Nghiên cứu xây dựng quy trình bao gói carotenoid sử dụng tế bào nấm men yarrowia lipolytica

vbbvb

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VÕ THỊ MỸ THU

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH BAO GÓI
CAROTENOID SỬ DỤNG TẾ BÀO NẤM MEN YARROWIA
LIPOLYTICA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA - 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VÕ THỊ MỸ THU

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH BAO GÓI
CAROTENOID SỬ DỤNG TẾ BÀO NẤM MEN YARROWIA
LIPOLYTICA

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Ngành:

Công nghệ sau thu hoạch

Mã số:

60540104

Quyết định giao đề tài:

416/ QĐ-ĐHNT ngày 06/05/2015

Quyết định thành lập HĐ:

226/ QĐ-ĐHNT ngày 17/03/2016

Ngày bảo vệ:

Ngày 16/05/2016

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
TS. TẠ THỊ MINH NGỌC
Chủ tịch Hội đồng:
TS. VŨ NGỌC BỘI
Khoa sau đại học:

KHÁNH HÒA - 2016


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình
bao gói Carotenoid sử dụng tế bào nấm men Yarrowia Lipolytica” là công trình
nghiên cứu của cá nhân tôi và chƣa từng đƣợc công bố trong bất cứ công trình khoa
học khác cho tới thời điểm này.
Nha Trang, Ngày tháng

năm 2016

Tác giả luận văn

Võ Thị Mỹ Thu

iii


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ của quý
phòng ban trƣờng Đại học Nha Trang, đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi đƣợc hoàn
thành đề tài. Đặc biệt là sự hƣớng dẫn tận tình của TS.Tạ Thị Minh Ngọc đã giúp đỡ
tôi hoàn thành tốt đề tài. Qua đây, tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến sự giúp đỡ của cô.
Xin cám ơn quý thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm và các cán bộ Trung tâm thí nghiệm thực hành Trƣờng Đại học Nha Trang đã tận tình giúp đỡ và tạo
điều kiện cho tôi trong suốt thời gian qua. Xin cám ơn các thầy cô phản biện đã cho tôi
những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu đƣợc hoàn thành có chất lƣợng.
Cuối cùng tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và tất cả bạn bè đã
giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, ngày

tháng

năm 2016

Tác giả luận văn

Võ Thị Mỹ Thu

iv


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... iii
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. iv
MỤC LỤC ....................................................................................................................... v
DANH MỤC KÝ HIỆU .............................................................................................. viii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................................... ix
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................................... x
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................... xi
TRÍCH YẾU LUẬN VĂN .......................................................................................... xiii
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN ............................................................................................... 5
1.1. Giới thiệu về nấm men ƣa béo Yarrowia lipolytica ................................................. 5
1.1.1. Nguồn gốc.............................................................................................................. 5
1.1.2. Đặc tính sinh lý ...................................................................................................... 5
1.1.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của Y. lipolytica ...................................... 7
1.1.4. Ứng dụng ............................................................................................................. 12
1.2. Chất kị nƣớc và tế bào nấm men ............................................................................ 14
1.3. Carotenoid .............................................................................................................. 16
1.3.1. Phân loại .............................................................................................................. 17
1.3.2. Chức năng sinh học của carotenoid ..................................................................... 22
1.4. Bao gói BC bằng tế bào nấm men Y. lipolytica...................................................... 23
1.4.1. Sự tƣơng đồng giữa cấu trúc tế bào nấm men và bao vi nang ............................ 27
1.4.2. Ƣu điểm của việc bao gói vi nang bằng tế bào nấm men .................................... 27
1.4.3. Cơ chế của quá trình bao gói ............................................................................... 28
1.4.4. Điều kiện giải phóng BC ra khỏi tế bào .............................................................. 29
v

Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 31
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................................. 31
2.2. Môi trƣờng nuôi cấy nấm men ............................................................................... 31
2.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng ................................................................................... 31
2.3.1. Hóa chất ............................................................................................................... 31
2. 3.2. Thiết bị sử dụng .................................................................................................. 32
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................ 32
2.4.1. Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS ............................................. 32
2.4.2. Phƣơng pháp nuôi cấy nấm men ......................................................................... 33
2.4.3. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng BC thấm qua màng tế bào ............................ 33
2.4.4. Phƣơng pháp đếm tỷ lệ sống chết của tế bào nấm men....................................... 35
2.4.4.1. Phƣơng pháp nhuộm xanh methylene .............................................................. 35
2.4.4.2. Phƣơng pháp đếm tế bào sống chết bằng buồng đếm hồng cầu...................... 35
2.4.4.3. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc ............................................................................ 36
2.4.5. Phƣơng pháp xác định tính kỵ nƣớc và tính acid/base của bề mặt tế bào nấm
men ................................................................................................................................ 37
2.5. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm ............................................................................... 38
2.5.1. Xây dựng quy trình bao gói hợp chất carotenoid sử dụng tế bào nấm men đƣợc
thể hiện thông qua sơ đồ ................................................................................................ 38
2.5.2. Xác định tỉ lệ nồng độ BC đối với tế bào nấm men ............................................ 39
2.5.3. Xác định nhiệt độ tiếp xúc của BC với tế bào nấm men ..................................... 40
2.5.4. Xác định điều kiện tiếp xúc ................................................................................. 42
2.5.5. Xác định thời gian tiếp xúc giữa BC với tế bào nấm men .................................. 44
2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu ...................................................................................... 45
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................................... 46
3.1. Xác định nồng độ BC thích hợp cho quá trình tiếp xúc tế bào nấm men............... 46
vi

