Tách dòng và biểu hiện gen mã hoá endoglucanase từ hệ vi sinh vật ruột mối coptotermes gestroi trong tế bào escherichiacolibl21(DE3)

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công Nghệ Sinh Học

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài

TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
ENDOGLUCANASE TỪ HỆ VI SINH VẬT RUỘT
MỐICOPTOTERMES GESTROI TRONG TẾ BÀO
ESCHERICHIACOLIBL21(DE3)

Hà Nội - 2016

Người hướng dẫn

: TS. Đỗ Thị Huyền

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thành Duy

Lớp

: K19-1203


LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. Trương Nam Hảivà TS. Đỗ Thị
Huyền Trưởng phòng Kỹ thuật di truyền,Viện Công nghệ sinh học,Viện Hàn
lâmKhoa học và Công nghệ Việt Nam đã thu nhận và hướng dẫn, quan tâm nhiệt
tình tạo mọi điều kiện cho em nghiên cứu cũng như trang thiết bị máy móc để em có
thể hoàn thành luận văn này.
Luận văn được thực hiện tại phòng Kỹ Thuật Di truyền, phòng Thí nghiệm trọng
điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện khoa học và Công nghệ Việt
Nam, với sự giúp đỡ của NCS ThS. Nguyễn Thị Thảo cùng các Anh (Chị) trong
phòng Kỹ thuật di truyền.
Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô bộ môn trong khoa Công
nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội đã giảng dạy và chỉ bảo cho em những kiến
thức chuyên môn và kỹ năng cần thiết.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn
bè đã tạo điều kiện và luôn ủng hộ em trong suốt thời gian học tập.
Hà nội, ngày

tháng

năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thành Duy

SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 1


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ ENDO-BETA-1,4–GLUCANASE ................................... 3
1.1.1 Sinh vật sản xuất endoglucanase ..................................................................... 3
1.1.2.Cấu trúc và cơ chế xúc tác của endo-beta-1,4-glucanase ................................. 4
1.1.3.Ứng dụng của endoglucanase .......................................................................... 7
1.2. BIỂU HIỆN GEN ENDOGLUCANASE TRONG E. COLI ......................... 9
1.2.1 Hệ biểu hiện E. coli ......................................................................................... 9
1.2.2 Chủng biểu hiện E.coli BL21 ........................................................................ 10
1.3.3 Vector biểu hiện pET22b(+) .......................................................................... 10
CHƯƠNG 2 . NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ....................................... 13
2. 1. NGUYÊN LIỆU ............................................................................................ 13
2.1.1 Chủng vi sinh vật và plasmid......................................................................... 13
2.1.2 Hóa chất, enzyme, máy móc và thiết bị ......................................................... 13
2.1.3. Dung dịch và môi trường nuôi cấy ............................................................... 14
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................. 16
2.2.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction).................................................... 16
2.2.2 Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose bằng QIAquick Gel Extration kit
............................................................................................................................... 18
2.2.3 Điện di ADN trên gel agarose ....................................................................... 18
2.2.4 Biến nạp gen vào tế bào E. coli DH10b bằng phương pháp sốc nhiệt ............ 19
2.2.5 Tách chiết ADN plasmid từ tế bào E. coli ..................................................... 21
2.2.6 Xử lý ADN bằng enzyme hạn chế ................................................................. 22
2.2.7 Phản ứng ghép nối gen .................................................................................. 22
2.2.9 Điện di protein trên gel polyacrylamide-SDS ................................................ 23

SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 2

2.2.10 Điện di protein trên gel polyacrylamide không SDS dùng xác định hoạt tính
bằng zymography ................................................................................................... 24
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 25
3.1 Thiết kế vector biểu hiện pET22-egc ............................................................. 26
3.1.1. Khuếch đại gen egc ...................................................................................... 27
3.1.2. Cắt sản phẩm PCR gen egc và pET22b(+) bằng NcoI+XhoI ......................... 28
3.1.3 Nối ghép gen egc vào vector biêu hiện pET22b+ ........................................... 29
3.1.4 Tách chiết DNA plasmid pET22-egc tế bào E. coli DH10b ........................... 29
3.1.5 Kiểm tra sự có mặt của gen egc trong vector tái tổ hợp pET22-egc ............... 30
3.2 Biểu hiện gen egc trong chủng E. coli BL21 (DE3) ....................................... 32
3.3.1 Nhiệt độ………………………………………………………………………….......34
3.3.2. Nồng độ chất cảm ứng IPTG……………………………………………………….37

3.4. KIỂM TRA HOẠT TÍNH CỦA ENDOGLUCANASE .............................. 41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 42
Tài liệu tham khảo ............................................................................................... 43

SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 3


DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt
Amp
bp
CMC
DNA

EDTA
E. coli
Egc

Tên tiếng anh
Ampicilin
Base pair
Cacboxymethylcellulose
Deoxyribonucleic acid
Ethylene diamine tetraacetic acid
Escherichia coli
Endoglucanase gene

EtBr
IPTG
Kb
kDa
LB
LBA

Ethidium bromide
Isopropy beta - D-1
thiogalactopyranoside
Kilo base
Kilo Dalton
Luria and bertani
Luria-bertani ampicilin

M
OD

Marker
Optical density

Tên tiếng việt
Ampicilin
Cặp bazơ
Cơ chất cacboxymethyl cellulose
Axit deoxyribonucleic
Axit ethylene diamine tetraacetic
Escherichia coli
Gen mã hóa endoglucanase trong
ruột mốiCoptotermes gestroi
Ethidium bromide
Chất cảm ứng Isopropy beta - D1 thiogalactopyranoside
Kilo base
Đơn vị đo khối lượng của protein
Môi trường LB
Môi trường LB có bổ sung
ampicillin
Thang chuẩn
Mật độ quang học

