Đánh giá khả năng tiếp nhận và biểu hiện gen bar và gen cryIA(c) m16 trên cây cải đất (rorippa dubia (pers ) hara) thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefacien

1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay lĩnh vực nghiên cứu tạo sinh vật biến đổi gen, nghiên cứu
chuyển gen vào cây trồng đang được tiếp cận, đầu tư và triển khai nghiên cứu,
ứng dụng với sự chú trọng đặc biệt. Nhiều gen quý có giá trị ứng dụng như
năng suất, chất lượng, khả năng chống chịu đã được phân lập và nghiên cứu
nhằm chuyển vào cây trồng để tạo nên những giống lý tưởng.
Nhiều phương pháp chuyển gen khác nhau như phương pháp dùng
súng bắn gen, phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens…
đã được áp dụng thành công trên hàng loạt đối tượng cây trồng quan trọng
như lúa, cà chua, cà tím, đậu xanh, cà phê, thuốc lá… Nhưng vấn đề chuyển
gen vào thực vật còn gặp nhiều khó khăn và tỉ lệ thành công còn tương đối
thấp, nhiều cây trồng chuyển gen vẫn chỉ đang dừng lại ở mức độ nghiên cứu
trong phòng thí nghiệm, thời gian để xác định hiệu quả và tỉ lệ thành công của
cây trồng chuyển gen là tương đối dài. Do vậy việc nghiên cứu, đánh giá hiệu
quả chuyển gen vào cây trồng hầu hết các phòng thí nghiệm thường tiến hành
thử nghiệm trên các cây có thời gian sinh trưởng ngắn.
Cây Arabidopsis thaliana đã được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí
nghiệm ở các nước trên thế giới trong nghiên cứu cơ bản thuộc lĩnh vực khoa
học thực vật. Tuy nhiên điều kiện môi trường của Việt Nam để Arabidopsis
thaliana sinh trưởng và phát triển là không thích hợp. Trong khi đó, Rorippa
dubia (Pers.) Hara hay còn gọi là Cải đất núi là cây thảo, mọc hàng năm có
phạm vi phân bố rộng như Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Việt Nam,
Inđônêxia và Philippin. Ở nước ta, thường gặp trên rẫy, ruộng, sinh trưởng và
phát triển tốt ở ngoài môi trường, hoa nở quanh năm. Chu kỳ sinh trưởng của


2

Rorippa dubia ngắn (khoảng 6-8 tuần), cao 10-50cm, toàn cây không lông và
dễ dàng nuôi trồng trong một không gian hẹp, cho nhiều hạt, số lượng quả
trên mỗi cây trung bình 10-20 quả, số lượng hạt trung bình trên mỗi quả 2535 hạt, quả dài 2-3cm, bộ nhiễm sắc thể 2n = 32. Ngoài những đặc điểm
thuận lợi cho nghiên cứu như trên, Rorippa dubia (Pers.) Hara còn là loài cây
có giá trị y học, thường được dùng trị cảm mạo phát sốt, sưng đau hầu họng,
phổi nóng sinh ho, viêm khí quản mạn tính, phong thấp đau nhức khớp cấp
tính, viêm gan hoàng đản, tiểu tiện khó khăn.
Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đánh
giá khả năng tiếp nhận và biểu hiện gen bar và gen cryIA(c)-M#16 trên
cây cải đất (Rorippa dubia (Pers.) Hara) thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefacien”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Đánh giá khả năng tiếp nhận và biểu hiện gen bar và gen cryIA(c)M#16 trên cây cải đất (Rorippa dubia (Pers.) Hara) thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefacien.


3

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về cây Cải đất núi (Rorippa dubia (Pers.) Hara)
2.1.1. Nguồn gốc
Rorippa dubia (Pers.) Hara là cây mọc dại ở ruộng, rẫy thuộc họ cải. Là
loại cây được sử dụng và nghiên cứu nhiều trong y học. Phân bố nhiều nơi
trên thế giới, được tìm thấy nhiều ở một số nước như Ấn Độ, Mianma, Trung
Quốc, Việt Nam, Indonexia và Philippin.
2.1.2. Phân loại
Tên khoa học là Rorippa dubia (Pers.) Hara ngoài ra còn có một số tên
khác như Cải đất núi; Hân thái; Xước thái; Thụy thái; Dạ du thái; Kê nhục thái là

loại cây có nhiều công dụng trong y học, dựa trên các đặc điểm sinh thái như kích
thước lá, chiều cao phát triển tối đa của cây, số lượng hạt tạo ra, địa điểm mà
người ta tìm thấy đầu tiên Rorippa dubia (Pers.) Hara được phân loại:
Ngành: Maqnoliophyta Lớp: Maqnoliopsida
Bộ: Capparales

Họ: BrassicaceaeChi: Rorippa

2.1.3. Đặc điểm sinh thái học
Rorippa dubia (Pers.) Hara là cây thảo mọc hàng năm, mọc trên đất ẩm
ướt, cao 10-50cm, toàn cây không lông, lá ở gốc, thân to, phiến dài 10-15cm, có
thùy ở gốc sâu hay cạn, các lá trên không thùy, gốc từ từ hẹp thành cuống rộng
ôm thân, mỏng, mép có răng thưa. Chùm hoa kép ở ngọn, các chùm đơn ở nách,
lá hoa mọc so le, cuống hoa dài 3-4mm, lá đài bốn hình bầu dục, cánh hoa bốn,
màu vàng nhạt dài 2mm, nhị 6, van mở tách khỏi vách trong suốt và các giá
noãn, vòi nhụy ngắn học không có trên quả cải, đầu nhụy nguyên hay có 2 thùy,
quả cài dài 3-4cm, rộng 1-1,5mm mở thành 2 mảnh, hạt xếp 2 dãy, nhỏ hình
trứng, màu nâu, rễ mầm đối diện với khoảng cách tách 2 lá mầm, 2n = 32.


