Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại buôn ma thuột

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN
=======***=======

ĐẬU THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN ƯA
NHIỆT THU THẬP TẠI BUÔN MA THUỘT

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Buôn Ma Thuột, năm 2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN
=======***=======

ĐẬU THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN ƯA
NHIỆT THU THẬP TẠI BUÔN MA THUỘT

Chuyên Ngành Sinh Học Thực Nghiệm
Mã Số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Người hướng dẫn: TS.Võ Thị Phương Khanh

Buôn Ma Thuột, năm 2010


TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Khưu Phương Yến Anh (2007), Nghiên cứu khả năng enzyme
cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn cần giờ, Luận
văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học sư phạm TP. Hồ Chí Minh.
[2]. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2007), Công nghệ sinh học,
tập 3 : Enzyme và ứng dụng, Nxb Giáo dục, trang 45 – 94.
[3]. Nguyễn Thị Kim Cúc, Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Tuyết Mai, Lê
Văn Nhương (1999), Phân lập và ñịnh loại một số tính chất của chủng vi nấm,
xạ khuẩn có tiềm năng ứng dụng trong quy trình xử lý vỏ cà phê , Báo cáo khoa
học Hội Nghị Công Nghệ Sinh Học Toàn Quốc; NXB KHKT; tr 206-213.
[4]. Tăng Thị Chính, Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy (1999), Nghiên cứu sản
xuất enzyme cellulase của một số chủng vi sinh vật ưa nhiệt phân lập từ bể ủ rác
thải, Báo cáo khoa học Hội Nghị Công Nghệ Sinh Học Toàn Quốc, NXB
KHKT; tr 790-796.
[5]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyền, Phạm Văn Ty (1978), Một
số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 2,3, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật.
[6]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2007), Vi
sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục.
[7]. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng
Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật
học, Nhà xuất bản Khoa học kĩ thuật.
[8]. Nguyễn Lân Dũng (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh
vật học, tập 2, NXB khoa học và kỹ thuật.
[9]. Lê Gia Hy, (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi streptomyces sinh
chất kháng sinh chống nấm gây bệnh ñạo ôn và thối cổ rễ phân lập ở Việt Nam,
Luận án Phó tiến sĩ sinh học.

[10]. Nguyễn Lan Hương, Lê Văn Nhương, Hoàng Đình Hoà (1999);
Phân lập và hoạt hóa vi sinh vật ưa nhiệt có hoạt tính cellulase cao ñể bổ sung
lại vào khối ủ, rút ngắn chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt, Báo cáo khoa học Hội
Nghị Công Nghệ Sinh Học Toàn Quốc, NXB KHKT, tr 531-535.
[11]. Phạm Thị Ngọc Lan, Phạm Thị Hoà, Lý Kim Bảng (1999), Tuyển chọn
một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose từ mùn rác, Báo cáo khoa
học Hội Nghị Công Nghệ Sinh Học Toàn Quốc, NXB KHKT; tr 177-182.
[12]. Nguyễn Đức Lượng, Đặng Vũ Bích Hạnh (1999), Khả năng sinh
tổng hợp Cellulase của Atinomyces griseus, Báo cáo khoa học Hội Nghị Công
Nghệ Sinh Học Toàn Quốc, NXB KHKT; tr 804- 809.
[13]. Nguyễn Đức Lượng, Đặng Vũ Bích Hạnh (1999), Một số tính chất
enzyme cellulase của xạ khuẩn Actinomyces griseus, Báo cáo khoa học Hội Nghị
Công Nghệ Sinh Học Toàn Quốc, NXB KHKT, tr 580-583.
[14]. Đinh Thị Kim Nhung (2005), Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ
cho việc tạo thành xenlulase của Acetobacter xylinum, Đại học Sư Phạm Hà Nội
2; Những vấn ñề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, NXB KHKT.
[15]. Ngô Đại Nghiệp (2009), Giáo trình enzyme học, Trường Đại học
Quốc gia TP.Hồ Chí Minh.
[16]. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng
(1982), Enzyme vi sinh vật, Nxb KH&KT.
[17]. Trần Cẩm Vân (2001), Giáo trình vi sinh vật học môi trường, NXB
Đại học Quốc gia Hà Nội.
[18]. Lê Thị Thanh Xuân, Phan Thị Tuyết Minh Viện Công Nghệ Sinh
Học, Viện KH&CNVN. Trần Hà Ninh, Tăng Thị Chính Viện Công Nghệ Môi
Trường, Viện KH&CNVN (2005), Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn
ưa nhiệt sinh tổng hợp xenlulaza cao, Những vấn ñề nghiên cứu cơ bản trong
khoa học sự sống, NXB KHKT; tr 872-875.