3.2. Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình tiếp xúc giữa BC với tế bào ................ 47
3.4. Xác định thời gian tiếp xúc giữa BC với tế bào ..................................................... 51
3.5. Đánh giá tính chất bề mặt của tế bào nấm men Y. lipolytica ................................. 56
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ ......................................................... 59
4.1. Kết luận................................................................................................................... 59
4.2. Kiến nghị ................................................................................................................ 59
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................... 61
PHỤ LỤC
PHẦN THỦ TỤC

vii


DANH MỤC KÝ HIỆU
A450

: Độ hấp thụ tại bƣớc sóng 450 nm.

V

: Thể tích tách chiết.

M

: Khối lƣợng sinh khối sau tiếp xúc BC

f

: Độ pha loãng

A0

: Độ hấp thụ tại bƣớc sóng 600 nm của tế bào trƣớc khi trộn với dung môi.

A

: Độ hấp thụ đo tại bƣớc sóng 600 nm của tế bào sau khi trộn với dung môi.

viii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BC

Beta caroten

BHT

Butylated hydroxy toluene

C

Cacbon

N

Nitơ

YPD

Yeast Peptone D-glucose

v/p

Vòng/ phút

YPDA

Yeast Peptone D-glucose Agar

MATS

Microbial adhesion to solvents

UV-VIS

Ultra violet visible

PFC

perfluorocarbon

ix


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Nguồn C đƣợc vi sinh vật sử dụng.................................................................9
Bảng 1.2. Nguồn N đƣợc vi sinh vật sử dụng ...............................................................10
Bảng 1.3. Nồng độ carotenoid trong một số thực phẩm ................................................17

Bảng 1.4. Một số bƣớc sóng của caroten khi chiết trong các dung môi khác nhau ......21
Bảng 1.5. Một số nguyên liệu thích hợp để chế tạo vi nang .........................................25
Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng (g/L) .......................................................................31
Bảng 3.1. Số khuẩn lạc của tế bào nấm men 0544 và W29 trên đĩa thạch (CFU/ml) ...55

x


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tế bào nấm men Y. lipolytica .........................................................................5
Hình 1.2. Hình thái khuẩn lạc của Y. lipolytica W29 trên môi trƣờng YPDA ở 27°C ...6
Hình 1.3. Hình thái tế bào Y. lipolytica W29 trên YPDA ở 27 °C ..................................6
Hình 1.4. Hình thái khuẩn lạc Y. lipolytica 0544 trên môi trƣờng YPDA ở 27 °C .........6
Hình 1.5. Hình thái tế bào Y. lipolytica 0544 trên môi trƣờng YPDA ở 27 °C ..............6
Hình 1.6. Sơ đồ phân loại carotenoid ............................................................................18
Hình 1.7. Công thức cấu tạo của β-caroten ...................................................................18
Hình 1.8. Công thức cấu tạo của  -caroten...................................................................19
Hình 1.9. Công thức cấu tạo của Lutein và zeaxanthin .................................................20
Hình 1.10. Công thức cấu tạo của astaxanthin ..............................................................20
Hình 1.11. Sơ đồ quy trình tạo vi nang BC bằng tế bào nấm men ................................ 27
Hình 1.12. Cấu trúc tế bào nấm men và bao vi nang ....................................................27
Hình 1.13. Sự vận chuyển hợp chất kỵ nƣớc qua màng tế bào .....................................29
Hình 1.14. Sự giải phóng hoạt chất khỏi màng tế bào ..................................................30
Hình 2.1. Sơ đồ xác định hàm lƣợng BC thấm qua màng tế bào bằng phƣơng pháp
UV-VIS ..........................................................................................................................34
Hình 2.2. Trình tự pha loãng mẫu theo dãy thập phân ..................................................36
Hình 2.3. Quy trình bao gói hợp chất carotenoid sử dụng tế bào nấm men ..................39
Hình 2.4. Sơ đồ lựa chọn nồng độ carotene/dầu ăn thích hợp ......................................40
Hình 2.5. Sơ đồ lựa chọn nhiệt độ tiếp xúc thích hợp giữa BC với nấm men ..............41
Hình 2.6. Sơ đồ lựa chọn điều kiện tiếp xúc thích hợp giữa BC với nấm men ............43

Hình 2.7. Sơ đồ lựa chọn thời gian tiếp xúc thích hợp giữa BC với nấm men .............44
Hình 3.1. Nồng độ BC đối với tế bào nấm men 0544 và W29 sau khi tiếp xúc 16 h ...46
Hình 3.2. Hàm lƣợng BC (µg/g) thấm qua màng tế bào nấm men sau khi tiếp xúc với
nhũ tƣơng dầu ở điều kiện nhiệt độ khác nhau ..............................................................47
xi