4

Hạt Rorippa dubia (Pers.) Hara chứa dầu có vị ngọt, nhạt, tính mát, có
tác dụng thanh nhiệt giải độc, chỉ khái, kiện vị, lợi niệu, tiêu thũng. Thường
được trị cam mạo phát sốt, sưng đau hầu họng, phổi nóng sinh ho, viêm khí
quản mạn tính, phong thấp đau nhức khớp cấp tính, viêm gan hoàng đản, tiểu
tiện khó khăn. Ở Trung Quốc, hạt cũng được dùng như hạt cây Đình lịch –
Draba nemorasa L. làm thuốc thanh nhiệt như đàm, sinh suyễn, lợi niệu.
2.2. Vi khuẩn A. tumefaciens và quá trình chuyển gen vào cây trồng
Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ

đã được thiết kế dạng plasmid tái tổ hợp, gắn vào hệ gen của tế bào chủ.
Trong tế bào chủ, gen lạ hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng, từ đó
xuất hiện đặc tính mới của cơ thể đã mang gen chuyển.
Hiện nay, có rất nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật khác nhau
như sử dụng súng bắn gen, dùng xung điện, dùng siêu âm, dùng vi tiêm, dùng
vi khuẩn A. tumefaciens, ... Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn
A. tumefaciens là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất hiện nay[5].
2.2.1. Đặc điểm vi khuẩn A. tumefaciens
A. tumefaciens là loài vi khuẩn sống trong đất gây ra bệnh khối u hình
chóp ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm, đặc biệt là thực vật có
hoa và một số ít thực vật một lá mầm thuộc họ Liliaceae và Amaryllidaceae.
Hoàn toàn khác với mô tế bào thực vật bình thường, khối tế bào được vi
khuẩn A. tumefaciens chuyển gen vào phát triển mạnh ngay trong điều kiện
cây thiếu hoormon sinh trưởng (auxin và cytokinin). Ti-plasmid đã chuyển
một đoạn T-DNA (Transfer DNA) sang tế bào thực vật và đoạn ADN này chứa
những gen điều khiển quá trình sinh tổng hợp các hoormon sinh trưởng đó. Tế
bào khối u tổng hợp amino acid và các dẫn xuất của đường được biết đến như là
opine [14]. Các loại opine được tổng hợp trong tế bào khối u gồm nopaline,
octopine, agrocinopine, mannopine và agropine, thành phần và tỷ lệ các loại


5

opine này tùy thuộc vào dòng vi khuẩn A. tumefaciens khởi đầu sự hình thành
khối u. Octopine và nopaline là hai loại opine có nguồn gốc từ arginine và dễ
dàng phát hiện nhất trong mô khối u hình chóp. Do đó, nhiều dòng A.
tumefaciens phổ biến được thiết kế theo kiểu octopine hoặc nopaline [21].
Nghiên cứu về hiện tượng gây khối u này, thấy rằng khả năng chuyển
đoạn T-DNA vào hệ gen thực vật của A. tumefaciens là dựa vào chức năng
của Ti-plasmid. Khi phát hiện ra Ti-plasmid và khả năng của nó, người ta đặc

biệt chú ý khai thác và sử dụng chúng để tạo nên các vectơ chuyển gen, để
chuyển các gen quan tâm vào thực vật nhằm tạo ra cây trồng mang những tính
trạng mong muốn [1]. Để làm được điều này, các nhà khoa học đã loại bỏ
toàn bộ các gen gây khối u và gen mã hóa opine của T-DNA chỉ giữ lại những
trình tự cần thiết cho quá trình chuyển gen như vùng vir và các trình tự biên
của vùng T-DNA.
2.2.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid
Ti-plasmid (tumor inducing) là một cấu trúc ADN vòng có kích thước
khoảng 200 - 250 kb, có nguồn gốc từ một loài vi khuẩn đất là A. tumefaciens
có khả năng gây bệnh khối u ở thực vật. Đặc điểm quan trọng của Ti-plasmid
là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể, nhưng cũng có thể tồn tại độc lập
bên ngoài nhiễm sắc thể.
Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng vi khuẩn A.
tumefaciens gây độc. Chúng được duy trì ổn định trong vi khuẩn này ở nhiệt
độ dưới 30oC. Bằng phương pháp lai ADN lập bản đồ chuỗi kép dị hợp,
người ta đã xác định được Ti-plasmid có 4 vùng tương đồng và được ký hiệu
là vùng A, B, C và vùng D [14].
Vùng A luôn được chuyển sang tế bào thực vật nên được gọi là vùng
T-ADN.
Vùng B liên quan đến quá trình tái sinh của tế bào vi khuẩn


6

Vùng C liên quan đến quá trình tiếp hợp của tế bào vi khuẩn
Vùng D được gọi là vùng gây độc (virulence region), vùng này chứa
các gen vir giữ vai trò quan trọng trong việc chuyển T-DNA vào hệ gen nhân
của thực vật.

Hình 1. Những nét chính của một Ti-plasmid

A) Cấu trúc pTiC58
B) Cấu trúc chung của T-ADN
Quá trình xâm nhập vào tế bào xung quanh vết thương của thực vật,
vùng T-DNA của vectơ Ti-plasmid được chuyển vào tế bào thực vật và gắn
ổn định trong hệ gen nhân. Số lượng bản sao và vị trí gắn của T-DNA trong
hệ gen nhân là hoàn toàn ngẫu nhiên.
Vùng T-DNA có kích thước từ 10 - 25 kb, nằm kẹp giữa hai trật tự biên
25 bp lặp lại không hoàn chỉnh gọi là biên trái LB (left border) và biên phải


7

RB (right border). Toàn bộ phần ADN được giới hạn giữa hai trình tự biên
này đều được chuyển sang tế bào thực vật, quá trình chuyển này được định
hướng bởi hai trình tự biên. Sự định hướng này rất quan trọng, nếu thiếu 2
trình tự biên này việc chuyển gen sẽ kém hiệu quả. Trong các gen được mã
hóa ở vùng T-DNA có 3 gen rất quan trọng trong việc phát triển khối u: một
gen mã hóa enzyme AMP - isopentenyl transferase và 2 gen mã hóa cho
enzyme tham gia vào sinh tổng hợp auxin (tryptophane - 2 mono oxygenase
và acetamid hydrolase). Sự hoạt động của các gen này sẽ kích thích sự phân
chia của các tế bào thực vật tạo nên khối u ở thực vật [14].
Vùng vir có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển T-DNA sang tế
bào thực vật. Vùng này có kích thước khoảng 40 kb và bao gồm 6 operon: A,
B, C, D, E và G trong đó operon A, B, D và G là hoàn toàn cần thiết cho việc
tạo ra độc tính còn vir C và E liên quan đến việc hình thành khối u. Trừ vir G
và A là đơn cistron còn lại các operon khác đều là đa cistron. Hoạt động của
các operon này có liên quan chặt chẽ đến sự có mặt các hợp chất phenol được
tiết ra từ vết thương của cây. Từ vết thương cây thuốc lá người ta đã chiết
xuất và xác định được các hợp chất này là acetosyringon và α –
hydroxyacetosyringon.

