co cac phuong phap kiem tra vi sinh trong thuc pham1

11/21/2013

CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA
VI SINH TRONG THỰC PHẨM

1


11/21/2013

Vì sao phải kiểm tra vs trong
thực phẩm?
Qui trình kiểm tra mẫu trong thực phẩm
Cách lấy mẫu
Các qui chuẩn
Các loại môi trường kiểm tra
Vi sinh vật chỉ thị
Các phương pháp kiểm tra

Phương pháp định lượng vsv
 Là các phương pháp để xác định số lượng
vsv trong mẫu.
 Trả lời cho câu hỏi: “Hàm lượng vi sinh vật
trong mẫu là bao nhiêu ?”

1. Kĩ thuật nuôi cấy truyền thống
2. Phương pháp đếm trực tiếp
3. Phương pháp thử nhanh

2

11/21/2013

Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu

Không sử dụng nước cất và nướcmuối sinh
lý để pha loãngmẫu thực phẩm

Các dung dịch pha loãng mẫu


Saline peptone water (SPW)

NaCl

1g

Peptone

8.5g

Nước cất vừa đủ

1 lít

 Buffered peptone water (BPW)
NaCl

5g

Peptone

10 g

Nước cất vừa đủ

1 lít

3


11/21/2013

Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu

1. Phương pháp nuôi cấy truyền thống
Xđ tế bào sống
 Thạch agar hoặc môi trường lỏng
 MT sử dụng tùy thuộc vào từng nhóm


◦ MT không chọn lọc (mt dinh dưỡng)
 Tổng số vk (ưa nhiệt trung bình, hiếu khí)

◦ MT chọn lọc
 Loại vsv riêng (Ức chế các loại khác)

4

11/21/2013

1. Phương pháp nuôi cấy truyền thống


Nuôi cấy trên đĩa – 3 loại
◦ 1. Tổng số vsv hiếu khí
 Đơn giản, chấp nhận hay loại bỏ, không chọn
lọc

◦ 2. Sự có mặt của vsv trong phân
 coliforms (những chỉ thị)

◦ 3. Mầm bệnh
 Chọn lọc, cần quá trình khẳng định

1. Phương pháp nuôi cấy truyền thống
Qui trình cho việc phân lập các vsv mục tiêu
1. Đồng hóa mẫu (Stomacher) (1-25g)
◦ Chuẩn bị mt pha loãng 1/10 (ví dụ: 1ml sữa + 9ml dd peptone hay
25g + 225ml dd pha loãng

2. +/- Tăng sinh (làm giàu)
◦ Qua đêm
◦ 0.1% peptone water, khôi phục tế bào

3. +/- Làm giàu chọn lọc
◦ Qua đêm, 1 CFU/25g có thể phát triển đến 105-106 CFU/ml

4. Đỗ đĩa trên mt chọn lọc hoặc khẳng định

◦ Qua đêm

5. +/- MT không chọn lọc
◦ Qua đêm

6. Kiểm tra khẳng định
◦ Hóa sinh hoặc huyết thanh

5


11/21/2013

1. Phương pháp nuôi cấy truyền thống


Điều kiện nuôi cấy
◦ Campylobacter : 42°C



Đỗ đĩa/ cấy trang
◦ 1ml/0.1ml (20 – 300 khuẩn lạc)
 Nhiều khuẩn lạc – độ tin cậy cao – hiệu quả lớn hơn
 Lặp lại



Drop plates
◦ 10-20 μL (2-20 khuẩn lạc)

 Tiết kiệm đĩa

1. Phương pháp nuôi cấy truyền thống




MPN – most probable number
(Phương pháp số có xác xuất cao nhất)
◦ MT lỏng
◦ Tiêm mẫu vào các ống(3,4 or 5) với lượng mẫu khác
nhau hoặc độ pha loãng khác nhau (10-1, 10-2 & 10-3
or 10g, 1g, & 0.1g)
◦ Nuôi cấy và ghi lại hiện tượng (+/-) như khả năng
sinh khí
Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần
lặp lại có một số lần dương tính và có một số lần âm
tính
◦ Đọc MNP/ đơn vị thực phẩm từ bảng McCrady

6


11/21/2013

MPN – most probable number


Hai hệ thống MPN
- Hệ thống 9 ống

- Hệ thống 15 ống



Đặc điểm

- Vi sinh vật mục tiêu phải có những biểu
hiện đặc trưng trên môi trường nuôi cấy như
Sự tạo hơi: Coliforms…
 Sự đổi màu: S. aureus


- Cho phép định lượng được mật độ VSV thấp trong
thể tích mẫu lớn

Hệ thống MPN/g(ml)
9 ống

15 ống

7


11/21/2013

Hệ thống MPN/g(ml)
Chuẩn bị các
ống nghiệm có
chứa môi trường
thích hợp cho sự

tăng trưởng của
đối tượng VSV
cần định lượng

Hệ thống MPN/g(ml)

8


11/21/2013

Hệ thống MPN/g(ml)

Phương pháp màng lọc




Kích thước lỗ lọc 0,47μm hay 0,22μm
Đường kính và hình dạng màng lọc phụ thuộc vào
đường kính phễu lọc
Đường kính màng thường là 45mm