Hình 3.3. Tỉ lệ tế bào còn sống trƣớc khi tiếp xúc và sau khi tiếp xúc với BC tại điều
kiện nhiệt độ khác nhau .................................................................................................48
Hình 3.4. Hàm lƣợng BC (µg/g) thấm qua màng tế bào nấm men theo hai điều kiện
tiếp xúc ..........................................................................................................................50
Hình 3.5. Hàm lƣợng BC thấm qua màng tế bào theo thời gian ...................................52
Hình 3.6. Phổ hấp thụ BC và dịch chiết từ sinh khối W29 và 0544 sau tiếp xúc .........53
Hình 3.7. Tỉ lệ tế bào còn sống trƣớc khi tiếp xúc và sau khi tiếp xúc với BC ............54
Hình 3.8. Tính chất bề mặt của tế bào nấm men ...........................................................56

xii


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Yarrowia lipolytica là chủng nấm men ƣa béo điển hình và các nhà nghiên cứu
hiện nay đang quan tâm đến việc chuyển hóa các hợp chất kị nƣớc nhằm sản xuất và
bao gói các hợp chất thiên nhiên có giá trị cao nhƣ tinh dầu gừng, polyphenol,
curcumin, beta-caroten... Chúng có khả năng sử dụng chất béo để sinh trƣởng và sản
sinh các hợp chất có giá trị nhƣ axit hữu cơ, chất hoạt động bề mặt, enzyme, chất
thơm, lipid đơn bào, protein đơn bào… Trong đó, carotenoid là một trong những hợp
chất đƣợc ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm, mỹ phẩm, nhƣng có nhƣợc điểm là
không tan trong nƣớc, nhạy cảm với nhiệt độ và cần đƣợc bảo vệ. Những nghiên cứu
gần đây về carotenoid nhƣ beta-caroten, lycopen, lutein, zeaxanthin, astaxanthin... cho
thấy các hợp chất này có khả năng chống oxy hóa, tăng cƣờng khả năng miễn dịch,

giúp ngăn ngừa đáng kể các bệnh. Do đó ngày nay, các hợp chất carotenoid rất đƣợc
quan tâm nghiên cứu, nhằm mục đích ứng dụng trong sản xuất thuốc chữa bệnh và
thực phẩm chức năng.
Việc sử dụng màng tế bào nấm men trong công nghệ bao gói vi nang sẽ là bƣớc
quan trọng giúp loại bỏ việc sử dụng hóa chất độc hại trong quy trình, đồng thời cũng
làm đơn giản hóa quy trình. Sử dụng tế bào nấm men làm vật liệu bao gói các hoạt
chất theo phƣơng pháp vi sinh là một vấn đề hoàn toàn mới.
Do đó, mục tiêu của đề tài nhằm: nghiên cứu xây dựng quy trình bao gói
carotenoid sử dụng tế bào nấm men Y. lipolytica, đồng thời nghiên cứu quá trình thẩm
thấu các hợp chất kị nƣớc qua màng tế bào nấm men, ứng dụng để bổ sung vào thực
phẩm và nuôi trồng thủy sản, sử dụng màng tế bào nấm men bao gói các hợp chất kị
nƣớc.
Các tế bào nấm men Y. lipolytica chủng W29 và chủng 0544 đƣợc nuôi cấy trên
môi trƣờng YPD tại 27°C, tốc độ lắc 150 rpm và cho tiếp xúc với hợp chất kị nƣớc.
Sau đó, thu sinh khối, đem sinh khối nấm men tiếp xúc với dầu carotene theo các điều
kiện khác nhau bao gồm: tỉ lệ nồng độ beta caroten/dầu ăn, thời gian tiếp xúc với nhũ
tƣơng dầu beta caroten, nhiệt độ tiếp xúc. Bên cạnh đó, tỉ lệ sống chết của tế bào trƣớc
và sau khi tiếp xúc đƣợc xác định bằng phƣơng pháp nhuộm xanh methylen. Tính chất
xiii


bề mặt của tế bào đƣợc xác định theo phƣơng pháp test Microbial adhesion to solvents
(Test MATS).
Từ đó, đề tài đã rút ra đƣợc các điều kiện tốt nhất cho quy trình bao gói
carotenoid sử dụng tế bào nấm men Y. lipolytica là: nồng độ BC/dầu ăn sử dụng:
1mg/ml, tiến hành tiếp xúc tế bào nấm men với nhũ tƣơng dầu caroten, nhiệt độ tiếp
xúc 27°C và thời gian tiếp xúc là 16 h.
Kết quả của nghiên cứu này góp phần làm sáng tỏ cơ chế tƣơng tác giữa màng
tế bào nấm men và các hợp chất kỵ nƣớc (hay khả năng thấm của màng tế bào) với yếu
tố ảnh hƣởng nhƣ: tỉ lệ nồng độ caroten/dầu ăn khi sử dụng, thời gian tiếp xúc, nhiệt

độ, quá trình tiếp xúc theo điều kiện khác nhau, tính chất tế mặt tế bào. Từ đó, góp
phần tìm ra đƣợc quy trình bao gói hợp chất carotenoid hiệu quả nhất, nhằm phục vụ
cho các nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất hoặc bao gói các hợp chất kị
nƣớc có hoạt tính sinh học. Đề tài cũng giúp mở ra một hƣớng nghiên cứu mới: ứng
dụng công nghệ vi nang sinh học trong việc bảo vệ hoạt tính sinh học của các hợp chất
thiên nhiên khác, giúp chúng ta chủ động trong quá trình chuyển hóa các hợp chất này
nhằm nâng cao hiệu quả quá trình sản xuất và bao gói sản phẩm.
Từ khóa: Yarrowia lipolytica, beta-caroten, vi nang sinh học, tính thấm qua màng tế
bào nấm men.