ORF

Open reading frame

Khung đọc mở

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi

rRNA

Ribosome ribonucleic acid

SDS

Sodium dodecyl sulfate

Axit ribonucleic mã hóa
ribosome
Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE
TAE

SDS - Polyacrylamide Gel
Electrophoresis
Tris – acetat – EDTA

Tris – acetat – EDTA

TE

Tris-EDTA

Tris-EDTA

TEDMED

Tetramethylethylenediamine

Tetramethylethylenediamine

w/v

Weight/volume

Trọng lượng/thể tích

SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Điện di trên gel polyacrylamide

Page 4


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. 1 Cấu trúc không gian của Cel5 (Endoglucanase Z) .................................
Hình 1. 2 Cấu trúc và mô hình xúc tác của cellulase nói chung và
endoglucanase nói riêng22. ...................................................................................... 6
Hình 1. 3 Vector pET22b(+) 28 ............................................................................. 12
Hình 3. 1 Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pET22b(+) mang gen egc.................. 26
Hình 3. 2 Điện di đồ sản phẩm PCR gen egc trên gel agarose 0,8%. ................ 27
Hình 3. 3 Điện di đồ sản phẩm tinh sạch sản phẩm PCR và vector pET22b(+)
cắt bằng NcoI+XhoI trước khi lai thành vector pET22-egc............................... 28

Hình 3. 4 Phân tích sản phẩm tách chiết DNA plasmid pET22-egc .................. 30
Hình 3. 5 Điện di đồ sản phẩm cắt 4 dòng pET22-egc tái tổ hợp bằng cặp
enzyme hạn chế NcoI và XhoI trên gel agarose 0,8% . ...................................... 31
Hình 3. 6 Điện di đồ protein tổng số của các thể biến nạp E. coli BL21(DE3)
mang gen egc trên gel polyacrylamide 12,6%. ................................................... 33
Hình 3. 7 Điện di đồ SDS-PAGE kiểm tra protein pha tan (T), pha không tan
(KT) và protein tổng số (TS) được biểu hiện trong chủng E. coli BL1(DE3)
mang gen egc ........................................................................................................ 34
Hình 3. 8 Điện di đồ SDS-PGE kiểm tra protein tan (T), pha không tan (KT) và
protein tổng số (TS) được biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau trong chủng E.
coli BL21(DE3) khi tế bào được phá bằng hạt thủy tinh ................................... 36
Hình 3. 9 Điện di đồ kiểm tra protein tan (T), pha không tan (KT) và protein
tổng số (TS) được biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau trong chủng E. coli
BL21(DE3) khi phá tế bào bằng siêu âm ............................................................ 37
Hình 3. 10 Đồ thị thể hiện giá trị OD600 tại thời điểm thu mẫu của tế bào được
cảm ứng ở các nồng độ IPTG khác nhau…………………………………………38
Hình 3. 11 Điện di đồ protein tổng số biểu hiện trong tế bào E. coli BL21(DE3)
mang gen egc ở các nồng độ IPTG khác nhau trên gel polyacrylamide 12,6 %
có SDS. .................................................................................................................. 39
Hình 3. 12 Điện di đồ kiểm tra protein pha tan biểu hiện trong tế bào E. coli
BL21(DE3) ở các nồng độ IPTG khác nhau trên gel polyacrylamide 12,6 % có
SDS. ....................................................................................................................... 40
Hình 3. 13 Điện di đồ kiểm tra hoạt tính protein tan (T), pha không tan (KT)
và protein tổng số (TS) trên gel polyacrylamide 9 % không biến tính kết hợp
đệm biến tính các mẫu nhuộm coomassie. .......................................................... 41

SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 5

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1 Thành phần điện di protein ............................................................................ 16
Bảng 2 Thành phần PCR ............................................................................................. 17
Bảng 3 Thành phần cắt DNA plasmid bằng enzyme hạn chế .................................... 22
Bảng 4 Thành phần phản ứng nối ghép gen ............................................................... 23

SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 6


MỞ ĐẦU
Endoglucanase là một trong ba loại enzyme quan trọng phân hủy
cellulose. Chúng phân cắt các liên kết β-1,4-glycoside ở bên trong chuỗi
polysaccharide dài của các vùng cellulose tinh thể và vô định hình để tạo
thành các đoạn oligosaccharide kích thước ngắn có các đầu tự do mới. Các
đoạn oligosaccharide ngắn này là cơ chất cho các cellulase khác như
exoglucanase, beta glucosidase phân cắt tạo đường glucose dùng cho lên men
sản xuất các sản phẩm có giá trị, điển hình là cồn sinh học.
Việt Nam là nước nông nghiệp mỗi năm lượng phế thải lignocellulose
như rơm rạ, bã mía được tạo ra với hàm lượng rất lớn (khoảng 40-50
tấn/năm). Ước tính cứ một tấn lúa sẽ có 1 – 1,2 tấn rơm rạ1. Lượng phế thải
này thường được đốt hoặc bỏ đi gây ô nhiễm không khí và ảnh hưởng nghiêm
trọng đến tầng ozon gây hiệu ứng nhà kính. Thay vì đốt hay bỏ đi thì đây là
nguồn nguyên liệu phong phú cho quá trình lên men sinh khối cellulose tạo
thành ethanol. Tuy nhiên, việc sản xuất ethanol từ sinh khối này còn gặp
nhiều khó khăn do giá thành các enzyme chuyển hóa lignocellulose còn cao
nên cồn sinh học chưa cạnh tranh được trên thị trường. Đây là một trong
những nguyên nhân dẫn đến việc sử dụng nhiên liệu sinh học hiện nay chưa

