Nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện trên bề mặt bào từ bacillus subtilis gen mã hoá kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Kiên Cường

NHÂN DÕNG VÀ BIỂU HIỆN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ
Bacillus subtilis GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28 CỦA
VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Kiên Cường

NHÂN DÕNG VÀ BIỂU HIỆN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ
Bacillus subtilis GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28 CỦA
VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM

Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa
2. PGS.TS. Nguyễn Thị Vân Anh

Hà Nội, 2015
1


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trin
̀ h nghiên cƣ́u mà tôi đã th ực hiện dƣới sự
hƣớng dẫn của GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa và PGS.TS. Nguyễn Thị Vân Anh. Các số
liê ̣u, kế t quả nêu trong luâ ̣n án là trung thƣ̣c và chƣ a tƣ̀ng đƣơ ̣c ai công bố trong bấ t
kỳ công trình nào khác.

NCS. Phạm Kiên Cường

2


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến GS.TS.
Phan Tuấn Nghĩa, PGS.TS. Nguyễn Thi ̣ Vân Anh , những người thầy đã tận tình dìu
dắt, hướng dẫn, động viên khích lệ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt
quá trình làm luận án nghiên cứu sinh.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến toàn thể quý thầy, cô trong Bộ môn Sinh lý
thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền
đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của
Cấp ủy thủ trưởng Viện Công nghệ mới, Viện Khoa học và Công nghệ Quân
sự, các anh chị bạn bè đồng nghiệp trong Viện Công nghệ mới, các thành
viên trong nhóm nghiên cứu Phòng Protein tái tổ hợp và Phòng Sinh học
nano và ứng dụng, thuộc Phòng Thí nghi ệm trọng điểm Công nghê ̣ Enzym

và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên .
Tôi xin gửi lời cảm ơn đ ến Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học , Ban Chủ
nhiệm Khoa Sinh học và các Phòng ch ức năng của Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điề u kiê ̣n cho tôi h ọc tập, hoàn thành các
thủ tục cần thiết của một nghiên cứu sinh.
Tôi xin chân thành cám ơn đến TS. Đặng Thị Lụa, Viện nghiên cứu nuôi
trồng thủy sản I và TS. Trần Thị Tuyết Hoa, Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần
Thơ đã nhiệt tình giúp đỡ, cung cấp và chia sẻ thông tin trong quá trình thử ng hiê ̣m
ứng dụng thực tế sản phẩm của đề tài luận án.
Luận án đã được thực hiện với sự tài trợ kinh phí của đề tài thuộc chương
trình Trọng điểm cấp nhà nước do Bộ Khoa học và Công nghệ tài trợ, mã số
KC.04.09/11-15 và bản thân tôi cũng đã được hỗ trợ kính phí làm thực nghiệm với
tư cách là một nghiên cứu sinh của đề tài.
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới bố , mẹ, vợ, con, gia đình, những
người đã luôn bên tôi, cổ vũ, động viên và tạo điề u kiê ̣n thuận lợi nhất cho tôi có thời
gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.
NCS. Phạm Kiên Cường

3


MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC..................................................................................................................1
DANH MỤC CÁC KÝ HIÊU
̣ VÀ CHỮ VIẾT TẮT..............................................3
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................8
DANH MỤC HÌNH .................................................. Error! Bookmark not defined.
MỞ ĐẦU ................................................................... Error! Bookmark not defined.
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................... Error! Bookmark not defined.

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM Error!
Bookmark not defined.
1.1.1. Vị trí phân loại của virus gây bệnh đốm trắng ở tômError! Bookmark not
defined.
1.1.2. Cấu trúc của WSSV ........................................ Error! Bookmark not defined.
1.1.3. Hệ gen của WSSV ........................................... Error! Bookmark not defined.
1.1.4. Bệnh đốm trắng do WSSV gây ra ở tôm......... Error! Bookmark not defined.
1.1.5. Chẩn đoán WSSV ........................................... Error! Bookmark not defined.
1.2. NGHIÊN CỨU TẠO VACCINE DỰA TRÊN KHÁNG NGUYÊN VỎ WSSV
................................................................................... Error! Bookmark not defined.
1.2.1. Một số biện pháp phòng chống WSSV ........... Error! Bookmark not defined.
1.2.2. Protein VP28 và nghiên cứu tạo vaccine phòng WSSVError! Bookmark not
defined.
1.2.3. Các protein bề mặt khác và nghiên cứu tạo vaccine phòng WSSV ........ Error!
Bookmark not defined.
1.3. BÀO TỬ B. subtilis VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN NGOẠI LAI TRÊN BỀ MẶT
BÀO TỬ TRONG NGHIÊN CỨU TẠO VACCINEError!

Bookmark

not

Bookmark

not

defined.
1.3.1. Bào tử B. subtilis và đặc tính hình thành bào tửError!
defined.
1.3.2. Một số protein bề mặt của B. subtilis .............. Error! Bookmark not defined.

4


1.3.3. Biểu hiện protein ngoại lai trên bề mặt bào tử Error! Bookmark not defined.
2.1. NGUYÊN LIỆU ................................................. Error! Bookmark not defined.
2.1.1. Mẫu tôm thử nghiệm ....................................... Error! Bookmark not defined.
2.1.2. Các hoá chất và nguyên vật liệu...................... Error! Bookmark not defined.
2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ ................. Error! Bookmark not defined.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................... Error! Bookmark not defined.
2.3.1. Thu nhận virus gây bệnh đốm trắng từ mẫu tôm nhiễm bệnh ................ Error!
Bookmark not defined.
2.3.2 Nuôi cấy tạo bào tử B. subtilis ......................... Error! Bookmark not defined.
2.3.3. Tách chiết, định lƣợng DNA ........................... Error! Bookmark not defined.
2.3.4. Nhân dòng, biểu hiện VP28 trong E. coli và B. subtilisError! Bookmark not
defined.
2.3.5. Phát hiện, định lƣợng và tinh sạch VP28 ........ Error! Bookmark not defined.
2.3.6. Thử nghiệm khả năng phòng WSSV của bào tử B. subtilis tái tổ hợp ... Error!
Bookmark not defined.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............ Error! Bookmark not defined.
3.1. NHÂN DÕNG, XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ VÀ MỘT SỐ ĐẶC TRƢNG CỦA
GEN vp28 TỪ CÁC MẪU WSSV THU NHẬN Ở VIỆT NAMError!