xiv


MỞ ĐẦU
Ngày nay, khi chất lƣợng cuộc sống của con ngƣời ngày càng đƣợc nâng cao
hơn, nhiều lĩnh vực sản xuất đòi hỏi phải đổi mới về công nghệ để tạo sản phẩm tốt
hơn. Những yêu cầu đó buộc các nhà khoa học phải không ngừng nghiên cứu, phát
triển các sản phẩm có tính năng vƣợt trội, chất lƣợng tốt. Một trong số những công
nghệ đang phát triển mạnh mẽ và đƣợc ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực thực phẩm,
mỹ phẩm, dƣợc phẩm đó chính là công nghệ vi nang.
Đây là một giải pháp bao gói hữu hiệu giúp chuyển đổi các hợp chất dạng lỏng,
khí sang dạng bột đồng thời bảo vệ hoạt tính của các hợp chất này nhờ có màng bao
bọc bên ngoài, hạn chế tác động của môi trƣờng nhƣ: ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, oxy;
là công cụ giúp bảo vệ các hợp chất có hoạt tính sinh học cao nhƣ enzyme, tế bào
(probiotic), chất thơm, chất màu thực phẩm … đồng thời nâng cao giá trị sử dụng của
các hợp chất này. Phạm vi ứng dụng của công nghệ vi nang trên thế giới hiện nay rất
rộng rãi trong các lĩnh vực: thực phẩm, dƣợc phẩm, công nghiệp tẩy rửa, sản phẩm gia
dụng, công nghiệp sơn, in ấn, công nghệ môi trƣờng … Ở Việt Nam, công nghệ này
chỉ mới ứng dụng trong dƣợc phẩm, mỹ phẩm, nuôi trồng thủy sản… Với sự phát triển
của ngành công nghiệp thực phẩm nói chung và thực phẩm chức năng nói riêng hiện

nay cùng với nguồn thực thẩm phong phú ở Việt Nam, việc phát triển công nghệ vi
nang trong ngành thực phẩm ở nƣớc ta là rất có triển vọng.
Hiện tại, phƣơng pháp sử dụng tế bào nấm men trong công nghệ bao gói vi
nang vẫn còn ít đƣợc công bố trên thế giới và trong nƣớc. Cụ thể, đó là các nghiên cứu
về:
-

Nghiên cứu của TS.Waché, Agrosup Dijon–France về bao gói bằng tế bào nấm

men. Trong đó, nghiên cứu này sử dụng chủng nấm men ƣa béo Y. lipolytica để bao
gói beta-caroten [39].
-

Nghiên cứu của Amaral và cộng sự về tính chất màng tế bào Y. lipolytica và sự

tƣơng tác của nó với perfluorocarbon (PFC) [9].

1


-

Nghiên cứu của Aguedo và cộng sự về tính chất bề mặt của Y. lipolytica và sự

liên quan của nó đến sự hình thành γ-decalactone từ cơ chất methyl ricinoleate [8].
-

Nghiên cứu của Aguedo và cộng sự về quá trình cho và nhận điện tử, ảnh

hƣởng của sự bám dính giữa các giọt dầu với tế bào nấm men Y. lipolytica đƣợc đánh

giá theo phƣơng pháp Cytometric, 2003 [7].
Hầu hết các nghiên cứu trên chỉ dừng lại ở việc đánh giá tính chất bề mặt màng
tế bào nấm men, sự hình thành hợp chất thơm γ-decalactone mà chƣa đề ra một quy
trình bao gói hợp chất kị nƣớc và việc sử dụng tế bào nấm men trong công nghệ bao
gói vi nang theo phƣơng pháp vi sinh.
Ngoài ra, carotenoid là một trong những hợp chất đƣợc ứng dụng rộng rãi trong
thực phẩm, mỹ phẩm, nhƣng có nhƣợc điểm là không tan trong nƣớc, nhạy cảm với
nhiệt độ và cần đƣợc bảo vệ. Những nghiên cứu gần đây về carotenoid nhƣ betacaroten, lycopen, lutein, zeaxanthin, astaxanthin... cho thấy các hợp chất này có khả
năng chống oxy hóa, tăng cƣờng khả năng miễn dịch, giúp ngăn ngừa đáng kể các
bệnh. Do đó, ngày nay, các hợp chất carotenoid rất đƣợc quan tâm nghiên cứu, nhằm
mục đích ứng dụng trong sản xuất thuốc chữa bệnh và thực phẩm chức năng.
B. Ozcelik và cộng sự [34] đã nghiên cứu tạo vi nang bằng các kỹ thuật bao gói
khác nhau nhƣ: sấy phun, đông khô, bẫy alginat để tạo lớp vỏ bao bọc bảo vệ beta
carotene bên trong. Khi tạo vi nang BC bằng kỹ thuật sấy phun sử dụng chất nhũ hóa
là Tween 80 với vật liệu bao gói là maltodextrin đạt hiệu suất bao gói tốt nhất (81%),
sản phẩm vi nang BC tạo thành cũng có khả năng hòa tan trong nƣớc cao nhất đạt
87%. Trong khi đó, Trần Hải Đăng và cộng sự [5] đã nghiên cứu công nghệ vi nang để
bao gói dầu gấc đạt tiêu chuẩn thực phẩm từ các hệ nhũ tƣơng theo các phƣơng pháp
khác nhau: đông tụ và sấy phun. Đối với phƣơng pháp sấy phun, vi nang tạo thành có
màu vàng cam và tồn tại dƣới dạng bột mịn với 86,2% hạt có kích thƣớc < 10 μm, hiệu
suất tạo vi nang cao nhất đạt 70,4%. Đối với phƣơng pháp đông tụ, vi nang tạo thành
có dạng hạt tròn, màu cam đến đỏ. Hiệu suất tạo vi nang đạt tới 96% với kích thƣớc vi
nang < 40 μm…
Nhìn chung, các phƣơng pháp bao gói thông thƣờng này gặp phải một số hạn
chế nhƣ:
2