được phổ biến.
Một trong những chiến lược quan trọng để giảm giá thành nhiên liệu
sinh học để đưa vào thực tiễn đó là làm giảm giá thành enzyme thủy phân
lignocellulose. Vì vậy, trong những năm qua trên thế giới có rất nhiều công
trình nghiên cứu khai thác tìm ra enzyme cellulase có hoạt tính mạnh, tốc độ
chuyển hóa nhanh cellulose thành đường đơn dùng cho lên men tạo ethanol
và các sản phẩm có giá trị. Các hướng nghiên cứu đó bao gồm tìm kiếm các
enzyme mới, gây đột biến định hướng làm tăng hoạt tính của enzyme.
Ngày nay, dựa trên thành tựu về giải trình tự gen nên DNA đa hệ gen
SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 1


của quần thể vi sinh vật của môi trường sinh thái được giải trình tự dễ dàng để
khai thác gen từ các vi sinh vật chưa nuôi cấy được mà vi sinh vật này chiếm
hàm lượng rất lớn (99-99,9%) tùy theo môi trường sinh thái. Từ năm 2013,
Phòng Kỹ thuật di truyền đã giải trình tự DNA đa hệ gen của vi sinh vật trong
ruột mối và khai thác được 316 gen mã hóa enzyme cellulase, trong đó có 31
ORF mã hóa endo glucanase. Bằng các phần mềm tin sinh ước đoán tính chất
enzyme, trình tự gen egc mã số GL0130684 mã hóa endo glucanase đã được
phân lập.
Trong công trình nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành: “Tách dòng và
biểu hiện gen mã hóa endoglucanase từ hệ vi sinh vật ruột mối
Coptotermes gestroi trong tế bào Escherichia coli”nhằm tiến tới tinh chế và
nghiên cứu tính chất của enzyme.

SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ ENDO-BETA-1,4–GLUCANASE
Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng phân cắt mối liên kết
beta-1,4-O-glucoside trong phân tử của cellulose, oligosaccharide, disacharide
và một số cơ chất tương tự khác. Cellulase được chia làm ba dạng: (1) endobeta-1,4-glucanase (được gọi tắt là endoglucanase) thủy phân liên kết ở bên
trong phân tử; (2) exo-beta-1,4-glucanase thủy phân các liên kết đầu khử và
đầu không khử của phân tử cellulose; (3) beta-1,4-glucosidase thủy phân các
phân tử cellodextrin và cellobiose thành glucose. Enzyme này được tổng hợp
chủ yếu từ các vi sinh vật như nấm2, vi khuẩn sống trên môi trường có
cellulose.
Endoglucanasecó tên gọi kháclà1,4-beta-D-glucan-4-glucanohydrolase hoặc
carboxylmethylcellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4) là enzyme thủy phân có khả
năng phân cắt mối liên kết beta-1,4-O-glucoside bên trong chuỗi
polysaccharide dài của các vùng cellulose tinh thể và vô định hình dẫn đến tạo
thành các đoạn oligosaccharide kích thước ngắn có đầu tự do mới hay nói
cách khác tạo ra các đoạn cellulose dextrin, một ít cellobiose (cắt 2 đơn vị).
1.1.1 Sinh vật sản xuất endoglucanase
Endo-beta-1,4-glucanase có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác
nhau trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật. Trong tự
nhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm
men có khả năng sinh tổng hợp endo-beta-1,4-glucanase. Ngoài ra, chúng còn
được tổng hợp ở thực vật Arabidopsis3, ở động vật nguyên sinh và một số
động vật như Mytilus edulis4.
Vi khuẩn là đối tượng có khả năng sinh tổng hợp endo-beta-1,4glucanase khá phong phú. Nhiều loại vi khuẩn hiếu khí có khả năng sinh tổng
hợp như: Acidothemus cellulobuticus5, Bacillus pumilis6, Cellulomonas
flavigena7, Cellulomonas udai8, Pseudomonas fluoressens8, đặc biệt là vi
SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 3


khuẩn trong ruột mối Coptotermes9.
Nấm mốc cũng là một trong những đối tương nghiên cứu sự sinh tổng
hợp endo-beta-1,4-glucanase. Nhiều loài thuộc chi Aspergillus, Trichoderma,
Penicillium, Phanerrochaete cũng khả năng tổng hợp nhiều endo-beta-1,4glucanase như: Aspergillus niger10, A. flavus11, A. fumigates12, Trichoderma
reesei13,

Penicillium

persicium,

P.brasiliamum14,

Penicillium

sp15,

Phanerochaete chrysosporium16 .
Nhiều xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces và Streptomyces cũng có khả
năng sinh tổng hợp endo-beta-1,4-glucanase như: Actinomyces griseus17,
Streptomyces reticuli18.
Trong số các nguồn enzyme trên thì vi sinh vật được xem là nguồn
cung cấp enzyme có nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất vượt trội so với
enzyme có nguồn gốc từ động vật, thực vật như: chu kỳ sinh trưởng ngắn(từ
16 đến 18 giờ), khối lượng nhỏ, kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế
bào tương đối lớn nên được ứng dụng quy trình sản xuất chế phẩm enzyme
khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao. Hơn nữa, enzyme từ vi sinh vật có hoạt
tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác. Vì thế, chúng được sử dụng rộng rãi