2.2.3. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens
Đoạn T-DNA muốn chuyển vào tế bào thực vật, trước tiên nó phải
được hoạt hóa, chính hoạt động của các gen trong vùng vir sẽ đảm nhiệm vai
trò này. Hiện tượng này xảy ra khi vi khuẩn A. tumefaciens tiếp xúc với chất
phenol được tiết ra từ vết thương của cây như: acetosyringon, hydroxy acetosyringon. Trong tế bào vi khuẩn A. tumefaciens gen virA luôn hoạt động
và tạo ra protein virA. Protein này nằm trong màng tế bào vi khuẩn, đóng vai
trò như một chất thụ cảm với chất Acetosyringon được tiết ra từ vết thương
của thực vật. Tín hiệu do protein này cảm nhận được sẽ được truyền dẫn qua


8

sự hoạt hóa gen virG. Gen này được hoạt hóa sẽ tổng hợp lên protein virG,
protein này được gắn vào gen chỉ huy nằm sát gen khởi động thuộc các gen
vir khác. Bằng cách như vậy, protein của gen virG đã được hoạt hóa làm tăng
quá trình phiên mã của chính nó, đồng thời làm giảm quá trình của các operon
B, C, D và E.
Trong tiến trình chuyển T-ADN, ở giai đoạn đầu xuất hiện các vết cắt
trên Ti-plasmid tại hai trật tự biên 25 bp, bắt đầu từ đầu phía biên phải, ở vị trí
giữa bazơ nitơ thứ ba và thứ tư của mạch đơn nằm phía dưới. Từ đó mạch đơn
T-DNA được giải phóng ra khỏi Ti-plasmid và thay thế vào đó là một mạch
đơn mới được tổng hợp theo hướng 5’ - 3’, bắt đầu từ chỗ đứt ở trật tự biên
phải. Điều này giải thích tại sao trật tự biên phải lại cần thiết cho sự chuyển
T-ADN. Operon D chủ yếu mã hóa cho một loại endonuclease tạo ra các vết
cắt nói trên tại hai trật tự biên. Sự hình thành mạch đơn T-DNA được tăng
cường nhờ sự tương tác giữa protein virD2 với một hoặc hai protein do gen
virC mã hóa. Protein do gen virE mã hóa gắn vào mạch đơn T-DNA sau khi
được cắt ra, để làm cho nó ổn định trong quá trình chuyển vào nhân tế bào

thực vật. Phức hợp protein - mạch đơn T-DNA là cấu trúc cần thiết cho việc
chuyển T-DNA sang tế bào thực vật. Gen virB mã hóa cho hơn 11 loại
protein, các protein này tham gia hình thành nên cầu nối cho phức hợp protein
- mạch đơn T-DNA được chuyển sang tế bào thực vật.

Hình 2. Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật


9

2.2.4. Các hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens
Hệ thống chuyển gen in vitro
Khó khăn chính trong việc xây dựng hệ thống chuyển gen in vitro là
phải có được sự kết hợp giữa sự xâm nhiễm của A. tumefaciens và khả năng
tái sinh của các tế bào sau khi lây nhiễm với vi khuẩn [8].
Kết hợp tác động của một số tác nhân trong quá trình biến nạp sẽ cải
thiện hiệu quả của hệ thống chuyển gen in vitro:
- Kết hợp với xử lý sóng siêu âm
Xử lý mô thực vật với A. tumefaciens trong điều kiện sóng siêu âm tạo
ra các tổn thương nhỏ ở mô thực vật, cho phép vi khuẩn này dễ dàng xâm
nhập vào mô tế bào thực vật. Bằng phương pháp này đã cái thiện rõ rệt hiệu
quả chuyển gen, biểu hiện gus tạm thời đã tăng từ 100 lên 1400 lần ở các tế
bào đậu tương, đậu đũa, cây vân sam trắng, lúa mỳ và ngô.
- Kết hợp với ly tâm tế bào
Khi chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens kết hợp với ly tâm ở giai
đoạn đồng nuôi cấy đã làm tăng đáng kể tần số chuyển gen [18].
Hệ thống chuyển gen in vivo
Trong hệ thống chuyển gen in vivo người ta tiến hành chuyển gen vào
nguyên cây, đây là phương pháp rất phổ biến đối với loài A. thaliana, một

trong những cây mô hình đối với các nghiên cứu về kỹ thuật di truyền.
Phương pháp này tốn ít thời gian, bỏ qua giai đoạn nuôi cấy mô và tái sinh
sau biến nạp, vì thế loại bỏ được các biến dị soma và số lượng cây chuyển thu
được lớn hơn. Kỹ thuật này đã được mô tả ở các cây trồng khác như: đậu
tương, hoa hướng dương, hoa rum và cây lạc.
- Chuyển gen vào hạt


3

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về cây Cải đất núi (Rorippa dubia (Pers.) Hara)
2.1.1. Nguồn gốc
Rorippa dubia (Pers.) Hara là cây mọc dại ở ruộng, rẫy thuộc họ cải. Là
loại cây được sử dụng và nghiên cứu nhiều trong y học. Phân bố nhiều nơi
trên thế giới, được tìm thấy nhiều ở một số nước như Ấn Độ, Mianma, Trung
Quốc, Việt Nam, Indonexia và Philippin.
2.1.2. Phân loại
Tên khoa học là Rorippa dubia (Pers.) Hara ngoài ra còn có một số tên
khác như Cải đất núi; Hân thái; Xước thái; Thụy thái; Dạ du thái; Kê nhục thái là
loại cây có nhiều công dụng trong y học, dựa trên các đặc điểm sinh thái như kích
thước lá, chiều cao phát triển tối đa của cây, số lượng hạt tạo ra, địa điểm mà
người ta tìm thấy đầu tiên Rorippa dubia (Pers.) Hara được phân loại:
Ngành: Maqnoliophyta Lớp: Maqnoliopsida
Bộ: Capparales

Họ: BrassicaceaeChi: Rorippa

2.1.3. Đặc điểm sinh thái học

Rorippa dubia (Pers.) Hara là cây thảo mọc hàng năm, mọc trên đất ẩm
ướt, cao 10-50cm, toàn cây không lông, lá ở gốc, thân to, phiến dài 10-15cm, có
thùy ở gốc sâu hay cạn, các lá trên không thùy, gốc từ từ hẹp thành cuống rộng
ôm thân, mỏng, mép có răng thưa. Chùm hoa kép ở ngọn, các chùm đơn ở nách,
lá hoa mọc so le, cuống hoa dài 3-4mm, lá đài bốn hình bầu dục, cánh hoa bốn,
màu vàng nhạt dài 2mm, nhị 6, van mở tách khỏi vách trong suốt và các giá
noãn, vòi nhụy ngắn học không có trên quả cải, đầu nhụy nguyên hay có 2 thùy,
quả cài dài 3-4cm, rộng 1-1,5mm mở thành 2 mảnh, hạt xếp 2 dãy, nhỏ hình
trứng, màu nâu, rễ mầm đối diện với khoảng cách tách 2 lá mầm, 2n = 32.