- Cấu tạo vỏ bao không liên tục. Vỏ có thể bị đứt gãy do quá trình sấy (mất
nƣớc cục bộ) làm cho khả năng bảo vệ của vỏ suy giảm.

- Hạn chế trong việc chọn vật liệu bao gói, tƣơng tác với lõi, tính ổn định….
- Quá trình chế biến phức tạp, đôi khi không đạt chuẩn thực phẩm nhƣ chọn hệ
dung môi để rửa…
Do đó, dựa trên sự tƣơng đồng giữa cấu trúc của tế bào nấm men và vi nang
cùng với những đặc tính ƣu việt của nó, màng tế bào nấm men đƣợc xem là một màng
bao bảo vệ rất tốt cho các chất chứa bên trong nó. Trong đó, một số chủng nấm men ƣa
béo nhƣ Y. lipolytica đang đƣợc các nhà nghiên cứu quan tâm trong nghiên cứu ứng
dụng các hợp chất kị nƣớc nhằm sản xuất và bao gói các hợp chất thiên nhiên có giá trị
cao nhƣ tinh dầu gừng, polyphenol, curcumin, beta-caroten... Sử dụng màng tế bào
nấm men sẽ là bƣớc quan trọng giúp loại bỏ việc sử dụng hóa chất độc hại trong quy
trình, đồng thời cũng làm đơn giản hóa quy trình tạo vi nang.
Xuất phát từ thực trạng trên tôi đã chọn hƣớng đề tài: “Nghiên cứu xây dựng
quy trình bao gói carotenoid sử dụng tế bào nấm men Yarrowia Lipolytica”
Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu xây dựng quy trình bao gói carotenoid sử dụng tế bào nấm men Y.
lipolytica nhằm ứng dụng để bổ sung vào thực phẩm và nuôi trồng thủy sản.
Tính mới của đề tài
Công nghệ bao gói vi nang dùng trong ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt
là bao gói BC hiện nay đều dựa trên tính chất vật lý, hóa lý, hóa học giữa vật liệu vỏ
và hoạt chất lõi.Việc sử dụng tế bào nấm men làm vật liệu bao gói các hoạt chất
theophƣơng pháp vi sinh là vấn đề hoàn toàn mới, giúp loại bỏ việc sử dụng hóa chất
độc hại trong quy trình, đồng thời cũng làm đơn giản hóa quy trình tạo vi nang.
Nội dung nghiên cứu
 Xây dựng quy trình bao gói carotenoid sử dụng tế bào nấm men qua các thông
số sau:
 Nồng độ beta carotene/dầu ăn khi sử dụng
 Nhiệt độ tiếp xúc
3

 Điều kiện tiếp xúc giữa BC với tế bào nấm men
 Thời gian tiếp xúc
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Kết quả của đề tài này có thể góp phần tìm ra đƣợc quy trình bao gói hợp chất
carotenoid hiệu quả nhất, nhằm phục vụ cho các nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất
và bao gói một số hợp chất kị nƣớc có giá trị.

4


Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về nấm men ƣa béo Yarrowia lipolytica
1.1.1. Nguồn gốc
Yarrowia lipolytica thuộc họ Saccharomycetaceae, và thuộc giới nấm
Ascomyces (dƣới họ Sacchromycetoideae) [31]. Nó thƣờng đƣợc tìm thấy trên các cơ
chất có nguồn gốc động vật hoặc thực vật mà các nguồn cacbon chính dƣới dạng các
ankan; lipid hoặc protein. Mặt khác nó đƣợc phân lập đầu tiên trên magarine. Nấm
men này có thể phân lập từ các thực phẩm giàu lipid và protein [36] nhƣ pho mai [37]
hoặc xúc xích [24]. Yarrowia lipolytica là một loài chiếm ƣu thế trong pho mát
camembe và các pho mát xanh với nồng độ cực cao 106-107 UFC [19].

Hình 1.1. Tế bào nấm men Y. lipolytica [1]
1.1.2. Đặc tính sinh lý
Ngƣợc với Candida albicans và Candida tropicalis, Y. lipolytica không gây
bệnh [33]. Nó rất nhạy cảm với nhiệt độ cao từ 32-34°C [24]. Nhiều nguồn Y.
lipolytica không có khả năng phát triển ở nhiệt độ 32°C và là vi sinh vật hiếu khí bắt
buộc. Y. lipolytica đã đƣợc Cơ quan quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ FDA
(American food and drug administration) cấp chứng nhận GRAS (Generally
Recognized As Safe) là sản phẩm tuyệt đối an toàn. Điều này cho phép chúng đƣợc sử
dụng trong công nghiệp thực phẩm hoặc dƣợc phẩm.