trong quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme19.
1.1.2.Cấu trúc và cơ chế xúc tác của endo-beta-1,4-glucanase
1.1.2.1 Cấu trúc
Sự khác nhau về cấu trúc các enzyme thể hiện ở sự sắp xếp các chuỗi
polypeptide trong không gian, các trung tâm xúc tác và vùng liên kết cơ chất.
Sự khác biệt này dẫn tới sự khác nhau về tính chất hóa lý của chúng. Ví dụ,
cellulase Cel5 (hay còn được gọi là enduglucanaseZ) được sản xuất bởi
Erwinia chrysanthem có nhiều trung tâm xúc tác (CD), một vùng liên kết và
một vùng liên kết với cellulose (CBD). Cấu trúc không gian 3 chiều của
CBDCel5 được phát hiện bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân với ba
SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 4


axit amin (Trp18, Trp43 và Tyr44) có vai trò xúc tác phản ứng. Asp17 có vai
trò quan trọng trong việc làm ổn định cấu trúc của Cel5. Loại bỏ axit amin
Asp17 đến Pro23 để làm cho cấu trúc cellulose sẽ nới lỏng20.

Hình 1. 1Cấu trúc không gian của Cel5 (Endoglucanase Z)
a. Cấu trúc không gian ba chiều của CBDCel5 phần đột biến được in đậm.
b. Cấu trúc không gian ba chiều của CBDCel5 khi loại bỏ phần đột biến.

1.1.2.2 Cơ chế xúc tác của endoglucanase
Mỗi loại enzyme trong nhóm cellulase tham gia thủy phân từ cơ chất
theo một cơ chế riêng. Tuy nhiên, những enzyme này thường phối hợp hoạt
động để thủy phân hoàn toàn phân tử cơ chất thành sản phẩm đơn giản nhất là
glucose.

SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 5


Vùng xúc tác
Đoạn nối

Vùng liên kết

Glucose

Hình 1. 2Cấu trúc và mô hình xúc tác của cellulase nói chung và
endoglucanase nói riêng22.
Enzyme cellulase nói chung và endoglucanase nói riêng có cấu trúc gồm 3 vùng
chính: vùng liên kết là vùng bám với cellulose còn được gọi là vùng CBM
(Cellulose binding module), vùng xúc tác hay còn gọi là vùng CD (Catalytic
domain) và đoạn peptide nối (linker peptide)- đoạn nối giữa CBM và CD.

Để phân cắt hết cellulose thì cấu trúc cellulase thường có 3 vùng: vùng
xúc tác (CD), một hoặc nhiều vùng liên kết với cellulose (CBD) và đoạn nối
peptide giữa CD và CBD.
CD có chức năng phân cắt liên kết beta-1,4-glucoside. Trong mỗi
enzyme, CD chiếm hơn 70% trình tự axitamin. Vị trí hoạt động của CD có hai
cách sắp xếp khác nhau: (1) tạo thành dạng khe hầm (đối với cellulase phân
hủy bên ngoài), (2) dạng khe rãnh (đối với cellulase phân hủy bên trong).
Đoạn peptide nối có khoảng 6 đến 59 axitamin và hoạt động như một
bản lề linh hoạt cho phép mỗi vùng thực hiện chức năng độc lập nhau. Trình
tự của đoạn nối rất khác nhau ở các enzyme khác nhau, tuy nhiên trong thành
phần của chúng giàu proline, threonine và serine. Nếu đoạn nối không có
hoặc ngắn thì cả hai vùng CBM và CD sẽ cản trở lẫn nhau.

CBD có kích thước khoảng 30 đến 300 axit amin, mỗi protein chứa 1
hay 2 hay 3 CBM độc lập với nhau. CBM có chức năng mang enzyme lại gần
SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 6


hơn và tương tác lâu hơn với cơ chất, qua đó làm tăng tốc độ phản ứng. Để
phân hủy cellulose, CBM liên kết với sợi cellulose, nhận dạng đầu khử của
chuỗi rồi đưa chuỗi vào khe xúc tác của CD và thủy phân cellulose. Sản phẩm
thủy phân sẽ được giải phóng ra khỏi khe xúc tác và cellulase sẻ thủy phân sợi
cellulose khác.
1.1.3.Ứng dụng của endoglucanase
1.1.3.1Trong công nghiệp sản xuất cồn sinh học
Nhiên liệu sinh học thứ hai ra đời đã tận dụng được nguồn sinh khối
cellulose có nguồn gốc từ chất thải nông nghiệp, chất thải rừng, chất thải rắn
đô thị hoặc các loại phế phẩm như rơm, rạ, bã mía, vỏ trấu, cỏ… qua nghiền
sấy rồi lên men thành nhiên liệu sinh học.
Người ta nghĩ đến việc sử dụng sản phẩm phân hủy của cellulose để
làm nhiên liệu đốt cháy, đó là nhờ vi sinh vật sử dụng sản phẩm thủy phân
cuối cùng là glucose để chuyển hóa thành enthanol. Với nhiều nghiên cứu
hiện nay đã ứng dụng thành công bổ sung thêm enthanol vào xăng để làm
giảm ô nhiễm môi trường như ở Brazil đã sử dụng E85(nghĩa là 85% là
enthanol còn 15% là xăng) còn ở Việt Nam mới bắt đầu sử dụng E5(nghĩa là
% là ethanol còn lại là xăng) vào 2011 và đang trên đà phát triển.
1.1.3.2 Trong công nghiệp thực phẩm
Trong quá trình sản xuất nước quả và nước uống không cồn,dịch quả
sau khi ép chiết thường chứa các thành phần tế bào quả và các chất xơ có bản
chất là polysaccharide làm cho dịch có độ nhớt cao và đục. Glucanase thường
được sử dụng để phá vỡ thành tế bào, thủy phân các polysaccharide làm giảm