[19]. Lương Đức Phẩm, Hồ Sường (1978), Vi sinh tổng hợp, NXB khoa
học và kỹ thuật Hà Nội.
[20]. GS.TS Nguyễn Xuân Thành (2007), Giáo trình vi sinh vật học công
nghiệp, NXB Giáo dục.
[21]. Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, Nhà
xuất bản giáo dục.
[22]. Hồ Sĩ Tráng (2004), Cơ sở hoá học gỗ và cellulose tập 1,2, NXB
khoa học kỹ thuật Hà Nội.
[23]. Allister J. Lyons, JR., and Thomas G. Pridham (1965), Colorimetric
Determination of Color of Aerial Mycelium of Streptomycetes, Journal of
bacteriology, American Society for Microbiology, 89(1), pp. 159-169.
[24]. Bergey’s Mannual of Systematic bacteriology (1989), Vol. 4.
[25]. Becker, B., M.P. Lechevalier and H.A.Lechevalier (1965), Chemical
composition of cell wall preparations from Strains of various form – genera of
aerobic Actinomyce, .J.Appl. Microbiol., 13, pp. 236-243.
[26]. Eberhard Kuster (1972), Simple working key for the classification
and identification of named taxe included in the International Stepmyces project,
Inter.J. Syst. Bac., 3, pp.139-148.
[27]. Faiez Alani, William A. Anderson, Murray Moo-Young (2007),
New isolate of Streptomyces sp. with novel thermoalkalotolerant cellulases,
Biotechnol Lett DOI 10.1007/s10529-007-9500-9 Original research paper.
[28]. Hung-Der Jang and Kuo-Shu Chen (2002), Production and
characterization of thermostable cellulases from Streptomyces transformant T31, World Journal of Microbiology & Biotechnology 19: 263–268, 2003. Kluwer
Academic Publishers. Printed in the Netherlands.
[29]. John G. Holt, Noel R. Krieg, Peter H. A. Sneath, James T. Staley ,
Stanley T. Wikkiams, 1994, Bergey’s Mannual of determinative bacteriology,
Ninth Edition, Lippincott Williams & Wilkins, p 605-703.

[30]. Lechevalier, M. P. and H.A.Lechevalier (1970). Chemical
composition as a criterion in the classification of aerobic Actinomycetes, Int. J.
System. Bact., 20, pp. 435-443.
[31]. Sherling, E.B. and D.Gottlieb (1966), Methods for characterization
of Streptomyces species, Intern. J. Syst. Bact., 16(3), pp .313-340.
[32]. Thomas G. Pridham (1965), Color and Streptomycetes - Report of
an International Workshop on Determination of Color of Streptomycetes,
Applied microbiology, American Society for Microbiology., 13(1), pp. 43-61.
TP.Hồ Chí Minh.
[33]. Tresner, H.D., E.J.Buckus (1963), System of color wheels for
Streptomyces taxonomy, Appl.Microbiol, 11, pp. 335-338.
[34]. Waksman, S.A. (1961), The Actinomycetes, vol.2 Classification, idetification
and description of the genera and species, The Williams and Wilkins Co., Baltimore.
[35].

Williams,

S.T.,

M.Goodfellow,

G.Alderson,

E.M.

Wellington,

P.H.A.Sneath and M.J. Sackin (1983), Numerical classification of Streptomyces and
related genera, J.Gen. Microbiol., 129, pp.1743-1813.
[36]. Witt, D., W. Liesack and E. Stackebbandt (1989), Identification of

Streptomyces by 16S RNA Sequences and oligonucleotide probes, Recent
advances in microbial ecology, Tokyo, Japan Scientific Press.
[37]. Witt, D. and E. Stackebbandt (1990), Unification of the genera
Streptomyces and Streptoverticillium and amendation of Streptomyces Waksman
and Henrici 1443, System.Appl. Microbiol., 13, pp. 361- 371.


PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Đường chuẩn CMCase
Nồng ñộ
glucose (IU/ml)
OD540nm

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.103

0.224

0.365

0.451

0.604

0.7

Đường chuẩn CMCase
y = 1.2317x - 0.0066
R2 = 0.9789

O D 540n m

0.8
0.6

OD 540nm

0.4

Linear (OD
540nm)

0.2
0
0

0.2

0.4

0.6

Nồng ñộ glucose (mg/ml)

0.8


Phụ lục 2: Tương quan hàm lượng glucose(mg/ml) và chỉ số OD540n.m
Nồng ñộ glucose (IU/ml)
0.100

0.200

0.300

0.400

Chỉ số OD
0.103
0.106
0.100
0.224
0.226
0.222
0.368
0.363
0.364
0.551

Trung bình OD Sai số
0.103
0.00001

0.224

0.00029

0.365

0.0021

0.451

0.0114

0.604

0.0054

0.700

0.005

0.550
0.552
0.500

0.606

0.602
0.604

0.600

0.700
0.698
0.702


Phụ lục 3: Đường kính vòng phân giải và nồng ñộ ñường khử trong môi trường
nuôi cấy 12 chủng phân lập ñược.
STT Chủng

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
C11
C12

Chỉ số
OD
540n.m
0.718
0.695
0.702
0.744
0.924
0.903

0.876
0.996
0.987
0.826
0.741
0.891
0.785
0.775
0.750
1.124
1.193
1.081
1.060
1.046
1.090
0.705
0.624
0.684
0.905
0.980
0.960
0.692
0.622
0.602
0.576
0.656
0.568
0.545
0.525
0.616

Trung
bình
OD

Nồng ñộ
ñường
khử(IU/ml)

0.705

0.579

0.857

0.702

0.953

0.780

0.819

0.672

0.770

0.632

1.132

0.926

1.065

0.871

0.671

0.551

0.948

0.776

0.638

0.525

0.601

0.495

0.562

0.463

Đường kính vòng
thủy phân (mm)
32.0

29.0
26.0
33.0
30.0
30.0
30.0
28.0
29.0
31.0
28.0
30.0
37.0
30.0
25.0
32.0
31.0
30.0
35.0
36.0
31.0
18.0
23.0
22.0
20.0
22.0
20.0
28.0
30.0
25.0
29.0

25.0
20.0
20.0
18.0
20.0

Mức ñộ
phân giải

Mạnh

Mạnh

Mạnh

Mạnh

Mạnh

Mạnh

Mạnh

Khá

Khá

Mạnh

Mạnh

Mạnh


Phụ lục 4: Khả năng chịu nhiệt của các chủng xạ khuẩn
Chủng

Nhiệt ñộ
450C
500C

A2

550C
600C
650C
450C
500C

C2

550C
600C
650C
450C
500C

C3
550C
600C

Chỉ số OD
540n.m
0.858
0.910
0.920
0.775
0.826
0.756
0.536
0.436
0.551
0.379
0.324
0.327
0.392
0.445
0.438
0.750
0.706
0.739
0.920
0.786
0.776
0.773
0.758
0.782
0.611
0.478
0.531

0.781
0.753
0.774
0.903
0.740
0.757
0.756
0.749
0.805
0.532
0.556
0.536
0.365
0.381
0.290

Trung bình

Sai số

Nồng ñộ ñường
khử(IU/ml)

0.890

0.00110

0.729

0.786

0.00131

0.645

0.508

0.00390

0.419

0.343

0.00100

0.285

0.425

0.00080

0.352

0.731

0.00052

0.600

0.827

0.00647

0.678

0.771

0.00015

0.633

0.540

0.00448

0.445

0.769

0.00021

0.631

0.800

0.00803

0.656

0.770

0.00093

0.632

0.541

0.00017

0.446

0.345

0.00236

0.287


650C
450C
500C

C4

550C
600C
650C
450C
500C

C6

550C
600C
650C
450C
500C

C7

550C

600C

0.344
0.407
0.365
0.935
0.841
0.899
0.803
0.861
0.928
0.715
0.592
0.653
0.541
0.519
0.560
0.601

0.543
0.628
1.231
1.208
1.175
1.029
1.064
1.022
0.928
1.004
0.822
0.389
0.342
0.330
0.449
0.427
0.449
1.001
1.018
0.903
0.729
0.673
0.676
0.494
0.553
0.542
0.332
0.316
0.329