Đây là một nấm men lƣỡng hình hình thành các tế bào chồi, các sợi nấm hoặc
giả sợi nấm tùy theo điều kiện nuôi cấy nhƣ thông gió, nguồn carbon hoặc nguồn nitơ,
pH… [30]. Khuẩn lạc của Y. lipolytica có nhiều hình dạng khác nhau nhƣ nhẵn và lấp
lánh, cuộn xoắn, sần sùi và màu trắng đục.
5


a 1a
a2

Figure 1
Figure 2
Figure 3
Figure 4
Figure 5
Figure 6
Hình 1.2 1
Hình 1.2 2

Hình 1.2. Hình thái khuẩn lạc của Y.

Hình 1.3. Hình thái tế bào Y. lipolytica

lipolytica W29 trên môi trƣờng YPDA ở

W29 trên YPDA ở 27 °C

27°C

Hình 1.4. Hình thái khuẩn lạc Y.

Hình 1.5. Hình thái tế bào Y. lipolytica

lipolytica 0544 trên môi trƣờng YPDA

0544 trên môi trƣờng YPDA ở 27 °C

ở 27 °C
a3
a 4re

7
6


Y. lipolytica có khả năng đồng hóa nhiều loại đƣờng nhƣ glucose, galactose
hoặc manitol nhƣng nó không có khả năng đồng hóa saccharose do thiếu hoạt động
của enzyme invertase [9]. Ngƣợc lại, nấm men này có khả năng sử dụng các chất kỵ
nƣớc nhƣ alcan (hexadecan, decan), các acid béo (nhƣ acid palmitic, acid rininoleic,
acid lauric), và các triglycerid (trioleine, tripalmitine). Y. lipolytica cũng có thể sử
dụng acetate nhƣ một nguồn cacbon duy nhất [9]. Y.lipolytica cũng có thể tăng trƣởng
trong môi trƣờng có bổ sung lipid nhƣ ricinoleic (dầu thầu dầu), sử dụng lipid để tổng
hợp thành lactone do hoạt động của enzyme lipase và esterase [8].
1.1.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của Y. lipolytica
 Nguồn cacbon
Y . lipolytica là nấm men hiếu khí bắt buộc có khả năng phân hủy một cách hiệu
quả các chất kỵ nƣớc nhƣ n-ankan, acid béo, chất béo và các loại dầu theo các con
đƣờng chuyển hóa đặc biệt [28]. Nguồn dinh dƣỡng cacbon của nấm men chính là các
loại đƣờng và dẫn xuất, các rƣợu, acid hữu cơ, acid amin… [22].
Hầu hết các loài nấm men không có enzyme polyhydrolase, amylase và

cellulase cho nên không sử dụng trực tiếp đƣợc tinh bột, cellulose, hemicellulose mà
sử dụng đƣờng hexose. Y. lipolytica có khả năng phân hủy nhiều loại đƣờng hexose
nhƣ glucose, fructose và mannose. Đối với Y. lipolytica hệ thống vận chuyển glucose
hoạt động không phụ thuộc vào nồng độ glucose trong môi trƣờng [27, 32].
Các hexose nội bào đi vào chu trình đƣờng phân sau giai đoạn photpho hóa.
Glucose, fructose và mannose đƣợc phosphoryl hóa bằng hexokinases. Hầu hết các
hexokinases bị ức chế bởi threalose -6P, một thành phần quan trọng trong thủy phân
glucose ở S. cerevisiae. Hexokinases ở Y. lipolytica chƣa đƣợc bị ức chế bởi trehalose
[30].
Nồng độ glucose cao không ảnh hƣởng đến tốc độ hô hấp, hàm lƣợng và tỉ lệ
phân tử của cytochrome hoặc tính chất của ti lạp thể trong Y. lipolytica. Tuy nhiên, sản
xuất Y. lipolytica IMUFRJ 50682 dƣới sự kiềm chế hay không kiềm chế glucose thì
không phụ thuộc vào chất cảm ứng. Saccharose không thể đƣợc sử dụng bởi chủng Y.
lipolytica hoang dã vì thiếu enzyme chuyển hóa saccharose.
7


Bên cạnh đó, Y. lipolytica cũng có thể sử dụng ethanol làm nguồn C ở nồng độ
lên đến 3%. Nồng độ ethanol cao hơn sẽ là chất độc. Một số enzyme NAD+ và NADP+
dehydrogenases đã đƣợc nghiên cứu có trong nấm men Y. lipolytica. Sự tổng hợp của
hai enzyme dƣờng nhƣ không bị kiềm chế bởi glucose hoặc cảm ứng bởi ethanol.
Glycerol cũng đƣợc sử dụng nhƣ một nguồn C trong điều kiện hiếu khí ở nhiều
loài nấm men [5], đƣợc đồng hóa thông qua con đƣờng glycerol-3-phosphate hoặc
dihydroxyacetone. Một số nấm men đƣợc cho là đồng hóa glycerol qua
dihydroxyacetone. Ban đầu glycerol đƣợc oxy hóa thành dihydroxyacetone bởi
glycerol dehydrogenase và sau đó đƣợc phosphoryl hóa thành phosphate
dihydroxyacetone bởi dihydroxyacetone kinase. Papanikolaou và cộng sự đã sử dụng
thành công glycerol thô trong việc nuôi Y. lipolytica và sản xuất acid citric. Môi
trƣờng glycerol ban đầu cao (40 g/l) với N hạn chế dẫn đến việc tiết ra acid citric lên
đến 35 g/l (sản lƣợng 0,42 – 0,44 g acid/g glycerol tiêu thụ).

