Phân lập và biểu hiện gen mã hóa yếu tố đông
máu IX của người ở vi khuẩn E. coli
Nguyễn Văn Phòng
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn Thạc sĩ ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30
Người hướng dẫn: PGS.TS. Nông Văn Hải
Năm bảo vệ: 2012
Abstract: Tách chiết được RNA tổng số từ mô gan sinh thiết của người. Phân lập
được đoạn cDNA mã hóa yếu tố đông máu IX từ mô người. Thiết kế được vector biểu
hiện mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX của người. Chuyển và biểu
hiện vector mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX của người ở vi khuẩn
E. coli.
Keywords: Sinh học phân tử; Gen mã hóa; Di truyền học hóa sinh
Content
MỞ ĐẦU
“Thu hẹp khoảng cách - Kết nối cộng đồng” là thông điệp được đưa ra tại Lễ mít tinh
hưởng ứng ngày Hemophilia thế giới (17/4/) diễn ra tại Hà Nội, với mong muốn cải thiện tình
hình chăm sóc bệnh nhân bị bệnh Hemophilia (hay còn gọi là bệnh máu khó đông) trên phạm
vi toàn cầu, hướng tới mục tiêu tất cả người bệnh máu khó đông đều có cơ hội được điều trị
và chăm sóc tốt. Ở Việt Nam, theo thống kê của Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương
ước tính hiện nay có khoảng 6.000 bệnh nhân bị bệnh Hemophilia, trong đó mới chỉ 20%
bệnh nhân được phát hiện và chăm sóc thường xuyên. Hemophilia là một rối loạn chảy máu di
truyền do bất thường gen gây nên, bệnh nhân bị chảy máu khó cầm ở khắp các bộ phận trên
cơ thể, đặc biệt là cơ và khớp. Bệnh xuất hiện do cơ thể thiếu hụt hoặc không có đủ các yếu tố
làm đông máu, thường gặp là yếu tố VIII (hemophilia A) và IX (hemophilia B).
Trên thế giới, việc nghiên cứu và sử dụng các thuốc giúp làm máu đông nhanh để điều
trị bệnh Hemophilia bằng công nghệ sinh học đã được bắt đầu từ cuối năm 1980. Cho tới nay,
việc áp dụng những kỹ thuật hiện đại của công nghệ gen và protein để phân lập và tách dòng
cDNA nhằm sản xuất các chể phẩm protein tái tổ hợp VIII và IX trong các tế bào vi khuẩn và
tế bào động vật đã phát triển vượt bậc. Người ta đã sản xuất được các chế phẩm VIII và IX có
giá trị trong điều trị với giá thành hạ, sản lượng tăng, độ tinh sạch cao đáp ứng những nhu
cầu cấp bách của thực tiễn.
Cho đến nay, ở nước ta vẫn chưa có một công bố hay đề tài nào về nghiên cứu sản xuất
yếu tố đông ma
́
u IX tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn hay tế bào động vật được thực hiện . Do
2
như
̃
ng nhu cầu cấp thiết trong điều tri
̣
bê
̣
nh Hemophilia , chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề
tài nghiên cứu: “Phân lập và biểu hiện gen mã hóa yếu tố đông máu IX của người ở vi
khuẩn E. coli”, nhằm tạo ra một bước tiền đề hướng tới việc nghiên cứu và phát triển chế
phẩm yếu tố đông máu IX tái tổ hợp, góp phần vào việc chăm sóc sức khỏe bệnh nhân
Hemophilia trong tương lai.
Đề tài thực hiện với mục tiêu cụ thể sau:
1. Tách chiết được RNA tổng số từ mô gan sinh thiết của người.
2. Phân lập được đoạn cDNA mã hóa yếu tố đông máu IX từ mô người.
3. Thiết kế được vector biểu hiện mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX
của người.
4. Chuyển và biểu hiện vector mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX của
người ở vi khuẩn E. coli.
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về bệnh Hemophilia
1.1.1. Giới thiệu chung về bệnh Hemophilia
Hemophilia là một bệnh rối loạn đông máu di truyền mà trong dân gian thường hay
gọi là “bệnh máu loãng”, “bệnh máu không đông” hoặc “bệnh máu khó cầm”. Bệnh này đặc
trưng bởi sự thiếu hụt hoặc không có một trong các protein cần thiết cho quá trình đông máu.
Một số người mắc bệnh Hemophilia do thiếu hụt yếu tố đông máu VIII, được gọi là
Hemophilia A. Một số khác do thiếu yếu tố đông máu IX, được gọi là Hemophilia B. Ngoài
ra, có tỷ lệ rất hiếm người mắc bệnh Hemophilia C, bệnh do thiếu hụt yếu tố đông máu XI.
1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh Hemophilia
Hemophilia là bệnh rối loạn chảy máu di truyền, được gây ra bởi đột biến trong các
gen mã hóa cho các yếu tố đông máu VIII, IX và XI. Tuy nhiên, có khoảng 30% trường hợp
mắc bệnh Hemophilia được sinh ra từ một gia đình không có tiền sử về bệnh Hemophilia
trước đó.
1.1.3. Phân loại Hemophilia
Bệnh Hemophilia có thể được chia làm 3 loại chính: Hemophilia A, Hemophilia B và
Hemophilia C.
1.1.4. Biểu hiện của bệnh Hemophilia
Biểu hiện của bệnh rất đa dạng: chảy máu bất thường, tự nhiên hoặc sau phẫu thuật, có
thể xảy ra ở bất cứ vị trí nào trên cơ thể tuy nhiên cơ và khớp thường hay bị chảy máu hơn
đến nỗi nhiều người bệnh nhầm tưởng là bệnh của cơ, khớp.
1.1.5. Phƣơng pháp điều trị bệnh Hemophilia
3
Đến nay, bệnh này vẫn chưa thể điều trị tận gốc. Người bệnh phải phụ thuộc vào các
loại thuốc đặc trị và bổ sung suốt đời các yếu tố đông máu lấy từ nguồn máu hiến và họ có thể
chung sống với bệnh.
