ tôi trong quá trình
thực tập tại phòng.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Công nghệ Sinh học,
Viện Đại học Mở Hà Nội đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập tại khoa.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn giúp đỡ,
động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu hoàn thành bài
khóa luận này.
Xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, ngày 22 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Hà Bích Huyền

Nguyễn Hà Bích Huyền

1

CNSH 12-02

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp
MỤC LỤC

MỞ ĐẦU..……………………………………………………………………1
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………………...9
1.1. Giới thiệu về nấm........…………………………………………………...9
1.1.1. Nấm đảm Basidiomycota…………………………………………9
1.1.2. Nấm túi Ascomycota..................................................................... 11
1.1.3. Nấm Aureobasidium pullulans ..................................................... 13
1.2.
Lignocellulose…………………………………………………………
…15
1.2.1. Cellulose....................................................................................... 17
1.2.2. Hemicellulose ............................................................................... 18
1.2.3. Lignin ............................................................................................ 19
1.3. Enzyme esterase………………………………………………………...13
1.3.1. Carbohydrate esterase ................................................................... 13
1.3.2. Acetyl esterase .............................................................................. 21
1.4. Vai trò của enzyme thủy phân từ nấm trong chuyển hóa carbohydrate...16
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...…………23
2.1. Vật liệu…...……………………………………………………………..23
2.1.1. Chủng nấm .................................................................................... 23
2.1.2. Máy móc thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ...................................... 23
2.1.3. Môi trường .................................................................................... 24
2.2.Phương pháp nghiên cứu…….…………………………………………..25
2.2.1. Phương pháp lên men dịch thể...................................................... 25
2.2.2. Xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp ........................................... 25
2.2.3. Xác định pH nuôi cấy thích hợp ................................................... 26

2.2.4. Phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme ............................... 26

Nguyễn Hà Bích Huyền

2

CNSH 12-02


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

2.2.5. Phương pháp xác định protein tổng số ........................................ 27
2.2.6. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme acetyl esterase ................ 27
2.2.7. Điện di gel polyacrylamide (SDS-PAGE) ................................... 27
2.2.8. Xác định nhiệt độ và pH tối ưu của enzyme acetyl esterase ........ 28
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..……………………………….29
3.1. Nguồn cơ chất và thời gian nuôi cấy tối ưu.…………………………….29
3.2. Nhiệt độ thích hợp sinh tổng hợp enzyme acetyl esterase………………31
3.3. pH thích hợp tổng hợp enzyme acetyl esterase…………………………31
3.4. Tinh sạch acetyl esterase từ môi trường nuôi cấy A. pullulans…………32
3.4.1. Kết quả nghiên cứu điều kiện chiết tách enzyme ......................... 32
3.4.2. Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel ................ 34
3.5. Đặc tính của acetyl esterase từ nấm A.pullulans………………………..37
3.6. Nhiệt độ và pH tối ưu của enzyme…...………………………………....38
KẾT LUẬN.…………………………………………………………………39
KIẾN NGHỊ..………………………………………………………………..40
TÀI LIỆU THAM KHẢO...…………………………………………………41
PHỤ LỤC...…………………………………………………………………45

Nguyễn Hà Bích Huyền

3

CNSH 12-02


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
SDS-PAGE

Sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

ApoAE

Acetyl esterase từ nấm Audreobasidium pullulans

DEAE

Diethylaminoethyl

Sm

Acid amin nhỏ

XAA

Acid amin bất kì

Ser

Serin

His

Histidine

Asp

Aspartie

Glu

Glutamic

Trp

Tryptophan

Nguyễn Hà Bích Huyền

4

CNSH 12-02

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp
DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Một đại diện của ngành Ascomycota, nấm Bisporella citrine phát
triển trên cây gỗ mục. ............................................................................................. 6
Hình 2: Nấm Aureobasidium pullulans trên đĩa thạch và hình ảnh hiển vi điện
tử quét (SEM) của khuẩn ty và bào tử nấm ........................................................... 8
Hình 3: Lignocellulose và các thành phần cấu tạo .............................................. 10
Hình 4: Cấu trúc của Cellulose............................................................................ 11
Hình 5: Các đơn vị cơ bản của lignin .................................................................. 13
Hình 6: Nếp gấp đặc trưng α/β-hydrolase và những phức hệ bộ ba xúc tác ....... 14
Hình 7: Hệ thống siêu lọc 10 kDa cut-off trên thiết bị amicon Ultra
Centrifugal Filters ................................................................................................ 21
Hình 8: Động học sinh tổng hợp acetyl esterase của nấm Aureobasidium
pullulans var. nambiae trên môi trường sử dụng cơ chất rơm ............................ 24
Hình 9: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh tổng enzyme acetyl esterase trên
môi trường nuôi cấy lỏng của chủng Aureobasidium pullulans var. namibiae... 25
Hình 10: Ảnh hưởng của pH lên sự sinh tổng enzyme acetyl esterase trên môi
trường nuôi cấy lỏng của chủng Aureobasidium pullulans var. namibiae .......... 26
Hình 11: Tinh sạch acetyl esterase qua các bước sắc ký lỏng: sắc ký trao đổi
anion DEAE Sepharose và sắc ký lọc gel SuperdexTM 75 ................................... 30
Hình 12: Protein tinh sạch biểu hiện hoạt tính acetyl esterase (ApoAE) trên
gel điện di SDS-PAGE ......................................................................................... 31
Hình 13: Nhiệt độ và pH của enzyme acetyl esterase tinh sạch từ dịch nuôi
cấy nấm Aureobasidium pullulans var. namibiae ở các điều kiện nhiệt độ và
pH khác nhau ........................................................................................................ 32

Nguyễn Hà Bích Huyền

5

CNSH 12-02


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Thành phần một số nguồn sinh khối giàu lignocellulose ...................... 10
Bảng 2: Kết quả cô, chiết tách protein enzyme từ dịch nuôi cấy nấm ................ 27
Bảng 3: Các bước tinh sạch protein enzyme có hoạt tính acetyl esterase ........... 29

Nguyễn Hà Bích Huyền

6

CNSH 12-02


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp
MỞ ĐẦU

Carbohydrate cấu tạo nên hầu hết các vật chất hữu cơ trên Trái Đất,
chúng có nhiều vai trò quan trọng trong các cơ thể sống như tích trữ và vận
chuyển năng lượng (tinh bột, glycogen) và tham gia vào các thành phần cấu

trúc (như cellulose trong thực vật và chitin trong động vật).
Sinh khối thực vật là nguồn carbohydrate có khả năng tái tạo lớn nhất
trên trái đất, được quang tổng hợp khoảng 200 tỷ tấn mỗi năm, trong đó
lignocellulose chiếm 60% tổng sinh khối (Pérez et al. 2002, Zhang et al.
2007). Lignocellulose từ sinh khối thực vật là polymer sinh học có ở tất cả các
hệ sinh thái trên đất liền và đây là nguồn hợp chất hữu cơ tái tạo lớn nhất
trong sinh quyển (Peters 2007). Việt Nam là một nước nhiệt đới và nền kinh
tế vẫn phụ thuộc chủ yếu vào sản xuất nông nghiệp, chúng ta có nguồn tài
nguyên thực vật phong phú, sản lượng cây trồng dồi dào vì vậy nguồn phụ
phẩm lignocellulose thu được rất lớn. Tuy nhiên do trình độ kinh tế, khoa học
kỹ thuật chưa cao, lignocellulose hoặc để huỷ loại tự nhiên hoặc sử dụng một
cách thô sơ theo tập quán (làm thức ăn gia súc, đốt, ủ compost) với hiệu quả
thấp.
Để có thể sử dụng nguồn sinh khối này một cách hiệu quả thì cần phải
can thiệp vào cấu trúc và thay đổi tính chất của vật liệu đầu vào sao cho phù
hợp với sản phẩm mong muốn. Tuy nhiên thành tế bào thực vật lại có cấu tạo
khá vững chắc bởi các thành phần chính như cellulose, hemicellulose và
lignin nên để phá hủy một phần hoặc toàn bộ chúng, người ta sử dụng các
phương pháp hóa - lý như xử lý ở nhiệt độ, áp suất cao, axit mạnh hay kiềm
mạnh. Do chi phí để xử lý thường cao và gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến
môi trường sinh thái tự nhiên nên phương pháp này không được ứng dụng
rộng rãi. Ngoài ra, trong lignocellulose còn có các liên kết ester giữa các

Nguyễn Hà Bích Huyền

7

CNSH 12-02

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

polysaccharit thành tế bào và đơn vị acid hydroxycinnamic của lignin; liên kết
cầu nối giữa các chuỗi xylan, giữa xylan với lignin.
Để tách riêng phần lignin ra khỏi cấu trúc lignocelluloses và có thể dễ
dàng phân hủy nó thành các chất đơn giản dễ xử lý mang tính ứng dụng cao
trong thực tiễn thì cần sử dụng chất xúc tác sinh học – enzyme thủy phân các
liên kết ester trong cấu trúc của lignocellulose. Đó là các enzyme thủy phân
carbohydrate esterase (CE) bao gồm: acetyl esterase (EC 3.1.1.6) và feruloyl
esterase (EC 3.1.1.73). Đặc biệt, enzyme acetyl esterase có liên quan đến
chuyển hóa xylan là công cụ quan trọng trong nghiên cứu cơ chế và cấu trúc
thành tế bào thực vật. Việc sử dụng enzyme này trong giai đoạn đầu của quá
trình chuyển hóa sẽ phá vỡ 1 phần cấu trúc và loại bỏ một phần thành tế bào
thực vật (Benoit I, 2006). Do đó, phức hợp lignin - cacbohydrate có thể trở
nên dễ bị tấn công bởi sự xúc tác của enzyme và sự hòa tan của sản phẩm
chuyển hóa trở nên tốt hơn.
Enzyme thủy phân carbohydrate esterase có thể được tìm thấy ở các
loài nấm. Trong số các loài nấm đó, nấm Aureobasidium pullulans được biết
đến là nấm có tầm quan trọng cao được ứng dụng nhiều trong công nghệ sinh
học để sản xuất siderophores (chất mang Fe3+) và các enzyme có liên quan
đến chuyển hóa lignocellulose.
Từ những cơ sở trên trên, chúng tôi đã chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên
cứu, tách chiết và tinh sạch enzyme acetyl esterase từ nấm Aureobasidium
pullulans var. namibiae”
Mục tiêu của đề tài nhằm:
- Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho quá trình lên men sinh tổng hợp
enzyme acetyl esterase của chủng nấm Aureobasidium pullulans var.
namibiae trên cơ chất giàu lignocellulose

- Tách chiết, tinh sạch và nghiên cứu đặc tính của enzyme acetyl
esterase.

Nguyễn Hà Bích Huyền

8

CNSH 12-02


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về nấm
Giới Nấm là nhóm sinh vật đơn ngành nhân thực dị dưỡng với thành tế
bào cấu tạo bởi chitin; là một giới riêng biệt rất lớn với khoảng 1,5 triệu loài,
có nguồn gốc hoàn toàn khác biệt so với những sinh vật có hình thái tương tự
như nấm nhày (Myxomycetes) hay Mốc nước (Oomycetes). Chúng sống phần
lớn trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc ký sinh trên cơ thể
thực vật, động vật. Nấm phần lớn phát triển dưới dạng các sợi đa bào được
gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium), một số loài khác lại phát
triển dưới dạng đơn bào. Quá trình sinh sản (hữu tính hoặc vô tính) thường
qua bào tử, được tạo ra trên những cấu trúc đặc biệt hay quả thể. Một số loài
lại mất khả năng tạo nên những cấu trúc sinh sản đặc biệt và nhân lên qua
hình thức sinh sản sinh dưỡng. Một số đại diện tiêu biểu của giới nấm là Nấm
men, Nấm mốc và Nấm lớn.
Nấm không có diệp lục, sống hoại sinh và không có khả năng sử dụng
trực tiếp các chất dinh dưỡng nhưng lại tiết ra các enzyme vào môi trường