11

Vir: vùng gây độc; gọi: các vùng tương đồng mà trong phạm vi đó sự
tái tổ hợp (trao đổi chéo) có thể xảy ra để dẫn đến sự hợp nhất giữa hai
plasmid; RB và LB: các đoạn trật tự bên phải và trái 25 bp của T-DNA (LB
hoặc RB hoặc cả hai có thể có ở vectơ trung gian)
Ti-plasmid không được dùng trực tiếp cho quá trình chuyển gen vì nó có
kích thước lớn và mang các gen gây khối u, hơn thế nữa ADN của Ti-plasmid
có quá nhiều vị trí cắt của enzym giới hạn gây khó khăn cho việc gắn gen và
kiểm tra vị trí gắn gen [21]. Cấu trúc của Ti-plasmid có thể cung cấp cho ta
những yếu tố cần thiết để thiết kế những vectơ hữu ích cho kỹ thuật chuyển
gen. Thường người ta hay sử dụng các Ti-plasmid, mà trong đó vùng T-DNA
gây khối u đã bị tách bỏ và thay thế vào đó là các gen trội chỉ thị chọn lọc thường là các gen của vi khuẩn có khả năng kháng chất kháng sinh như
kanamycin, ampicilin .... [7]. Trước đây người ta hay dùng các gen chỉ thị được
kiểm soát bởi promotor và các tín hiệu polyadenin hóa được tách ra từ các gen
vùng T-DNA như octopine synthase hay nopaline synthase. Gần đây, người ta
hay sử dụng các promotor mạnh hơn được tách ra từ virus khảm bắp cải, như
CaMV35S và CaMV19S [2]. Tuy nhiên, kích thước lớn của Ti-plasmid rất khó
khăn cho việc gắn trực tiếp một phân đoạn ADN vào vùng giữa hai trật tự biên.

Để giải quyết khó khăn này, hai hệ thống vectơ không gây khối u (hệ thống
vectơ nhị thể và hệ thống vectơ liên hợp) đã được thiết kế. Hai hệ thống này
khác nhau ở chỗ: vùng gen vir và hai trật tự biên (LB và RB) cùng nằm trên
một đơn vị tái bản (plasmid) hay trên hai đơn vị khác nhau.
2.3.1. Hệ thống vectơ liên hợp
Đây là loại vectơ được tạo nên do sự hợp nhất của vài ba loại plasmid
khác nhau trước khi nó được biến nạp sang tế bào thực vật. Năm 1983,
Zambryski đã thiết kế thành công vectơ liên hợp pGV3850, đến này hệ thống
này vẫn được ứng dụng rộng rãi [21].


12

Hệ thống này bao gồm 2 plasmid: Plasmid thứ nhất là Ti-plasmid thể
nhận pGV3850, có nguồn gốc từ pTiC58. Nó chứa vùng gen vir, vùng TDNA mà ngoài hai đoạn biên LB và RB cùng một số gen chỉ thị được giữ lại,
còn thì loại bỏ hết (vì thế không có khả năng gây khối u và được thay thế vào
đó là một đoạn tương đồng với đoạn có trên plasmid thứ hai (gọi là plasmid
trung gian). Đoạn được thay thế này thực ra là một plasmid như pBR322 của
vi khuẩn E. coli [21].
Plasmid thứ hai (plasmid trung gian) pGV1103, là một plasmid đã được
tách dòng nhờ vi khuẩn E. coli dựa trên vectơ pBR322, và có thể tái sinh
được ở A. tumefaciens [21].
Sau khi được trộn lẫn với nhau, giữa hai loại plasmid xảy ra sự tiếp hợp
nhờ đoạn khởi đầu EcolEI có trong pGV1103. Quá trình tiếp hợp dẫn đến sự
hợp nhất giữa hai loại plasmid nhờ hiện tượng trao đổi chéo xảy ra giữa các
vùng tương đồng của hai loại plasmid pGV1103 và pGV3850. Vì thế vectơ
liên hợp chứa toàn bộ vectơ trung gian trong đó có chứa gen cần chuyển vào
tế bào thực vật [21].
2.3.2. Hệ thống vectơ nhị thể
Khác với hệ thống vectơ liên hợp, ở hệ thống vectơ nhị thể đoạn TDNA và đoạn mang gen vir nằm trên hai plasmid khác nhau. Mặc khác, nó

không có chứa đoạn tương đồng với Ti-plasmid và có khả năng tái bản độc
lập trong cả tế bào E. coli và A. tumefaciens. Đây là ưu điểm của hệ thống
vectơ này so với vectơ liên hợp. Năm 1984, Bevan thiết kế hệ thống vectơ nhị
thể pBin19, đến nay hệ thống vectơ này vẫn còn được dùng phổ biến [7]
Đoạn ADN cần chuyển vào tế bào thực vật nằm kẹp giữa hai trật tự
biên RB và LB. Nó gồm một gen khảm Pnos-NPT(II) 3’ ocs và trật tự
polylinker được tổng hợp bằng con đường hóa học để gắn gen cần chuyển.
Gen khảm này được tao ra bằng cách gắn promotor nopaline (Pnos) vào đoạn