1.2. Vai trò của yếu tố đông máu IX trong quá trình đông máu
Được tổng hợp chủ yếu ở gan sau đó được tiết vào máu, yếu tố đông máu IX đóng vai
trò rất quan trọng trong việc hoạt hóa yếu tố đông máu X thành dạng hoạt hóa Fxa.
1.3. Cấu trúc gen mã hóa yếu tố đông máu IX
Gen FIX là gen mã hóa cho yếu tố đông máu IX (human factor IX, protein FIX), nằm
trên cánh tay dài của nhiễm sắc thể giới tính X tại vị trí Xq27.1. Gen FIX có kích thước
khoảng 34 kb gồm 8 exon và 7 intron.
1.4. Cấu trúc và những biến đổi sau dịch mã của yếu tố đông máu IX
1.4.1. Cấu trúc của phân tử protein FIX
Ở người, phân tử protein FIX là một protein phụ thuộc vào vitamin K, tham gia vào
quá trình đông máu. Phân tử protein FIX được tổng hợp ở các tế bào của mô gan dưới dạng
một protein tiền chất của một serine protease-FIXa. Sau khi được tổng hợp, protein tiền chất
này là một chuỗi polypeptide đơn gồm 461 amino acid, khối lượng khoảng 56 kDa.
1.4.2. Những biến đổi sau dịch mã của phân tử protein FIX
1.5. Sự hoạt hóa yếu tố đông máu IX
Để yếu tố đông máu IX (protein FIX) trở thành một protease chức năng trong quá
trình đông máu, đoạn peptide hoạt hóa phải được loại bỏ khỏi chuỗi polypeptide của protein
FIX tiền chất. Phân tử protein FIX có thể được hoạt hóa trở thành dạng protease (protein
FIXaβ) bởi phức hợp TF/FVIIa hoặc FXIa (dạng hoạt hóa của yếu tố XI) cùng với sự có mặt
của màng phospholipid và ion Ca
2+
.
1.6. Vector biểu hiện pET32a
Vector pET32a là một vector thuộc hệ vector pET của hãng Novagen. Đây là vector
được thiết kế với mục đích để chọn dòng và biểu hiện ở mức độ cao của các gen ngoại lai ở vi
khuẩn E. coli. Vector pET32a (5.900 bp) thường được sử dụng với mục đích chính là biểu
hiện gen.
1.7. Chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3)
E. coli BL21 là chủng được bắt nguồn từ E. coli B, được phát hiện vào năm 1946. E.
coli là vi khuẩn Gram âm, kị khí tùy tiện và không sinh bào tử. Tế bào E. coli có khả năng
sinh sản với tốc độ nhanh trên môi trường nuôi cấy tối thiểu, trung bình khoảng 20 phút chúng
lại phân chia một lần.
1.8. Các hệ thống biểu hiện dùng trong tạo protein tái tổ hợp
4
Đối với dược phẩm sinh học tái tổ hợp, hệ thống biểu hiện có thể là hệ thống nhân sơ
(prokaryote) hoặc nhân chuẩn (eukaryote).
1.9. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Hướng nghiên cứu biểu hiện gen/protein có giá trị để tiến tới sản xuất sinh phẩm sử
dụng trong y dược là hướng rất quan trọng, cấp thiết mới được tiếp cận nghiên cứu ở nước ta
trong thời gian gần đây.
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
Mẫu nghiên cứu
Các mẫu gan sinh thiết được lấy từ những người Việt Nam khỏe mạnh do bệnh viện K
cung cấp.
Chủng vi sinh vật
Chủng E.coli DH5α của hãng Invitrogen được sử dụng để chọn dòng và nhân dòng
gen.
Chủng E. coli BL21(DE3) của hãng Bio-Rad được sử dụng để biểu hiện gen mã hóa
yếu tố đông máu IX ở người.
Các vector
Vector tách dòng: pJET1.2/blunt (Fermentas).
Vector biểu hiện: pET32a (Novagen).
Các cặp mồi
Các cặp mồi dùng để phân lập, chọn dòng và biểu hiện gen được thiết kế dựa trên trình
tự cDNA chuẩn công bố trên Genbank (NM_000133) và đặt tổng hợp hãng IDT (Mỹ) có trình
tự như sau:
Bảng 1. Trình tự các cặp mồi được sử dụng.
STT
Tên mồi
Trình tự nucleotide
1
FIX-F1
5’- GCT AGC AAA GGT TAT GCA GCG C- 3’
FIX-R1
5’- GGA AAT CCA TCT TTC ATT AAG TG- 3’
2
FIX-F4-NcoI
5’-TTC TGG TGC ACC ATG GTT TTT CTT GAT CAT GAA
AAC GCC-3’
FIX-R5-
XhoI
5’- ATATG CTC GAG TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG
AGT GAG CTT TGT TTT TTC C- 3’
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thiết kế cặp mồi (F1/R1) để nhân toàn bộ cDNA mã
hóa FIX từ mRNA được tách từ mô gan sinh thiết ở người. Trong khi biểu hiện, chúng tôi
thiết kế cặp mồi (F4/R5) với mục đích nhân đoạn cDNA mã hóa FIX với chuỗi polypeptide
cắt vùng tín hiệu tiết (signal peptide) ở đầu N để biểu hiện đoạn cDNA này trong tế bào vi
khuẩn E. coli. Protein mã hóa từ cDNA được nhân với cặp mồi (F4/R5), kí hiệu là FIX
noSP
.
Hóa chất
5
Các enzyme giới hạn NcoI, XbaI, XhoI ; các hóa chất dùng cho kỹ thuật PCR (đệm,
MgCl
2
, dNTPs, enzyme Taq DNA polymerase, enzyme Pfu DNA polymerase được đặt mua
tại hãng Fermentas.