xung quanh để phân hủy các phân tử phức tạp thành các chất hòa tan để nấm
có thể hấp thụ được. Trong số đó các loài nấm sợi có khả năng tiết ra các
enzyme có khả năng phân hủy tốt. Đó là phân giới Dikarya - Nấm bậc cao,
bao gồm hai ngành là Ascomycota – Nấm túi và Basidiomycota - Nấm đảm,
cả hai ngành này đều có nhân kép, chúng có thể có dạng sợi hoặc đơn bào,
nhưng không có lông roi.
1.1.1. Nấm đảm Basidiomycota
Đa phần những loài nấm lớn đều thuộc ngành này, nấm đảm sản xuất ra
những bào tử đảm chứa trong những thân hình dùi gọi là đảm. Hệ sợi nấm của
nấm đảm rất phát triển, sợi nấm có vách ngăn ngang chưa hoàn chỉnh. Sinh
sản vô tính bằng bào tử đính, sinh sản hữu tính bằng bào tử đảm hình thành
ngoài đảm. Quá trình sinh sản hữu tính diễn ra như sau: Các bào tử đảm về
Nguyễn Hà Bích Huyền

9

CNSH 12-02


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

hình thái giống nhau nhưng về mặt sinh lý có khác nhau, nảy mầm cho ra 2
loại sợi nấm sơ cấp khác tính (gọi là sợi âm và sợi dương). Mỗi tế bào của sợi
mang một nhân đơn bội. Khi các tế bào ở đầu 2 sợi gặp nhau sẽ kết hợp thành
tế bào 2 nhân và phát triển thành sợi thứ cấp có đời sống kéo dài. Ðến một lúc
nào đó thì tế bào ở đầu sợi mọc ra một ống nhỏ hướng về phía gốc của tế bào,
hai nhân phân chia thành 4, đồng thời xuất hiện 2 vách ngăn, tách thành 3 tế
bào: tế bào đỉnh chứa 2 nhân, tế bào ống và tế bào chân ở gốc đều chứa một

nhân (2 tế bào này về sau sẽ hợp nhau lại thành một tế bào có 2 nhân). Tế bào
đỉnh sẽ phát triển thành đảm: 2 nhân kết hợp với nhau rồi phân chia liên tiếp 2
lần, lần đầu giảm nhiễm, để cho 4 nhân. Tế bào phình to ra, phía trên mọc ra 4
u nhỏ, mỗi nhân con sẽ chui vào 1 u và biến thành 1 bào tử đảm mọc bên
ngoài đảm.
Cũng như nấm túi, ở đây đảm có thể hình thành trực tiếp trên hệ sợi
nấm hoặc nằm trong thể quả được bảo vệ bởi lớp mô giả do các sợi nấm phát
triển cài chặt lại, khác với thể quả ở nấm túi, thể quả nấm đảm do các sợi thứ
cấp tạo nên.
Tùy theo cách hình thành đảm và vách ngăn mà phân chia ra các loại
đảm:
- Đảm đơn bào (hay đảm không vách) gặp ở phần lớn các nấm đảm
- Đảm đa bào (hay đảm có vách ngăn ngang hoặc vách ngăn dọc).
Phân loại: dựa vào đặc điểm của đảm, một số tác giả chia lớp nấm
đảm này thành 3 phân lớp:
- Phân lớp nấm đảm đơn bào (Holobasidiomycetidae)
- Phân lớp nấm đảm đa bào (Phragmobasidiomycetidae)
- Phân lớp nấm đảm có bào tử đông (Teliosporomycetidae)

Nguyễn Hà Bích Huyền

10

CNSH 12-02


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

1.1.2. Nấm túi Ascomycota
Là nhóm phân loại đông nhất trong Eumycota (nấm thật). Chúng tạo ra
những bào tử giảm phân gọi là bào tử nang, mà được chứa trong một cấu trúc
đặc biệt có dạng giống túi gọi là nang (ascus). Ngành này bao gồm Nấm nhăn
(moscela), vài loại Nấm lớn và Nấm cục, Nấm men đơn bào (như các chi
Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia và Candida) và nhiều nấm sợi sống
hoại sinh, kí sinh và cộng sinh. Nhiều loài nấm nang chỉ trải qua quá trình
sinh sản vô tính (ở nấm gọi là anamorph), tuy nhiên, những dữ liệu phân tử đã
giúp nhận dạng được những giai đoạn hữu tính (teleomorph) gần nhất của
chúng ở nấm nang. Bởi những sản phẩm của quá trình giảm phân được chứa
trong nang nấm, nên vài loài nấm nang (như Neurospora crassa) được sử
dụng để giải thích những nguyên lý của di truyền học.
Hệ sợi của nấm túi rất phát triển, sợi nấm có vách ngăn ngang chưa
hoàn chỉnh (mang lỗ có gờ ở mép). Sinh sản vô tính bằng bào tử ngoại sinh
(bào tử đính), sinh sản hữu tính bằng các bào tử túi được sinh ra trong túi
(ascus). trong mỗi túi thường có 8 bào tử. Túi thường được hình thành trong
một bộ phận đặc biệt gọi là thể quả, nhưng cũng có khi túi nằm trực tiếp trên
sợi nấm. Ở những nấm túi còn nguyên thủy thì quá trình sinh sản hữu tính
giống như ở lớp Nấm tiếp hợp. Ở đây xảy ra sự tiếp hợp của 2 tế bào có nhân
đơn bội trên 2 sợi nấm khác tính nhau hình thành hợp tử lưỡng bội (2n) và
phân chia 3 lần với lần đầu giảm nhiễm tạo thành 8 nhân đơn bội, và hợp tử
trở thành túi chứa bào tử túi. Trường hợp này túi nằm trực tiếp trên sợi nấm.

Nguyễn Hà Bích Huyền

11

CNSH 12-02

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

Hình 1: Một đại diện của ngành Ascomycota, nấm Bisporella citrine phát
triển trên cây gỗ mục
Ở đa số Nấm túi có cấu tạo cơ thể phức tạp hơn thì quá trình sinh sản
hữu tính xảy ra sự kết hợp nội chất của 2 cơ quan sinh sản đực và cái, không
có sự phân hóa thành giao tử. Cơ quan sinh sản cái (túi cái, hay còn gọi là túi
quả) gồm 2 phần, phần dưới phình to trong chứa nhiều nhân và phần cổ ở trên
có hình một ống ngắn. Cơ quan sinh sản đực (túi đực) chỉ gồm một tế bào
trong cũng chứa nhiều nhân. Túi đực và túi cái tiếp xúc với nhau qua phần cổ
của túi cái, vách ngăn bị mất đi, tạo thành một ống thông nối liền 2 túi, toàn
bộ nội chất của túi đực chuyển sang túi cái. Lúc này chỉ có chất nguyên sinh
kết hợp còn nhân không kết hợp ngay mà xếp từng đôi một (1 nhân đực và
một nhân cái) tạo thành các cặp nhân. Từ túi cái mọc ra nhiều chồi, các cặp
nhân chuyển vào đó, phân chia nhiều lần riêng rẽ ở từng nhân, đồng thời xuất
hiện các vách ngăn tạo thành những sợi sinh túi gồm nhiều tế bào có 2 nhân.
Về sau, tế bào ở đầu sợi uốn cong lại, 2 nhân phân chia thành 4, xuất hiện
thêm 2 vách ngăn tách ra thành 3 tế bào trong đó tế bào ở giữa (tế bào đỉnh)
chứa 2 nhân, còn 2 tế bào kia mỗi cái chỉ chứa một nhân, sau sẽ gặp nhau để
thành một tế bào có 2 nhân mới. Tế bào đỉnh có 2 nhân nói trên tương ứng với
tế bào sinh bào tử. Nó phát triển dài ra, 2 nhân tới lúc này mới kết hợp tạo
thành một nhân lưỡng bội. Nhân này phân chia 3 lần, lần đầu giảm nhiễm,
cho ra 8 nhân con đơn bội. Mỗi nhân con này cùng một ít chất nguyên sinh
quanh nó tạo lấy một màng bọc và biến thành một bào tử túi. Tế bào sinh bào
tử trở thành túi chứa bào tử túi.

Nguyễn Hà Bích Huyền

12

CNSH 12-02


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

Nấm túi là một lớp lớn, khoảng hơn 30.000 loài, chiếm tới 30% số nấm
hiện biết, được chia làm 2 phân lớp và nhiều bộ.
- Phân lớp nấm túi trần (Hemiascomycetidae): gồm những nấm túi chưa
có thể quả và sợi sinh túi.
+ Bộ đại diện là Endomycetales với họ điển hình là Saccharomycetaceae.
Họ này có rất nhiều giống, giống thường gặp nhất và có ý nghĩa kinh tế nhất
là Saccharomyces (nấm men).
- Phân lớp nấm túi thật (Euascomycetidae): gồm những nấm túi có thể
quả, chia thành 3 nhóm:
+ Nhóm có thể quả kín
+ Nhóm có thể quả mở lỗ đỉnh
+ Nhóm có thể quả hở, hình đĩa.
1.1.3. Nấm Aureobasidium pullulans
Nấm Aureobasidium pullulans thuộc ngành nấm đảm Ascomycota (họ
Dothioraceae) nhưng hình thái giống với nấm men, có màu đen (do bào tử
chlamydospore) và có thể tìm thấy loài này trong các môi trường khác nhau
như đất, nước, không khí và đá vôi. Chúng thường được thấy ở các vùng ôn
đới chủ yếu ở Anh, Mỹ nhưng cũng được thấy nhiều ở Canada, Alaska,
Antarctica, Nga và Châu Âu. Trong tự nhiên, chúng được biết là những loài
nội ký sinh của nhiều cây thực vật (như táo, nho, dưa chuột, đậu đỗ, bắp cải)
mà không gây ra bất kỳ triệu chứng nào của bệnh. Thay đổi kiểu hình của loài

này cũng rất đáng chú ý. Hình thái khuẩn lạc có thể bị ảnh hưởng bởi nguồn
carbon, tuổi của khuẩn lạc, nhiệt độ, ánh sáng và cơ chất với các khuẩn lạc
thay đổi từ đồng nhất đến phân cụm. Bên cạnh đó những hình thái của chúng
cũng thích nghi với điều kiện môi trường khắc nghiệt khác nhau như: độ muối
cao, axit và kiềm, nhiệt độ thấp và nghèo dinh dưỡng. Do đó chúng được coi
là loài có khả năng chịu đa điều kiện khắc nghiệt.

Nguyễn Hà Bích Huyền

13

CNSH 12-02


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

Hiện nay có bốn loài Aureobasidium pullulans được công nhận từ các
đặc điểm vùng sinh thái khác nhau là: var. pullulans trên các cơ chất có tính
thẩm thấu thấp và lá cây; var. melanogenum từ môi trường gần các nguồn
nước; var. subglaciale từ các vùng lạnh và băng giá; và var. namibiae được
mô tả chỉ có một chủng phân lập từ đá cẩm thạch và bột đôlômit ở Namibia
(Zalar et al, 2008).

Hình 2: Nấm Aureobasidium pullulans trên đĩa thạch (ảnh phải) và hình ảnh
hiển vi điện tử quét (SEM) của khuẩn ty và bào tử nấm (ảnh trái)
Nguồn: và
Nấm Aureobasidium pullulans là nấm có tầm quan trọng trong công
nghệ sinh học cho sinh tổng hợp enzyme. Pullulan là một polymer sinh học có

giá trị thương mại cao được sinh tổng hợp ngoại bào bởi nấm chủng này.
Theo nhiều công bố, đơn vị cấu trúc của pullulan là maltotriose α(1→4)Glup-α-(1→4)Glup-α-(1→6)Glup- hoặc α-(1→4)Glup-α-(1→4) Glupα-(1→4)Glup-α-(1→6)Glup-. Pullulan được sử dụng nhiều trong các ngành
công nghiệp thực phẩm do tính nghèo calo (thích hợp cho người ăn kiêng)
dùng thay tinh bột. Màng sinh học pullulan có màu trong, ngăn oxy và nước
nên được dùng bọc vỏ kẹo hay chất kết dính trong sản xuất thuốc lá và dùng