độ nhớt của dịch quả tạo thuận lợi cho quá trình tách chiết và làm trong.
Glucanase kết hợp với các hemicellulase, pectinase trong chế phẩm enzyme
Viscoenzyme được ứng dụng chủ yếu trong phá vỡ màng tế bào đậu tương21.
Trong công nghiệp sản xuất bia, ngoài các thành phần đường, protein,
dịch lên men còn có một lượng không nhỏ các phân tử khối lượng cao như
SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 7


cellulose và beta-glucan làm ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm. Người
ta thường sử dụng beta-glucanase để loại bỏ những thành phần này. Các chế
phẩm

cellulase

từ

A.

niger,

beta-glucanase

từ

Bacillus

subtilis,

Disporotrichum dimorphosporum đã được sử dụng trong sản xuất bia22.
Ngoài ra, endoglucanase còn được sử dụng trong công nghệ sản xuất
bánh mỳ, bánh quy và thực phẩm chức năng. Glucanase từ Humicola insolens
được ứng dụng trong sản xuất bánh mỳ, glucanase từ Trichoderma reesei, A.
niger được ứng dụng trong sản xuất fructooligosachcaride. Đây là một trong
số các oligosaccharide chức năng(probiotic) được sản xuất để bổ sung vào
khẩu phần ăn. Probiotic có nhiều lợi ích tốt đến sức khỏe như: ngăn cản quá
trình xâm nhập của các vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ các chức năng gan, làm
giảm cholesterol trong huyết thanh, tăng khả năng miễn dịch của cơ thể,
kháng lại bệnh ung thư, ức chế sự phát triển của các vi sinh vật trong miệng23.
1.1.3.3Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc
Chăn nuôi là một phần quan trọng của ngành nông nghiệp nói chung.
Thu nhập hàng năm từ chăn nuôi đạt 20% tổng giá trị kinh tế của ngành nông
nghiệp. Chăn nuôi cung cấp các loại thực phẩm như thịt, trứng, sữa hay phân
bón cho ngành trồng trọt. Để nâng cao năng suất vật nuôi, tăng hiệu quả chăn
nuôi mà vẫn bảo đảm an toàn cho môi trường xung quanh, đặc biệt là sức
khỏe cho con người, nhiều nghiên cứu về thức ăn cho gia súc có bổ sung thêm
các chế phẩm enzyme để tăng khả năng tiêu hóa, hấp thụ chất dinh dưỡng,
năng cao chất lượng vật nuôi. Thức ăn gia súc chủ yếu từ các loại ngũ cốc,
thóc, bã mía… có chứa nhiều cellulose và glucan, chất này làm hạn chế sự
hấp thụ chất dinh dưỡng, làm giảm khả năng tiêu hóa của động vật. Bổ sung
thêm beta-glucanase vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng phân giải các hợp chất
trên, giải phóng nhóm glucose và các oligosaccharide, làm giảm độ nhớt, tăng
khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn và nhiều nghiên cứu cho thấy khi bổ
sung beta-glucanase hoặc kết hợp với các enzyme khác làm tăng tốc độ sing
SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 8

trưởng và giảm bênh tật cho vật nuôi24.
1.1.3.4Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, nguyên liệu ban đầu được
nghiền cơ học và xử lý bằng phương pháp hóa học nhưng tốn kém và gây ô
nhiễm môi trường nên thay vì xử lý bằng phương pháp hóa học người ta bổ
sung glucanase vào công đoạn nghiền bột giấy để làm thay đổi cấu hình của
sợi cellulose25, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng
cho quá trình nghiền cơ học, đồng thời phá vỡ lớp vỏ ngoài của gỗ, làm tăng
khả năng khuếch tán hóa chất vào trong gỗ, tăng hiệu quả khử lignin. Trong
công nghiệp tái chế glucanase được sử dụng để tẩy vết mực trên giấy.
1.2.BIỂU HIỆN GEN ENDOGLUCANASE TRONG E. COLI
1.2.1Hệ biểu hiệnE. coli
Hiện nay có 5 hệ biểu hiện thường được sử dụng để biểu hiện gen như:
E coli, B. sutilis, nấm men (S. cerevisiae), tế bào động vật và tế bào thực vật.
Để thu được protein ngoại lai với hàm lượng lớn và hoạt tính tốt thì việc chọn
lựa hệ biểu hiện và vector biểu hiện phù hợp là quan trọng và cần thiết.E. coli
vẫn là một trong những đối tượng sử dụng rộng rãi hiện nay.
E. coli là vi khuẩn gram âm, có dạng hình que và được sử dụng phổ
biến trong các protein tái tổ hợp do có nhiều ưu điểm sau: có khả năng sinh
trưởng, phát triển nhanh trên môi trường nuôi cấy đơn giản của vi khuẩn như
LB (cứ 30 phút vi khuẩn E. coli lại sinh sản bằng hình thức phân đôi một lần),
chúng có khả năng thu nhận rất nhiều yếu tố di truyền vận động từ môi trường
ngoài như plasmid, phage…Các yếu tố di truyền này có thể tồn tại và tái bản
nhiều lần trong E. coli ở nhiệt độ 37oC. E. coli đã được nghiên cứu khá lâu
nên đã biết được cấu trúc di truyền và cách thức hoạt động của chúng cũng
như các quá trình phiên mã, dịch mã và quá trình sinh protein nội bào.
Bên cạnh đó, việc sử dụng vi khuẩn E. coli trong biểu hiện cũng có một
SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 9