13

mã hóa enzyme neomycin phosphatransferse II thuộc gen TN5 (NPT-II) của
vi khuẩn và ghép thêm vào đó đoạn kết 3’ của octopine synthase (3’ ocs) [7].
Hệ thống vectơ này được thiết kế từ hai loại plasmid: Plasmid thứ nhất
có nguồn gốc từ pUC19 của vi khuẩn E. coli mang đoạn T-DNA chỉ còn lại
hai trật tự biên RB và LB (toàn bộ phần gen gây khối u đã bị loại bỏ) và một
trật tự nucleotit đặc trưng cho sự nhận biết của enzyme giới hạn - dùng để gắn
kết gen cần chuyển hoặc các gen chỉ thị cho sự chọn lọc trong tế bào vi khuẩn
hoặc trong tế bào thực vật.
Plasmid thứ hai đóng vai trò hỗ trợ là Ti-plasmid, plasmid này đã được
loại bỏ toàn bộ vùng T-DNA (kể cả hai trật tự biên) nhưng vẫn còn giữ lại vùng
gen vir. Vùng gen vir này đóng via trò quan trọng cho việc chuyển của vectơ
nhị thể. Vì thế plasmid thứ hai này có tên gọi là plasmid tái tổ hợp. Loại
plasmid thứ nhất sau khi được nhân lên trong tế bào E. coli thì được chuyển
sang A. tumefaciens chứa loại plasmid thứ hai bằng quá trình tiếp hợp.
Nếu như trong vectơ nhị thể nói trên có mang gen chỉ thị kháng
kanamycin và gen gus thì sau khi các gen này được biến nạp vào mô thuốc lá,
chỉ có những tế bào cây được biến nạp mới có khả năng sống sót trên môi
trường chứa kanamycin. Và sau đó, các mô được tái sinh từ các tế bào được

biến nạp, do có chứa gen gus nên sẽ sản sinh ra β-glucuronidase có khả năng
phân hủy X-gluc thành một hợp chất trung gian mà khi bị oxy hóa sẽ tạo ra
chất indogo màu xanh đặc trưng [3].
Nếu so sánh hai hệ thống vectơ nói trên với nhau ta thấy rằng giữa
chúng có hai điểm khác nhau như sau: (1) Ở hệ thống vectơ liên hợp, vùng TDNA và vùng vir cùng nằm trên một plasmid, trong khi đó ở hệ thống vectơ
nhị thể chúng nằm trên hai vectơ khác nhau; (2) Trước khi chuyển sang tế bào
thực vật, vectơ liên hợp xảy ra sự hợp nhất giữa Ti-plasmid thể nhận với
vectơ trung gian bằng quá trình trao đổi chéo, trong khi ở vectơ nhị thể không
xảy ra quá trình hợp nhất này.


14

2.3.3. Vectơ chuyển gen pB2GW7
Vectơ pB2GW7 là vectơ nhân tạo dùng để chuyển gen vào thực vật,
vectơ này có kích thước là 10,882 kb có đặc điểm như sau:

Hình 4. Sơ đồ vectơ pB2GW7 [15]
+ Có promoter 35S và terminator 35S cho phép khởi đầu và kết thúc
quá trình phiên mã của gen được gắn vào.
+ Có trình tự LB và RB là trình tự biên trái và biên phải của vùng TADN, vùng này gồm 25 bp có cấu trúc lặp lại không hoàn toàn, có chức năng
giúp cho quá trình chuyển T-DNA sang tế bào thực vật.
+ Có chứa gen bar, gen kháng thuốc trừ cỏ gốc phosphonothricin
(PPT), chức năng để chọn lọc thực vật chuyển gen.
+ Trình tự attR1 và attR2 là trình tự tái tổ hợp có nguồn gốc từ thực
khuẩn thể lambda, có chức năng tạo vị trí tiếp nhận gen được chuyển sang từ
vectơ nhận trong phản ứng LR.
+ Có chứa gen ccdB là một gen thông minh, gen này gây chết các tế
bào chứa nó trong môi trường có kháng sinh kanamycin.
+ Có chứa các vị trí cắt của enzym giới hạn BamHI, EcoRI, HindIII.

15

2.4. Các nghiên cứu về Bacillus thuringiensis và gen cry
2.4.1. Những nghiên cứu về Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis (B. thuringiensis) là một loại vi khuẩn đất có
khả năng sản xuất ra các protein tinh khiết rất độc đối với ấu trùng của nhiều
loài côn trùng nhưng không độc với động vật có xương sống (động vật có vú,
chim, cá ...) [10]. Vi khuẩn này có thể sản sinh ra bốn loại độc tố hại côn
trùng khác nhau: ngoại độc tố α, β, γ toxin và nội độc tố δ toxin. Trong đó nội
độc tố δ toxin là quan trọng nhất. Tinh thể protein do vi khuẩn này tạo ra sau
khi xâm nhập vào côn trùng sẽ bị các protease trong ruột côn trùng phân giải
thành các đoạn nhỏ trong đó có đoạn mang khối lượng phân tử là 68.000
dalton chứa gần 1.200 aminoaxit có hoạt tính độc gây hỏng ruột côn trùng.
Năm 1984, Stahly đã tách được gen mã hóa protein này (Bt toxin) [12]. Các
gen này thường định vị trên plasmid của vi khuẩn và gọi tên chung là gen ICP
(Insecticidal Crystal protein) [12]. Do vi khuẩn B. thuringiensis là vi khuẩn
phức tạp có hơn 30 serotype nên chúng có chứa các gen ICP khác nhau và tạo
nên những nhóm độc tố khác nhau [12].
Từ những năm 1970 vi khuẩn này đã được nghiên cứu tạo ra chế phẩm
để diệt sâu và được gọi là chế phẩm Bt. Chế phẩm này được dùng để diệt
nhiều loại sâu hại khác nhau như bộ cánh cứng, bộ hai cánh, bộ cánh vẩy, bộ
cánh màng...với hiệu lực khá mạnh [10]. Mặc dù được coi là thuốc trừ sâu
hiệu quả cao và an toàn, nhưng nó cũng có một số hạn chế nhất định về
phương diện sinh học như thời gian ảnh hưởng ngắn hiệu quả tác động chậm,
không tiếp xúc được với côn trùng ẩn sâu dưới lá, đất. Điều đó đã phần nào
làm giảm mức độ sử dụng của chế phẩm này. Những nhược điểm này hoàn
toàn bị loại trừ khi người ta chuyển gen cry vào cây trồng để tạo cây trồng
kháng sâu [12]. Từ năm 1996 đến nay có rất nhiều loại cây trồng chuyển gen

kháng sâu được tạo ra như: lúa, ngô, đậu tương, bông ... [16].