Các hóa chất dùng để tách RNA, DNA plasmid hay điện di protein của hãng
Amersham Bioscien (Anh), BioRad (Mỹ), Sigma (Mỹ), Merk (Đức).
Các bộ Kit tổng hợp cDNA, tinh sạch sản phẩm PCR, tinh sạch DNA plasmid của
hãng Promega (Mỹ), Invitrogen (Mỹ).
Trang thiết bị
Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng các trang thiết bị của Viện Công
nghệ Sinh học, Viện Nghiên cứu hệ gen.
2.2. Phƣơng pháp
2.2.1. Tách chiết RNA tổng số
Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô gan sinh thiết người bằng Trizol.
2.2.2. Tổng hợp cDNA
cDNA sợi một được tổng hợp từ khuôn RNA tổng số được tiến hành theo hướng dẫn
của Kit tổng hợp cDNA SuperScript
TM
First-Strand Synthesis System for RT-PCR
(Invitrogen).
2.2.3. Nhân đoạn cDNA bằng phản ứng PCR
2.2.4. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose
2.2.5. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế
Sử dụng các enzyme giới hạn cắt phân tử DNA thành hai mảnh dạng đầu bằng hay đầu
dính tại các vị trí xác định nhờ trình tự nhận biết đặc hiệu.
2.2.6. Tinh chế các đoạn DNA trên gel agarose
Các sản phẩm PCR bằng cách điện di chúng trên gel 0,8% agarose, sau đó cắt phần gel
có băng DNA mong muốn và thu lại DNA bằng Kit tinh sạch Wizard
®
SV.
2.2.7. Ghép nối DNA
Dưới sự xúc tác của enzyme T4 DNA ligase, các cầu nối phosphodieste sẽ được hình
thành giữa hai nucleotide sát cạnh nhau trên cùng một mạch (gốc phosphat đầu 5’ của
nucleotide đoạn DNA này với gốc hydroxyl đầu 3’ của nucleotide của đoạn DNA kia), đồng
thời giải phóng một phân tử nước.
2.2.8. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phƣơng pháp sốc nhiệt
Dưới tác dụng của CaCl
2
0,1 M, thành tế bào vi khuẩn E.coli đang ở giai đoạn sinh
trưởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho DNA có thể chui qua các lỗ xốp trên màng tế bào chất
khi thay đổi nhiệt độ đột ngột.
2.2.9. Tách chiết DNA plasmid
6
Phương pháp tách chiết DNA plasmid dựa trên nguyên lý sử dụng các hóa chất (SDS,
NaOH) có tác dụng phá vỡ cấu trúc thành tế bào vi khuẩn, biến tính các phân tử protein và
giải phóng các plasmid của vi khuẩn.
2.2.10. Xác định trình tự DNA
Trình tự nucleotide quan tâm được xác định trên nguyên tắc của phương pháp Sanger.
2.2.11. Biểu hiện gen mã hóa cho protein FIX
Sau khi các plasmid tái tổ hợp (pET32a; pET32a/FIX
noSP
) được biến nạp vào chủng E.
coli BL 21(DE3), chọn các khuẩn lạc phát triển tốt nhất trên đĩa môi trường chọn lọc LBA và
nuôi cấy lắc qua đêm vào môi trường LBA qua đêm ở 37
o
C, 200 vòng/phút. Hòa dịch nuôi
cấy qua đêm vào môi trường LBA theo tỷ lệ 1% và nuôi cấy ở cùng điều kiện trên trong
khoảng thời gian 2h đến khi OD
600nm
của dịch tế bào đạt 0,6 - 0,8 thì bổ sung IPTG vào môi
trường nuôi cấy với nồng độ cuối cùng là 0,5 mM. Nuôi tiếp tục khoảng 3h ở 37
o
C, 200
vòng/phút để tổng hợp FIX
noSP
-Trx. Mẫu tế bào được thu ở các thời điểm 0h, 1h và 3h sau
cảm ứng. Tế bào được thu bằng cách ly tâm 6.000 vòng/phút trong thời gian 5 phút. Màng
ngoài tế bào được phá bằng siêu âm. Mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp được kiểm tra
bằng điện di SDS-PAGE.
2.2.12. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE
SDS-PAGE được thực hiện theo phương pháp của Laemmli UK, 1970 với các thiết bị
của hãng Bio-Rad. Để phân tách các protein có trọng lượng từ 12 - 68 kDa, chúng ta sử dụng
gel ở nồng độ 12,6% (w/v).
2.3.1. Sơ đồ thí nghiệm
Nội dung nghiên cứu được chia làm hai phần và thực hiện qua các bước sau:
a. Phân lập gen mã hóa yếu tố đông máu IX từ mô gan sinh thiết ở người.
b. Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa FIX
noSP
và biểu hiện trong tế bào vi
khuẩn E. coli BL21(DE3).
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập gen mã hóa yêu tố đông máu IX ở ngƣời
3.1.1. Thu thập mẫu mô gan sinh thiết ngƣời
Do yếu tố đông máu IX người được tổng hợp chủ yếu ở các tế bào mô gan nên chúng
tôi đã chọn mô gan làm nguyên liệu nghiên cứu. Phối hợp với Bệnh viện K, chúng tôi đã chọn
được mẫu mô gan sinh thiết từ 2 trong số 7 người.
3.1.2. Tách chiết RNA tổng số
Sản phẩm RNA tổng số tách chiết từ 2 mẫu mô gan sinh thiết bằng phương pháp trizol
được điện di biến tính trên gel agarose 1% (Hình 1). Kết quả điện di thể hiện rõ các băng 28S,
18S và 5S rRNA, không có hiện tượng bị phân hủy do quá trình tách chiết.
7
Hình 1. Điện di đồ sản phẩm RNA tổng số trên gel agarose 1%.
1 - 2: Sản phẩm RNA tổng số của 2 mẫu mô gan sinh thiết người.