số hạn chế sau: các gen mã hóa protein có kích thước lớn hơn 50 kDa, protein
giàu cystein hoặc những sản phẩm protein có liên kết disunfua (S – S) rất khó
biểu hiện trong tế bào E. coli,biểu hiện các loại protein không biến đổi cấu
trúc phân tử sau dịch mã và một số chủng E. coli có thể gây bệnh hoặc tạo
độc tố khi biểu hiện gen26.
1.2.2 Chủng biểu hiện E.coli BL21
Trong quá trình biểu hiện, protein ngoại lai mới sinh có thể bị phân giải
bởi các protease củaE. coli. Để giải quyết vấn đề này, người ta sử dụng biện
pháp đó là tạo chủng biểu hiện mang gen đột biến làm mất khả năng tổng hợp
protease. Với chủng biển hiện E. coli BL21 chứa đột biếnlonprotease (một
protease nội bào),opmTprotease (một protease ngoại bào) bị đột biến nênlàm
giảm khả năng thủy phân protein đáng kể.
Ngoài ra, DNA của hệ gen E. coli BL21 còn chứa gen mã hóa cho T7RNA polymerase. Đây là gen có nguồn gốc từ bacteriophage T7 được đưa
vào hệ gen của E. coli BL21 dưới sự điều khiển của promoter lac cảm ứng
IPTG. Chính nhờ những cải biến này mà E. coli BL21 đã trờ thành vật chủ
hiện hữu trong việc biểu hiện gen ngoại lai, đặc biệt la những gen được đưa
vào hệ vector pET (plasmid for Expression by T7 ARN polymerase).
1.3.3Vector biểu hiện pET22b(+)
Vector biểu hiện là vector có thể mang gen ngoại lai mong muốn, cho
phép thực hiện sự phiên mã của các bản sao được tạo dòng và sự dịch mã các
mARN của chúng trong hệ biểu hiện, từ đó tổng hợp protein mong muốn từ
gen ngoại lai. Vector có thể là ADN plasmid, phage hoặc cosmid. Đây là
những phân tử có khả năng phân đôi , phiên mã, dịch mã độc lập với vật chủ.
Ngoài ra, vector còn phải chứa gen mã hóa cho protein có chức năng làm dấu
hiệu chọn lọc. Gen thường sử dụng trong vector biểu hiện là gen kháng kháng
sinh. Gen này tạo điều kiện thuận lợi cho việc nhận biết các dòng tế bào mang
ADN plasmid.
SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 10


Hệ vector pET đã được Studier và các cộng sự thiết kế dựa trên cơ sở
hệ điều khiển promotor T7 mạnh có nguồn gốc từ bacteriophage T7, cho phép
biểu hiện gen tách dòng ở các tế bào chủ là vi khuẩn (E. coli, bacillus…) khi
có mặt chất cảm ứng IPTG27.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng vector pET22b(+) làm vector
biểu hiện. Vector pET22b(+) có chiều dài 5493 bp là vector được sử dụng chủ
yếu cho tách dòng và biểu hiện gen tái tổ hợp trong E. coli. Về cấu tạo, vector
này bao gồm:
- Trình tự khởi đầu sai chép (ori) là vị trí gắn của ADN polymerase,
quyết định số lượng bản sao trong vật chủ.
- Các trình tự mã hóa gen chỉ thị chọn lọc (AmpR) để đảm bảo sự suy trì
tồn tại của vector trong tế bào vi khuẩn đồng thời giúp chọn lọc các tế
bào mang plasmid.
- Vùng đa nối (multiple cloning site) có chứa điểm cắt của một số
enzyme hạn chế (Hind III, EcoR I, BamH I… ) để thuận tiện cho việc
đưa gen ngoại lai vào vector.
- Promoter T7 kiểm soát phiên mã để nhận biết tín hiệu khởi đầu phiên
mã, từ đó cho phép sản xuất một lượng lớn mARN từ các gen được
nhân dòng sau khi được cảm ứng.Khi trong môi trường không có chất
cảm ứng, gen lacI nằm trên hệ gen vi khuẩn được phiên mã sinh tổng
hợp protein LacI. LacI là chất ức chế, chúng có ái lực cao với lac
operon và bám chặt vào operator làm cho lac promoter điều khiển
phiên mã gen T7 RNA polymerase trong hệ gen chủng chủ và T7
promoter điều khiển phiên mã gen ngoại lai trên plasmid không hoạt
động. Khi được cảm ứng với IPTG, IPTG bám vào LacI làm thay đổi
hình dạng LacI không còn ái lực với lac operator nữa và rời khỏi phức

hợp với operator trên DNA hệ gen chủng chủ và plasmid. Kết quả là T7
ARN polymerase được tổng hợp từ hệ gen chủng chủ gắn với vùng
trình tự -35 và -10 của lacpromoter trên vector để khởi động phiên mã
SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 11


gen ngoai lai.
- Các trình tự kiểm soát dịch mã như điểm bám của ribosome được bố trí
thích hợp và codon khởi đầu ATG.