16

2.4.2. Một số nghiên cứu về gen cry
Năm 1982, Held đã đề nghị sử dụng chữ viết tắt “cry” (Crystal) để chỉ
các gen tạo tinh thể độc tố của B. thuringiensis. Dựa trên tác động chuyên biệt
và sự tương đồng về trình tự, gen tạo protein độc tố có thể được chia làm sáu
nhóm chính và được ký hiệu từ cryI đến cryVI. Trong mỗi nhóm lại có các
nhóm phụ được ký hiệu theo chữ cái từ A đến G [10].
Gen cryI mã hóa cho loại tiền độc tố có kích thước từ 130 - 140 kDa
gây hại cho sâu bộ cánh vẩy (Lepidoptera), điển hình như loài sâu quấn lá,
sâu đo, sâu róm, sâu đục gân lá ...
Gen cryII mã hóa cho loại tiền độc tố có kích thước 66 kDa gây hại
cho sâu bộ cánh vẩy và bộ hai cánh (Diptera), điển hình như ruồi đục quả.
Gen cryIII mã hóa cho loại tiền độc tố có kích thước 73 kDa gây độc
tính lên ấu trùng bộ cánh cứng Coleoptera, gồm các loại sâu như câu cấu, xén
tốc đục thân, bọ dừa ...
Gen cryIV mã hóa cho loại tiền độc tố có khối lượng 72, 74, 128 và
135 kDa có tác dụng gây hại ấu trung bộ hai cánh.
Gen cryV mã hóa cho loại tiền độc tố có khối lượng 80 kDa có tác
dụng gây hại ấu trùng bộ cánh vẩy và bộ cánh cứng.
Gen cryVI mã hóa cho loại tiền độc tố có hoạt tính diệt tuyến trùng.
2.4.3. Những nghiên cứu về gen cryIA
Gen cryIA(c) là gen mã hóa cho protein gây độc cho côn trùng. Trong
tự nhiên gen này có nguồn gốc từ vi khuẩn B. thuringiensis [10]. Gen này đã
được các nhà khoa học phân lập, mang đi giải trình tự và chỉ ra rằng chúng có
kích thước là 3,534 kb. Từ sau khi trình tự gen cryIA(c) được công bố trên
ngân hàng gen có nhiều công trình nghiên cứu khác được thực hiện nhằm xây

dựng những hệ thống vectơ mang gen này để chuyển vào cây trồng, đánh giá
khả năng biểu hiên của gen này trên cây trồng. Năm 1997, Wu và cộng sự đã


4

Hạt Rorippa dubia (Pers.) Hara chứa dầu có vị ngọt, nhạt, tính mát, có
tác dụng thanh nhiệt giải độc, chỉ khái, kiện vị, lợi niệu, tiêu thũng. Thường
được trị cam mạo phát sốt, sưng đau hầu họng, phổi nóng sinh ho, viêm khí
quản mạn tính, phong thấp đau nhức khớp cấp tính, viêm gan hoàng đản, tiểu
tiện khó khăn. Ở Trung Quốc, hạt cũng được dùng như hạt cây Đình lịch –
Draba nemorasa L. làm thuốc thanh nhiệt như đàm, sinh suyễn, lợi niệu.
2.2. Vi khuẩn A. tumefaciens và quá trình chuyển gen vào cây trồng
Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ
đã được thiết kế dạng plasmid tái tổ hợp, gắn vào hệ gen của tế bào chủ.
Trong tế bào chủ, gen lạ hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng, từ đó
xuất hiện đặc tính mới của cơ thể đã mang gen chuyển.
Hiện nay, có rất nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật khác nhau
như sử dụng súng bắn gen, dùng xung điện, dùng siêu âm, dùng vi tiêm, dùng
vi khuẩn A. tumefaciens, ... Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn
A. tumefaciens là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất hiện nay[5].
2.2.1. Đặc điểm vi khuẩn A. tumefaciens
A. tumefaciens là loài vi khuẩn sống trong đất gây ra bệnh khối u hình
chóp ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm, đặc biệt là thực vật có
hoa và một số ít thực vật một lá mầm thuộc họ Liliaceae và Amaryllidaceae.
Hoàn toàn khác với mô tế bào thực vật bình thường, khối tế bào được vi
khuẩn A. tumefaciens chuyển gen vào phát triển mạnh ngay trong điều kiện
cây thiếu hoormon sinh trưởng (auxin và cytokinin). Ti-plasmid đã chuyển
một đoạn T-DNA (Transfer DNA) sang tế bào thực vật và đoạn ADN này chứa
những gen điều khiển quá trình sinh tổng hợp các hoormon sinh trưởng đó. Tế

bào khối u tổng hợp amino acid và các dẫn xuất của đường được biết đến như là
opine [14]. Các loại opine được tổng hợp trong tế bào khối u gồm nopaline,
octopine, agrocinopine, mannopine và agropine, thành phần và tỷ lệ các loại


18

Phần 3
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Chủng vi khuẩn
- Tế bào vi khuẩn A. tumefaciens chủng EHA105 có mang vector tái tổ
hợp pB2GW7 chứa gen CryIA(c)-M#16 và gen bar do Bộ môn Công nghệ
sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên cung cấp
- Cây thử nghiệm: Rorippa dubia (Pers.) Hara hay còn gọi là Cải đất
núi được lấy tại tỉnh Thái Nguyên
- Mồi sử dụng để nhân gen do hãng COSMO Genetech cung cấp gồm:
Bảng 3.1: Trình tự mồi sử dụng trong PCR
Tên mồi

Trình tự

Bar – F

TCC GTA CCG AGC CGC AGG AA

Bar – R

CCG GCA GGC TGA AGT CCA GC

CryIA(c)-M#16 F

CCT CAG CGT GCT TCG AGA CGT

CryIA(c)-M#16 R

ACG TTG TTG TGG AGC GGC GT

Kích thước sản
phẩm PCR (bp)
408

544

3.1.4. Hóa chất, dụng cụ
- Môi trường YEP dùng cho nuôi khuẩn A. tumefaciens gồm Bacto
Pepton (Oxoid), Yeast Extract (Oxoid), Agar (Hạ Long).
- Hóa chất dùng cho phản ứng PCR là bộ kít PCR Master mix 2X của
Fermentas
- Hóa chất sử dụng trong chạy điện di ADN: Agarose (Bio-Canada),
đệm TAE (Tris base (Merk), EDTA (Merk), NaOH, Acid acetic 100% (Merk)),
Loading dye (Intronbio), Ethidium bromide (Canada).


