Chương 2 sắc kí LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Chương 2: SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
2.1. Khái niệm
2.1.1. Lịch sử phát triển

•
•

Phươ ng pháp này ra đờ i từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ ph ươ ng pháp
sắc ký cột cổ điển.
Hiện nay phươ ng pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đạ i hoá cao nh ờ s ự phát tri ển
nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích .


•

2.1.2. Các Lực Liên Kết Trong Hệ Sắc Ký.

Chất Phân Tích

Fa

Pha Tĩnh
(Silicagen)

Fb

Fc

Pha Động
(Hexan,metanol,..)

•

2.1.2. Các Lực Liên Kết Trong Hệ Sắc Ký.

•

Châu cho up video Principles of Chromatography.mp4 rồi giải thích . Đây là
phần ví dụ


•
•
•
•

2.1.3. Các lực liên kết trong sắc ký
Lực phân tử
Lực van-de-van( lực phân tán)
Lực tương tác đặc biệt.


•
•

2.1.4. Qúa trính sắc ký và định nghĩa
2.1.4.1. Qúa trình sắc ký

Châu phần này châu cho mở video CHROMATOGRAPHY- Technique for separating
mixtur… mp4 lên nha hảo up vào mà nó ko ok

•
•
•

2.1.4. Qúa trính sắc ký và định nghĩa
2.1.4.2. Định nghĩa
HPLC là kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp trên cột với các đặc điểm sau:

+ Nhồi bằng các hạt có kích thước < 10µm (pha tĩnh).
+ Dùng bơm cao áp có áp suất gần 300 atm với tốc độ dòng vài ml/phút và cho phép
phân giải nhanh một lượng mẫu nhỏ.


•

2.1.4.2. Định nghĩa

b) Khác nhau: so sánh với sắc ký thường

•

Giống nhau:

+ Các lực liên kết trong hệ sắc ký.
+ Qúa trình tách sắc ký.

Sắc ký thường

Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

+ Áp suất thường

+ Áp suất cao gần 300 atm

+ Chiều dài cột lớn( 50 500 cm)

+ Chiều dài cột nhỏ (525cm )

+ Kích thước hạt nhồi cột

+ Kích thước hạt nhồi cột < 10

(150 200
+ Hiệu suất tách không cao

+ Hiệu suất tách cao


2.1.5. Phân Loại.
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:

•
•

Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).

Sắc ký phân bố (partition chromatography).
+ SKPT (normal phase chromatography)

+ sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography).
Sắc ký ion (ion chromatography).

•
•

Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).


2.2 Các kĩ thuật trong phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao:
- Sắc kí lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp ( kĩ thuật) như: sắc kí lỏng
pha lien kết, sắc kí lỏng – rắn, sắc kí trao đổi ion, sắc kí cặp ion…
-Trong đó có 2 kĩ thuật chính, đó là:
+Sắc kí lỏng pha liên kết
+Sắc kí trao đổi ion


2.2.1 Sắc kí lỏng pha liên kết:
2.2.1.1 Pha tĩnh
- Pha tĩnh được gắn hóa học (liên kết) với chất mang (hạt silicagen) tạo nên hợp
chất cơ- siloxan. Silicagen có đặc tính đặc biệt : xốp, bề mặt gồ ghề, có những hạt
mao quản nên diện tích bề mặt lớn
-Trên bề mặt của Silicagen có các nhóm silanol có thể tham gia liên kết với chất
phân tích nên nó dung để tách sắc kí.


* Phân loại:
- Khi dung trực tiếp silicagen(silicagen gắn với các nhóm ankyl có ít cacbon mang
các nhóm phân cực) làm pha tĩnh có thể tách đa dạng hợp chất không phân cực hay
ít phân cực; còn pha động là dung môi không phân cực như hexan, toluene thì ta có

sắc kí pha thường.
- Khi silicagen gắn với nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18) hay phenyl
và pha động là dung môi phân cực như H2O, methanol, acetonitril thì có sắc kí pha
đảo (hay sắc kí pha ngược).


2.2.1.2Pha động:
- Trong sắc kí pha thường , pha động là dung môi không phân cực như benzene, nhexan. Còn trong pha đảo, pha động là dung môi phân cực như nước, methanol…
- Ngoài ra , người ta thường dung hỗn hợp 2 hay 3 dung môi để tạo pha động có độ
phân cực phù hợp;
- Đối với hỗn hợp phân tích thì pha động có thành phần là hỗn hợp các dung môi;
* Các điều kiện thỏa mãn của pha động:

 Trơ với pha tĩnh;
 Hòa tan được mẫu phân tích;
 Bền trong thời gian chạy sắc kí;
 Có độ tinh khiết cao;
 Phù hợp với detector


2.2.1.3.Ứng dụng:
-Phân tích các mẫu trong nông nghiệp;
-Các mẫu sản phẩm trong công nghiệp;
-Các mẫu từ các bệnh viện;
-Mẫu phân tích trong dược phẩm


2.2.2 Sắc kí trao đổi ion
- Ionit được sử dụng là Ionit thiên nhiên ( có đặc điểm: dung lượng trao đổi thấp,
độ lặp lại kém) và ionit tổng hợp( có đặc điểm: dung lượng trao đổi cao, độ bền lí

học và hóa học tốt, độ lặp lại của phép tách sắc kí tốt).
2.2.2.1 Tổng hợp ionit

 Các nhựa trao đổi ion được chế tạo bởi sự đồng trùng hợp giữa styrene và
divinyl benzene với divinyl benzene .