Như vậy, chúng tôi đã tách chiết được RNA tổng số từ 2 mẫu mô sinh tiết gan ở
người. Mẫu RNA tổng số tách từ mẫu mô gan sinh thiết của Lương Mỹ H. được sử dụng làm
nguyên liệu cho việc tổng hợp cDNA mã hóa FIX ở người.
3.1.3. Tạo dòng và xác định trình tự gen FIX
Thiết kế cặp mồi và PCR
Trên cơ sở trình tự mRNA mã hóa protein FIX của người đã công bố trên Ngân hàng
trình tự gen Quốc tế GENBANK/DDBJ/EMBL (mã số NM_000133), chúng tôi đã thiết kế
cặp mồi nhân cDNA mã hóa FIX là F1/R1.
Sản phẩm RT-PCR sau đó được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose
0,8% (Hình 2). Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR thu được một băng đặc hiệu có kích
thước khoảng 1,4 kb phù hợp với kích thước tính toán lý thuyết của cDNA mã hóa cho FIX.
Như vậy, sản phẩm PCR đã đạt độ đặc hiệu về kích thước và đảm bảo về nồng độ để sử dụng
cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 2. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen cDNA mã hóa FIX
trên gel agarose 0,8%.
M: Marker 1 kb (Fermentas); 1: Sản phẩm PCR nhân gen FIX.
Tạo dòng đoạn cDNA mã hóa protein FIX trong vector pJET1.2
Để tạo cơ sở cho thí nghiệm thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa cho FIX,
chúng tôi đã tiến hành tạo dòng phân tử sản phẩm RT-PCR (tức là nhân bản chúng trong tế
bào chủ dưới dạng một plasmid tái tổ hợp mang đoạn cDNA này).
8
Tinh sạch sản phẩm PCR và gắn vào vector tách dòng
Tách chiết DNA plasmid
Chúng tôi đã tiến hành tách chiết plasmid từ 11 khuẩn lạc. Sản phẩm tách chiết
plasmid được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 3). Các plasmid có kích
thước lớn hơn kích thước của plasmid đối chứng âm là các plasmid có khả năng mang sản
phẩm RT-PCR.
Từ kết quả điện di sản phẩm DNA plasmid, chúng tôi có thể sơ bộ kết luận các dòng
vi khuẩn (2, 4 và 9) chứa plasmid tái tổ hợp mang đoạn sản phẩm RT-PCR.
Hình 3. Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 0,8%.
1: Đối chứng âm (vector pJET1.2 không mang đoạn đoạn sản phẩm RT-PCR); 2- 12:
Plasmid tái tổ hợp của 3 dòng vi khuẩn mang (giếng số 2, 4 và 9) và không mang sản
phẩm RT-PCR (giếng số 3, 5, 6, 7, 8, 10, 11 và 12).
Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme hạn chế
Hình 4. Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp mang cDNA của gen FIX
bằng enzyme hạn chế XbaI và XhoI.
M: Marker 1kb (Fermentas); 1: Sản phẩm PCR của cDNA mã hóa FIX; 2, 3, 4: Sản phẩm xử
lý pJET1.2/FIX_p18; pJET1.2/FIX_p19, pJET1.2/FIX_p22 bằng XbaI + XhoI; 5: Sản phẩm
xử lý pJET1.2/XbaI + XhoI.
Chúng tôi đã tiến hành xử lý plasmid của các dòng số hai, bốn và chín (ký hiệu: dòng
pJET1.2/FIX_p18, pJET1.2/FIX_p19 và pJET1/FIX_p22) bằng hai enzyme hạn chế XbaI và
XhoI. Kết quả cho thấy, plasmid của 3 dòng này khi được xử lý bằng hai enzyme nói trên đã
cho hai băng: một băng có kích thước khoảng 3,0 kb (tương đương với kích thước của vector
pJET1.2) và một băng có kích thước khoảng 1,4 kb (tương đương kích thước của sản phẩm
PCR) (Hình 4).
9
Như vậy, đoạn cDNA mã hóa cho protein FIX đã được tách dòng thành công trong
vector pJET1.2. Các plasmid tái tổ hợp được tách chiết với lượng lớn và được tinh sạch cho
phản ứng xác định trình tự.
Trình tự nucleotide của FIX
Để khẳng định chính xác sản phẩm tách dòng là đoạn cDNA của gen FIX, sản phẩm
được tiếp tục xác định trình tự nucleotide. Sau khi phân tích trình tự cả 3 dòng plasmid tái tổ
hợp, đoạn cDNA có chiều dài 1386 bp, khung dịch mã được xác định mã hóa yếu tố đông
máu IX gồm 461 amino acid kể cả mã kết thúc.
Khi so sánh trình tự cDNA đầy đủ của gen FIX được phân lập từ mô gan sinh thiết của
người Việt Nam với trình tự trên ngân hàng GenBank (NM_000133), chúng tôi thấy ở dòng
p19 có độ tương đồng là 100% ở cả mức độ nucleotide và amino acid.
3.2. Thiết kế vector biểu hiện FIX (pET32a/FIX
noSP
)
3.2.1. Khuếch đại cDNA mã hóa FIX
noSP
Trong nghiên cứu này, vector pJET1.2/FIX_p19 đã được sử dụng làm khuôn để nhân
bản gen cần biểu hiện. Trên cơ sở trình tự mRNA mã hóa FIX của người công bố trên Ngân
hàng trình tự gen Quốc tế GenBank (NM_000133), chúng tôi đã thiết kế cặp mồi nhân cDNA
mã hóa FIX
noSP
là F4/R5. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
Kết quả điện di được thể hiện ở Hình 5.
Kết quả điện di đồ cho thấy, sản phẩm PCR thu được có kích thước phân tử khoảng
1,3 kb, kích thước này phù hợp với kích thước tính toán lý thuyết. Băng sản phẩm PCR sáng,
đậm và rõ nét đủ điều kiện cho việc tạo dòng vector tái tổ hợp. Sản phẩm PCR này được xử lý
với enzyme hạn chế NcoI và XhoI, sau đó tinh sạch trước khi sử dụng để tiến hành ghép nối
gen.