Bookmark

not defined.
3.1.1. Nhân bản đoa ̣n gen mã hóa VP28 bằ ng PCR .. Error! Bookmark not defined.
3.1.2. Nhân dòng gen mã hóa VP28 vào vector pGEM-TError!

Bookmark

not

defined.
3.1.3. Xác định trình tự và nghiên cứu tính đa hình của gen mã hóa VP28 ..... Error!
Bookmark not defined.
3.2. NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA VP28Error!

Bookmark

not

defined.
3.2.1. Biể u hiê ̣n VP28 bằng hệ thống vector pET28b trong E. coli .................. Error!
Bookmark not defined.

5


3.2.2. Biểu hiện VP28 dạng dung hợp với protein CotB trên bề mặt bào tử B.
subtilis ....................................................................... Error! Bookmark not defined.
3.3. KHẢ NĂNG PHÕNG BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM THẺ CHÂN
TRẮNG CỦA BÀO TỬ B. subtilis BIỂU HIỆN VP28 TRÊN BỀ MẶT ........ Error!
Bookmark not defined.
3.3.1. Sự tồn tại của bào tử B. subtilis biểu hiện VP28 trong ruột tôm thẻ chân trắng
................................................................................... Error! Bookmark not defined.
3.3.2. Khả năng kích thích miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng của bào tử B. subtilis
biểu hiện VP28 .......................................................... Error! Bookmark not defined.
3.3.3. Đánh giá khả năng bảo hộ trên tôm thẻ chân trắng của bào tử tái tổ hợpError!
Bookmark not defined.

KẾT LUẬN ............................................................... Error! Bookmark not defined.
KIẾN NGHỊ .............................................................. Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN
LUẬN ÁN ................................................................. Error! Bookmark not defined.
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................9

6


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
BCIP

5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate

BSA

Albumin huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin)

Cm

Chloramphenicol

dNTP

Deoxyribonucleoside triphosphate

DSM

Môi trƣờng tạo bào tử Difco (Difco Sporulation medium)

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

GST

Glutathione S-transferase

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

kDa

Kilodalton

LB

Luria Bertani

NBT

p- nitro blue tetrazolium chloride

PAGE

Điện di gel polyacrylaminde (Polyarylamide Gel Electrophoresis)

PBS

Muối chứa đệm phosphate (Phosphate Buffered Saline)

PCR

Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)

PVDF

Polyvinylidere Fluoride

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

GST

Glutathione S-transferase

TSA

Tryptic Soy Agar

TTFC

Phân đoạn đầu C của độc tố uốn ván (C- terminal fragment of the
tetanus toxin)

WSSV

Virus gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus)

7


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Tên gọi của virus gây bệnh đốm trắng qua từng giai đoạn .............. Error!
Bookmark not defined.
Bảng 1.2: Các gen mã hóa protein cấu trúc của WSSV ......... Error! Bookmark not
defined.
Bảng 1.3: Một số giáp xác nhiễm bệnh đốm trắng .. Error! Bookmark not defined.
Bảng 1.4: Các chiến lƣợc vaccine chống WSSV để bảo vệ tôm ... Error! Bookmark
not defined.
Bảng 1.5: Một số protein trong lớp áo bào tử vi khuẩn B. subtilis Error! Bookmark
not defined.
Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi sƣ̉ du ̣ng trong nghiên cƣ́u nhân bản và biể u hiê ̣n gen
vp28 ........................................................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR ....................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng Real-time PCR ...... Error! Bookmark not defined.
Bảng 2.4: Thành phần gel cô và gel tách acrylamide trong SDS-PAGE .......... Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3. 1: Các mẫu tôm nhiễm WSSV thu nhận từ các địa điểm khác nhau ... Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.2: Một số sai khác về trình tự nucleotide và acid amin của VP28 thu nhận tại
Việt Nam so với trình tự đã công bố (AY168644) ... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.3: Sự hình thành sinh khối bào tử B. subtilis tái tổ hợp trên một số môi
trƣờng khác nhau ....................................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.4: Sự hình thành bào tử tái tổ hợp trên môi trƣờng DSM ở các thời gian
khác nhau................................................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.5: Độ sống vi khuẩn ở mẫu thức ăn trộn bào tử B. subtilis biểu hiện VP28
................................................................................... Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.6: Số copy trong từng dung dịch WSSV ...... Error! Bookmark not defined.

