LV thiết kế vector cây dừa cạn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
–––––––––––––––––––

ĐÀO THỊ NHÂM

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN
MANG CẤU TRÚC GEN CrPrx PHÂN LẬP
TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G. Don)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN – 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
–––––––––––––––––––

ĐÀO THỊ NHÂM

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN
MANG CẤU TRÚC GEN CrPrx PHÂN LẬP
TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G. Don)
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm

THÁI NGUYÊN – 2016


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi
rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và
chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác.
Thái Nguyên, tháng 4 năm 2016
Tác giả

Đào Thị Nhâm

i


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm đã tận
tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình
nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc Bộ môn Di truyền &
Sinh học hiện đại, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi
trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Sơn, Ths. Hồ Mạnh Tường và các cán
bộ Phòng DNA ứng dụng, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen, Viện
Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo
điều kiện và giúp đỡ tôi tiến hành các thí nghiệm của đề tài luận văn.
Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình và bạn bè trong suốt
thời gian học tập và thực hiện đề tài luận văn.
Đề tài luận văn thuộc chương trình đào tạo nghiên cứu sinh và cao học

của Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư
phạm - Đại học Thái Nguyên.

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2016
Tác giả

Đào Thị Nhâm

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan........................................................................................................i
Lời cảm ơn...........................................................................................................ii
Mục lục..............................................................................................................iii
Danh mục chữ viết tắt......................................................................................iv
Danh mục bảng..................................................................................................v
Danh mục hình..................................................................................................vi

iii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
ABA
A.tumefacien
s
Bp
CaMV 35S
Cs

CrPrx
C. roseus
DAT
DNA
E. coli
EDTA
ELISA

IPTG
LB
MCS
NptII
PCR
Kb
SDS
RT-PCR
X-gal

Tiếng Anh
Abscisic acid
Agrobacterium tumefaciens

Tiếng Việt
Axit Absisic

base pairs
Cauliflower
promoter

Cặp bazơ nitơ

Mosaic

Virus

35S

Cộng sự
Gen mã hóa peroidase ở
cây dừa cạn
Catharanthus roseus (L.) G. Don.
Cây dừa cạn
Deacetylvindoline
4-O-acetyl Gen DAT
tranferase
Deoxyribonucleic acid
Axit Deoxyribonucleic
Escherichia coli
Ethylene diamine tetraacetic acid
Enzyme-Linked Immuno Sorbent
Xét nghiệm ELISA
Assa
Catharanthus roseus peroxidase

Isopropyl β-D-1Thiogalactopyranoside
Luria Bertami
Multi Cloning Site
Neomycin phosphotransferase gene
Polymerase chain reaction
Kilo base
Sodium dodecyl sulphate

Reverse transcription - Polymerase
Chain Reaction
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-betaDgalacto-pyranoside

V/p

Môi trường dinh dưỡng cơ
bản nuôi cấy vi khuẩn
Vùng cắt gắn đa vị
Phản ứng chuỗi polymerase
Phản ứng chuỗi polymerase
-phiên mã ngược

Vòng/ phút

iv


DANH MỤC BẢNG

v


DANH MỤC HÌNH
Ethylene diamine tetraacetic acid...............................................................................iv
24
24
25
25
25

26
26
26

vi


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Nước ta là một nước nhiệt đới với những điều kiện khí hậu thuận lợi, vì
vậy nguồn tài nguyên thiên nhiên rất phong phú và đa dạng. Cùng với nền y
học cổ truyền dân tộc có truyền thống lâu đời, nhân dân ta đã biết sử dụng các
loài cây cỏ xung quanh làm nguồn dược liệu để chữa bệnh rất có hiệu quả.
Ngày nay, bên cạnh thuốc tân dược thì các loại dược liệu có nguồn gốc từ
thiên nhiên ngày càng được ưa chuộng.
Sự thay đổi khí hậu toàn cầu dẫn tới sự khắc nghiệt của thời tiết, môi
trường sống bị ô nhiễm, thói quen sinh hoạt của con người thay đổi, thực phẩm
không an toàn… Những yếu tố này tác động đến sức khỏe của con người, làm
gia tăng nguy cơ mắc bệnh, trong đó có nguy cơ các tế bào bị biến đổi. Đây là
một trong các nguyên nhân làm cho số ca mắc bệnh ung thư ngày càng tăng. Vì
thế, một trong những nhiệm vụ hàng đầu của các nhà khoa học là nghiên cứu,
cải tiến các biện pháp chữa trị ung thư để nâng cao chất lượng đời sống cho
người bệnh.
Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) là một trong những cây
có khả năng sản xuất các indol alkaloid có dược tính quan trọng trong chế tạo
các loại thuốc chống ung thư, đặc biệt là ung thư máu. Trong các indol alkaloid
có mặt trong cây dừa cạn, hai loại alkaloid là vinblastine, vincristine được sử
dụng nhiều nhất. Nhưng các chất này lại có hàm lượng rất nhỏ trong cây dừa
cạn, khoảng nửa tấn lá khô mới chiết được 1g vinblastine cho sản xuất dược
phẩm (Noble, 1990) [21]. Các chất này không thể tổng hợp bằng con đường