9


11/21/2013

Phương pháp màng lọc






Phễu lọc, giá đỡ màng lọc phải được vô trùng sau
mỗi lần lọc
Mật độ VSV trong dịch lọc thích hợp: <150 khuẩn
lạc/màng
Thể tích dịch lọc trong 1 lần: 50 -100ml
Nếu thể tích dịch lọc nhỏ hơn thì phải pha loãng
bằng dd pha loãng hay nước cất vô trùng

Phương pháp màng lọc
Ưu điểm
Xác định được mật độ VSV cụ thể trong một
thể tích mẫu lớn: 10ml, 100ml …
 Nhược điểm
Không thích hợp cho việc phân tích các mẫu
thực phẩm rắn


10


11/21/2013

2. Phương pháp đếm trực tiếp
 Ưu

điểm: xác định nhanh chóng mật độ vi sinh

vật chứa trong mẫu
 Nhược

điểm:



Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết



Dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các vật thể khác trong mẫu



Khó đạt được độ chính xác cao



Không thích hợp với huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp

2. Phương pháp đếm trực tiếp


Đếm bằng buồng đếm hồng cầu



Đếm bằng buồng đếm Breed



Đếm bằng kính hiển vi huỳnh quang

11


11/21/2013

3. Phương pháp thử nhanh


Phương pháp phát quang sinh học
ATP



Phương pháp ELISA (Enzyme – linked
ImmunoSorbent Assay)
Phương pháp PCR
Phương pháp lai phân tử




Phương pháp phát quang sinh học ATP
 Dựa vào sự phát quang sinh học
 Cho kết quả rất nhanh: 1minute - <1h
 Ước lượng kết quả tổng

lượng vsv có mặt trong mẫu
nhờ vào sự tương quan
giữa lượng ánh sáng phát ra
với số lượng của vsv

12


11/21/2013

Phương pháp phát quang sinh học ATP
Sự phát quang sinh học
- Được thấy rộng rãi trong tự nhiên: đom
đóm, các sinh vật biển (bọt biển, trai..)

Phương pháp phát quang sinh học ATP


Tất cả tế bào sống chứa Adenosinetriphosphate (ATP)



Tế bào chết – ATP bị phân hủy 1
cách nhanh chóng
◦ Sau thu hoạch, các sản phẩm cây trồng và
động vật có rất ít ATP



ATP được phát hiện trong những

sản phẩm này phải có nguồn gốc từ
vsv còn sống
Luciferase

ATP + D-Luciferin + O2

Oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 + Light

13


11/21/2013

Phương pháp phát quang sinh học ATP





Việc phân tích ATP này là một chỉ thị tốt cho
sự có mặt của vsv còn sống
Phản ứng có tính đặc hiệu cao cho ATP
Nồng độ ATP trong trong tế bào vsv tương
đối giống nhau (~ 1 fentogram [10-15 g] đối
với tế bào vi khuẩn, ~ 100 fentograms đối với
tế bào nấm men)

Phát quang sinh học ATP – Ưu điểm





Mối quan hệ đường thẳng giữa ánh sáng
phát ra và nồng độ ATP
Lượng ATP tỉ lệ thuận với lượng vsv
Thông thường, mối quan hệ đường thẳng
giữa lượng ánh sáng và số lượng vsv xảy
ra trong pham vi 103 đến 106 cfu/ml

14


11/21/2013

Phát quang sinh học ATP – Ưu điểm
 Nhanh
 Dụng

và nhạy

cụ có thể mang đi

được
 Giám

sát vệ sinh, đánh
giá chất lượng vs của tp

Phát quang sinh học ATP –Nhược điểm



Thiếu tính đặc trưng
◦ Không có sự phân biệt giữa tb vi
khuẩn, nấm men hay nấm mốc



Kết quả có thể bị nhiễu từ
ATP của cây trồng hay động
vật
◦ Lượng ATP còn lại đôi khi lớn
hơn lượng ATP trong vsv

15


11/21/2013

Phát quang sinh học ATP –Nhược điểm


Bị nhiễu từ thực phẩm hoặc các chất trong
môi trường
◦ Thành phần của thực phẩm (mẫu dày hay sẫm màu)
◦ pH thấp
◦ Dư lượng chất vệ sinh



ATPaza
◦ Có mặt trong một số thực phẩm được tạo ra bởi vsv
◦ Phải được kiểm soát bằng cách sử dụng các chất ức
chế ATPaza

Phát quang sinh học ATP –Nhược điểm


Sự thay đổi của nồng độ ATP trong tế bào sv
◦ Thay đổi trong suốt chu kì sống



Cần phải có đường chuẩn
◦ Phải được xây dựng cho mỗi sản phẩm

16


11/21/2013

Phát quang sinh học ATP – ứng dụng


Kiểm tra thường xuyên vsv
trong các loại thực phẩm
◦ Sữa, thịt bò, heo, gia cầm, các loại thức
uống