19

- Hóa chất sử dụng cho môi trường đồng nuôi cấy bao gồm: Sucrose
(Việt Nam)
3.1.5. Thiết bị sử dụng trong đề tài

- Bộ điện di DNA (Mupid 2 plus)
- Cân phân tích Sartorius TE214S
- Máy lắc SK 300
- Máy vortex IKA ZX3
- Micropipet Gilson
- Tủ lạnh 4ºC (HITACHI) tủ lạnh -20ºC (DAEWOO) và -80ºC (Sanyo)
- Bể ổn nhiệt (Labtech)
- Tủ cấy vô trùng (Airtech)
- Máy ly tâm MIKRO 22 (Hettich zentrifugen)
- Máy ly tâm loại nhỏ (Hanil)
- Máy spindown (Hanil)
- Máy PCR EG3200 (Thermocycle)
- Máy hút chân không (Wech)
- Lò vi sóng (LG)
- Nồi khử trùng TLG (Nhật)
Ngoài ra đề tài còn sử dụng một số thiết bị khác của phòng thí nghiệm Công
nghệ tế bào thực vật Khoa CNSH & CNTP Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên.
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Khoa Công Nghệ Sinh Học và Công
Nghệ Thực Phẩm.
- Thời gian: Từ 03/2012- 03/2013.
3.3. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Tạo cây cải đất chuyển gen thông qua vi khuẩn
A.tumefaciens


20

- Nội dung 2: Đánh giá khả năng di truyền của gen bar và gen
cryIA(c)-M#16 trên cây cải qua 3 thế hệ.

- Nội dung 3: Đánh giá khả năng biểu hiện gen bar và gen cryIA(c)M#16 trong cây cải đất qua 3 thế hệ thông qua phương pháp PCR.

3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Tạo cây cải đất chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
3.4.1.1. Phương pháp chuẩn bị mẫu và chủng khuẩn
Trồng cây Cải đất núi đến lúc ra hoa. Cây phát triển sinh trưởng tốt
trong điều kiện khí hậu ở Việt Nam, dải nhiệt độ cho cây sinh trưởng phát
triển tương đối rộng từ 200C đến 350C. Chăm sóc cho cây sinh trưởng và phát
triển đến khi cây sẵn sàng cho biến nạp.
Chuẩn bị vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng EHA105 mang
vector pB2GW7 có chứa gen mục tiêu là gen bar và gen cryIA(c)-M#16.
Chủng vi khuẩn được bảo quản trong glycerol ở -20oC, cấy ria trên môi
trường YEP thạch có bổ sung kháng sinh rifamicin nồng độ 30 mg/l và
spectinomicin nồng nộ 100 mg/l, nuôi ở 28 oC trong 48-72 giờ. Cấy chuyển vi
khuẩn trên đĩa thạch sang môi trường YEP lỏng có bổ sung kháng sinh tương
ứng và nuôi ở 28 oC có lắc 200 vòng/phút trong khoảng 10-12 giờ. Giai đoạn
tiếp theo chuyển 1 ml dịch khuẩn sang 200 ml môi trường YEP lỏng có bổ
sung kháng sinh để tiếp tục nuôi ở 28 oC có lắc 200 vòng/phút khoảng 16-18
giờ. Tiến hành ly tâm 200 ml dịch khuẩn ở 5000 vòng/phút trong 15 phút, 4
C. Phần cặn được hòa trong 200 ml môi trường biến nạp.

o

3.4.1.2. Biến nạp gen thông qua Agrobacterium tumefaciens
Quá trình biến nạp được thực hiện theo phương pháp nhúng hoa của
Bechtold, 1993. Hòa khuẩn trong môi trường biến nạp tạo dịch huyền phù.
Toàn bộ các cụm hoa được nhúng ngập trong đó đồng thời hút chân không


21

trong một khoảng thời gian thích hợp. Sau đó che chắn cho cây từ 16-24 giờ
để duy trì độ ẩm cao. Tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời, có thể
làm thoát hơi nước giảm độ ẩm, làm giảm hiệu quả biến nạp. Sau khi biến
nạp tránh tưới nước trực tiếp lên cây có thể làm rửa trôi vi khuẩn và hạt phấn.
Biến nạp được lặp lại 3 lần để tăng cường hiệu quả, chú ý giữa các lần cách
nhau hơn 4 ngày để tránh ảnh hưởng tới sinh lý của cây. Khi quả chín, vỏ quả
khô có thể thu hạt, hạt được thu riêng rẽ trên từng cây. [6]
Hạt cây cải thu hái sau chuyển gen được gieo trên giấy thấm bổ sung
1/10 MS để cung cấp dinh dưỡng. Dùng pipet phun dung dịch thuốc diệt cỏ
Basta với nồng độ 3 mg/l để chọn lọc. Những hạt có khả năng nảy mầm và
phát triển trên môi trường chọn lọc được chuyển sang khay đất chăm sóc để
tiến hành các đánh giá tiếp theo.
3.4.2. Đánh giá khả năng di truyền của gen bar và gen CryIA(c)-M#16
trong cây cải đất qua 3 thế hệ
Để đánh giá khả năng di truyền của gen được chuyển trong cây cải đất, sau
khi thu được hạt ở thế hệ T0, chọn ngẫu nhiên 10 hạt đem trồng trên đất, đến khi
cây được 10 lá thu mỗi cây 1 lá đem phân tích sự di truyền gen mục tiêu bằng
phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu gen bar và gen cryIA(c)-M#16. Tiến
hành làm tương tự với hạt ở thế hệ T1 và T2. Sau đó đọc kết quả và rút ra kết luận.
Hóa chất dùng cho tách chiết ADN:
- Dung dịch CTAB (100ml)
CTAB

1g

Mecaptoetanol

1ml

EDTA – 8 0,5M

2ml

Tris – 7,5 1M

10ml

NaCl 5M

14ml

dH2O

73ml


22

- Cồn tuyệt đối, cồn 70%.
- Dung dịch 24:1 bao gồm Chloroform : Isoamin alcohol pha theo tỷ lệ 24:1
- NaCl 5M
- Đệm TE 0,1X gồm Tris – HCl : EDTA pha theo tỷ lệ 10:1
Quy trình tách chiết DNA:
- Bước 1: Ủ sẵn dung dịch đệm CTAB ở 600C trong 30 phút.
- Bước 2: Cắt 0,7 – 1 g mô lá cho vào ống eppendof có chứa viên
bi đã vô trùng, bổ sung khoảng 600 µl dung dịch CTAB, lắc mạnh cho
tới khi nát nhuyễn.
- Bước 3: Ủ mẫu ở 650C trong 30 phút, đảo nhẹ 3 – 5 lần trong quá trình ủ.
- Bước 4: Thêm một thể tích dung dịch chloroform:isoamyl alcohol (

24 : 1), đảo đều.
- Bước 5: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C.
- Bước 6: Chuyển phần dịch nổi phía trên sang ống eppendof mới và
bổ sung thêm một thể tích dung dịch chloroform:isoamiyl alcohol (24:1),
đảo đều.
- Bước 7: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C.
- Bước 8: Chuyển phần dịch nổi phía trên sang ống eppendof mới. Bổ
sung thêm một thể tích cồn tuyệt đối và 20 µl NaCl 5M. Để mẫu ở - 200C
trong 20 phút (có thể để qua trưa).
- Bước 9: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, thu kết tủa.
- Bước 10: Rửa 2 lần kết tủa bằng cồn 70%, ly tâm 13000 vòng/phút
trong 5 phút ở 40C, thu kết tủa.
- Bước 11: Làm khô tủa trong điều kiện nhiệt độ phòng. Hòa tan tủa
trong 20 µl TE 0,1X, giữ ở - 200C dể dùng dần.