0.372

0.00102

0.309

0.892

0.00225

0.731

0.850

0.00391

0.697

0.653

0.00378

0.537

0.540

0.00042

0.445

0.02383

0.486

1.205

0.00079

0.985

1.038

0.00051

0.849

0.918

0.00836

0.752

0.354

0.00097

0.294

0.442

0.00016

0.365

0.974

0.00385

0.797

0.693

0.00099

0.569

0.530

0.00098

0.437

0.326

0.00001

0.271

0.590

650C
450C
500C

Ctm

550C
600C
650C

0.319
0.328
0.316
0.768
0.689
0.749
0.817
0.906
0.860
0.630
0.690
0.711
0.548
0.519
0.437
0.290
0.318
0.329

0.321

0.00002

0.267

0.735

0.00170

0.603

0.861

000198

0.706

0.677

0.00177

0.556

0.501

0.00331

0.413

0.312

0.00040

0.200


Phụ lục 5. pH thích hợp ñến hoạt tính enzyme cellulase của các chủng xạ khuẩn.
Chủng

pH

55

60

65
A2
70

75

80

55

60

65
C2

70

75

80

Chỉ số OD
540n.m
0.470
0.381
0.425
0.440
0.362
0.422
0.300
0.318
0.286
0.178
0.217
0.198
0.322
0.296
0.337
0.176
0.149
0.219
0.390
0.339
0.376
0.430

0.360
0.420
0.263
0.259
0.228
0.357
0.257
0.328
0.361
0.292
0.372
0.143
0.134
0.134

Sai số
Trung bình

Nồng ñộ
ñường khử
(IU/ml)

0.00198
0.425

0.352
0.00167

0.408

0.338
0.00016

0.310

0.258
0.00038

0.198

0.167
0.00043

0.318

0.265
0.00125

0.181

0.154
0.00069

0.368

0.305
0.00143

0.403

0.334
0.00037

0.250

0.210
0.00265

0.314

0.262
0.00188

0.342

0.284
0.00001

0.137

0.118


55

60

65
C3
70

75

80

55

60

65
C4
70

75

80

0.417
0.305
0.435
0.326
0.301
0.421
0.336
0.304
0.524
0.345
0.379
0.330
0.406

0.352
0.441
0.302
0.276
0.301
0.360
0.232
0.446
0.334
0.318
0.360
0.362
0.319
0.383
0.278
0.285
0.282
0.298
0.345
0.332
0.232
0.170
0.202

0.00496
0.404

0.335
0.00401

0.349

0.290
0.01413

0.388

0.322
0.00063

0.351

0.292
0.00201

0.400

0.331
0.00022

0.293

0.244
0.01160

0.346

0.288
0.00045

0.337

0.280
0.00106

0.355

0.295
0.00001

0.282

0.236
0.00059

0.325

0.270
0.00096

0.201

0.170


55

60

65

C6
70

75

80

55

60

65
C7
70

75

80

0.365
0.479
0.360
0.426
0.454
0.416
0.500
0.546
0.521
0.586
0.441

0.480
0.577
0.576
0.501
0.557
0.432
0.531
0.252
0.284
0.307
0.328
0.412
0.380
0.438
0.428
0.439
0.454
0.431
0.461
0.413
0.343
0.490
0.412
0.399
0.511

0.00453
0.401

0.332

0.00039

0.432

0.357
0.00053

0.522

0.430
0.00190

0.502

0.141
0.00435

0.551

0.454
0.00076

0.507

0.418
0.00180

0.281

0.235

0.00001

0.373

0.309
0.00025

0.435

0.360
0.00544

0.449

0.371
0.00375

0.415

0.344
0.00113

0.441

0.365


55

60

65
Ctm
70

75

80

0.253
0.186
0.224
0.262
0.328
0.319
0.319
0.259
0.280
0.345
0.317
0.361
0.292
0.309
0.325
0.278
0.317
0.237

0.00001
0.221

0.186
0.00128

0.303

0.253
0.00093

0.286

0.239
0.00050

0.341

0.283
0.00027

0.309

0.257
0.00160

0.277

0.231


Phụ lục 6: Ảnh hưởng của tỉ lệ ñường bổ sung ñến tốc ñộ sinh trưởng và khả

năng phân giải cellulose của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Ký hiệu
chủng

A2

C2

C3

C4

C6

C7

Tỷ lệ ñường bổ sung
(%)
0%
0.05%G
0.1%G
0.15%G
0.05%S
0.1%S
0.15%S
0%
0.05%G:
0.1%G:
0.15%G
0.05%S