8


TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tiếng Việt
1. Đoàn Văn Cƣờng, Phạm Thị Tuyết Anh, Ngô Xuân Tuyến, Nguyễn Văn Hảo
(2007), "Xác định quá trình phát sinh bệnh của virus gây hội chứng đốm trắng",
Tuyển tập nghề các sông Cửu Long, pp. 265-278.
2. Nguyễn Viết Dũng, Ngô Xuân Tuyến, Phạm Võ Ngọc Ánh , Trƣơng Hồng Việt,
Nguyễn Văn Hảo (2007), "Đặc trƣng bộ gen và hình thái của virus gây hội
chứng đốm trắng trên tôm sú nuôi Penaeus monodon phân lập tại Việt Nam",
Tạp chí Viện nghiên cứu nuôi trông thủy sản II, pp. 222- 230.
3.Huỳnh Trƣờng Giang, Vũ Ngọc Öt, Trƣơng Quốc Phú (2011), "Sử dụng chiết suất
β-Glucan từ rong biển để tăng sức đề kháng của tôm biển: Tổng quan", Kỷ yếu
Hội nghị Khoa học thủy sản lần 4, pp. 103-113.
4. Nguyễn Văn Hảo, Lâm Trâm Anh, Phạm Thị Tuyết Anh, Đoàn Văn Cƣờng, Ngô
Xuân Tiến, Nguyễn Thị Hiền (2007), "Xây Dựng mô hình gây bệnh thực
nghiệm chuẩn đối với bệnh đốm trắng trên tôm sú Penaeus monodon", Tuyển
tập nghề các sông Cửu Long, pp. 257-264.
5. Trần Thị Minh Tâm (1999), "Bệnh thường gặp ở tôm phương pháp chẩn đoán và
phòng trị". Nhà xuất bản Nông nghiệp. 126 trang.
6. Bùi Quang Tề (2003), Bệnh của tôm nuôi và biện pháp phòng trị, Nhà xuất bản
Nông Nghiệp, Thành Phố Hồ Chí Minh. 184 trang.
7. Đỗ Thị Thảo; Đỗ Thị Phƣơng; Đỗ Khắc Hiếu; Hà Thị Thu; Đinh Thƣơng
Vân; Đinh duy Kháng; Lê Trần Bình (2008), "Tạo dòng tế bào lai sản xuất
kháng thể đơn dòng kháng protein vỏ VP28 của virus gây bệnh đốm trắng trên
tôm sú", Tạp chí Công nghệ Sinh học 2, 203-208
8. Tổng cục thủy sản (2010), Báo cáo về thành tựu thủy sản năm 2010 và phương

hướng hoạt động năm 2011, Hà Nội. 23 trang.
9. Phan Thị Phƣợng Trang, Nguyễn Đức Hoàng, Trần Linh Thƣớc (2003),
"Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa protein vỏ VP28 của virus gây hội

9


chứng đốm trắng WSSV trên sú trong E. coli", Tạp chí Công nghệ Sinh
học 1, pp. 47-55.
II. Tiếng Anh
10.

Amparyup

P.,

Charoensapsri

W.,

Tassanakajon

A.

(2009),

"Two

prophenoloxidases are important for the survival of Vibrio harveyi challenged
shrimp Penaeus monodon", Developmental and Comparative Immunology 33,

pp. 247-256.
11. Balasubramanian G., Sarathi M., Venkatesan C., Thomas J., Sahul-Hameed A.
S. (2008), "Oral administration of antiviral plant extract of Cynodon dactylon
on a large scale production against white spot syndrome virus (WSSV) in
Penaeus monodon", Aquaculture 279, pp. 2–5.
12. Bradford (1976). "A dye binding assay for protein". Analytical Biochemistry 72,
pp. 248-254.
13. Braunig P., Rosa R. D. D., Caroline C. H. S. H., Borsa M., Stoco P. H.,
Edmundo E. C. C. G., Pinto A. R. (2011), "Molecular cloning and recombinant
expression of the VP28 carboxyl-terminal hydrophilic region from a brazilian
white spot syndrome virus isolate", Brazilian Archives of Biology and
Technology 54, pp. 399-404.
14. Bright S. I. S., Manjusha M., Pai S. S., Philip R. (2005), "Fenneropenaeus
indicus is protected from white spot disease by oral administration of
inactivated white spot syndrome virus", Diseases of Aquatic Organisms 66, pp.
265-270.
15. Cai S., Huang J., Wang C., Song X., Sun X., Yu J. (1995), "Epidemiological
studies on explosive epidemic disease of prawn 1994-1994", Journal of
Fisheries China 19, pp. 112-117.
16. Caipang C. M., Verjan N., Ooi E. L., Kondo H., Hirono I., Aoki T., Kiyono H.,
Yuki Y. (2008), "Enhanced survival of shrimp, Penaeus (Marsupenaeus)
japonicus from white spot syndrome disease after oral administration of

10


recombinant VP28 expressed in Brevibacillus brevis", Fish and Shellfish
Immunology 25, pp. 315-320.
17. Campadelli-Fiume G., Amasio M., Avitabile E., Cerretani A., Forghieri C.,
Gianni T., Menotti L. (2007), "The multipartite system that mediates entry of

herpes simplex virus into the cell", Reviews in Medical Virology 17, pp. 313326.
18. Cerenius L., Lee B. L., Soderhall K. (2008), "The proPO-system: pros
and cons for its role in invertebrate immunity", Trends in Immunology
29, pp. 263-271.
19. Cerenius L., Soderhall K. (2004), "The prophenoloxidase-activating system in
invertebrates", Immunological Reviews 198, pp. 116-126.
20. Chang C. F., Su M. S., Chen H. Y., Lo C. F., Kou G. H., Liao I. C. (1999),
"Effect of dietary b-1,3-glucan on resistance to white spot syndrome virus
(WSSV) in postlarval and juvenile Penaeus monodon", Diseases of Aquatic
Organisms 36, pp. 163–168.
21. Chang Y. S., Liu W. J., Lee C. C., Chou T. L., Lee Y. T., Wu T. S., Huang J.
Y., Huang W. T., Lee T. L., Kou G. H., Wang A. H., Lo C. F. (2010), "A 3D
model of the membrane protein complex formed by the white spot syndrome
virus structural proteins", PloS One 5, pp. 10718-10728.
22. Chazal N., Gerlier D. (2003), "Virus entry, assembly, budding, and membrane
rafts", Microbiology and Molecular Miology Reviews 67, pp. 226-237.
23. Chen L. L., Leu J. H., Huang C. J., Chou C. M., Chen S. M., Wang C. H., Lo C.
F., Kou G. H. (2002), "Identification of a nucleocapsid protein (VP35) gene of
shrimp white spot syndrome virus and characterization of the motif important
for targeting VP35 to the nuclei of transfected insect cells", Virology 293, pp.
44-53.
24. Citarasu T., Sivaram V., Immanuel G., Rout N., Murugan V. (2006), "Influence
of selected Indian immunostimulant herbs against white spot syndrome virus
(WSSV) infection in black tiger shrimp, Penaeus monodon with reference to

11


haematological, biochemical and immunological changes", Fish and Shellfish
Immunology 21, pp. 372-384.