Nguyễn Hà Bích Huyền

14

CNSH 12-02


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

như chất phụ gia trong công nghiệp đồ uống. Trong y dược, Pullulan được
dùng làm chất kết dính trong nha khoa, bao thuốc… (Singh et al. 2008).
Ngoài ra, chủng nấm Aureobasidium pullulans cũng được quan tâm nghiên
cứu cho mục đích sản xuất nhiên liệu sinh học (Wang et al, 2014) và sinh
tổng hợp các enzyme liên quan quá trình chuyển hóa lignocellulose (xylanase,
laccase…) (Rich et al .2013; Ohta et al, 2001).
Formatted: Font: 14 pt, English (United
States)

1.2. Lignocellulose
Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và các

Formatted: Left, Line spacing: Multiple 1.15

li, Tab stops: Not at 0.29"

thực vật khác như cỏ, lúa, ngô…Trong tự nhiên, lignocellulose có thể tìm
thấy ở thực vật hay các chất thải nông nghiệp, lâm nghiệp và các chất thải rắn
trong thành phố. Thành phần chủ yếu của lignocellulose bao gồm cellulose
(40-50%), hemicellulose (chủ yếu xylan, 20-40%) và lignin (20-30%)
(Eriksson et al. 1990; Monties & Fukushima, 2001). Cellulose và
hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đường khác nhau, trong
khi lignin là một polymer dạng vòng được tổng hợp từ tiền phenylpropanoid.
Thành phần cấu tạo và phần trăm của các polymer này là khác nhau giữa các
loài, trong cùng một cây hay các cây khác nhau là khác nhau dựa vào độ tuổi,
giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây và các điều kiện khác. Ngoài các

Formatted: Font: 14 pt

thành phần này, Lilholt & Lawther (2000) còn cho rằng pectin cũng là thành

Formatted: Font: 14 pt

phần của lignocellulose thành tế bào, đặc biệt là ở các cấu trúc sợi thực vật

Formatted: Font: 14 pt

không phải thành phần gỗ.
Trong lignocellulose có các liên kết ester giữa các polysaccharide thành
tế bào và các đơn vị axit hydroxycinnamic của lignin cùng với sự có mặt của
các gốc acetyl hóa trong thành phần hemicellulose và pectin là một trong
những lý do khiến vật liệu lignocellulose khó chuyển hóa. Các nhóm acetyl
này có trong hemicellulose của gỗ dưới dạng liên kết mạch nhánh, như Oacetyl-4-O-methyl-glucurono-β-D-xylans ở thực vật hạt kín và O-acetylgalacto-glucomannan ở thực vật hạt trần (Joseleau et al. 1993; Timell 1967;

Nguyễn Hà Bích Huyền

15

CNSH 12-02

Formatted: Font: 14 pt


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

Lindberg et al. 1973). Sự acetyl hóa ở vị trí 3-O của gốc xylosyl liên kết với
axit 4-O-methyl-D-glucuronic cũng được thấy ở xylan của rơm hay cây ngũ
cốc (Naran et al. 2009). Khoảng 22-50% các gốc xylose có liên kết với nhóm
acetyl, đây là nguyên nhân góp phần hạn chế sự chuyển hóa sinh học
hemicellulose sinh khối thực vật (Blum et al. 1999; Chen et al. 2014). Do đó,
các enzyme có khả năng đề acetyl hóa vật liệu lignocellulose (như acetyl
esterase hay acetyl xylan esterase) có tiềm năng lớn trong các ứng dụng công
Formatted: bảng Char, Font: 14 pt

nghiệp như các xúc tác thân thiện với môi trường.

Formatted: bảng Char, Font: 14 pt, Bold
Formatted: bảng Char, Font: 14 pt
Formatted: bảng Char, Font: 14 pt, Not Italic
Formatted: Font: 14 pt, English (United
States)
Formatted: Centered, Line spacing: single

Formatted: Centered, Line spacing: single
Formatted: Centered, Line spacing: single
Formatted: Font: 14 pt, English (United
States)
Formatted: Font: 14 pt, English (United
States)
Formatted: Font: 14 pt, English (United
States)
Formatted: Font: 14 pt, English (United
States)

Hình 3: Lignocellulose và các thành phần cấu tạo
Bảng 1: Thành phần một số nguồn sinh khối giàu lignocellulose
(Limayem & Rick, 2012)
Nguồn
Cellulose
Hemicellulose
Lignin
lignocellulose
(%)
(%)
(%)
Gỗ cứng

45-47

25-40

20-25

Gỗ mềm

40-45

25-29

30-36

Cỏ

25-40

35-50

-

Bột giấy

50-70

12-20

6-10

Giấy báo

40-50

25-40

18-30

Cỏ mềm

40-45

30-35

12

Phế thải n.nghiệp

37-50

35-50

5-15

Formatted: Centered
Formatted: Font: 14 pt, English (United
States)
Formatted: Font: 14 pt, English (United
States)
Formatted: Centered
Formatted: Font: 14 pt, English (United
States)
Formatted: Centered
Formatted: Font: 14 pt, English (United
States)
Formatted: Centered

Formatted: Font: 14 pt, English (United
States)
Formatted: Centered
Formatted: Font: 14 pt, English (United
States)
Formatted: Centered
Formatted: Font: 14 pt, English (United
States)
Formatted: Centered
Formatted: Font: 14 pt, English (United
States)

Nguyễn Hà Bích Huyền

16

CNSH 12-02


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

1.2.1. Cellulose
Cellulose có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n, là
polysaccharide phổ biến nhất có mặt chủ yếu trong thành tế bào thực vật giúp
cho các mô thực vật có độ bền cơ học và tính đàn hồi. Về cấu trúc hóa học,

Formatted: Left, Line spacing: Multiple 1.15
li, Tab stops: Not at 0.29"

Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt

cellulose là một mạch thẳng do các β-D-glucopyranosa liên kết với nhau qua
liên kết 1,4-glucoside.