0.1%S
0.15%S
0%
0.05%G:
0.1%G:
0.15%G
0.05%S
0.1%S
0.15%S
0%
0.05%G:
0.1%G:
0.15%G
0.05%S
0.1%S
0.15%S
0%
0.05%G:
0.1%G:
0.15%G
0.05%S
0.1%S
0.15%S
0%
0.05%G:
0.1%G:
0.15%G

Đường kính vòng thủy
phân (mm)

28.7
29.0
29.7
32.7
29.0
30.7
28.7
34.3
33.0
34.2
30.1
29.7
28.0
30.8
34.5
32.0
31.3
34.8
36.7
30.7
33.5
34.5
31.7
32.7
33.5
32.7
32.5
31.0
28.0
27.2

29.7
29.5
27.3
31.0
31.7
27.3
25.7
26.7
27.7

Tốc ñộ sinh
trưởng sau 5 ngày
nuôi cấy (lần)
6.519
2.359
6.522
3.508
4.931
2.279
2.757
2.082
5.349
12.633
2.531
2.592
3.598
2.854
2.062
3.653
2.719

7.385
1.986
3.974
3.812
5.400
4.169
5.016
3.312
4.262
2.160
2.088
1.037
3.712
3.068
6.316
2.465
2.653
2.438
2.720
4.541
2.333
3.010


Ctm

0.05%S
0.1%S
0.15%S
0%

0.05%G:
0.1%G:
0.15%G
0.05%S
0.1%S
0.15%S

27.7
27.5
29.2
34,3
34.0
21.3
20.6
24.3
17.6
16.8

1.159
1.796
5.879
17,000
3.310
2.267
3.673
2.308
3.766
6.579

Phụ lục 7. Bảng phân tích ảnh hưởng của nhiệt ñộ
Anova: Two-Factor With Replication
SUMMARY

45

50

55

60

65 Total

3
2.688
0.896
0.001108

3
2.357
0.785667
0.00131

3
1.523
0.507667
0.003908

3

1.03
0.343333
0.000956

3
1.275
0.425
0.000829

15
8.873
0.591533
0.04975

3
2.195
0.731667
0.000524

3
2.482
0.827333
0.006465

3
2.313
0.771
0.000147

3

1.62
0.54
0.004483

3
2.308
0.769333
0.000212

15
10.918
0.727867
0.012144

3
2.4
0.8
0.008029

3
2.31
0.77
0.000931

3
1.624
0.541333
0.000165

3

1.036
0.345333
0.00236

3
1.116
0.372
0.001029

15
8.486
0.565733
0.041068

3
2.675
0.891667
0.002249

3
2.592
0.864
0.003913

3
1.96
0.653333
0.003782

3

1.62
0.54
0.000421

3
1.772
0.590667
0.001886

15
10.619
0.707933
0.023832

3
3.614
1.204667
0.000792

3
3.115
1.038333
0.000506

3
2.754
0.918
0.008356

3

1.061
0.353667
0.000972

3
1.325
0.441667
0.000161

15
11.869
0.791267
0.121909

3
2.922
0.974
0.003853

3
2.078
0.692667
0.000992

3
1.589
0.529667
0.000984

3

0.977
0.325667
7.23E-05

3
0.963
0.321
3.9E-05

15
8.529
0.5686
0.065473

3
2.206
0.735333
0.0017

3
2.583
0.861
0.001981

3
2.031
0.677
0.001767

3

1.504
0.501333
0.003314

3
0.937
0.312333
0.000404

15
9.261
0.6174
0.040596

A2
Count
Sum
Average
Variance
C2
Count
Sum
Average
Variance
C3
Count
Sum
Average
Variance
C4

Count
Sum
Average
Variance
C6
Count
Sum
Average
Variance
C7
Count
Sum
Average
Variance
Ctm
Count
Sum
Average
Variance


Total
Count
Sum
Average
Variance

21
18.7
0.890476

0.026306

21
17.517
0.834143
0.012085

21
13.794
0.656857
0.021925

21
8.848
0.421333
0.010281

21
9.696
0.461714
0.024932

ANOVA
Source of
Variation
Sample
Columns
Interaction
Within

SS
0.71287
3.769126
1.056476
0.141214

df

MS
0.118812
0.942281
0.04402
0.002017

F
58.89509
467.0904
21.82069

P-value
2.06E-25
1.15E-49
1.12E-23

Total

5.679685

6
4

24
70
104

F crit
2.231192
2.502656
1.673829