25. Do T. T. H., Jasmani S., Jayasankar V., Wilder M. (2010), "Na/K-ATPase
activity and osmo-ionic regulation in adult whiteleg shrimp Litopenaeus
vannamei exposed to low salinities", Aquaculture 304, pp. 88-94.
26. Do T. T. H., Wang T., Bayley M., Phuong T. N. (2010), "Osmoregulation,
growth and moulting cycles of the giant freshwater prawn (Macrobrachium
rosenbergii) at different salinities", Aquaculture 41, pp. 135-143.
27. Driks A. (1999), "Bacillus subtilis spore coat", Microbiology and Molecular
Biology Reviews 63, pp. 1-20.
28. Duc L. H., Cutting S. M. (2003), "Bacterial spores as heat stable vaccine
vehicles", Expert Opinion on Biological Therapy 3, pp. 1263-1270.
29. Durand D., Lightner D. V., Nunan L. M., Redman R. M., Mari J., Bonami J. R.
(1996), "Application of gene probes as diagnostic tools for White Spot
Baculovirus (WSBV) of Penaeid shrimp", Diseases of Aquatic Organisms 27,
pp. 59–66.
30. Durand S., Lightner D. V., Redman R. M., J.R J. R. B. (1997), "Ultrastructure
and morphogenesis of white spot syndrome baculovirus (WSSV)", Diseases of
Aquatic Organisms 29, pp. 205–211.
31. Escobedo-Bonilla C. M., Vega-Peña S., Mejía-Ruiz C. H. (2015), "Efficacy of
double-stranded RNA against white spot syndrome virus (WSSV) nonstructural (orf89, wsv191) and structural (vp28, vp26) genes in the Pacific white
shrimp Litopenaeus vannamei ", Journal of King Saud University - Science 27,
pp. 182–188
32. Flegel T. W. (1997), "Major viral diseases of the black tiger prawn (Penaeus
monodon) in Thailand", World Journal of Microbiology and Biotechnology 13,
pp. 433–442.
34. Fu L. L., Shuai J. B., Xu Z. R., Li J. R., Li W. F. (2010), "Immune responses of
Fenneropenaeus chinensis against white spot syndrome virus after oral delivery

12

of VP28 using Bacillus subtilis as vehicles", Fish and Shellfish immunology 28,
pp. 49-55.
35. Hao N. V., Te B. Q., Loan L. T. P., Yen L. T. P., Thanh L. M. (1997),
"Pathogens in cultured shrimp in Southern Vietnam. In: Flegel TW and MacRae
IH Diseases in Asian aquaculture III", Fish health section, Asian Fisheries
Society Manila, pp. 233–239.
36. Harwood C. R., Cutting S. M. (1990), "Molecular Biological Methods for
Bacillus", Chichester, England., John Wiley & Sons Ltd. Chichester United
Kingdom, pp. 27–74.
37. Hoffmann J. A., Reichhart J. M. (2002), "Drosophila innate immunity: an
evolutionary perspective", Nature Immunology 3, pp. 121-126.
38. Hou C. L., Cao Y., Xie R. H., Wang Y. Z., Du H. H. (2011), "Characterization
and diagnostic use of a monoclonal antibody for VP28 envelope protein of
white spot syndrome virus", Virologica Sinica 26, pp. 260-266.
39. Huang C., Zhang X., Lin Q., Xu X., Hu Z., Hew C. L. (2002), "Proteomic
analysis of shrimp white spot syndrome viral proteins and characterization of a
novel envelope protein VP466", Molecular and Cellular Proteomics 1, pp. 223231.
40. Huang J., Song X. L., Yu J., Yang C. H. (1995), "Baculoviral hypodermal and
hematopoietic necrosis - study on the pathogen and pathology of the explosive
epidemic disease of shrimp", Marine Fish Research 16, pp. 1–10.
41. Inouye K., Yamano K., Ikeda N., Kimura T., Nakano H., Momoyama K.,
Kobayashi J., Miyajima S. (1996), "The penaeid rod-shaped DNA virus
(PRDV), which causes penaeid acute viremia (PAV)", Fish Pathology 31, pp.
39-45.
42. Isticato R., Cangiano G., Tran H. T., Ciabattini A., Medaglin D., Oggioni M. R.,
Felice M. D., Pozzi G. (2001), "Surface display of recombinant proteins on
Bacillus subtilis spores", Journal of Bacteriology 183, pp. 294–301.