Y. lipolytica có khả năng sử dụng các acid hữu cơ nhƣ: axetic, lactic, propionic,
malic, succinic, citric và acid oleic nhƣ nguồn carbon và năng lƣợng duy nhất, trong nhiều
trƣờng hợp, khả năng này không phụ thuộc vào độ pH của môi trƣờng. Khi nấm men phát
triển trong môi trƣờng chứa đƣờng và acid citric hoặc acid lactic thì có sự tăng trƣởng
diauxic và việc sử dụng hai loại acid này phải chịu sự kiềm chế bởi glucose.
Hầu hết các chủng Y. lipolytica phát triển rất hiệu quả trên acetat nhƣ nguồn
carbon duy nhất. Nồng độ natri axetat lên đến 0,4% đƣợc dung nạp tốt, nồng độ cao hơn
làm giảm tốc độ tăng trƣởng và nồng độ cao hơn 1,0% thì ức chế sự phát triển [16].
Nấm men Y. lipolytica thƣờng đƣợc phân lập từ môi trƣờng có chứa chất béo,
trong các sản phẩm sữa, môi trƣờng ô nhiễm và gia cầm sống đặc biệt phù hợp với
chất kị nƣớc.
Theo Aguedo và cộng sự [7, 8] đã nghiên cứu các tính chất bề mặt của Y.
lipolytica W29 bằng các thử nghiệm Microbial adhesion to solvents và quan sát thấy
đặc tính ƣa nƣớc của bề mặt các tế bào phát triển trong đƣờng hoặc dầu, với tính
cho/nhận điện tử trong sự có mặt của methyl ricinoleate. Ngƣợc lại, chủng Y. lipolytica
khác (Y. lipolytica IMUFRJ 50.682), đƣợc phân lập từ Vịnh Guanabara ở Rio de
Janeiro, Brazil, cho thấy sự bám dính của tế bào rất cao đối với các dung môi không
8


phân cực, một dấu hiệu của tính kị nƣớc cao [10], cho thấy cơ chế của chất kị nƣớc
thay đổi từ chủng này đến chủng khác.
Trong quá trình lên men hydrocarbon, pha dầu đƣợc phân tán dƣới dạng giọt trong
pha nƣớc và sự tƣơng tác bề mặt là xu hƣớng để tạo thành các giọt dầu. Những giọt nhỏ
kết hợp liên tục và phân phối kích thƣớc của nó phụ thuộc vào tƣơng tác bề mặt, thể tích
phần hydrocarbon và cƣờng độ khuấy. Gutierrez và Erickson quan sát thấy sự giảm
đƣờng kính trung bình của các giọt dầu đồng thời với sự giảm tƣơng tác bề mặt trong môi
trƣờng ở quá trình tăng trƣởng của Y. lipolytica trong hexadecan do hiện tƣợng sản xuất
tác nhân hoạt động bề mặt bởi nấm men. Trong thực tế, Cirigliano và Carman đã phát
hiện và cô lập một chất nhũ hóa có khả năng ổn định hệ nhũ tƣơng nƣớc/dầu, trong môi

trƣờng phát triển ankan của Y. lipolytica. Chất nhũ hóa sinh học này đƣợc gọi là Liposan
bao gồm 83% carbohydrate và 17% protein. Một chủng Y. lipolytica khác cũng có khả
năng sản xuất chất nhũ hóa sinh học, với thành phần tƣơng tự, chỉ có mặt của glucose nhƣ
nguồn cacbon, cho thấy việc sản xuất các tác nhân hoạt động bề mặt là một đặc tính cấu
thành của nấm men này [29].
Bảng 1.1. Nguồn C đƣợc vi sinh vật sử dụng [2]
Nguồn C

Các dạng hợp chất

Đƣờng

Glucose, fructose, maltose, saccharose, tinh bột,
galactose, lactose, mannite, cellobiose, cellulose,
hemicellulose, chitin...

Acid hữu cơ

Acid lactic, acid citric, acid fumaric, acid béo bậc cao,
acid béo bậc thấp, aminoacid...

Rƣợu

Ethanol

Lipid

Lipid, phospholipid

Hydrocarbon

Khí thiên nhiên, dầu thô, dầu paraffin

Carbonate

NaHCO3, CaCO3, đá phấn

Các nguồn C khác

Hợp chất nhóm thơm, cyanide, protein, pepton, acid
nucleic...

