Nghiên cứu phân loại nấm men moniliella phân lập tại việt nam

Luận văn thạc sĩ

K20 – Vi sinh vật học

Đinh Đức Hiền


Luận văn thạc sĩ

`Lời cảm ơn
Lời cảm ơn

K20 – Vi sinh vật học

Đinh Đức Hiền


Luận văn thạc sĩ

Lời cảm ơn
Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Vũ Nguyên
Thành và PGS. TS Bùi Thị Việt Hà - những người thầy đã luôn tận tình hướng dẫn,
chỉ bảo, tạo mọi điều kiện giúp em thực hiện luận văn này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ Trung tâm Vi sinh vật
Công nghiệp - Viện Công nghiệp Thực phẩm đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện, hỗ trợ
kỹ thuật, chia sẻ tài liệu và kinh nghiệm nghiên cứu.
Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian
sinh viên và học viên cao học.
Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân bạn
bè những người luôn động viên, khích lệ em trên con đường học tập, và nghiên cứu

khoa học.

Hà Nội, ngày 25 tháng 11 năm 2014
Học viên

Đinh Đức Hiền

K20 – Vi sinh vật học

Đinh Đức Hiền


Luận văn thạc sĩ

DANH MỤC HÌNH

Hình 1. Hình thái tế bào đặc trƣng của Phaeococcus catenatus CBS 650. 76.
Hình 2. Hình ảnh tế bào Exophiala salmonis CBS 157.67.
Hình 3. Hình ảnh tế bào Aureobasidium pullulans.
Hình 4. Hình ảnh tế bào Moniliella suaveolens CBS 120.63 (trái) và Moniliella
acetoabuten CBS 169.66 (phải).
Hình 5. Cây phả hệ mô tả mối quan hệ giữa các loài thuộc chi Moniliella.
Hình 6. Hình ảnh tế bào của Geotrichum candidum (trái) và
Trichosporon beigelii (phải).
Hình 7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi đặc hiệu phát hiện.
Candida albicans và Candida dubliniensis.
Hình 8. Một số mẫu hoa phân lập đƣợc Moniliella.
Hình 9. Vị trí các địa điểm thu thập mẫu phân lập Moniliella tại Việt Nam.
Hình 10. Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào một số chủng nấm men Moniliella phân lập
đƣợc.

Hình 11. Phổ fingerprinting của 126 chủng Moniliella phân lập đƣợc.
Hình 12. Vị trí các chủng đại diện phân lập đƣợc thuộc chi Moniliella.
Hình 13. Phổ PCR fingerprinting với mồi (GAC)5 của các chủng Moniliella carnis
và Moniliella dehoogii.
Hình 14. Phổ PCR fingerprinting với mồi (GAC)5 của các chủng Moniliella byzovii.
Hình 15. Tế bào sinh dƣỡng của Moniliella carnis (KFP 246T) sinh trƣởng trên môi
trƣờng YM ở 25C sau 5 ngày (trái) và trên môi trƣờng tinh bột ngô Dalmau agar
sau 7 ngày (phải).

K20 – Vi sinh vật học

Đinh Đức Hiền


Luận văn thạc sĩ

Hình 16. Tế bào sinh dƣỡng của Moniliella dehoogii KFP 211T sinh trƣởng trong
YM ở 25C sau 5 ngày (trái) trên môi trƣờng Dalmau tinh bột ngô sau 7 ngày
(phải).
Hình 17. Tế bào sinh dƣỡng của chủng TBY 2041.7T sinh trƣởng trên môi trƣờng
Dalmau tinh bột ngô sau 5 ngày.
Hình 18. Sự hình thành Chlamydospore ở chủng TBY 2041.7T sinh trƣởng trên môi
trƣờng Yeast Cacbon Base agar không có nguồn nito.
Hình 19. Hình thái khuẩn lạc của Moniliella byzovii TBY 2041.7T (trái) và TBY
2041.8 (phải) trên môi trƣờng Malt-Glucoseagar sau 45 ngày nuôi cấy ở 28C.
Hình 20. Hình thái khuẩn lạc của M. dehoogii KFP 211T và TBY 2041.5 trên môi
trƣờng Malt glucose 2°Bx sau 10 ngày nuôi cấy ở 28°C

K20 – Vi sinh vật học

Đinh Đức Hiền


Luận văn thạc sĩ

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. So sánh đặc điểm của chi Moniliella và một số chi khác.
Bảng 2. Phƣơng pháp trộn lẫn tế bào các chủng trong cùng 1 loài để phát hiện pha
sinh sản hữu tính.
Bảng 3. Các chủng nấm men đen Moniliella phân lập đƣợc.
Bảng 4. Ký hiệu các chủng trong PCR fingerprinting.
Bảng 5. Kết quả phân nhóm các chủng bằng fingerprinting.
Bảng 6. Danh sách chủng Moniliella trong mô tả loài mới.
Bảng 7. Danh sách các chủng thuộc 2 nhóm M. byzovii.
Bảng 8. Sự khác nhau những đặc tính quan trọng giữa M. carnis, M. dehoogii, M.
byzovii và những loài đã biết thuộc chi Moniliella.
Bảng 9. Phân lập Moniliella tại Việt Nam và trên thế giới

K20 – Vi sinh vật học

Đinh Đức Hiền


Luận văn thạc sĩ

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CBS – Centraalbureau voor Schimmelcultures (Bảo tàng giống Vi sinh vật Hà Lan)
h – hour (giờ)
NRRL-Northern Regional Research Laboratory (hiện là National Center For

Agricultural Utilization Research) (Bảo tàng giống Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ)
DGGE-Denaturing gradient gel electrophoresis
rDNA-Ribosomal DNA
rRNA-Ribosomal RNA
PCR – Polymerase Chain Reaction (phản ứng trùng hợp chuỗi)
RFLP-Restriction Fragment Length Polymorphism (đánh giá đa hình DNA theo
phƣơng pháp cắt hạn chế)
T – Type strain (chủng chuẩn)

K20 – Vi sinh vật học

Đinh Đức Hiền


Luận văn thạc sĩ

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................................................ 10
CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN ........................................................ ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

1.1. NHÓM NấM MEN ĐEN ..................................................ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
Một số chi nấm men đen ....................................................... Error! Bookmark not defined.
1.1.1. Chi Phaeococcomyces ................................................ Error! Bookmark not defined.
1.1.2. Chi Exophiala ............................................................. Error! Bookmark not defined.
1.1.3. Chi Aureobasidium ..................................................... Error! Bookmark not defined.
1.1.4. Chi Moniliella ............................................................. Error! Bookmark not defined.
1.2. MộT Số PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOạI NấM MEN .................ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
1.2.1. Các phương pháp phân loại truyền thống .................. Error! Bookmark not defined.
1.2.2. Các phương pháp hóa phân loại và sinh học phân tử Error! Bookmark not defined.
1.3. MộT Số PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIệN VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DạNG VI SINH VậTERROR! BOOKMARK NOT DEF

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUERROR! BOOKMARK NOT DEFINE

2.1. ĐốI TƢợNG ..................................................................ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
2.2. HÓA CHấT, DụNG Cụ, TRANG THIếT Bị MÁY MÓC ..........ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
2.2.1. Hóa chất ..................................................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc ........................... Error! Bookmark not defined.
2.3. THÀNH PHầN MÔI TRƢờNG Sử DụNG TRONG NGHIÊN CứUERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
2.3.1. Môi trường làm giàu có nồng độ đường cao .............. Error! Bookmark not defined.
2.3.2. Môi trường Malt-Glucose 2Bx có axit lactic 1‰ ..... Error! Bookmark not defined.
2.3.3. Môi trường Malt-Glucose 2Bx không có axit lactic . Error! Bookmark not defined.
2.3.4. Môi trường thử khả năng chuyển hóa các nguồn cacbon khác nhauError! Bookmark not def
2.3.5. Môi trường thử khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhauError! Bookmark not defined.
2.3.6. Thử khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường và muối caoError! Bookmark
2.3.7. Môi trường xác định khả năng sinh trưởng trong các điều kiện nhiệt độ khác
nhau.
2.3.8. Môi trường thử khả năng hình thành tinh bột ............ Error! Bookmark not defined.
2.3.9. Môi trường đánh giá hoạt tính phân giải urea ........... Error! Bookmark not defined.
2.3.10. Môi trường đánh giá khả năng sinh trưởng khi có mặt CycloheximideError! Bookmark not
2.3.11. Môi trường đánh giá khả năng chống chịu acid acetic 1 %Error! Bookmark not defined.
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CứU ........................................ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
2.4.1. Phương pháp phân lập ............................................... Error! Bookmark not defined.
2.4.3. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào .......................... Error! Bookmark not defined.
2.4.4. Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm men .......... Error! Bookmark not defined.
2.4.5. Phương pháp tinh chế DNA........................................ Error! Bookmark not defined.
2.4.6. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR fingerprintingError! Bookmark not defined.
2.4.7. Phương pháp điện di .................................................. Error! Bookmark not defined.
2.4.8. Nhuộn gel và đọc kết quả ........................................... Error! Bookmark not defined.

K20 – Vi sinh vật học

Đinh Đức Hiền


Luận văn thạc sĩ

2.4.9. Phương pháp phân loại nấm men dựa vào đọc trình tự rDNAError! Bookmark not defined.
2.4.10. Đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhauError! Bookmark not defined.
2.4.11. Đánh giá khả năng đồng hóa các nguồn nito khác nhau.Error! Bookmark not defined.
2.4.12. Đánh giá khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường và nồng độ
muối cao. .............................................................................. Error! Bookmark not defined.
2.4.13. Đánh giá khả năng sinh trưởng trong các điều kiện nhiệt độ khác nhauError! Bookmark not
2.4.14. Thử khả năng hình thành tinh bột .............................. Error! Bookmark not defined.
2.4.15. Thử khả năng phân giải urea..................................... Error! Bookmark not defined.
2.4.16. Thử khả năng chống chịu với cycloheximit ................ Error! Bookmark not defined.
CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................. ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
3.1. KếT QUả PHÂN LậP .......................................................ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
3.2. QUAN SÁT HÌNH THÁI KHUẩN LạC, Tế BÀO ...................ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
3.3. PHÂN NHÓM BằNG Kỹ THUậT FINGERPRINTING ............ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
3.5. MÔ Tả CÁC NHÓM LOÀI MớI THUộC CHI MONILIELLA ...ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
3.5.1. Phân tích đặc tính di truyền của 3 loài mới ............... Error! Bookmark not defined.
3.5.2. Đặc tính kiểu hình, sinh lý, sinh hóa của 3 loài mới .. Error! Bookmark not defined.
3.6. Sự ĐA DạNG MONILIELLA PHÂN LậP TạI VIệT NAM .......ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ..... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................................... 11
PHỤ LỤC

K20 – Vi sinh vật học

Đinh Đức Hiền


Luận văn thạc sĩ

MỞ ĐẦU
Chi Moniliella đƣợc thiết lập bởi bởi Stolk và Dakin năm 1966 để xác lập vị trí
phân loại cho 2 loài mới tìm đƣợc khi đó là Moniliella acetoabutens và Moniliella
tomentosa. Năm 2009, căn cứ vào sự tƣơng đồng nhất định về di truyền cũng nhƣ
một số đặc tính sinh lý, sinh hóa quan trọng, Rosa và cộng sự đã xếp một chi khác
là Trichosporonoides vào Moniliella. Nhƣ vậy, trƣớc khi nghiên cứu của chúng tôi
đƣợc thực hiện, chi Moniliella bao gồm 9 loài, đó là Moniliella acetoabutens, M.
fonsecae, M. megachiliensis, M. mellis, M. nigrescens, M. oedocephalis, M. pollinis,
M. spathulata và M. suaveolens. Phân loại của Moniliella thực sự vẫn chƣa rõ ràng.
Trình tự gần nhất của Moniliella fonsecae trong Genbank là Phylloporia pectinata,
một thành viên của Agaricomycotina. Với những trình tự khác, Moniliella thuộc
Ustilagionomycotina. Hơn nữa, sự khác biệt về mặt di truyền giữa các loài thuộc chi
Moniliella lại rất lớn, có thể tới 15-16% trong đoạn D1/D2. Do vậy việc tìm kiếm
những loài trung gian giữa các loài đã biết sẽ góp phần làm sáng tỏ phân loại của
Moniliella.
Moniliella đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất erythriltol, một loại đƣờng
chức năng có giá trị thƣơng mại cao. Gần đây, Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp,
Viện Công nghiệp Thực phẩm đã phát hiện một số đặc tính công nghệ ít hoặc chƣa
đƣợc biết tới của Moniliella nhƣ khả năng chuyển hóa thầu dầu thành γ-declactone
(tinh dầu đào) với độ tinh khiết cao, khả năng sinh lipase, khả năng sinh một loại
kháng sinh (zymocin) mới. Các nội dung nghiên cứu trong bản luận văn này đƣợc
thực hiện nhằm đánh giá đa dạng nấm men Moniliella tại Việt Nam, góp phần củng
cố hệ thống phân loại của chi và tạo cơ sở cho nghiên cứu công nghệ có sử dụng
Moniliella, cụ thể những nội dung nghiên cứu bao gồm:
- Phân lập nấm men Moniliella từ các nguồn mẫu khác nhau tại các địa điểm

khác nhau ở Việt Nam.
- Phân nhóm, phân loại Moniliella phân lập đƣợc bằng hình thái; PCR
fingerprinting; giải trình tự DNA; phân tích cây phả hệ.
- Phân tích sự đa dạng nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam về số loài,
phân bố.

K20 – Vi sinh vật học

Đinh Đức Hiền


Luận văn thạc sĩ

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001), Vi sinh vật
học, Nxb Giáo Dục.
Tiếng Anh
2. Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller,
W. & Lipman, D. J. (1997), “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new
generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Research,
25, pp. 3389-3402.
3. Begerow D, Stoll M, Bauer R.(2006), “A phylogenetic hypothesis of
Ustilaginomycotina based on multiple gene analyses and morphological
data”, Mycologia, 98: 906–916.
4. Boekhout T, Fell JW, O’Donnell K (1995), “Molecular systematics of some
yeast-like anamorphs belonging to the Ustilaginales and Tilletiales”, Studies
in Mycology, 38: 175–183.
5. De Hoog, G. S., A. H. Gerritis van den Ende, J. M. Uijthof, and W. A.
Untereiner. (1995), “Nutritional physiology of type isolates of currently

accepted species of Exophiala and Phaeococcomyces”, Antonie Van
Leeuwenhoek, 68, pp. 43-49.
6. De Hoog, G. S. & Guého E. (1984), “Deoxyribonucleic acid base
composition and taxonomy of Moniliella and allied genera”, Antonie
Leeuwenhoek, 50, pp. 135-141.
7. De Hoog, G. S., J. Guarro, J. Gene, and M. J. Figueras (2000), Atlas of
Clinical Fungi, 2nd ed, vol. 1, Centraalbureau voor Schimmelcultures,
Utrecht, The Netherlands.
8. De Hoog, G. S., Smith, M. T. & Rosa, C. A. (2011), “Moniliella Stolk &
Dakin (1966)”, The Yeasts, a Taxonomic Study, 5th edn, pp. 1837-1846.
Edited by C.P. Kurtzman, J.W. Fell, Teun Boekhout. London: Elsevier.

K20 – Vi sinh vật học

Đinh Đức Hiền


Luận văn thạc sĩ

9. De Hoog G.S. (1999), Ecology and evolution of black yeast and their
relative, the Royal NetherlDNAs Academy of Arts and Sciences.
10. Edgar, R. C. (2004), “MUSCLE: multiple sequence alignment with high
accuracy and high throughput”, Nucleic Acids Res, 32, pp. 1792-1797.
11. Esteve-Zarzoso, B., Belloch, C., Uruburu, F. & Querol, A. (1999),
“Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8S rRNA gene and the
two ribosomal internal transcribed spacers”, Int J Syst Bacteriol, 49, pp.
329-337.
12. Felsenstein, J. (1985), “Confidence limits on phylogenies: an approach using
the bootstrap”, Evolution, 39, pp. 783-791.
13. Günther Laufenberg, Pietro Rosato, Benno Kunz (2004), “Adding value to

vegetable waste: Oil press cakes as substrates for microbial decalactone
production”, Eur. J. Lipid Sci. Technol, 106: 207–217.
14. Haase, G., L. Sonntag, Y. van de Peer, J. M. Uijthof, A. Podbielski, and B.
Melzer-Kric (1995), “Phylogenetic analysis of ten black yeast species using
nuclear small subunit rRNA gene sequences”, Antonie Van Leeuwenhoek,
68, pp. 19-33.
15. Inglis, G. D., Sigler, L. & Goettel, M. S. (1992), “Trichosporonoides
megachiliensis, a new Hyphomycete associated with alfalfa leafcutter
bees, with notes on Trichosporonoides and Moniliella”, Mycologia, 84,
pp. 555-570.
16. Kimura, M. (1980), “A simple method for estimating evolutionary rates of
base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences”, J
Mol Evol, 16, pp. 111-120.
17. Kurtzman C. P., Blanz P. A. (1998), “Ribosomal RNA/DNA sequence
comparisons for assessing phylogentic relationships”, Elsevier Science
Publishers, pp. 69-74.
18. Kurtzman C. P., Jack W. Fell, T. Boekhout, (2011), The Yeasts: A
Taxonomic Study, 5th, Elsevier.

K20 – Vi sinh vật học

Đinh Đức Hiền


Luận văn thạc sĩ

19. Kurtzman, C. P. & Robnett, C. J. (1998), “Identification and phylogeny of
ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S)
ribosomal DNA partial sequences”, Antonie van Leeuwenhoek, 73, pp. 331-371.
20. Lachance, M. A., Starmer, W. T., Rosa, C. A., Bowles, J. M., Barker J. S. &

Janzen, D. H. (2001), “Biogeography of the yeasts of ephemeral flowers and
their insects”, FEMS Yeast Res, 1, pp. 1-8.
21. Martinez A. T. (1979), “Ultrastructure of Moniliella, Trichosporonoides and
Hyalodendron”, Stud Mycol, 19, pp. 50-57.
22. Martínez A. T., Hoog GS de, Smith M. T. (1979), “Physiological
characteristics of Moniliella, Trichosporonoides and Hyalodendron”, Studies
in Mycology, 19: 58–68.
23. Perko, R. & DeCock, P. (2007), “Erythritol”, Sweeteners and Sugar
Alternatives in Food Technology, pp. 151-176. Edited by H. Mitchell.
Oxford: Wiley-Blackwell.
24. Rosa, C. A., Jindamorakot, S., Limtong, S., Nakase, T., Lachance, M. A.,
Fidalgo-Jiménez, A., Daniel, H. M., Pagnocca, F. C., Inácio, J. & Morais, P.
B. (2009), “Synonymy of the yeast genera Moniliella and Trichosporonoides
and proposal of Moniliella fonsecae sp. nov. and five new species
combinations”, Int J Syst Evol Microbiol, 59, pp. 425-429.
25. Saitou, N. & Nei, M. (1987), “The neighbor-joining method: a new method
for reconstructing phylogenetic trees”, Mol Biol Evol, 4, pp. 406-425.
26. Sawada, K., Taki, A., Yamakawa, T. & Seki, M. (2009), “Key role for
transketolase activity in erythritol production by Trichosporonoides
megachiliensis SN-G42”, J Biosci Bioeng, 108, pp. 385-390.
27. Sipiczki, M. (2012), “ Detection of yeast species also occurring in
substrates associated with animals and identification of a novel
dimorphic species in Verbascum flowers from Georgia”, Antonie van
Leeuwenhoek, 103, pp. 567–576.
28. Stolk, A. C. & Dakin, J. C. (1966), “Moniliella, a new genus of Moniliales”,
Antonie Leeuwenhoek, 32, pp. 399-409.

K20 – Vi sinh vật học

Đinh Đức Hiền

Luận văn thạc sĩ

29. Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M. & Kumar, S.
(2011), “MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum
likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods”, Mol
Biol Evol, 28, pp. 2731-2739.
30. Thanh, V. N., Hai, D. A. & Lachance, M. A. (2006), “Cryptococcus
bestiolae and Cryptococcus dejecticola, two new yeast species isolated from
frass of the litchi fruit borer Conopomorpha sinensis Bradley”, FEMS Yeast
Res, 6, pp. 298-304.
31. Yamada, Y. & Kondo, K. (1973), “Coenzyme Q system in the classification
of the yeast genera Rhodotorula and Cryptococcus, and the yeast-like genera
Sporobolomyces and Rhodosporidium”, J Gen Appl Microbiol, 19, pp. 59-77.
32. Yarrow, D. (1998), “Methods for the isolation and identification of yeasts”,
The yeasts, a taxonomic study, 4th ed, pp. 77-100. Edited by C. P. Kurtzman
& J. W. Fell. Amsterdam: Elsevier.

K20 – Vi sinh vật học

Đinh Đức Hiền