Hình 5. Ảnh điện di đồ sản phẩm PCR nhân cDNA mã hóa FIX
noSP
.
M: Marker 1 kb (Fermentas); 1 : Sản phẩm PCR của cDNA mã hóa FIX
noSP
nhân từ khuôn là
pJET1.2/FIX (p19).
3.2.2. Ghép nối cDNA mã hóa FIX
noSP
vào vector biểu hiện pET32a
Vector pET32a và sản phẩm PCR sau khi được xử lý với hai enzyme hạn chế (NcoI và
XhoI) sẽ được tinh sạch và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trước khi thực hiện phản
ứng ghép nối với nhau (Hình 6).
10
Hình 6. Ảnh điện đi đồ sản phẩm PCR và vector pET32a sau khi
tinh sạch trên gel agarose 0,8%.
M: Marker 1 kb (Fermentas); 1: Sản phẩm PCR (FIX
noSP
)/ (NcoI và XhoI); 2: Vector
pET32a/( NcoI và XhoI).
Trên cơ sở kết quả điện di (Hình 6), vector pET32a và cDNA mã hóa FIX
noSP
được
ghép nối với nhau nhờ xúc tác của enzyme T4 DNA ligase. Sản phẩm phản ứng ghép nối gen
được biến nạp vào tế bào E.coli DH5 bằng phương pháp sốc nhiệt và chọn lọc trên môi
trường có bổ xung kháng sinh Amp với nồng độ 100 μg/ml. Kết quả, chúng tôi đã nhận được
một số dòng khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp.
3.2.3. Kiểm tra sự có mặt của cDNA mã hóa FIX
noSP
trong vector pET32a
Để xác định các dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp mong muốn, chúng tôi tiến hành
chọn lọc các khuẩn lạc mọc trên môi trường có kháng sinh Amp, nuôi cấy thu sinh khối để
tách DNA plasmid của các khuẩn lạc, cắt kiểm tra các plasmid tái tổ hợp bằng enzyme hạn
chế (NcoI và XhoI) và giải trình tự gen.
a. Tách chiết DNA plasmid
Chúng tôi tiến hành nhặt 5 khuẩn lạc và sản phẩm tách chiết plasmid được kiểm tra
bằng điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 7). Từ kết quả điện di sản phẩm DNA plasmid,
chúng tôi thấy cả 5 dòng vi khuẩn (2 3, 4 và 5) đều có kích thước lớn hơn kích thước đối
chứng (1). Từ đó, chúng tôi có thể sơ bộ kết luận 5 dòng vi khuẩn này chứa plasmid tái tổ hợp
mang đoạn cDNA mã hóa FIX
noSP
.
Hình 7. Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 0,8%.
1: Đối chứng âm (vector pET32a không mang đoạn DNA ngoại lai); 2 - 6: DNA plasmid
của 5 dòng vi khuẩn.
b. Kiểm tra các plasmid bằng enzyme giới hạn
11
Hình 8. Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng
enzyme hạn chế trên gel agarose 0,8%.
M: Marker 1kb; 1: Sản phẩm PCR của cDNA mã hóa FIX
noSP
;
2 - 4: Sản phẩm xử lý pET32a/ FIX
noSP
với enzyme NcoI +
XhoI; 5: Sản phẩm xử lý pET32a với enzyme NcoI + XhoI.
Từ kết quả điện di sản phẩm DNA plasmid Hình 7, chúng tôi tiến hành lựa chọn 3
trong 5 dòng vi khuẩn này để cắt kiểm tra bằng hai enzyme hạn chế (NcoI và XhoI) để kiểm
tra kích thước đoạn chèn (Hình 8). Kết quả trên ảnh điện di Hình 8 cho thấy, tại các đường
chạy số 2, 3 và 4 xuất hiện các băng có kích thước đúng như tính toán. Từ đó, chúng tôi có thể
kết luận rằng đã thành công trong việc thiết kế vector biểu hiện pET32a/FIX
noSP
.
c. Kiểm tra độ chính xác trình tự nucleotide của đoạn cDNA mã hóa FIX
noSP
trong
vector tái tổ hợp pET32a/FIX
noSP
Chúng tôi đã lựa chọn một trong số ba dòng plasmid tái tổ hợp đã được cắt kiểm tra
thành công bằng enzyme trước đó để tiến hành giải trình tự nucleotide và so sánh với trình tự
cDNA (GenBank: NM_000133). Sau khi phân tích trình tự dòng plasmid tái tổ hợp này, đoạn
cDNA mã hóa FIX
noSP
có kích thước 1302 bp và khung dịch mã được xác định yếu tố đông
máu IX với chuỗi polypeptide cắt đoạn tín hiệu đầu N tương ứng với 433 amino acid.
Như vậy có thể kết luận, chúng tôi đã thiết kết thành công vector tái tổ hợp
pET32a/FIX
noSP
mang cDNA mã hóa cho FIX
noSP
và cấu trúc này đã được chọn dòng trong vi
khuẩn E. coli DH 5α.
3.3. Biểu hiện cDNA mã hóa FIX
noSP
ở vi khuẩn E. coli BL21(DE3)
Kết thúc thí nghiệm, chúng tôi thu được dịch tế bào có chứa protein tái tổ hợp. Để
kiểm tra kết quả biểu hiện chúng tôi đã tiến hành điện di biến tính protein trên gel
polyacrylamide 12,6% có SDS. Kết quả điện di protein tổng số của các mẫu được trình bày ở
Hình 9.
Kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp cho thấy, protein tổng số của các mẫu tế bào ở
phân đoạn không tan thu tại các thời điểm khác nhau sau khi được cảm ứng bằng IPTG (các
đường chạy từ 4 - 6), có xuất hiện một băng protein mới có khối lượng phân tử khoảng 67
kDa so với mẫu đối chứng sau khi cảm ứng bởi IPTG (các đường chạy từ 1 - 3). Như đã trình
bày ở trên, ở đây sản phẩm protein lai FIX
noSP
-Trx biểu hiện sẽ bao gồm trình tự đoạn lai (158
aa) và trình tự FIX
noSP
(433 aa), tương đương với băng có kích thước khoảng 67 kDa. Như
12
vậy protein mới này có trọng lượng phân tử phù hợp với tính toán lý thuyết về trọng lượng
phân tử của protein FIX
noSP
-Trx.
Hình 9. Điện di kết quả biểu hiện protein trên gel polyacrylamide 12,6%.
M: Marker protein (Fermentas); 1: Protein tổng số của đối chứng (pET32a), tại thời điểm 0h
(trước cảm ứng); 2-3: Protein tổng số của đối chứng (pET32a), sau 1h và 3h cảm ứng bằng
IPTG; 4-6: Protein tổng số của mẫu tế bào E.coli mang pET32a/FIX
noSP
ở pha không tan sau
0h, 1h và 3h cảm ứng bằng IPTG.
Kết quả điện di trên gel acrylamide 12,6% cho thấy protein dung hợp FIX
noSP
-Trx
được biểu hiện tốt nhất ở nhiệt độ 37
o
C, 0,5 mM IPTG và thời gian nuôi cấy là 3h sau cảm
ứng (Hình 29). Các kết quả nhận được cho thấy các điều kiện đã sử dụng để biểu hiện protein
tái tổ hợp là tương đối phù hợp.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
Từ những kết quả thu được ở trên, chúng tôi có một số kết luận sau:
Từ mô gan sinh thiết của người Việt Nam khỏe mạnh, chúng tôi đã tách được RNA
tổng số có chất lượng đảm bảo, làm nguyên liệu tổng hợp cDNA mã hóa cho FIX.
Đã nhân được đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu ở người (FIX). Đoạn cDNA
mã hóa FIX có độ dài tương ứng khoảng 1,4 kb mã hóa 461 amino acid đã được tách
dòng và giải trình tự.
Đã thiết kế được vector biểu hiện pET32a/FIX
noSP
mang đoạn cDNA mã hóa FIX
noSP
và biểu hiện được gen mã hóa cho yếu tố đông máu IX ở E. coli.
Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu biểu hiện cDNA mã hóa FIX
noSP
trong vector pET32a ở vi khuẩn
E.coli.
Nghiên cứu phương pháp biến tính, hồi tính cho protein dung hợp FIX
noSP
-Trx thể vùi
để thu được protein FIX
noSP
ở dạng tan. Từ đó, nghiên cứu phương pháp tinh sạch
protein FIX
noSP
để từng bước tiến tới sản xuất chế phẩm.
References
Tài liệu tiếng việt
13
1. Bùi Thị Huyền, Đặng Thành Nam, Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Hoàng Quốc
Trường, Phan Văn Chi (2005), “Biểu hiện và xác định interleukin-2 của người”, Tạp
chí Công nghệ Sinh học, 3(2), tr. 143-148.
2. Chu Kỳ Nam, Hoàng Văn Quốc Chương, Trần Linh Thước (2005), “Tạo dòng và biểu hiện
mini-proinsulin của người tái tổ hợp trong Escherichia coli”, Tạp chí Công nghệ Sinh
học, 3(2), tr. 155-160.
3. Đặng Trần Hoàng, Vũ Minh Đức, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải (2005), “Biểu hiện
gen interleukin-2 của người rh-IL2MM bị đột biến tại các điểm glycosyl hóa và gốc
cysteine 125 trong Escherichia coli”, Tạp chí Công nghệ Sinh học. 3(2), tr. 149-154.
4. Lã Thị Huyền, Nguyễn Phương Hoa, Đặng Thị Thu, Lê Quang Huấn (2009), “Biểu hiện
kháng nguyên CD25 tái tổ hợp trong vi khuẩn E.coli”, Tạp chí Công nghệ Sinh học,
7(3), tr. 319-324.
5. Lê Thu Ngọc (2009), “Tổng hợp và biểu hiện gen mã hóa cho enterocin P của vi khuẩn
Enterococcus faecium P13 trong tế bào Escherichia coli ER2566”, Luận văn thạc sĩ
Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
6. Lê Trần Bình, Cao Huyền Trang (2005), “Nghiên cứu và phát triển sản xuất vaccine ăn
được trong thực vật”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(2), tr. 133-142.
7. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003), Áp
dụng các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam, NXB Khoa
học và Kỹ thuật, Hà Nội.
8. Nguyễn Đình Cường, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải, Đặng Thành Nam, Phan Văn Chi
(2004), “Tinh chế và phân tích khối phổ protein bất hoạt ribosome tái tổ hợp từ cây
mướp đắng (Momordica charantia L.)”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2(2), tr. 217-
226.
9. Nguyễn Đình Cường, Nguyễn Thùy Dương, Lê Thị Thu Hiền, Lương Thị Thu Hường,
Trần Thị Phương Liên, Nguyễn Huy Hoàng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải (2003),
“Biểu hiện gen mã hóa protein bất hoạt ribosome của cây mướp đắng ở vi khuẩn
Escherichia coli”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 1(4), tr. 451-460.
10. Nguyễn Đình Huyên (1998), Sinh học phân tử ADN, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
11. Nguyễn Hải Hà, Nguyễn Văn Phòng, Nguyễn Đăng Tôn, Nguyễn Huy Hoàng, Quyền
Đình Thi, Nông Văn Hải (2010), “Biểu hiện yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (h-tPA)
người ở tế bào”, Kỷ yếu hội nghị sinh học phân và hóa sinh y học, tr. 185-191.
14
12. Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2005), “Tách dòng gen mã hóa
interleukin-2 của người”, Y học Việt Nam 310(5), tr. 26-30.
13. Nguyễn Thu Thúy, Trần Vân Khánh, Phạm Đăng Khoa, Tạ Thành Văn (2008), “Nghiên
cứu tách dòng gen mã hóa yếu tố đông máu VIII ở người”, Tạp chí nghiên cứu Y học,
tr. 7-12.