Hình 4: Cấu trúc của Cellulose

Formatted: Font: 14 pt

Các phân tử cellulose kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi (mixel) có
chiều dài 50-100Å. Các mixel lại tạo thành bó microfiril với đường kính
khoảng 250Å có thể thấy được bằng kính hiển vi điện tử, còn fibril tạo thành

Formatted: Font: 14 pt, Not Italic
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt

từ các microfibril có đường kính 2000Å và có thể quan sát được bằng kính
hiển vi thường. Các sợi cellulose chính là các fibril. Các phân tử cellulose
trong các mixel nhờ có rất nhiều liên kết hydro nên tạo được dạng sợi bền

Formatted: Font: 14 pt

chắc. Cellulose không tan trong nước và dung môi hữu cơ nhưng tan trong

Comment [A1]: Tài liệu tham khảo

dung dịch Schweitzer là hydroxyd đồng trong dung dịch amoniac [Cu(CH3)4

Formatted: Font: 14 pt

Comment [A2]: Tài liệu tham khảo
Formatted: Font: 14 pt

](OH)2, tan trong dung dịch kẽm chlorid đậm đặc. Cellulose có nhiều trong

Formatted: Font: 14 pt

bông (95-98%), đay, gai ,tre, nứa, gỗ...(Cellulose chiếm khoảng 40-45% trong

Formatted: Font: 14 pt

gỗ) ( Một số nghiên cứu cho thấy

Formatted: Font: 14 pt, Underline, Font color:
Blue

cellulose có thể có vai trò trong điều hòa hoạt động của hệ thống tiêu hóa. Vi

Formatted: Font: 14 pt

khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vât nhai lại và động vật nguyên sinh

Formatted: Font: 14 pt

Formatted: Font: 14 pt

Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt

Nguyễn Hà Bích Huyền

17

CNSH 12-02


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose. Nấm cũng có thể
phân hủy cellulose để cung cấp nguồn carbon cho sự phát triển của chúng.

Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt

1.2.2. Hemicellulose
Hemicellulose cùng với cellulose là thành phần quan trọng cấu tạo nên
vách tế bào thực vật. Các đơn vị mắt xích của hemicellulose thường là vòng

Formatted: Font: 14 pt

anhydro của nhiều saccharide như D-glucose, D-mannose, D-galactose (thuộc
hexose), D-xylose, L-arabinose (thuộc pentose). Ngoài ra, còn có các đơn vị
axit D-glucuronic, axit 4-O-metyl-D-glucuronic và D-galacturonic. Một số

Formatted: Font: 14 pt

polysaccharide hemicellulose còn liên kết với nhóm acetyl, làm thành phần
của hemicellulose trở nên phức tạp hơn.
Thành phần hemicellulose của cây gỗ cứng chủ yếu là O-acetyl-4-Omethylglucuronoxylan (hay xylan). Xylan là một polysaccharide hỗn tạp có
chứa các nhóm phụ là các gốc acety l,4-O-methyl-D-glucuronosyl và αarabinofuranosyl liên kết với bộ khung được tạo bởi các gốc xylopyranose.
Bộ khung này liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-glycoside. Xấp xỉ 60-70%
các đơn vị xylose được ester hóa với axit acetic ở nhóm hydroxyl của carbon

Formatted: Font: 14 pt

thứ hai hoặc thứ ba và trung bình thì cứ mười đơn vị xylose thì có một nhóm
axit uronic liên kết với gốc xylose theo kiểu α-1,2-glycoside (Girio et al.
2010; Sjostrom, 1993).

Comment [A3]: Tài liệu tham khảo????

Ở gỗ mềm, mannan chiếm ưu thế trong thành phần hemicellulose với
lượng xấp xỉ 20% trọng lượng khô. Mannan trong gỗ mềm điển hình là
glucomannan với các hàm lượng D-glucose khác nhau. Mannan với hàm

Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt, Font color: Red
Formatted: Font: 14 pt

lượng galactose cao đã được đề cập như galactogluco mannan. Gỗ mềm cũng
có chứa arabinoglucuronoxylan, cấu tạo phân tử gồm L-arabinose, 4-Omethyl-α-D-glucoronic và D-xylose, tỉ lệ 1,3:2:10 (Timell et al, 1967).

Nguyễn Hà Bích Huyền

18

CNSH 12-02

Formatted: Font: 14 pt


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp
Formatted: Font: 14 pt

1.2.3. Lignin
Sau cellulose, lignin là một trong những polymer có nguồn gốc sinh học
phổ biến nhất trong tự nhiên. Lignin chiếm khoảng 30% khối lượng gỗ khô ở
cây lá kim, khoảng 20% ở cây lá rộng và không tồn tại trong thực vật bậc thấp
như rong, tảo, nấm. Tỉ lệ phần trăm lignin ở cây gỗ cứng và gỗ mềm là khác
nhau (Christiernin, 2006). Các đơn vị hình thành nên cấu trúc của lignin là
phenylpropan. Lignin của thực vật có thể được chia thành ba loại: lignin gỗ lá

Formatted: Font: 14 pt

kim, lignin gỗ lá rộng, lignin cây thân thảo và cây hàng năm. Các nhóm chức

Formatted: Font: 14 pt

ảnh hưởng lớn nhất đến tính chất của lignin là nhóm hydroxylphenol, nhóm
hyroxyl và nhóm cacbonyl. Hàm lượng các nhóm chức thay đổi tùy theo loài

Formatted: Font: 14 pt

thực vật và tùy thuộc vị trí của lignin ở lớp liền kế, lớp sơ cấp hay thứ cấp của

Formatted: Font: 14 pt

tế bào thực vật.
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Centered, Space After: 0 pt

Hình 5: Các đơn vị cơ bản của lignin

Formatted: Hình Char, Font: 14 pt
Formatted: Hình Char, Font: 14 pt, Not Italic

1.3. Enzyme esterase
1.3.1. Carbohydrate esterase
Carbohydrate esterase (EC 3.1.1x) là đại diện cho một nhóm lớn các
hydrolases xúc tác đặc biệt cho sự phân tách hoặc hình thành các ester no và
ester thơm. Esterase phân bố rộng rãi ở động vật, thực vật và vi sinh vật. Nhờ
đặc tính hữu ích như tương đối ổn định trong dung môi hữu cơ, không có yêu
cầu nhiều đối với cofactors và các vùng phân cắt, esterase có vai trò quan