13

43. Jariyapong P., Weerachatyanukul W., Direkbusarakom S., Hirono I.,
Wuthisuthimethavee S., Chotwiwatthanakun C. (2015), "Enhancement of
shrimp immunity against white spot syndrome virus by Macrobrachium
rosenbergii nodavirus-like particle encapsulated VP28 double-stranded RNA",
Aquaculture 446, pp.325–332
44. Jha R. K., Xu Z. R. (2005), "Production of recombinant enveloped structural
proteins from the Chinese WSSV isolate", Indian Journal of Clinical
Biochemistry 20, pp. 136-141.
45. Jha R. K., Xu Z. R., Bai S. J., Sun J. Y., Li W. F., Shen J. (2007), "Protection of
Procambarus clarkii against white spot syndrome virus using recombinant oral
vaccine expressed in Pichia pastoris", Fish and Shellfish Immunology 22, pp.
295-307.
46. Jiang Y. S., Zhan W. B., Wang S. B., Xing J. (2006), "Development of primary
shrimp hemocyte cultures of Penaeus chinensis to study white spot syndrome
virus (WSSV) infection", Aquaculture 253, pp. 114–119.
47. Jiravanichpaisal P., Soderhall K., Soderhall I. (2004), "Effect of water
temperature on the immune response and infectivity pattern of white spot
syndrome virus (WSSV) in freshwater crayfish", Fish and Shellfish
Immunology 17, pp. 265-275.
48. Jiravanichpaisal P., Soderhall K., Soderhall I. (2006), "Characterization of white
spot syndrome virus replication in in vitro-cultured haematopoietic stem cells of
freshwater crayfish, Pacifastacus leniusculus", Journal of General Virology 87,
pp.847–854
49. Kono T., Biswas G., Fall J., Mekata T., Hikima J., Itami T., Sakai M. (2015),
"Adjuvant effects of poly I:C and imiquimod on the immunization of kuruma
shrimp (Marsupenaeus japonicus) with a recombinant protein, VP28 against
white spot syndrome virus", Aquaculture 446, pp. 236–241.
50. Kim C. S., Kosuke Z., Nam Y. K., Kim S. K., Kim K. H. (2007), "Protection of
shrimp (Penaeus chinensis) against white spot syndrome virus (WSSV)

14


challenge by double-stranded RNA", Fish and Shellfish Immunology 23, pp.
242-246.
51. Lan Y., Lu W., Xu X. (2002), "Genomic instability of prawn white spot
bacilliform virus (WSBV) and its association to virus virulence", Virus
Research 90, pp. 269-274.
52. Lee S. Y., Soderhall K. (2002), "Early events in crustacean innate immunity",
Fish and Shellfish Immunology 12, pp. 421-437.
53. Laemmli (1970). "Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the
Head of Bacteriophage T4". Nature 227: 680 - 685.
54. Leu J. H., Tsai J. M., Wang H. C., Wang A. H., Wang C. H., Kou G. H.,
Lo C. F. (2005), "The unique stacked rings in the nucleocapsid of the
white spot syndrome virus virion are formed by the major structural
protein VP664, the largest viral structural protein ever found", Journal
of Virology 79, pp. 140-149.
55. Leu J. H., Yang F., Zhang X., Xu X., Kou G. H., Lo C. F. (2009),
"Whispovirus", Current Topics in Microbiology and Immunology 328, pp. 197227.
56. Li L., Cutting M. S. (2008), "Bacillus subtilis spore vaccines: use of glutathione
S-transferase", The Conference Clostridium perfringens, 1st – 4th December
2008, in Torquay, Devon, UK, pp.31
57. Li Q., Chen Y., Yang F. (2004), "Identification of a collagen-like protein gene
from white spot syndrome virus", Archives of Virology 149, pp. 215-223.
58. Li X., Liu Q. H., Huang J. (2010), "Effect of VP28 DNA vaccine on white spot
syndrome virus in Litopenaeus vannamei", Aquaculture International 18, pp.
1035–1044.
59. Li Z., Lin Q., Chen J., Wu J. L., Lim T. K., Loh S. S., Tang X., Hew C. L.
(2007), "Shotgun identification of the structural proteome of shrimp white spot

syndrome virus and iTRAQ differentiation of envelope and nucleocapsid
subproteomes", Molecular and Cellular Proteomics 6, pp. 1609-1620.

15


60. Lightner D. V. (1999), "The penaeid shrimp viruses TSV, IHHNV, WSSV, and
YHV: current status in the Americas, available diagnostic methods and
management strategies", Journal of Applied Aquaculture 9, pp. 27–52.
61. Lin S. T., Chang Y. S., Wang H. C., Tzeng H. F., Chang Z. F., Lin J. Y., Wang
C. H., Lo C. F., Kou G. H. (2002), "Ribonucleotide reductase of shrimp white
spot syndrome virus (WSSV): expression and enzymatic activity in a
baculovirus/insect cell system and WSSV-infected shrimp", Virology 304, pp.
282-290.
62. Liu W. J., Chang Y. S., Wang A. H., Kou G. H., Lo C. F. (2007), "White spot
syndrome virus annexes a shrimp STAT to enhance expression of the
immediate-early gene ie1", Journal of Virology 81, pp. 1461-1471.
63. Lo C. F., Ho C. H., Peng S. E., Chen C. H., Hsu H. C., Chiu Y. L., Chang C. F.,
Liu K. F., Su M. S., Wang C. H., Kou G. H. (1996), "White spot syndrome
baculovirus (WSBV) detected in cultured and captured shrimp, crabs and other
arthropods", Diseases of Aquatic Organisms 27, pp. 215-225.
64. Lo C. F., Kou G. H. (1998), "Virus-associated white spot syndrome of shrimp in
Taiwan: A review", Fish Pathology 33, pp. 365-371.
65. Lu Y., Tapay L. M., Gose R. B., Brock J. A., Loh P. C. (1997), "Infectivity of
Yellow Head Virus (YHV) and the Chinese baculo-like virus (CBV) in two
species of penaeid shrimp Penaeus stylirostris (Stimpson) and Penaeus
vannamei (Boone). In: Diseases in Asian Aquaculture III, Flegel TW and
MacRae IH, (Eds)", Asian Fisheries Society, Manila, the Philippines, pp. 297–
304.
66. Luna-Acosta A., Thomas-Guyon H., Amari M., Rosenfeld E., Bustamante P.,

Fruitier-Arnaudin I. (2011), "Differential tissue distribution and specificity of
phenoloxidases from the Pacific oyster Crassostrea gigas", Comparative
Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry and Molecular Biology
159, pp. 220-226.

16


67. Marks H., Goldbach R. W., Vlak J. M., Van Hulten M. C. (2004), "Genetic
variation among isolates of White spot syndrome virus", Archives of Virology
149, pp. 673-697.
68. McCord J.M., Fridovich I. (1969), "Superoxidase dismutase, an enzymic
function for erythrocuprein (hemocuprein)", Journal of Biological Chemistry .
244, pp. 6049 –6055
69. Mejia-Ruiz C. H., Vega-Pena S., Alvarez-Ruiz P., Escobedo-Bonilla C. M.
(2011), "Double-stranded RNA against white spot syndrome virus (WSSV)
vp28 or vp26 reduced susceptibility of Litopenaeus vannamei to WSSV, and
survivors exhibited decreased susceptibility in subsequent re-infections",
Journal of Invertebrate Pathology 107, pp. 65-68.
70. Mu Y., Lan J. F., Zhang X. W., Wang X. W., Zhao X. F., Wang J. X. (2012), "A
vector that expresses VP28 of WSSV can protect red swamp crayfish from
white spot disease", Developmental and Comparative Immunology 36, pp. 442449.
71. Nakano H., Koube H., Umezawa S., Momoyama K., Hiraoka M., Inouye K.,
Oseko S. (1994), "Mass mortalities of cultured kuruma shrimp, Penaeus
japonicus, in Japan in 1993: epizootiological survey and infection trials", Fish
Pathology 29, pp. 135–139.
72. Namikoshi A., Wu J. L., Yamashita T., Nishizawa T., Nishioka T., Arimoto M.,
Muroga K. (2004), "Vaccination trials with Penaeus japonicus to induce
resistance to white spot syndrome virus", Aquaculture 229, pp. 25–35.
73. Nguyen V. A., Huynh H. A., Hoang T. V., Ninh N. T., Pham A. T., Nguyen H.

A., Phan T. N., Cutting S. M. (2013), "Killed Bacillus subtilis spores expressing
streptavidin: a novel carrier of drugs to target cancer cells", Journal of Drug
Targeting 21, pp. 528-541.
74. Ning D., Leng X., Li Q., Xu W. (2011), "Surface-displayed VP28 on
Bacillus subtilis spores induce protection against white spot syndrome

17


virus in

crayfish

by

oral

administration",

Journal

of

Applied

Microbiology 111, pp. 1327-1336.
75. Ning J. F., Zhu W., Xu J. P., Zheng C. Y., Meng X. L. (2009), "Oral delivery of
DNA vaccine encoding VP28 against white spot syndrome virus in crayfish by
attenuated Salmonella typhimurium", Vaccine 27, pp. 1127-1135.
76. Perazzolo L. M., Barracco M. A. (1997), "The prophenoloxidase activating

system of the shrimp Penaeus paulensis and associated factors", Developmental
and Comparative Immunology 21, pp. 385-395.
77. Rahman M. N., Corteel M., Wille M., Aldaysanz V., Pensaert M. B., Sorgeloos
P., Nauwynck H. J. (2007), "The effect of raising water temperature to 33oC in
Penaeus vannamei juveniles at different stages of infection with white spot
syndrome virus (WSSV)", Aquaculture 272, pp. 240–245.
78. Rajeshkumar S., Venkatesan C., Sarathi M., Sarathbabu V., Thomas J., Anver
Basha K., Sahul Hameed A. S. (2009), "Oral delivery of DNA construct using
chitosan nanoparticles to protect the shrimp from white spot syndrome virus
(WSSV)", Fish and Shellfish Immunology 26, pp. 429-437.
79. Rameshthangam P., Ramasamy P. (2007), "Antiviral activity of bis(2methylheptyl)phthalate isolated from Pongamia pinnata leaves against White
Spot Syndrome Virus of Penaeus monodon Fabricius", Virus Research 126, pp.
38-44.
80. Reske A., Pollara G., Krummenacher C., Chain B. M., Katz D. R. (2007),
"Understanding HSV-1 entry glycoproteins", Reviews in Medical Virology 17,
pp. 205-215.
81. Robalino J., Browdy C. L., Prior S., Metz A., Parnell P., Gross P., Warr G.
(2004), "Induction of antiviral immunity by double-stranded RNA in a marine
invertebrate", Journal of Virology 78, pp. 10442-10448.
82. Robalino J., Payne C., Parnell P., Shepard E., Grimes A. C., Metz A., Prior S.,
Witteveldt J., Vlak J. M., Gross P. S., Warr G., Browdy C. L. (2006),
"Inactivation of White Spot Syndrome Virus (WSSV) by normal rabbit serum:

18


implications for the role of the envelope protein VP28 in WSSV infection of
shrimp", Virus Research 118, pp. 55-61.
83. Rout N., Kumar S., Jaganmohan S., Murugan V. (2007), "DNA vaccines
encoding viral envelope proteins confer protective immunity against WSSV in

black tiger shrimp", Vaccine 25, pp. 2778-2786.
84. Sarathi M., Simon M. C., Ahmed V. P., Kumar S. R., Hameed A. S. (2008),
"Silencing VP28 gene of white spot syndrome virus of shrimp by bacterially
expressed dsRNA", Marine Biotechnology (NY) 10, pp. 198-206.
85. Sathish S., Musthaq S., Hameed A. S. S., Narayanan R. B. (2004), "Production
of recombinant structure protein from the Indian WSSV", Aquaculture 242, pp.
69-80.
86 Sharma S. R., Shankar K. M., Sathyanarayana M. L., Sahoo A. K., Patil R.,
Narayanaswamy H. D., Rao S. (2010), "Evaluation of immune response and
resistance to diseases in tiger shrimp, Penaeus monodon fed with biofilm of
Vibrio alginolyticus", Fish and Shellfish Immunology 29, pp. 724-732.
87. Sithigorngul P., Chauychuwong P., Sithigorngul W., Longyant S.,
Chaivisuthangkura P., Menasveta P. (2000), "Development of a monoclonal
antibody specific to yellow head virus (YHV) from Penaeus monodon",
Diseases of Aquatic Organisms 42, pp. 27-34.
88. Söderhäll K. (1999), "Invertebrate immunity", Developmental and Comparative
Immunology 23, pp. 263–266.
89. Sritunyalucksana K., Söderhäll K. (2000), "The proPO and clotting system in
crustaceans", Aquaculture 191, pp. 53–69.
90. Sritunyalucksana K., Wannapapho W., Lo C. F., Flegel T. W. (2006), "PmRab7
is a VP28-binding protein involved in white spot syndrome virus infection in
shrimp", Journal of Virology 80, pp. 10734-10742.
91. Syed M. S., Kwang J. (2011), "Oral vaccination of baculovirus-expressed VP28
displays enhanced protection against White Spot Syndrome Virus in Penaeus
monodon", PloS One 6, p e26428.