 Các dạng ionit tổng hợp:
 Cationit axit mạnh
 Cationit axit yếu
 Tùy vào bậc amin đưa vào phản ứng mà có anionit bazo mạnh – yếu khác nhau
 Nhựa tạo phức


2.2.2.2 Phân loại ionit
Ionit loại 1: là ionit thể hiện tính chất như axit mạnh hoặc bazo mạnh





Đặc điểm:
Có thể làm việc ở mọi giá trị pH
Dung lượng hấp thu ít thay đổi theo pH
Là ionit đơn chức ( -SO3H )

Ionit loại 2: : là ionit thể hiện tính chất như một axit yếu hoặc bazo yếu
Đặc điểm:






Làm việc ở một giá trị pH xác định
Dung lượng hấp thụ ít thay đổi theo pH
Thường đơn chức


Ionit loại 3: là ionit thể hiện tính chất như axit mạnh và axit yếu hoặc bazo mạnh và
bazo yếu
Đặc điểm: Là ionit đa chức, có 2 giá trị hấp dung



Với cacionit có cả -SO 3H, -COOH, -OH làm việc ở pH cao, khi pH thấp chỉ có -SO
3H làm việc.



Với anionit, ở pH cao amin bậc 4 -N+(R)3OH làm việc ở pH thấp, tất cả các amin
bậc 1, 2, 3, 4 đều làm việc.

Ionit loại 4: : là ionit thể hiện tính chất như một hỗn hợp nhiều axit yếu có Ka khác
nhau hoặc bazo yếu có Kb khác nhau, vì vậy hấp dung của ionit thay đổi lien tục.


•

2.3 Sơ đồ thiết bị sắc kí lỏng hiệu nâng cao:

3 phần chính: Đầu vào – Tách – Phát hiện và xử lý số liệu

Vòng bơm mẫu

Bơm cao áp
Van điều chỉnh tỷ lệ dung môi

Van điều tiết xung
Cột bảo vệ

Cột SK

Bể chứa pha động
Detector


•

2.3.1. Pha động:

-Cột được làm bằng thủy tinh trung tính, có nắp đậy thích hợp để tránh bay hơi dung môi.
- Lọc loại hạt tạp chất: dung môi khi pha thường có lẫn tạp chất→ gây nghẽn cột→ loại bỏ bằng cách
qua một màng mỏng thích hợp.
- Bộ phận khử khí dung môi: Đuổi khí hòa tan trong bình dung môi hoặc trên dòng chảy của pha động
trước khi bơm
- Có thể dung kết hợp hỗn hợp dung môi để rửa giải (gradient).
2.3.2. Hệ thống bơm cao áp:
Dung để hút pha động từ bình chứa dung môi và đẩy chúng qua cột sắc ký.


-Yêu cầu:

+ Tạo áp suất cao: khoảng 250-500 at.
+ Lưu lượng bơm khoảng 0.1-10 ml/phút.
+ Bơm không bị ăn mòn bởi nhiều loại dung môi.
Trong phân tích hay dùng bơm tốc độ hằng định.
-Bơm cơ:
+ Kiểu syringe đẩy dung môi liên tục,
+ Bơm kiểu piston thì đẩy hút luân phiên
2.3.3. Hệ tiêm mẫu ( bơm mẫu):
- Đưa mẫu vào cột, không làm xáo trộn chất nhồi trong cột
- Có thể dùng syringe tiêm qua một tấm đệm đàn hồi
- Trong phương pháp tiêm dòng dừng, người ta dùng bơm và dùng syringe tiêm
mẫu
- Phương pháp phổ biến là dùng một van tiêm có vòng chứa mẫu với dung tích xác
định và chính xác
- Van tiêm có hai vị trí để nạp mẫu và bơm mẫu


(a)Tiêm mẫu vào vòng mẫu

(b) pha động đẩy mẫu vào cột


2.3.4. Lọc tiền cột ( cột bảo vệ)
-Gắn đầu cột chính phân tích.
-Được nhồi chất hấp phụ giống cột chính nhưng kích thước lớn hơn.

⇒Hấp phụ, giữ lại tạp chất trong mẫu phân tích hoặc pha động.
2.3.5. cột HPLC

-Cột bằng thủy tinh dùng ở áp suất thấp (< 50 at) hoặc cột bằng thép không gỉ

được dùng phổ biến, chịu được áp suất cao (đến 500 at).
- Cột dài 10 – 30 cm, đường kính trong d = 4 – 10 mm, hạt chất nhồi cỡ 5 – 10 µm.
Với chất nhồi từ 3 - 5 µm có thể dùng các cột ngắn (3 – 10 cm) và nhỏ (d = 1 – 4
mm). Loại cột này có hiệu lực cao, số đĩa lý thuyết lên đến 100.000 đĩa cho 1 m cột.

•

- Chất nhồi thường là silicagen, có thể dùng nhôm ôxyt, polyme xốp, chất
trao đổi ion.


2.3.6 . Detector
-Trong HPLC có hai loại detector:
+ Loại theo dõi tính chất của pha động : dựa vào tính hóa học hoặc vật lý của pha động có liên quan
đến chất phân tích.
+ Loại theo dõi tính chất của chất phân tích : dựa vào phản ứng đặc trưng của chất phân tích.
- Hai detector thường dùng là
+ Detector quang phổ hấp thụ phân tử;
+ Detector đo độ dẫn


2.4 . Phân loại
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:
-Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn
-Sắc ký phân bố
-Sắc ký
-Sắc ký rây phân tử
Sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không
phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000).

*Một số đại lượng cơ bản trong phân tích sắc ký
-Hệ số phân bố:

Với CS : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh.
CM : nồng độ cấu tử trong pha động.


-

Thời gian lưu:

tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khi tách ra ngồi cột.
tO : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; đó cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là
thời gian lưu chết.
tR' : thời gian lưu thật của một cấu tử.

- Hệ số dung lượng k’: