Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp pectinase của hanseniaspora uvarum và ứng dụng trong lên men cà phê

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA VÀ THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP PECTINASE
CỦA HANSENIASPORA UVARUM
VÀ ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN CÀ PhÊ

GVHD: TS. LÊ HỒNG PHÚ
SVTH: VÕ HƯỜNG VI
MSSV: 11116080

SKL 0 0 3 9 5 1

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7/2015


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
MÃ SỐ: 2015-11116080

KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP
PECTINASE CỦA HANSENIASPORA UVARUM
VÀ ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN CÀ PHÊ

GVHD: TS. LÊ HỒNG PHÚ
SVTH: VÕ HƢỜNG VI
MSSV: 11116080

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 07/2015


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên: Võ Hƣờng Vi

MSSV: 11116080

Ngành: Công nghệ Thực phẩm
1. Tên khóa luận: Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp pectinase của Hanseniaspora
uvarum và ứng dụng trong lên men cà phê.
2. Mã số khóa luận: 2015-11116080
3. Nhiệm vụ của khóa luận:
(1) Sinh viên khảo sát điều kiện nuôi cấy trên đối tƣợng Hanseniaspora uvarum để
sinh tổng hợp pectinase.
(2) Bƣớc đầu ứng dụng enzim trong xử lý cà phê tăng chất trích hòa tan.
4. Ngày giao nhiệm vụ khóa luận: 20/01/2015
5. Ngày hoàn thành khóa luận: 15/07/2015
6. Họ tên ngƣời hƣớng dẫn: TS. Lê Hồng Phú
Nội dung và yêu cầu khóa luận tốt nghiệp đã đƣợc thông qua bởi
Trƣởng Bộ môn Công nghệ Thực phẩm

Tp.HCM, ngày… tháng… năm 2015
Trƣởng Bộ môn

Ngƣời hƣớng dẫn

i


LỜI CẢM ƠN
Chúng tôi xin chân thành cảm ơn đến trƣờng đại học Sƣ Phạm Kỹ Thuật TPHCM,
khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, bộ môn Công nghệ Thực phẩm, quý Thầy/Cô
trong khoa đã tạo môi trƣờng, điều kiện cho chúng tôi học tập và nghiên cứu và tận tình chỉ
bảo, truyền đạt kiến thức cho chúng tôi trong suốt những năm qua. Đó chính là những hành
trang quý giá cho chúng tôi sau này.
Đặc biệt chúng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Lê Hồng Phú đã tận tình
hƣớng dẫn, hỗ trợ hết lòng trong quá trình chúng tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp và giúp
chúng tôi hoàn thành đồ án tốt nghiệp này.
Dù đã rất cố gắng tìm hiểu, học hỏi những kiến thức mà Thầy/Cô đã truyền đạt
nhƣng do thời gian còn hạn chế, kiến thức chuyên môn chƣa nhiều và bản thân còn thiếu
kinh nghiệm trong công tác nghiên cứu khoa học nên nội dung của đề tài không thể tránh
khỏi những sai sót. Rất mong sự đóng góp ý kiến của quý Thầy/Cô để đồ án tốt nghiệp của
chúng tôi đƣợc hoàn thiện hơn.
Chúng tôi xin chân thành cám ơn.
Tác giả khóa luận
Võ Hƣờng Vi

ii


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung đƣợc trình bày trong khóa luận tốt nghiệp là của
riêng tôi. Tôi xin cam đoan các nội dung đƣợc tham khảo trong khóa luận tốt nghiệp đã
đƣợc trích dẫn chính xác và đầy đủ theo qui định.

Ngày 15 tháng 07 năm 2015
Ký tên

iii


iv


v


vi


vii


viii


ix


x

MỤC LỤC
NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ........................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................................ii
LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................................iii
PHIẾU ĐÁNH GIÁ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA NGƢỜI HƢỚNG DẪN ............ iv
PHIẾU ĐÁNH GIÁ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA NGƢỜI PHẢN BIỆN ............... vi
PHIẾU ĐÁNH GIÁ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA HỘI ĐỒNG XÉT BẢO VỆ
KHÓA LUẬN ..................................................................................................................... viii
MỤC LỤC ............................................................................................................................ xi
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................................xiii
DANH MỤC BẢNG BIỂU ................................................................................................ xiv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................................... xv
TÓM TẮT KHÓA LUẬN ................................................................................................. xvi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 3
1.1 Cơ sở lý thuyết ................................................................................................................. 3
1.1.1 Tổng quan về cà phê ............................................................................................ 3
1.1.2 Tổng quan về pectic ............................................................................................ 9
1.1.3 Tổng quan về pectinase ..................................................................................... 11
1.1.4 Tổng quan về Hanseniaspora uvarum .............................................................. 14
1.2 Cơ sở thực nghiệm ......................................................................................................... 16
1.2.1 Nghiên cứu trong nƣớc về quá trình lên men cà phê......................................... 16
1.2.2 Nghiên cứu trên thế giới về quá trình lên men cà phê ....................................... 16
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................................. 18
2.1 Nguyên vật liệu .............................................................................................................. 18
2.1.1 Cà phê ................................................................................................................ 18
2.1.2 Vi sinh vật ......................................................................................................... 18
2.2 Hóa chất ......................................................................................................................... 18
2.3 Thiết bị - dụng cụ ........................................................................................................... 18

2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................................... 19
2.4.1 Phƣơng pháp cấy truyền và giữ giống ............................................................... 19

xi


2.4.2 Phƣơng pháp hoạt hóa giống và nuôi cấy tăng sinh khối .................................. 19
2.4.3 Phƣơng pháp quan sát đặc điểm hình thái tế bào nấm men .............................. 19
2.4.4 Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào nấm men ................................................. 19
2.4.5 Phƣơng pháp làm dịch malt ............................................................................... 20
2.4.6 Phƣơng pháp định lƣợng pectin ........................................................................ 20
2.4.7 Phƣơng pháp xác định hoạt độ pectinase .......................................................... 21
2.4.8 Phƣơng pháp lên men ........................................................................................ 22
2.4.9 Phƣơng pháp xác định độ ẩm ............................................................................ 22
2.4.10 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tro tổng số (TCVN 5253-90) .................... 22
2.4.11 Phƣơng pháp trích chất hòa tan ....................................................................... 22
2.4.12 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng đƣờng khử ................................................ 23
2.4.13 Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................................... 23
2.5 Bố trí thí nghiệm ............................................................................................................ 23
2.5.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ chất cảm ứng và thời gian nuôi cấy tối ƣu cho
tổng hợp pectinase ............................................................................................ 23
2.5.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát một số điều kiện môi trƣờng nuôi cấy tối ƣu cho tổng
hợp pectinase..................................................................................................... 24
2.5.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát xác định lƣợng chế phẩm enzim tối ƣu dùng cho lên
men cà phê ........................................................................................................ 24
2.5.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát xác định thời gian lên men tối ƣu khi sử dụng chế
phẩm enzim ....................................................................................................... 25
2.5.5 Thí nghiệm 5: Kiểm tra độc tố, hàm lƣợng caffeine ......................................... 25
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ...................................................................... 26
3.1 Một số thành phần vật liệu ............................................................................................. 26

3.2 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng, thời gian nuôi cấy tối ƣu cho tổng hợp pectinase ...... 27
3.3 Khảo sát một số điều kiện môi trƣờng nuôi cấy tối ƣu cho tổng hợp pectinase ............ 31
3.4 Khảo sát xác định lƣợng chế phẩm enzim tối ƣu dùng cho lên men cà phê .................. 34
3.5 Khảo sát xác định thời gian lên men tối ƣu khi sử dụng chế phẩm enzim .................... 36
3.6 Kiểm tra độc tố, hàm lƣợng caffeine ............................................................................. 39
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN ................................................................................................. 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................................
PHỤ LỤC A.............................................................................................................................

xii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Mặt cắt dọc của quả cà phê ................................................................................... 5
Hình 1.2. Quy trình sản xuất cà phê nhân bằng phƣơng pháp ƣớt ........................................ 7
Hình 1.3. Mô hình chuỗi mạch trung tâm của pectin ............................................................ 9
Hình 1.4. Sơ đồ pectate lyase phân cắt α-1,4-polygalacturonic axit bằng cơ chế βelimination ........................................................................................................ 13
Hình 1.5.Hanseniaspora uvarum ........................................................................................ 15
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cà rốt đến hoạt độ pectinase của H. uvarum. ..................... 27
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ pectinase của H. uvarum. ......... 29
Hình 3.3. Ảnh hƣởng nồng độ đƣờng đến tổng hợp pectinase của H. uvarum. .................. 32
Hình 3.4. Ảnh hƣởng nồng độ muối (NH4)2SO4 đến tổng hợp pectinase của H. uvarum. . 33
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của tỉ lệ chế phẩm đến hiệu quả lên men. ........................................ 35
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến hiệu quả lên men. ................................... 37
Hình 3.7. Biến thiên pH của dịch lên men theo thời gian. .................................................. 38

xiii


DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Dự báo khả năng tiêu thụ cà phê thế giới đến năm 2015 ...................................... 3
Bảng 1.2. Thành phần của lớp nhớt....................................................................................... 5
Bảng 1.3. Thành phần hóa học của cà phê tƣơi ..................................................................... 6
Bảng 1.4. Thành phần pectin trong các loại rau quả khác nhau .......................................... 11
Bảng 3.1. Thành phần pectin có trong nguyên vật liệu ....................................................... 26
Bảng 3.2. Thành phần hóa học có trong cà phê nguyên liệu ............................................... 26
Bảng 3.3. Sự thay đổi về hoạt độ pectinase của mẫu chế phẩm enzim từ H. uvarum đƣợc
nuôi cấy ở các tỷ lệ bột cà rốt/ MT...................................................................... 27
Bảng 3.4. Sự thay đổi về hoạt độ pectinase của mẫu chế phẩm enzim từ H. uvarum đƣợc
nuôi cấy theo thời gian ........................................................................................ 29
Bảng 3.5. Sự thay đổi về hoạt độ pectinase của mẫu chế phẩm enzim từ H. uvarum đƣợc
nuôi cấy ở các nồng độ đƣờng/MT ..................................................................... 31
Bảng 3.6. Sự thay đổi về hoạt độ pectinase của mẫu chế phẩm enzim từ H. uvarum đƣợc
nuôi cấy ở các nồng độ muối (NH4)2SO4/MT ..................................................... 33
Bảng 3.7. Sự thay đổi về tỉ lệ tách nhớt và nồng độ chất hòa tan trong dịch trích của mẫu
cà phê lên men có bổ sung chế phẩm ở các tỉ lệ. ................................................ 35
Bảng 3.8. Sự thay đổi về tỉ lệ tách nhớt và nồng độ chất hòa tan trong dịch trích của mẫu
cà phê lên men có bổ sung chế phẩm theo thời gian lên men. ............................ 36
Bảng 3.9. So sánh sản phẩm cà phê lên men tự nhiên và lên men có bổ sung chế phẩm ... 40

xiv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
STT

Chữ viết tắt

Chữ nguyên

1.

ĐC

Đối chứng

2.

H. uvarum

Hanseniaspora uvarum

3.

MT

Môi trƣờng

4.

TN

Thí nghiệm

5.

VSV

Vi sinh vật

xv


TÓM TẮT KHÓA LUẬN
Lớp nhớt trong thành phần vỏ cà phê chứa một tỉ lệ cao hợp chất pectin khó phân
hủy tự nhiên, gây trở ngại trong quá trình xử lý cà phê sau thu hoạch và quá trình tách chiết
các chất hòa tan có trong hạt cà phê. Chúng tôi nghiên cứu về việc sử dụng chủng nấm
men Hanseniaspora uvarum để sinh tổng hợp pectinase làm cho quá trình phân hủy diễn ra
nhanh hơn. Hoạt độ pectinase đƣợc đo thông qua sản phẩm tạo thành là axit galacturonic
khi cho pectinase tác dụng với cơ chất pectin. Kết quả cho thấy chế phẩm pectinase đƣợc
sản xuất từ chủng nấm menHanseniaspora uvarum trên môi trƣờng dịch malt 8oBrix, có
chứa(NH4)2SO4 0,08%, chất cảm ứng bột cà rốt 4%, sau 36 giờ đạt hoạt độ cao nhất. Ứng
dụng vào quá trình lên men cà phê có bổ sung chế phẩm trong 11 giờ với tỉ lệ chế phẩm
5% cho hiệu quả cao nhất khi so sánh với mẫu lên men tự nhiên: tỉ lệ tách nhớt tăng
156,47%,nồng độ chất hòa tan trong dịch trích tăng 32,73%, hàm lƣợng caffeine tăng
3,21%. Bƣớc đầu ứng dụng chế phẩm pectinase thô vào quá trình lên men cà phê đã khắc
phục đƣợc những nhƣợc điểm khi lên men tự nhiên, đây làcơ sở tiền đề cho những nghiên
cứu sâu hơn, đóng góp một phần giá trị trong hƣớng phát triển nâng cao chất lƣợng cà phê
bằng công nghệ lên men.
Từ khóa:cà phê; Hanseniaspora uvarum; lên men; pectinase.

xvi


MỞ ĐẦU
Hiện nay, cà phê Việt Nam có diện tích gieo trồngđạt 653.000 ha (2014), sản lƣợng
đạt 1,74 triệu tấn (mùa vụ 2013/14) và có xu hƣớng tăng nhẹ trong mùa vụ 2014/15, đứng
thứ hai thế giới về lƣợng xuất khẩu, nhƣng chủ yếu vẫn là cà phê vối ở dạng nguyên liệu,
chƣa qua chế biế n sâu. Vì vậy, Việt Nam không chỉ thiệt hại về giá trị, còn chịu nhiều thiệt
thòi do chƣa xây dựng đƣợc thƣơng hiệu đối với ngƣời tiêu dùng thế giới, cũng nhƣ không

cạnh tranh đƣợc với các sản phẩm nhập khẩu. Theo Tổ chức cà phê quốc tế (ICO), trong
những năm tới, lƣợng tiêu thụ cà phê hoà tan sẽ tăng nhanh ở các nƣớc phát triển. Nhu cầu
đối với các loại cà phê chất lƣợng cao tăng lên khuyến khích các nƣớc sản xuất nhƣ Việt
Nam cần điều chỉnh lại cơ cấu sản xuất các loại cà phê.
Trong nƣớc hiện nay, công nghệ lên men cà phê (chế biến cà phê bằng phƣơng pháp
ƣớt) đã đƣợc nghiên cứu ứng dụng nhằm nâng cao khả năng khai thác các thành phần hòa
tan của hạt cà phê, nhằm cải thiện hƣơng vị cà phê. Các nghiên cứu đều cho thấy quá trình
lên men cà phê là do hoạt động của các loại nấm sợi, vi khuẩn, nấm men và enzim của
chúng, phân giải pectin để loại bỏ lớp vỏ nhớt khỏi hạt cà phê. Trong đó, nấm men có ƣu
điểm trong sản xuất của pectinase, vì chúng là sinh vật đơn bào, sinh trƣởng tƣơng đối đơn
giản và môi trƣờng phát triển không đòi hỏi chất cảm ứng và dễ nuôi cấy ở quy mô lớn.
Ngoài ra, việc nhân bản gen và xử lý gen có thể cải thiện sản xuất enzim, điều đó cho thấy
rằng sản xuất enzim thƣơng mại bằng nấm men có thể khả thi.
Xuất phát từ đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát điều kiện sinh tổng
hợp pectinase của Hanseniaspora uvarum và ứng dụng trong lên men cà phê”
Nội dung của đề tài:
1. Nuôi cấy chủng Hanseniaspora uvarum trên những môi trƣờng nuôi cấy khác nhau,
khảo sát nồng độ chất cảm ứng và thời gian nuôi cấy tối ƣu cho việc sinh tổng hợp
pectinase cao nhất.
2. Khảo sát các điều kiện môi trƣờng nuôi cấy khác (nguồn carbon, nguồn nitơ) ảnh
hƣởng đến sinh tổng hợp pectinase.
3. Khảo sát khả năng xử lý lớp nhớt trên hạt cà phê của enzim tổng hợp từ chủng
Hanseniaspora uvarum (về tỉ lệ enzim, thời gian).
4. Khảo sát hiệu suất trích chất hòa tan của cà phê đƣợc lên men (về tỉ lệ enzim, thời
gian).

1


5. Kiểm tra mức độ an toàn của cà phê đƣợc lên men về chỉ tiêu vi sinh, chỉ tiêu độc tố

nấm mốc.
Những đóng góp của đề tài nếu thành công:
1. Chứng minh đƣợc Hanseniaspora uvarum có khả năng sinh tổng hợp pectinase và có
khả năng ứng dụng trong lên men cà phê.
2. Tìm thấy đƣợc điều kiện tối ƣu cho H. uvarum sinh tổng hợp pectinase có hoạt độ
cao nhất.
3. Xây dựng đƣợc quy trình lên men cà phê sử dụng chế phẩm enzim từ H. uvarum cho
chất lƣợng cà phê tối ƣu.
4. Từ các kết quả đạt đƣợc ở quy mô phòng thí nghiệm có thể cho thấy tiềm năng khi
nghiên cứu ở quy mô lớn hơn.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Cơ sở lý thuyết
1.1.1 Tổng quan về cà phê
1.1.1.1 Giới thiệu
Cà phê thuộc họ Rubiaceae, chi Coffea, có nguồn gốc từ vùng cao nguyên Ethiopia
và các khu vực lân cận vùng cao nguyên của Sudan và Kenya (Charrier và Berthaud,
1985). Cà phê đầu tiên đƣợc trồng bởi ngƣời Ả Rập vào thế kỷ 14, sau đó đƣợc giới thiệu
đến vùng nhiệt đới vào thế kỷ 17 (Smith, 1985).
Hiện nay cà phê chủ yếu đƣợc trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới và đƣợc
tiêu thụ trên toàn thế giới. Một số khu vực đƣợc biết đến về sản xuất cà phê chất lƣợng cao,
nhƣ vùng xích đạo ở châu Phi, Java, Sumatra và các đảo khác của Đông Ấn, Tây Ấn, Ấn
Độ, Arabia, các đảo Thái Bình Dƣơng, Mexico, Trung và Nam Mỹ (Anzueto và cộng sự,
2005).
1.1.1.2 Tình hình sản xuất, tiêu thụ
Theo Tổ chức cà phê quốc tế (ICO), trong những năm tới, tiêu thụ cà phê thế giới sẽ
đạt mức tăng trƣởng bình quân 1,3- 1,5%/năm. Theo đó, đến năm 2015, lƣợng cà phê tiêu

thụ trên toàn cầu đạt 145 triệu bao. Lƣợng tiêu thụ cà phê hòa tan sẽ tăng nhanh ở các nƣớc
phát triển. Nhu cầu đối với các loại cà phê chất lƣợng cao tăng lên sẽ khuyến khích các
nƣớc sản xuất điều chính lại cơ cấu sản xuất các loại cà phê, phát triển cà phê hữu cơ.
Bảng 1.1. Dự báo khả năng tiêu thụ cà phê thế giới đến năm 2015
Năm
2010(*)
2015(*)
Tăng bình quân 2010-2015 (%)
Thế giới
130,73
145,00
2,10
Các nƣớc sản xuất
33,54
33,82
0,50
Các nƣớc nhập khẩu
97,19
102,88
1,40
(*) Đơn vị triệu bao

Việt Nam là thành viên quan trọng của Tổ chức Cà phê thế giới (ICO). Cà phê của
Việt Nam hiện đƣợc xuất khẩu sang thị trƣờng của hơn 70 quốc gia và vùng lãnh thổ trên
thế giới. Đức, Hoa Kỳ, Bỉ, Tây Ban Nha, Italia, Nhật Bản là các thị trƣờng chính của xuất
khẩu cà phê Việt Nam.
Theo báo cáo hàng tháng của Trung tâm Tin học và Thống kê trực thuộc Bộ Nông
nghiệp & Phát triển nông thôn cho biết xuất khẩu cà phê tháng 4/2015 ƣớc đạt 112.000 tấn,

3

S

K

L

0

0

2

1

5

4