19


92. Syed M.S, Kwang J. (2015), "Reprint of “Evolution of specific immunity in

shrimp – A vaccination perspective against white spot syndrome virus”",
Developmental & Comparative Immunology 48, pp.342–353
93. Syedmusthaq S., Yoganandhan K., Sudhakaran R., Hameed A. S. S. (2006),
"Neutralization of white spot syndrome virus of shrimp by antiserum raised
against recombinant VP28", Aquaculture 253, pp. 98–104.
94. Takahashi Y., Fukuda K., Kondo M., Chongthaleong A., Nishi K., Nishimura
M., Ogata K., Shinya I., Takise K., Fujishima Y., Matsumaura M. (2003),
"Detection and prevention of WSSV infection in cultured shrimp", Asian
Aquaculture Magazine. November/December 2003, pp. 25–27.
95. Takahashi Y., Itami T., Kondo M., Maeda M., Fujii R., Tomonaga S.,
Supamattaya K., Boonyaratpalin S. (1994), "Electron microscopic evidence of
bacilliform virus infection in Kuruma shrimp (Penaeus japonicus)", Fish
Pathology 29, pp. 121–125.
96. Takahashi Y., Kondo M., Itami T., Honda T., Inagawa H., Nishizawa T., Soma
G. I., Yokomizo Y. (2000), "Enhancement of disease resistance against penaeid
acute viraemia and induction of virus-inactivating activity in haemolymph of
kuruma shrimp, Penaeus japonicus, by oral administration of Pantoea
agglomerans lipopolysaccharide (LPS)", Fish and Shellfish Immunology 10, pp.
555-558.
97. Tang X., Wu J., Sivaraman J., Hew C. L. (2007), "Crystal structures of major
envelope proteins VP26 and VP28 from white spot syndrome virus shed light
on their evolutionary relationship", Journal of Virology 81, pp. 6709-6717.
98. Tassanakajon A., Somboonwiwat K., Supungul P., Tang S. (2013), "Discovery
of immune molecules and their crucial functions in shrimp immunity", Fish and
Shellfish Immunology 34, pp. 954-967.
99. Thomas A., Sudheer N. S., Viswanathan K., Kiron V.,

Singh I. S. B.,

Narayanan R. B. (2014), "Immunogenicity and protective efficacy of a major

White Spot Syndrome Virus (WSSV) envelope protein VP24 expressed in

20


Escherichia coli against WSSV", Journal of Invertebrate Pathology 123, pp.
17–24.
100. Tran T. T. H., Phuong T. N., Vlak J. (2008), "High variation of tandem repeat
sequences in ORF94 among WSSV outbreak strains in the Mekong Delta,
Vietnam", Handbook & Abstracts of the 7th Symposium on Diseases in Asian
Aquaculture,. Taipei, Taiwan, pp. 222 - 222.
101. Tsai J. M., Wang H. C., Leu J. H., Hsiao H. H., Wang A. H., Kou G. H., Lo C.
F. (2004), "Genomic and proteomic analysis of thirty-nine structural proteins of
shrimp white spot syndrome virus", Journal of Virology 78, pp. 11360-11370.
102. Tseng D. Y., Ho P. L., Huang S. Y., Cheng S. C., Shiu Y. L., Chiu C. S., Liu
C. H. (2009), "Enhancement of immunity and disease resistance in the white
shrimp, Litopenaeus vannamei, by the probiotic, Bacillus subtilis E20", Fish
and Shellfish Immunology 26, pp. 339-344.
103. Van Hulten M. C., Goldbach R. W., Vlak J. M. (2000), "Three functionally
diverged major structural proteins of white spot syndrome virus evolved by
gene duplication", The Journal of General Virology 81, pp. 2525-2529.
104. Van Hulten M. C., Tsai M. F., Schipper C. A., Lo C. F., Kou G. H., Vlak J. M.
(2000), "Analysis of a genomic segment of white spot syndrome virus of shrimp
containing ribonucleotide reductase genes and repeat regions", The Journal of
General Virology 81, pp. 307-316.
105. Van Hulten M. C., Tsawestenberg M., Goodall S. D., Vlak J. M. (2000),
"Identification of two major virion protein genes of white spot syndrome virus
of shrimp", Virology 266, pp. 227-236.
106 Van Hulten M. C., Vlak J. M. (2001), "Identification and phylogeny of a
protein kinase gene of white spot syndrome virus", Virus Genes 22, pp. 201207.

107. Van Hulten M. C., Witteveldt J., Peters S., Kloosterboer N., Tarchini R., Fiers
M., Sandbrink H., Lankhorst R. K., Vlak J. M. (2001), "The white spot
syndrome virus DNA genome sequence", Virology 286, pp. 7-22.