 Nguồn nitơ
Nguồn Nitơ cần thiết cho tổng hợp chính là các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ có
sẵn trong môi trƣờng, có tác dụng cung cấp cho tế bào nguyên liệu để hình thành các
9


nhóm amin (-NH2) và imin (-NH-) nhằm tổng hợp protein và các hợp chất khác trong
nguyên sinh chất.
Các hợp chất hữu cơ chứa nitơ của tế bào là các acid amin, các nucleotide
purin, protein, pirimidin và một số vitamin.
Nguồn nitơ vô cơ nhƣ: các muối amoni của acid vô cơ cũng nhƣ hữu cơ: amoni
phosphate, muối acetat, lactat, malat… dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân.
Nấm men có thể tự tổng hợp các acid amin. Tuy nhiên nếu cho các acid amin
vào môi trƣờng thì quá trình sinh sản và phát triển của tế bào sẽ nhanh hơn. Nấm men
đồng hóa các acid amin bằng cách amin hóa (tách NH3 ra khỏi các chất), do đó các
nguồn nitơ khác nhau sẽ có ảnh hƣởng rất lớn tới hàm lƣợng acid amin trong tế bào
nấm men.
Ngoài ra, nguồn nitơ thƣờng đƣợc vi sinh vật sử dụng là protein và các sản

phẩm phân hủy của protein (peptone, peptide, aminoacid…), muối amon, nitrat, N
phân tử, purine, pyrimidin, ure, amin, amid, cyanid [3].
Bảng 1.2. Nguồn N đƣợc vi sinh vật sử dụng [2]
Nguồn N

Các dạng hợp chất

Protein và các sản

Peptone, peptide, aminoacid... (một số vi sinh vật tiết

phẩm phân giải của

men proteinase phân giải protein thành các hợp chất phân tử

protein

nhỏ hơn rồi mới hấp thu đƣợc vào tế bào)

Ammone và muối

NH3, (NH4)2SO4, ... (dễ đƣợc hấp thu)

ammone
Nitrate

KNO3 (dễ đƣợc hấp thu)

N phân tử

N2 (với vi sinh vật cố định N)

Các nguồn N khác

Purine, pyrimidin, urea, amin, amid, cyanid (chỉ một số
nhóm vi sinh vật mới có thể đồng hoá đƣợc)

 Oxy
Trong quá trình sinh trƣởng và chuyển hóa của nấm men Y. lipolytica thì oxy là
một trong những yếu tố quan trọng. Suốt quá trình nuôi cấy liên tục Y. lipolytica N1,
10


nhu cầu oxy cho sự tăng trƣởng và tổng hợp axit citric đƣợc tìm thấy phụ thuộc vào
nồng độ sắt trong môi trƣờng [9]. Việc bổ sung các perfluorocarbon (PFC) vào môi
trƣờng nuôi cấy Y. lipolytica là phƣơng pháp mới để tăng cƣờng sự hấp thu oxy [11].
Tính thấm oxy trên PFC cao hơn nhiều so với trong nƣớc với khả năng hòa tan cao
hơn 10-20 lần. Khi tăng nồng độ PFC và tốc độ lắc thì Y. lipolytica có tốc độ tăng
trƣởng cao hơn. Amaral và cộng sự [9] cũng quan sát thấy một phân vùng lạ của tế bào
giữa các pha dung dịch và pha PFC hữu cơ, với sự ƣa thích bất ngờ của các tế bào với
các dung môi hữu cơ.
Các phản ứng thích nghi của Y. lipolytica gây ra bởi các chất oxy hóa hydrogen
peroxid, menadion, và juglone đã đƣợc nghiên cứu bởi Biryukova và cộng sự [19]. Sự
thích ứng của các tế bào nấm men đối với các tác nhân oxy hóa có liên quan với sự gia
tăng hoạt động của enzyme catalase tế bào, superoxide dismutase, glucose-6-phosphat
dehydrogenase và glutathione reductase, các enzyme chính liên quan đến bảo vệ tế bào
để chống lại quá trình stress oxy hóa. Lopes và cộng sự đã sử dụng lò phản ứng sinh
học áp lực để tăng khả năng hòa tan oxy trong môi trƣờng nuôi cấy Y. lipolytica. Tăng
oxy có khả năng gây ra sự cảm ứng của các enzyme chất chống oxy hóa nhƣ
superoxide dismutase, liên quan đến các cơ chế phòng thủ của tế bào chống lại sự oxy

hóa một cách hiệu quả và các tế bào có thể đối phó với tăng áp suất. Khi áp suất dƣới 6
bar thì khối lƣợng sinh khối và tốc độ phát triển tăng tƣơng ứng 5 và 3,4 lần.
 Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hƣởng không những đối với sự sinh trƣởng, phát triển của vi
sinh vật mà còn đối với sự trao đổi chất của chúng (ảnh hƣởng đến tốc độ của các phản
ứng hóa học và sinh hóa học).
Nấm men là những vi sinh vật ƣa mát (chúng có nhiệt độ tối ƣu ở khoảng 25°C,
nhƣng cũng có thể thích nghi ở 0°C), nhƣng cũng có một số nấm men có thể phát triển
đƣợc ở 45°C.
Nhiệt độ thấp thƣờng không làm chết vi sinh vật ngay mà nó tác động lên khả
năng chuyển hóa các hợp chất, làm giảm hoạt động của các hệ enzyme, làm chậm quá
trình trao đổi chất của vi sinh vật. Vì vậy nhiệt độ càng thấp sẽ làm cho vi sinh vật mất
khả năng phát triển và sinh sản. Nhiều trƣờng hợp vi sinh vật sẽ bị chết nhƣng khả
năng gây chết hết sức từ từ không giống nhƣ đối với nhiệt độ cao. Nhiệt độ cao thƣờng
11