5

opine này tùy thuộc vào dòng vi khuẩn A. tumefaciens khởi đầu sự hình thành
khối u. Octopine và nopaline là hai loại opine có nguồn gốc từ arginine và dễ
dàng phát hiện nhất trong mô khối u hình chóp. Do đó, nhiều dòng A.
tumefaciens phổ biến được thiết kế theo kiểu octopine hoặc nopaline [21].
Nghiên cứu về hiện tượng gây khối u này, thấy rằng khả năng chuyển
đoạn T-DNA vào hệ gen thực vật của A. tumefaciens là dựa vào chức năng
của Ti-plasmid. Khi phát hiện ra Ti-plasmid và khả năng của nó, người ta đặc
biệt chú ý khai thác và sử dụng chúng để tạo nên các vectơ chuyển gen, để
chuyển các gen quan tâm vào thực vật nhằm tạo ra cây trồng mang những tính
trạng mong muốn [1]. Để làm được điều này, các nhà khoa học đã loại bỏ
toàn bộ các gen gây khối u và gen mã hóa opine của T-DNA chỉ giữ lại những
trình tự cần thiết cho quá trình chuyển gen như vùng vir và các trình tự biên

của vùng T-DNA.
2.2.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid
Ti-plasmid (tumor inducing) là một cấu trúc ADN vòng có kích thước
khoảng 200 - 250 kb, có nguồn gốc từ một loài vi khuẩn đất là A. tumefaciens
có khả năng gây bệnh khối u ở thực vật. Đặc điểm quan trọng của Ti-plasmid
là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể, nhưng cũng có thể tồn tại độc lập
bên ngoài nhiễm sắc thể.
Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng vi khuẩn A.
tumefaciens gây độc. Chúng được duy trì ổn định trong vi khuẩn này ở nhiệt
độ dưới 30oC. Bằng phương pháp lai ADN lập bản đồ chuỗi kép dị hợp,
người ta đã xác định được Ti-plasmid có 4 vùng tương đồng và được ký hiệu
là vùng A, B, C và vùng D [14].
Vùng A luôn được chuyển sang tế bào thực vật nên được gọi là vùng
T-ADN.
Vùng B liên quan đến quá trình tái sinh của tế bào vi khuẩn


24

- Nguyên lý: Điện di là kỹ thuật được sử dụng trong thí nghiệm để phân
tích các đại phân tử tích điện. Axit nucleic là phân tử tích điện âm, vì vậy,
dưới tác dụng của điện trường chúng có thể dịch chuyển từ cực âm (cathode)
sang cực dương (anode). Trên cùng một bản gel, có cùng một dòng điện
những phân tử DNA khác nhau về trọng lượng nên khác nhau về điện tích và
chạy được những quãng đường khác nhau sau một thời gian như nhau.
- Tiến hành:
+ Đổ bản gel điện di: Cân 1g agarose cho vào 100 ml TAE 1X (Trisbase: 48,8 g/l; acid acetic: 10,2 ml/l; EDTA 0,5M: 20 ml/l; pH = 8,0), đun
sôi cho tan hết, để nguội xuống khoảng 500C bổ sung khoảng 3 µl ethydium
bromide lắc đều rồi đổ ra khay điện di đã cài sẵn răng lược. Để gel đông và ổn
định trong 30 – 40 phút ở nhiệt độ phòng. Rút lược ra khỏi khuôn.

+ Tra mẫu: Mẫu được trộn theo tỷ lệ 10 µl DNA + 2 µl loading dye.
Dùng pipet trộn đều rồi tra vào các giếng điện di.
+ Chạy điện di: Chạy điện di với hiệu điện thế 60 – 110V. Quan sát
vạch màu đến gần cuối bản gel thì dừng lại.
+ Soi gel và chụp ảnh: Gel sau khi chạy điện di xong được lấy ra đặt
lên máy soi gel để xem băng DNA và chụp ảnh dưới đèn tử ngoại.
3.4.3. Đánh giá khả năng biểu hiện gen bar và gen CryIA(c)-M#16 trên cây
cải đất qua 3 thế hệ
3.4.3.1. Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của các cây cải đất
chuyển gen qua 3 thế hệ
Đánh giá các chỉ tiêu theo dõi về chiều cao cây, thời gian sinh trưởng
của cây, số quả thu được trên một cây qua từng thế hệ. Kết quả thu được ở
cây chuyển gen sẽ được so sánh với cây đối chứng không chuyển gen. Từ đó


25

sẽ đưa ra được kết luận gen chuyển có tác động thế nào tới sự sinh trưởng và
phát triển của cây.
3.4.3.2. Đánh giá khả năng biểu hiện gen bar trên cây cải đất chuyển
gen qua 3 thế hệ
Đánh giá khả năng biểu hiện gen bar trên cây cải chuyển gen nhờ tính
kháng basta : các cây chuyển gen và đối chứng được phun thuốc trừ cỏ basta
để kiểm tra sự hiện diện và biểu hiện của gen bar trong cây chuyển gen. Sử
dụng basta nồng độ 0.3% để chọn lọc. Khi cây con đạt 2 lá thật (cây khoảng 2
tuần tuổi), chúng tôi tiến hành chọn lọc basta trên lá. Quan sát và so sánh với
cây đối chứng, từ đó rút ra kết luận.
3.4.3.3. Đánh giá khả năng biểu hiện gen CryIA(c)-M#16 trên các cây
cải đất chuyển gen qua 3 thế hệ
Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng sâu hại được tiến hành với loại

sâu chính là sâu xanh trên cải. Tiến hành theo dõi với chỉ tiêu tỷ lệ cây bị hại
và tỷ lệ lá bị hại qua từng thế hệ. Kết quả thu được sẽ so sánh với khay cây
đối chứng không chuyển gen.