Hình 1. 3Vector pET22b(+)28

SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 12


CHƯƠNG 2 . NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2. 1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1Chủng vi sinh vật và plasmid
Chủng vi sinh vật :
- Chủng vi khuẩn E. coli DH10b (Invitrogen) kiểu gen: F– mcrA ∆(mrrhsdRMS-mcrBC) Φ80lacZ∆M15 ∆lacX74 recA1 endA1 araD139
∆(ara leu) 7697 galU galK rpsL nupG λ–được sử dụng trong thí
nghiệm để tách dòng.
- Chủng vi khuẩn E. coli BL21 (DE3)(Invitrogen) kiểu gen: F–
ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene
1 ind1 sam7 nin5]) được sử dụng trong thí nghiệm để biểu hiện gen.
Plasmid :

- Plasmid pJET1.2/blunt của hãng Fementas (Mỹ) mang toàn bộ gen mã
hóa endoglucanase (có vùng mã hóa tín hiệu tiết) có tên là pJET-wegc
do phòng Kỹ thuật di truyền thiết kế được sử dụng làm khuôn để
khuếch đại gen egc (không chứa trình tự mã hóa peptide tín hiệu) cho
biểu hiện gen.
- Plasmid pET22b(+) được sử dụng làm vector biểu hiện (Novagen).
Mồi dùng cho khuếch đại gen:
Mồi xuôi: 5'-accatggatgcctgtcgctggccagcatgggatc-3'
Mồi ngược: 5'-actcgagctgtgaacttgcgcattcctgg-3'
Mồi xuôi có thêm trình tự của enzyme hạn chế NcoI (CCATGG), mồi
ngược có thêm trình tự của enzyme hạn chế XhoI (CTCGAG).
2.1.2 Hóa chất, enzyme, máy móc và thiết bị
Hóa chất:
Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều được đặt mua từ các công ty
đạt tiêu chuẩn quốc tế như Bio-rad (Mỹ), Fementas (Mỹ), Sigma (Mỹ), Merck
(Đức) gồm có: SDS, Tris-HCl, EDTA, cao nấm men, bactor pepton, d-NTPs,
SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 13


phenol, methanol, isoamylalcohol, chloroform, ampicillin, ethidium bromide,
bis-acrylamide, TEMED, APS, sodium chloride, potassium acetate, agar,
dNTP, agarose, glycerol.
Enzyme:
Các loại enzme hạn chế (Bio-lab, Mỹ) XhoI, NcoI và T4 DNA ligase
(Bio-lab, Mỹ).
Máy móc và thiết bị:
Máy PCR (MJ Research, Mỹ), máy ly tâm lạnh bé (Sorvall RC5B,
Mỹ), máy ly tâm lạnh lớn (Sorvall RC5B, Mỹ), máy ổn nhiệt (Mỹ), máy điện

di (Bio-lab, Mỹ), máy UV (Bio-rad, Mỹ),máy khuấy từ, máy lắc ổn nhiệt
(New Jersey, Mỹ), máy siêu âm tự động, bể ổn nhiệt, cân phân tích (Precisa,
Thụy Sĩ), cân điện tử (Precisa, Thụy Sĩ), máy đo pH (Metler, Thụy Sĩ), máy
hút chân không (Savant, Mỹ), tủ box cấy.
2.1.3.Dung dịch và môi trường nuôi cấy
2.1.3.1 Môi trường và dung dịch sử dụng để biến nạp và biểu hiện
Môi trường:
- Môi trường Luria-Bertani (LB) lỏng: 0,5% cao nấm men; 1% peptone;
0,1% NaCl.
- Môi trường chọn lọc LBA lỏng: môi trường LB bổ sung ampicillin đến
nồng độ cuối cùng là 100 µg/ml.
- Môi trường chọn lọc LBA đặc: tương tự môi trường LB lỏng nhưng
thêm agar 1,5%.
Dung dịch: CaCl20,1 M vô trùng, giữ ở 4oC.
2.1.3.2 Dung dịch được sử dụng để tách chiết ADN plasmid từ tế
bào E. coli
- Dung dịch I (Sol I): 50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM
EDTA, pH 8,0.
SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 14


- Dung dịch II (Sol II): 0,2 N sodium hydroxide; 1% SDS.
- Dung dịch III (Sol III): 3 M potassium acetate; 11,5% acetic acid.
- Dung dịch I và III được giữ ở 4oC; dung dịch II được chuẩn bị trước
khi sử dụng.
- TE: 1 M Tris-HCl, pH 8,0; 0,5 M EDTA, pH 8.
- Dung

dịch

phenol/chloroform/isoamylalcohol:

50

phenol:

49

chloroform: 1 isoamylalcohol.
- Gel agarose 0,8%: 0,8 g bột agarose pha trong 100 ml TAE 1 lần.
2.1.3.3 Dung dịch được sử dụng trong điện di ADN trên gel
agarose
- Dung dịch đệm TAE 50 lần (100 ml): 24,2 g Tris-base; 5,71 ml glacial
acetic acid; 10 ml EDTA 0,5 M, pH 8,0.
- Đệm tra mẫu (6 lần) (loading dye): 0,25% bromophenol blue; 0,25%
xylen cyanol FF; 30% glycerol.
- Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide (EtBr) 0,5 µg/ml.
2.1.3.4 Dung dịch sử dụng trong điện di SDS-PAGE
- Bis-acrylamide 30%: 30 g acrylamide và 0,8 g bis- acrylamide hòa tan
trong 100 ml nước cất vô trùng, bảo quản ở 4oC.
- Đệm Tris 1,5 M pH 8,8: Tris 0,75 M; 0,2% SDS và dùng HCl để chỉnh
đến pH 8,8.
- Đệm Tris 0,5 M pH 6,8: Tris 0,25 M; 0,2% SDS và dùng HCl để chỉnh
đến pH 6,8.
- SDS 10% (100 ml): 10 g SDS và bổ sung nước cất cho đến thể tích
100 ml.
- Đệm chạy điện di: 0,05 M Tris; 0,192 M glycine; 0,1% SDS.
- APS 10%: 10 mg ammonium persulfate bổ sung nước cất cho đến 100

ml.
- TEMED: Sử dụng dung dịch đậm đặc mua từ công ty hóa chất.
SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 15