Kiểm tra độ vô trùng



◦ Sữa UHT milk



Kiểm tra bề mặt
◦ CIP
◦ Không phân biệt giữa ATP từ vsv sống
và ATP từ thực phẩm

PCR
 Polymerase

◦
◦
◦
◦

Chain Reaction

Đệm PCR
Magnesium chloride
dNTPs
Mồi
 Xuôi và ngược

◦ Taq enzyme
◦ Mẫu

Template

Picture by Dr Pranee Leechanachai modified

17


11/21/2013

PCR


Bước 1: Hỗn hợp được nâng nhiệt đến 95°C để biến tính (denature) ("unzip")
sợi đôi của DNA thành 2 sợi đơn

Picture by Dr Pranee Leechanachai

PCR


Bước 2: Hỗn hợp được hạ nhiệt độ đến ~55°C (bắt cặp với mạch khuôn

Picture by Dr Pranee Leechanachai modified

18


11/21/2013

PCR


Bước 3: Hỗn hợp được nâng nhiệt trở lại đến ~75°C để cho phép TAQ
polymerase tổng hợp những bản sao của mỗi mạch



(xem phần PCR animation)

Picture by Dr Pranee Leechanachai modified

PCR
 Độ

phân giải thấp trên gel
agarose

 Nhuộm

Ethidium bromide
không nhạy và không định
lượng được

 Chỉ

phân biệt kích cỡ của gene

 Không

định lượng được

19


11/21/2013

Real Time PCR


Điều khiển tiến trình của
phản ứng PCR trong thời
gian thực



Số lượng nhỏ của sản phẩm
PCR (DNA, cDNA hoặc
RNA) có thể được định
lượng một cách chính xác



Dựa vào quá trình phát hiện
của huỳnh quang được tạo
ra bởi phân tử báo cáo mà
sẽ tăng khi phản ứng được
thúc đẩy – xảy ra do sự tích
tụ của sản phẩm PCR ở
từng chu kì khuêch đại

Real Time PCR


Phân tử sử dụng
cho qt phát hiện

1.

Phát hiện không đặc
trưng sử dụng phân tử
báo cáo là huỳnh quang
hoặc thuốc nhuộm liên
kết với DNA (ví dụ:
SYBR green)

2.

Đầu dò đặc trưng cho
một trình tự (ví dụ
TaqMan Probes hoặc
Molecular Beacons)

20


11/21/2013

Real Time PCR


Roche LightCycler®
480 Real-Time PCR
System
◦ Block based

96 or 384-well format

Real Time PCR



QIAGEN Rotor-Gene Q
Real-Time PCR System
◦ Air based

21


11/21/2013

Real Time PCR


Không cần thực hiện
các bước sau PCR nên
tiết kiệm thời gian, hóa
chất



Thử nghiệm:
◦
◦
◦
◦

Dễ thực hiện
Độ nhạy cao
Đặc trưng
Tự động hóa

Real Time PCR


Thí nghiệm được thực hiện
trong tuyp đóng kín – giảm
sự tạp nhiễm cho sản phẩm
PCR



Mối quan hệ nghịch đảo giữa
Ct và lượng mẫu ban đầu lượng mẫu càng cao, thời
gian để nó bắt cặp với huỳnh
quang để đạt đến ngưỡng
càng ngắn nên giá trị Ct càng
thấp

• NOTE: same type of inverse

relationship that occurs in
impedometry (Ct and Dt are
inversely proportional to starting
template/bacteria levels

22


11/21/2013

ELISA


Viết tắt của:
◦



Enzyme Linked
ImmunoSorbent Assay

PP nhanh:
◦ Kết quả thu được trong vòng
4-8h

27th February 2012

MICR3860 Food Microbiology II

ELISA



Xét nghiệm miễn dịch dựa trên cơ sở sử
dụng một thể tiếp hợp chứa kháng thể đặc
hiệu với một kháng nguyên và được gắn với
một loại enzym nhất định

23


11/21/2013

ELISA


Khai thác sự tương tác đặc hiệu giữa
các kháng nguyên (Antigens-Ag) với
một kháng thể (Antibody – Ab) để
hình thành một hệ có thể phát hiện
được



Quá trình phát hiện dựa vào phản
ứng của các enzym trong thể tiếp
hợp tạo ra các sản phẩm cos màu.
◦ Horseradish peroxidase (HRP)
◦ Alkaline phosphatase

ELISA



Qui trình ELISA sandwich được sử dụng để
phát hiện vi sinh trong thực phẩm

24


11/21/2013

Qui trình ELISA Sandwich


Gắn kháng thể (Ab) đặc hiệu với
chất cần tìm kiếm vào chất mang,
đáy ống nghiệm hoặc khuôn lõm,
rữa những vật liệu không liên kết



Cho dung dịch chứa chất nghi ngờ
vào (kháng nguyên, Ag)



Nếu chất cần tìm có mặt trong
dung dịch, Ag sẽ liên kết với kháng
thể, rửa các chất không liên kết.

Qui trình ELISA Sandwich



Cho kháng thể đánh dấu với enzym (E-Ab) đặc hiệu với Ag
đang tìm kiếm



E-Ab sẽ liên kết với Ag được bắt cặp, rửa

25