21


108. Van Hulten M. C., Witteveldt J., Snippe M., Vlak J. M. (2001), "White spot
syndrome virus envelope protein VP28 is involved in the systemic infection of
shrimp", Virology 285, pp. 228-233.
109. Vaseeharan B., Prem Anand T., Murugan T., Chen J. C. (2006), "Shrimp
vaccination trials with the VP292 protein of white spot syndrome virus", Letters
in Applied Microbiology 43, pp. 137-142.
110. Venegas C. A., Nonaka L., Mushiake K., Nishizawa T., Murog K. (2000),
"Quasi-immune response of Penaeus japonicus to penaeid rod-shaped DNA
virus (PRDV)", Diseases of Aquatic Organisms 42, pp. 83-89.
111. Wang C. S., Tang K. F. J., Kou G. H., Chen S. N. (1996), "Yellow head
disease-like virus infection in the kuruma shrimp Penaeus japonicus cultured in
Taiwan", Fish Pathology 31, pp. 177-182.
112. Wang Q., White B. L., Redman R. M., Lightner D. V. (1999), "Per os
challenge of Litopenaeus vannamei postlarvae and Farfantepenaeus duorarum
juveniles with six geographic isolates of white spot syndrome virus",
Aquaculture 170, pp. 179–194.
113. Wang Y., Zhang X., Yuan L., Xu T., Rao Y., Li J., Dai H. (2008), "Generation
of recombinant monoclonal antibodies to study structure-function of envelope
protein VP28 of white spot syndrome virus from shrimp", Biochemical and
Biophysical Research Communications 372, pp. 902-906.
114. Witteveldt J., Vlak J. M., Van Hulten M. C. (2004), "Protection of Penaeus
monodon against white spot syndrome virus using a WSSV subunit vaccine",
Fish and Shellfish Immunology 16, pp. 571-579.

115. Wongprasert K., Khanobdee K., Glunukarn S. S., Meeratana P.,
Withyachumnarnkul B. (2003), "Time-course and levels of apoptosis in various
tissues of black tiger shrimp Penaeus monodon infected with white-spot
syndrome virus", Diseases of Aquatic Organisms 55, pp. 3-10.
116. Wongteerasupaya C., Vickers J. E., Sriurairatana S., Nash G. L., Alarajamorn
A., Boonsaeng V. (1995), "A non-occluded, systemic baculovirus that occurs in

22


cells of ectodermal and mesodermal origin and causes high mortality in the
black tiger prawn Penaeus monodon", Diseases of Aquatic Organisms 21, pp.
69–77.
117. Wongteerasupaya C., Wongwisansri S., Boonsaeng V., Panyim S., Pratanpipat
P., Nash G. L. (1996), "DNA fragment of Penaeus monodon baculovi-rus
PmNOBII gives positive in situ hybridization with white spot viral infections in
six Penaeid shrimp species", Aquaculture 143, pp. 23–32.
118. Wu C., Yang F. (2006), "Localization studies of two white spot syndrome
virus structural proteins VP51 and VP76", Virology Journal 3, pp 76-83.
119. Wu J. L., Nishioka T., Mori K., Nishizawa T., Muroga K. (2002), "A timecourse study on the resistance of Penaeus japonicus induced by artificial
infection with white spot syndrome virus", Fish and Shellfish Immunology 13,
pp. 391-403.
120. Xie X., Xu L., Yang F. (2006), "Proteomic analysis of the major envelope and
nucleocapsid proteins of white spot syndrome virus", Journal of Virology 80,
pp. 10615-10623.
121. Xie X., Yang F. (2005), "Interaction of white spot syndrome virus VP26
protein with actin", Virology 336, pp. 93-99.
122. Xu H., Yan F., Deng X., Wang J., Zou T., Ma X., Zhang X., Qi Y. (2009),
"The interaction of white spot syndrome virus envelope protein VP28 with
shrimp Hsc70 is specific and ATP-dependent", Fish and Shellfish Immunology

26, pp. 414-421.
123. Yang F., He J., Lin X., Li Q., Pan D., Zhang X., Xu X. (2001), "Complete
genome sequence of the shrimp White spot syndrome baciliform virus", Journal
of Virology 75, pp. 11811-11820.
124. Yi G., Wang Z., Qi Y., Yao L., Qian J., Hu L. (2004), "Vp28 of shrimp white
spot syndrome virus is involved in the attachment and penetration into shrimp
cells", Journal of Biochemistry and Molecular Biology 37, pp. 726-734.

23


125. Zhang X., Huang C., Tang X., Zhuang Y., Hew C. L. (2004), "Identification of
structural proteins from shrimp white spot syndrome virus (WSSV) by 2DEMS", Proteins 55, pp. 229-235.
126. Zhang X., Huang C., Xu X., Hew C. L. (2002), "Transcription and
identification of an envelope protein gene (p22) from shrimp white spot
syndrome virus", The Journal of General Virology 83, pp. 471-477.
127. Zhang X., Xu X., Hew C. L. (2001), "The structure and function of a gene
encoding a basic peptide from prawn white spot syndrome virus", Virus
Research 79, pp. 137-144.
128. Zhu Y., Ding Q., Yang F. (2007), "Characterization of a homologous-regionbinding protein from white spot syndrome virus by phage display", Virus
Research 125, pp. 145-152.
129. Wei K. Q., Xu Z. R. (2005), "Effect of white spot syndrome virus
envelope protein Vp28 expressed in silkworm (Bombyx mori) pupae on
disease resistence in Procambarus clarkii", Shi Yan Sheng Wu Xue Bao
38, pp. 190-198.
130. OIE (2003) "Manual of diagnostic tests for aquatic animals". 4th edtition.
World Organization for Animal Health, Paris. 358pp.
131. Wang C. H., Lo C. F., Leu J. H., Chou C. M., Yeh P. Y., Chou H. Y. (1995),
"Purification and genomic analysis of baculovirus associated with white spot
syndrome (WSBV) of Penaeus monodon", Diseases of Aquatic Organisms 23,

pp.239–242.

24