hóa học do có cấu trúc rất phức tạp. Do vậy, nâng cao hàm lượng vinblastine và
vincristine trong cây dừa cạn theo hướng công nghệ gen là một hướng nghiên
cứu được quan tâm bởi nhiều nhà khoa học trên thế giới.

1


Trong cây dừa cạn, vinblastine và vincristine được tạo ra từ sự kết hợp
của catharanthine và vindoline. Gen CrPrx mã hoá peroxidase có chức năng
xúc tác cho phản ứng tạo tiền chất cho sự tổng hợp vinblastine và vincristine.
Các nghiên cứu cho thấy, trong các giống dừa cạn hiện có thì giống dừa cạn
hoa hồng nhụy tím có hàm lượng alkaloid toàn phần và các chất là vinblastine
và vincristine cao nhất.
Nâng cao năng suất tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn
phục vụ cho việc tạo thuốc chữa bệnh ung thư là rất cần thiết. Để tăng năng
suất tổng hợp hai loại alkaloid trên, việc nghiên cứu đặc điểm gen tham gia vào
các con đường tổng hợp alkaloid và thiết kế vector phục vụ chuyển gen là rất
quan trọng.
Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế
vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân lập từ cây dừa cạn
(Catharanthus roseus (L.) G. Don)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập được đoạn mã hóa cDNA của gen CrPrx từ cây dừa cạn hoa
hồng tím.
Thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân lập từ
cây dừa cạn hoa hồng tím, phục vụ chuyển gen nâng cao hàm lượng alkaloid ở
cây dừa cạn.
3. Nội dung nghiên cứu
Phân lập, tách dòng gen CrPrx.
Xác định trình tự gen CrPrx được nhân lên từ cặp mồi chứa điểm cắt của

enzyme giới hạn NotI/NcoI.
Thiết kế vector chuyển gen mang gen CrPrx từ cây dừa cạn hoa hồng tím.
Tạo dòng vi khuẩn A.tumefaciens mang vector chuyển gen gắn CrPrx.

2


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây dừa cạn
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Cây dừa cạn hay còn gọi là hải đằng, dương giác, bông dừa, trường
xuân, hoa thuộc họ Apocynaceae, chi Catharanthus, loài Catharanthus
roseus. [4], [37].
Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) có nguồn gốc ở
Madagasca (châu Phi), mọc hoang và được trồng ở nhiều nước nhiệt đới và ôn
đới như Việt Nam, Ấn Độ, Indonesia…. Cây dừa cạn được người Pháp đưa vào
trồng ở Việt Nam để làm cây cảnh. Tại châu Âu và châu Mỹ ở những vùng
nóng cây dừa cạn được trồng quanh năm, nhưng ở những vùng lạnh cây được
trồng theo mùa vì không chịu được lạnh. Cây dừa cạn dễ trồng, phát triển
nhanh chịu nắng, hạn tốt, không kén đất và ít phải chăm sóc, cách chăm sóc
không quá đặc biệt nên ít lâu sau nó đã lan ra ở nhiều địa phương, nhất là ở các
tỉnh đồng bằng và ven biển nước ta. Cây dừa cạn ra hoa quanh năm, chủ yếu là
từ tháng 5 - 9 [5].
Ở Việt Nam, dừa cạn có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh
Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tương đối tập trung ở các
tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Ðà
Nẵng, Bình Ðịnh và Phú Yên. Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển, dừa
cạn có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ,
cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven

biển. Trước đây cây dừa cạn còn chỉ được trồng để làm cảnh, nhưng gần đây
cây đã được trồng để thu hoạch lấy cây, lá, rễ dùng làm thuốc [5].
Cây dừa cạn là nguồn giàu alkaloid thuộc alkaloid terpenoid indole được
phân lập từ 3 giống cây khác nhau: (1) Catharanthus roseus “Roseus” có hoa

3


màu hồng tím; (2) Catharanthus roseus “Ocellatus” có hoa màu trắng nhụy đỏ;
(3) Catharanthus roseus “Albus” có hoa màu trắng. Trong đó, hoa màu hồng
tím có hàm lượng vincristine và vinblastine cao nhất [37].