Nguyễn Hà Bích Huyền

19

CNSH 12-02

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

trọng và ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học và cả trong công nghiệp
(Agafonov et al, 2005). Về mặt cấu trúc, hầu hết tất cả các esterase được biết
đến hiện nay có cấu trúc gồm nếp gấp đặc trưng α/β-hydrolase và những phức
hệ bộ ba xúc tác tương tự. Nếp gấp này tạo nên cấu trúc đặc trưng cho bộ ba
xúc tác của esterase (Ser, His và Asp/Glu) và chuỗi thống nhất Sm-XAA-SerXAA-Sm (Sm = acid amin nhỏ; XAA = acid amin bất kỳ) bảo vệ cho vùng
hoạt động của acid amin. Kiểu chuỗi này có sự thống nhất vị trí hoạt động của
serine và là một penta peptid đặc trưng cho hầu hết các esterases (Arpigny &
Jaeger, 1999).

Hình 6: Nếp gấp đặc trưng α/β-hydrolase và những phức hệ bộ ba xúc
tác
Cơ chế xúc tác thủy phân ester bởi esterases được biết đến gồm hai
bước chính: Bước đầu tiên là acetyl hóa - nguyên tử oxy của nhóm hydroxyl ở
vùng hoạt động của serine gắn vào carbon qua liên kết ester. Một nửa các gốc
alcol được giải phóng và phức hệ acetyl-enzyme được hình thành. Sau đó là
bước deacetyl hóa, nhóm hydroxyl của một phân tử nước tấn công carbon của
phức hệ acetyl-enzyme, các thành phần acetyl được giải phóng và các enzyme
hoạt động được tái sinh (Cyler et al, 1994; Lang et al, 1998).
Quá trình chuyển hóa lignocellulose cần hỗn hợp các enzyme thủy phân
bao gồm các cellulase, xylanase, carbohydrate esterase… có thể hoạt động
phối hợp với nhau để tấn công cấu trúc polymer (Van Dyk & Pletschke,
Nguyễn Hà Bích Huyền

20

CNSH 12-02

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

2012). Một trong số các carbohydrate esterase tham gia vào chuyển hóa
lignocellulose là enzyme acetyl esterase.
1.3.2. Acetyl esterase
Acetyl esterase (EC 3.1.1.6) là enzyme thủy phân xúc tác cho phản ứng
giải phóng nhóm acetyl từ các polysaccharit acetyl hóa như pectin hay xylan
của lignocellulose (Biely, 2012). Acetyl esterase cùng với hệ enzyme thủy
phân cellulose và xylan đóng vai trò quan trọng trong khả năng chuyển hóa
các dưỡng chất cần thiết của thành tế bào thực vật bằng cách thủy phân liên
kết ester giữa acetyl và xylose trong xylan, có thể loại bỏ các nhóm acetyl
ester từ vị trí C-2, C-3 của d-xylopyranosyl trong chuỗi xylan (Biely, 2003).
Quá trình deacetyl này làm các đơn vị xylopyranosyl của mạch chính xylan dễ
bị phân hủy hơn bởi endo-β-1,4-xylanases (EC 3.2.1.8). Các nhóm acetyl
nhánh có thể làm ảnh hưởng tới khả năng tiếp cận của các enzyme phân cắt
mạch chính bởi trở ngại về không gian và sự bài tiết của enzyme, vì vậy hoạt
động của enzyme endo-xylanase sẽ phân cắt các nhóm acetyl nhánh này, giúp
enzyme phân cắt mạch chính được dễ dàng hơn (Javier & cs., 2007). Enzyme
này sẽ loại bỏ các nhóm O-acetyl ở các vị trí 2/3 trên β-D xylopyranosyl của
acetyl xylan.
Acetyl esterase có thể được tách chiết từ vi sinh vật như Bacillus
pumilis, Bacillus subtilis, chủng vi khuẩn ưa nhiệt Strain JW/SL-YS485, vi
khuẩn đường ruột,… Acetyl esterase từ các vi khuẩn hoạt động ở các điều
kiện nhiệt độ và pH khác nhau. Với chủng Bacillus pumilis, enzyme có trọng
lượng phân tử là 40kDa, nhiệt độ tối ưu 55ºC, pH tối ưu 8,0; còn với chủng
Bacillus subtilis enzyme trọng lượng phân tử là 31kDa và hoạt động tối ưu ở

45ºC. Enzyme tách chiết từ vi khuẩn đường ruột hoạt động tối ưu ở 40ºC với
pH 8,0. Hoạt động của enzyme có thể được thúc đẩy bởi các ion Zn2+, Ni2+,
Fe2+ và bị ức chế bởi các ion Cu2+, Fe3+, Mn2+, Mg2+, Ca2+ và Co2+. Bên cạnh
nguồn enzyme từ vi sinh vật thì acetyl esterase cũng được tìm thấy từ một số

Nguyễn Hà Bích Huyền

21

CNSH 12-02


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

Nấm túi Ascomycota đã được miêu tả, bao gồm Trichoderma reesi (Sundberg
& Poutanen, 1991), Aspergillus awamori (Sundberg & cs., 1990), Aspergillus
niger (Linden & cs., 1994), Penicillium purpurogenum (Gordillo & cs.,
2006), Fusarium oxysporum (Christakopoulos, 1999) và Chrysosporium
lucknowense (Pouvreaua & cs., 2011). Theo đó, enzyme acetyl esterase tinh
sạch từ Aspergillus awamori có trọng lượng phân tử là 31kDa và nhiệt độ tối
ưu 40ºC với pH 7,0.
1.4. Vai trò của enzyme thủy phân từ nấm trong chuyển hóa
carbohydrate
Sinh vật phân hủy lignocellulose đóng một vai trò quan trọng trong việc
duy trì vòng tuần hoàn carbon nhờ khả năng chuyển hóa hiệu quả các vật liệu
thực vật bởi hệ enzyme thủy phân. Trong số các sinh vật phân hủy
lignocellulose, các loài nấm thuộc Basidiomycota và Ascomycota được biết là
có hệ xúc tác sinh học hiệu quả nhất và được chia thành 3 nhóm: nấm mục