14. Nguyễn Thúy Hà, Nguyễn Bích Nhi, Đỗ Khắc Hiếu, Phan Văn Chi (2003), “Khả năng ức
chế các dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro của Trichobakin tái tổ hợp”, Y học Việt
Nam, 284, tr. 26-30.
15. Vũ Ngọc Tân, Vũ Minh Đức, Lê Thị Lan Anh, Bùi Khánh Chi, Trương Nam Hải (2009),
“Biểu hiện gen mã hóa interleukin-2 của người trong tế bào Escherichia coli”, Tạp chí
Công nghệ sinh học, 7(1), tr. 35-39.
Tài liệu tiếng anh
16. Amphlett G. W., Kisiel W., Castellino F. J. (1981), "The interaction of Ca
2+
with human
Factor IX", Arch Biochem Biophys, 208(2), pp. 576-585.
17. Anson D. S., Choo K. H., Rees D. J., Giannelli F., Gould K., Huddleston J. A., Brownlee
G. G. (1984), "The gene structure of human anti-haemophilic factor IX", EMBO J,
3(5), pp. 1053-1060.
18. Bajaj S. P., Sabharwal A. K., Gorka J., Birktoft J. J. (1992), "Antibody-probed
conformational transitions in the protease domain of human factor IX upon calcium
binding and zymogen activation: putative high-affinity Ca
2+
-binding site in the
protease domain", Proc Natl Acad Sci U S A, 89(1), pp. 152-156.
19. Bovill E. G., Mann K. G. (1987), "Warfarin and the biochemistry of the vitamin K
dependent proteins", Adv Exp Med Biol, 214, pp. 17-46.
20. Brandstetter H., Bauer M., Huber R., Lollar P., Bode W. (1995), "X-ray structure of
clotting factor IXa: active site and module structure related to Xase activity and
hemophilia B", Proc Natl Acad Sci U S A, 92(21), pp. 9796-9800.
21. Bristol J. A., Freedman S. J., Furie B. C., Furie B. (1994), "Profactor IX: the propeptide
inhibits binding to membrane surfaces and activation by factor XIa", Biochemistry,
33(47), pp. 14136-14143.
22. Broze G. J., Jr., Gailani D. (1993), "The role of factor XI in coagulation", Thromb
Haemost, 70(1), pp. 72-74.
23. Chalmers E. A. (2004), "Haemophilia and the newborn", Blood Rev, 18(2), pp. 85-92.
15
24. Chavin S. I., Weidner S. M. (1984), "Blood clotting factor IX. Loss of activity after
cleavage of sialic acid residues", J Biol Chem, 259(6), pp. 3387-3390.
25. Chen S. H., Yoshitake S., Chance P. F., Bray G. L., Thompson A. R., Scott C. R., Kurachi
K. (1985), "An intragenic deletion of the factor IX gene in a family with hemophilia
B", J Clin Invest, 76(6), pp. 2161-2164.
26. Derian C. K., VanDusen W., Przysiecki C. T., Walsh P. N., Berkner K. L., Kaufman R. J.,
Friedman P. A. (1989), "Inhibitors of 2-ketoglutarate-dependent dioxygenases block
aspartyl beta-hydroxylation of recombinant human factor IX in several mammalian
expression systems", J Biol Chem, 264(12), pp. 6615-6618.
27. Di Scipio R. G., Kurachi K., Davie E. W. (1978), "Activation of human factor IX
(Christmas factor)", J Clin Invest, 61(6), pp. 1528-1538.
28. Doolittle R. F., Feng D. F., Johnson M. S. (1984), "Computer-based characterization of
epidermal growth factor precursor", Nature, 307(5951), pp. 558-560.
29. Fernlund P., Stenflo J. (1983), "Beta-hydroxyaspartic acid in vitamin K-dependent
proteins", J Biol Chem, 258(20), pp. 12509-12512.
30. Furie B., Bouchard B. A., Furie B. C. (1999), "Vitamin K-dependent biosynthesis of
gamma-carboxyglutamic acid", Blood, 93(6), pp. 1798-1808.
31. Furie B., Furie B. C. (1988), "The molecular basis of blood coagulation", Cell, 53(4), pp.
505-518.
32. Furie B., Furie B. C. (2005), "Thrombus formation in vivo", J Clin Invest, 115(12), pp.
3355-3362.
33. Galeffi P., Brownlee G. G. (1987), "The propeptide region of clotting factor IX is a signal
for a vitamin K dependent carboxylase: evidence from protein engineering of amino
acid -4", Nucleic Acids Res, 15(22), pp. 9505-9513.
34. Green P. M., Bentley D. R., Mibashan R. S., Nilsson I. M., Giannelli F. (1989),
"Molecular pathology of haemophilia B", EMBO J, 8(4), pp. 1067-1072.
35. Hoag H., Gore J., Barry D., Mueller C. (1999), "Gene therapy expression vectors based on
the clotting Factor IX promoter", Gene Ther, 6(9), pp. 1584-1589.
36. Hoffman M., Monroe D. M., 3rd (2001), "A cell-based model of hemostasis", Thromb
Haemost, 85(6), pp. 958-965.
37. Hoffman M., Monroe D. M., Oliver J. A., Roberts H. R. (1995), "Factors IXa and Xa play
distinct roles in tissue factor-dependent initiation of coagulation", Blood, 86(5), pp.
1794-1801.
16
38. Kaufman R. J. (1998), "Post-translational modifications required for coagulation factor
secretion and function", Thromb Haemost, 79(6), pp. 1068-1079.
39. Kurachi K., Davie E. W. (1982), "Isolation and characterization of a cDNA coding for
human factor IX", Proc Natl Acad Sci U S A, 79(21), pp. 6461-6464.
40. Laemmli U. K. (1970), "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4", Nature, 227(5259), pp. 680-685.
41. LaVallie E. R., DiBlasio E. A., Kovacic S., Grant K. L., Schendel P. F., McCoy J. M.
(1993), "A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body
formation in the E. coli cytoplasm", Biotechnology (N Y), 11(2), pp. 187-193.
42. Lawson J. H., Mann K. G. (1991), "Cooperative activation of human factor IX by the
human extrinsic pathway of blood coagulation", J Biol Chem, 266(17), pp. 11317-
11327.
43. Lenting P. J., Christophe O. D., Maat H., Rees D. J., Mertens K. (1996), "Ca
2+
binding to
the first epidermal growth factor-like domain of human blood coagulation factor IX
promotes enzyme activity and factor VIII light chain binding", J Biol Chem, 271(41),
pp. 25332-25337.
44. Lin S. W., Dunn J. J., Studier F. W., Stafford D. W. (1987), "Expression of human factor
IX and its subfragments in Escherichia coli and generation of antibodies to the
subfragments", Biochemistry, 26(17), pp. 5267-5274.
45. Lindquist P. A., Fujikawa K., Davie E. W. (1978), "Activation of bovine factor IX
(Christmas factor) by factor XIa (activated plasma thromboplastin antecedent) and a
protease from Russell's viper venom", J Biol Chem, 253(6), pp. 1902-1909.
46. Mannucci P. M., Ruggeri Z. M., Pareti F. I., Capitanio A. (1977), "1-Deamino-8-d-
arginine vasopressin: a new pharmacological approach to the management of
haemophilia and von Willebrands' diseases", Lancet, 1(8017), pp. 869-872.
47. Nemerson Y. (1992), "The tissue factor pathway of blood coagulation", Semin Hematol,
29(3), pp. 170-176.
48. Park C. H., Seo J. Y., Kim H. J., Jang J. H., Kim S. H. "A diagnostic challenge: mild
hemophilia B with normal activated partial thromboplastin time", Blood Coagul
Fibrinolysis, 21(4), pp. 368-371.
49. pET system manual of Novagen (2003), 10
th
Edition Rev.B0403, pp. 11-13.
50. Presnell S. R., Stafford D. W. (2002), "The vitamin K-dependent carboxylase", Thromb
Haemost, 87(6), pp. 937-946.
17
51. Sambrook J., Russel W. D. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3
rd
, ed,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
52. Siguret V., Amselem S., Vidaud M., Assouline Z., Kerbiriou-Nabias D., Pietu G.,
Goossens M., Larrieu M. J., Bahnak B., Meyer D., et al. (1988), "Identification of a
CpG mutation in the coagulation factor-IX gene by analysis of amplified DNA
sequences", Br J Haematol, 70(4), pp. 411-416.
53. Singh S. M., Panda A. K. (2005), "Solubilization and refolding of bacterial inclusion body
proteins", J Biosci Bioeng, 99(4), pp. 303-310.
54. Sona P.S, Lingam C. M. (2010). "Hemophilia: An overview", International journal of
pharma ceutical review and rechear, 5, pp. 18-26.
55. Stenina O., Pudota B. N., McNally B. A., Hommema E. L., Berkner K. L. (2001),
"Tethered processivity of the vitamin K-dependent carboxylase: factor IX is efficiently
modified in a mechanism which distinguishes Gla's from Glu's and which accounts for
comprehensive carboxylation in vivo", Biochemistry, 40(34), pp. 10301-10309.
56. Studier F. W., Moffatt B. A. (1986), "Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct
selective high-level expression of cloned genes", J Mol Biol, 189(1), pp. 113-130.
57. Sunnerhagen M. S., Persson E., Dahlqvist I., Drakenberg T., Stenflo J., Mayhew M.,
Robin M., Handford P., Tilley J. W., Campbell I. D., et al. (1993), "The effect of
aspartate hydroxylation on calcium binding to epidermal growth factor-like modules
in coagulation factors IX and X", J Biol Chem, 268(31), pp. 23339-23344.
58. Suttie J. W. (1980), "Mechanism of action of vitamin K: synthesis of gamma-
carboxyglutamic acid", CRC Crit Rev Biochem, 8(2), pp. 191-223.
59. Wang L., Zoppe M., Hackeng T. M., Griffin J. H., Lee K. F., Verma I. M. (1997), "A
factor IX-deficient mouse model for hemophilia B gene therapy", Proc Natl Acad Sci
U S A, 94(21), pp. 11563-11566.
60. Wasley L. C., Rehemtulla A., Bristol J. A., Kaufman R. J. (1993), "PACE/furin can
process the vitamin K-dependent pro-factor IX precursor within the secretory
pathway", J Biol Chem, 268(12), pp. 8458-8465.
61. Wojcik E. G., Van Den Berg M., Poort S. R., Bertina R. M. (1997), "Modification of the
N-terminus of human factor IX by defective propeptide cleavage or acetylation results
in a destabilized calcium-induced conformation: effects on phospholipid binding and
activation by factor XIa", Biochem J, 323 (3), pp. 629-636.
62. Wolberg A. S., Morris D. P., Stafford D. W. (1997), "Factor IX activation by factor XIa
proceeds without release of a free intermediate", Biochemistry, 36(14), pp. 4074-4079.
18
63. Yoshitake S., Schach B. G., Foster D. C., Davie E. W., Kurachi K. (1985), "Nucleotide
sequence of the gene for human factor IX (antihemophilic factor B)", Biochemistry,
24(14), pp. 3736-3750.
Tài liệu trang Website
64.
65.
66.
67.
ter2-Backgroupd.pdf.
68.
(Accessed June 19, 2012).
69. o/encyclopedia/H/hemophilia.html.
(Accessed December 29, 2009).
70. />5&rptname=bleeding.
(Accessed December 18, 2009).
71. />6&rptname=bleeding.
(Accessed December 18, 2009).
72. .
73.
(Accessed March 8, 2012).
74. www.ahcdc.ca/publications.html.