- Đệm xử lý mẫu 6X: 7 ml Tris-HCl 1 M, pH, 6,8; 3 ml glycerol 100%;
1 g SDS; 0,6 ml 2-mercapto-ethanol; 1,2 mg bromophenol.
- Dung dịch nhuộm gel (Coomassie blue staining) (100 ml): 0,025 g
Coomassie brilliant blue; 40 ml ethanol; 10ml axit axetic và bổ sung
nước đến 100 ml.
- Dung dịch tẩy gel (Destaining): 30% methanol và 10% axit axetic.
- Sau khi đã chuẩn bị gel điện di protein, bắt đầu tiến hành đổ lần lượt
gel tách trước, khi đổ tránh sao không để tạo bọt khí, sau đó bổ sung
nước lên trên bề mặt gel để tránh hiện tượng gel bị oxi hóa và giúp cho
bề mặt gel được phẳng. Sau khoảng 30 phút gel đông, đổ hết nước trên
bề mặt gel và gài lược để tiếp tục đổ gel cô.
Bảng 1 Thành phần điện di protein

Thành phần

dd H2O
Tris-HCl pH
6,8
Tris-HCl pH
6,8
Glycerol 50%
Acrylamid
30%

SDS 10%
APS 10%
TEMED
Tổng

Gel tách
biến tính
12,5%
0,55 ml
-

Gel cô biến
tính 5%
0,45 ml
0,2 ml

Gel tách
không biến
tính 9%
1,125 ml
-

Gel cô
không biến
tính 5%
0,454 ml
0,2 ml

1,125 ml
0m9 ml

-

1,125 ml
0,9 ml

-

1,89 ml

0,14 ml

1,36 ml

0,14 ml

45 µl
30 µl
3 µl
4.543 ml

4 µl
8 µl
1 µl
0,803 ml

30 µl
3 µl
5,245 ml

8 µl
1 µl
0,803 ml

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)
Cơ sở lý thuyết của phương pháp
PCR là một phương pháp hiệu quả để tạo ra số lượng lớn trình tự DNA
đặc hiệu in vitro. Sự nhân bội này, có thể lên tới một triệu lần, được tạo bởi
SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 16


một quá trình có chu kỳ gồm ba bước. Các thành phần cần thiết cho phản ứng
nhân bội PCR là (1) hai mồi oligonucleitide tổng hợp (~20 nucleotide mỗi
mồi) bổ sung với các vùng trên các sợi đối nhau, các vùng này nằm ở hai đầu
của trình tự DNA đích và sau khi ủ ghép với DNA khuôn; (2) một trình tự
đích trong mẫu DNA nằm giữa cặp mồi và có thể dài từ 100 đến 3500 bp; (3)
một DNA polymerase bền nhiệt, có thể chịu được nhiệt độ từ 95oC trở lên; và
(4) bốn deoxyribonuclotide29,26.
Các bước PCR được thực hiện theo sơ đồ sau:

94oC
4 phút

94oC
30 giây

72oC

72oC

90 giây

7 phút

50oC

4oC

1 phút
30 chu kỳ

Thành phần của phản ứng
Một mẫu phản ứng PCR được tiến hàn trong tổng thể tích 100 µl gồm
các thành phần sau:
Bảng 2 Thành phần PCR

Tổng
H2 O
Đệm PCR 10X
dNTP 2 mM
MgCl2 25 mM
Mồi xuôi 10 pmol
Mồi ngược 10 pmol
Plasmid (0,2 ng)
Vent (10 u/ul)

SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

100 µl
53
10
5
5
10
10
5
2

Page 17


2.2.2 Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose bằng QIAquick Gel
Extration kit

Các bước tiến hành được thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit tinh sạch
DNA Quiagene – QIAquick Gel Extration kit30.
Quy trình

1. Vùng gel có chứa DNA đích được cắt và cho vào ống eppendorf 2
ml sạch.
2. Bổ sung đệm gắn – QG vào gel sao cho cứ 100 mg agarose bổ sung
300µl, sau đó ủ hỗn hợp ở 50oC cho đến khi tan hết.
3. Dùng pipet hút hỗn hợp cho lên cột, ly tâm 13000 vòng/phút trong
1 phút.
4. Bổ sung 700 µl dịch rửa lên cột và ủ 30 giây ở nhiệt độ phòng, sau
đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để loại hoàn toàn ethanol ra
khỏi cột.

5. Sau đó chuyển cột sang ống eppendorf 2 ml mới , bổ sung ít nhất 30
µl nước khử trùng ion vô trùng, ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút và ly
tâm 13000 vòng/phút trong 1phút và thu dịch DNA
6. Sản phẩm tinh sạch được điện di kiểm tran trên gel agarose.
2.2.3 Điện di ADN trên gel agarose

Cơ sở lý thuyết của phương pháp
Trong môi trường có pH trung tính, ADN mang điện tích âm. Do đó, khi
được đặt trong một điện trường đều, ADN sẽ di chuyển từ cực âm sang cực
dương. Trên môi trường chất giá agarose, các đoạn ADN có kích thước khác
nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau (đoạn ADN có kích thước lớn hơn sẽ
di chuyển chậm hơn) và sẽ tách biệt nhau trong quá trình chạy.
Quy trình
Chuẩn bị gel agarose
- Cân bột agarose rồi hoà tan vào đệm TAE 1X sao cho được nồng độ
0,8%
- Đun sôi dịch agarose cho đến khi tan hết và để dịch nguội đến khoảng
SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203

Page 18