trắng, nấm mục nâu và nấm mục mềm. Trong khi có nhiều nghiên cứu tập
trung vào nhóm nấm mục trắng và mục nâu (chủ yếu thuộc ngành
Basidiomycota), có rất ít các nghiên cứu trên hệ enzyme chuyển hóa
lignocellulose bởi nhóm nấm mục mềm (phần lớn thuộc ngành Ascomycota).
Các nấm thuộc Ascomycota dường như thiếu các enzyme peroxidase chuyển
hóa lignin nhưng thay vào đó, chúng có các enzyme thủy phân và laccase cho
phép chuyển hóa hiệu quả lignocellulose (Liers & cs. 2006; Nghi & cs. 2012).
Ở Việt Nam, nguồn tài nguyên nấm ứng dụng trong hóa sinh và công
nghệ sinh học nhìn chung còn ít được khai thác sử dụng. Trong khi đó nước ta
có sự đa dạng lớn các sinh vật nấm ở các môi trường sống khác nhau với trên
850 loài nấm lớn (bao gồm các nấm túi và nấm đảm sinh quả thể) đã được xác
định và mô tả (Trịnh Tam Kiệt 1996; Dorfelt & cs. 2004). Vì vậy, nước ta có
tiềm năng lớn về các loài và các chất xúc tác sinh học có hoạt tính hữu ích.

Nguyễn Hà Bích Huyền

22

CNSH 12-02


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Chủng nấm
Chủng giống để nghiên cứu điều kiện tối ưu sinh tổng hợp enzyme
acetyl esterase là chủng nấm Aureobasidium pullulans var. nambiae (A.

Pullulans). Chủng nấm trên được phân lập từ các mẫu vật thu được từ vườn
Quốc gia Cúc Phương – Ninh Bình và hiện đang được lưu giữ tại Phòng Sinh
học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên.
Nấm A. Pullulans được phát triển trên môi trường thạch malt (20 g/L) ở
nhiệt độ 23ºC và lưu giữ ở 4ºC sau khi khuẩn ty phát triển đầy bề mặt thạch.
Để nhân giống cho quá trình sinh tổng hợp enzyme tiếp theo, khuẩn ty nấm từ
môi trường thạch được cấy chuyển sang các đĩa môi trường thạch malt mới
nuôi cấy ở 25ºC khoảng 3 tuần để nấm phát triển.
2.1.2. Máy móc thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Máy móc thiết bị
Tủ cấy vi sinh vật Box – Laminar (Đức), tủ ấm CO2 (Deawoo – Hàn
Quốc), cân điện tử AL300 (Thụy Sỹ), nồi khử trùng Lequenx (Pháp), tủ lạnh
Sanyo (Nhật Bản), máy li tâm Sigma (Mỹ), máy lắc ngang (Đức), máy votex
(Mỹ), máy siêu âm sonix (Canada), máy siêu lọc 10 kDa cut-off (Mỹ).
Dụng cụ thí nghiệm
Các dụng cụ cấy vi sinh: ống nghiệm, bình tam giác, đĩa petri, pipet, cột
sắc ký, ống eppendorf, ống falcon, đèn cồn, que cấy… (Việt Nam, Pháp,
Trung Quốc).
Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong đề tài có xuất xứ từ Việt Nam, Trung Quốc,
Đức.

Nguyễn Hà Bích Huyền

23

CNSH 12-02


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

2.1.3. Môi trường
Môi trường cơ bản:
MgSO4

0,5 g

KH2 PO4

1,5 g

Cao nấm men

2,0 g

Dịch nguyên tố vi lượng (vết)* 1ml
• Thành phần dịch nguyên tố vi lượng:
FeCl.6H2O

0,08g

ZnSO4.7H2O

0,09g

MnSO4.H2O

0,03g

CuSO4.5H2O

0,005g

EDTA

0,4g

Nước cất

1000ml

Môi trường lưu giữ: Môi trường thạch khoai tây (PDA):
Khoai tây

200g

Glucose

20g

Pepton

5g

Agar

15g

Nước cất

1000ml

Nguyễn Hà Bích Huyền

24

CNSH 12-02


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

Môi trường Czapek Dox:
Saccarose

30g

NaNO3

2g

KH2PO4

1g

MgSO4.7H2O

0,5g

KCl

0,5g

FeSO4.7H2O

0,5g

Agar

20g

Nước cất

1000ml

pH= 6.
Các môi trường trên đều được khử trùng ở 121ºC, 1atm trong 30 phút.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp lên men dịch thể
Các thành phần cơ bản của môi trường lên men được bổ sung 2% (w/v)
cơ chất giàu lignocellulose và cơ chất ester khác nhau như: cà chua (CC), đậu
tương (ĐT), rơm rạ (RR); mùn gỗ (MG); bã ngô (BN). Các cơ chất trên đều
được rửa sạch, nghiền nhỏ (kích thước dài 0,5-0,7 cm), sấy khô, trước khi bổ
sung vào bình lên men chứa môi trường cơ bản và khử trùng (121ºC trong 30
phút).
Trong quá trình nuôi cấy từ 2-3 tuần, sau mỗi 3 ngày lấy 1ml mẫu để
xác định hoạt tính enzyme và pH môi trường. Thực nghiệm được thực hiện

lặp lại 2-3 lần, lấy giá trị trung bình.
2.2.2. Xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp
Nấm được lên men trên môi trường gốc sử dụng cơ chất rơm và nuôi
cấy nấm trên các khoảng nhiệt độ khác nhau là 23º, 25º, 28º, 30º, 37ºC trong
khoảng thời gian 2 - 3 tuần. Tiến hành thu sinh khối, thử hoạt tính enzyme, so
sánh và tìm ra nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển của hệ sợi nấm.

Nguyễn Hà Bích Huyền

25

CNSH 12-02