Hình 1.1: Hoa của ba giống Catharanthus roseus (L.) G. Don [37].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây dừa cạn
Cây dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40cm – 60cm, phân
nhiều cành, cây có bộ rễ phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên. Thân
hình trụ có 4 khía dọc, lông ngắn, thân non màu xanh lục nhạt sau chuyển sang
màu hồng tím có bộ rễ rất phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên. Cây
dừa cạn mọc thành bụi dày có cành đứng. Lá mọc đối, thuôn dài, đầu lá hơi
nhọn, phía cuống hẹp nhọn, kích thước của lá thường biến động tùy từng vùng
phân bố dài 3cm - 6cm, rộng 2cm - 3cm. Cuống lá ngắn 3 - 5mm. Gân lá hình
lông chim lồi mặt dưới, gồm 12 - 14 cặp gân phụ hơi lồi mặt dưới. Mỗi cành
thường có 8 - 15 cặp lá, lá có phiến bầu dục màu xanh thẫm, mặt trên nhẵn mặt
dưới có nhiều lông. Mùa hoa và quả vào tháng 4 - 5 và tháng 9 - 10 hàng năm [5].
Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5; cuống hoa dài 4 - 5mm. Lá đài 5, hơi dính
nhau ở dưới, trên chia thành 5 thùy hình tam giác hẹp, có lông ở mặt ngoài, dài
3 - 4mm. Cánh hoa 5, dính. Ống tràng màu xanh, cao 2 - 4cm, hơi phình ở gần
họng, mặt ngoài có 5 chấm lồi; 5 thùy có màu đỏ hay hồng tím, trắng, …. Mặt
trên và mặt dưới của hoa màu trắng, dài 1,5 - 1,7cm, miệng ống tràng có nhiều
lông và có màu khác phiến (màu vàng hay đỏ nếu hoa trắng, màu đỏ sẫm hay

vàng nếu hoa màu hồng tím). Nhị 5, rời, đính ở phần phình của ống tràng, xen

4


kẽ cánh hoa, chỉ nhị ngắn. Hoa có mùi thơm, mọc riêng lẻ ở các kẽ lá phía trên.
Quả gồm hai đại dài 2cm - 4cm, rộng 2mm – 3mm, mọc thẳng đứng hơi ngả hai
bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả hơi tù. Trong quả chứa 12 - 20 hạt nhỏ màu nâu
nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có các hột nổi thành đường chạy dọc [4], [2].
Rễ thường chỉ có một rễ cái và chùm rễ phụ. Rễ cái đâm thẳng xuống đất
có thể đạt chiều dài 30cm – 40cm, rễ phụ mọc thành chùm thưa ngắn, phát triển
theo chiều ngang [4], [5].
1.1.3. Tác dụng của cây dừa cạn
Trong tất cả các bộ phận của cây dừa cạn đều chứa alkaloid. Người ta đã
chiết, phân lập ra trên 150 alkaloid khác nhau, chủ yếu là vinblastine,
vincristine, tetrahydroalstonine, pirinine, vindoline, catharanthine, vindolinine,
ajmalicine… chúng được sử dụng làm nguyên liệu điều trị bệnh ung thư [5].
Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, có nơi dùng
thân và lá phơi khô sắc uống để thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít, làm
thuốc điều kinh, tẩy giun, chữa sốt, săn da, chữa bệnh ngoài da.
Một số bài thuốc dân gian chữa bệnh ung thư của cây dừa cạn [4]:
Tăng huyết áp: Lấy 20g thân lá dừa cạn khô sao vàng và 20g lá dâu, sắc
lấy nước, chia uống từ 2 – 3 lần mỗi ngày. Cách khác, lấy 6g hoa dừa cạn, 10g
nụ hoa hoè (hoặc 10g cúc hoa), hãm với nước sôi trong bình kín khoảng 20
phút. Uống thay nước trà mỗi ngày.
Ung thư máu, viêm đại tràng: Lấy từ 15 – 20g thân lá dừa cạn khô sao
vàng và sắc uống từ 2 – 3 lần trong ngày.
Mất ngủ: Lấy 20g thân lá dừa cạn khô sao vàng, 12g lá vông nem, 12g
hạt muồng sao đen, sắc uống trước khi đi ngủ.
Rong kinh: Lấy từ 20 – 30g dừa cạn sao vàng (toàn cây có cả hoa và rễ),

sắc lấy nước, uống liên tục từ 3 – 5 ngày.
Chữa bỏng nước sôi: Lá dừa cạn tươi lượng vừa đủ, giã nát, nhuyễn với
chút gạo, đắp lên vết thương bỏng.

5


Trị bệnh bạch cầu lympho cấp: Dùng 15g dừa cạn sắc nước uống. Y học
đã chiết được vinblastine từ lá dừa cạn và dưới dạng thuốc tiêm vinblastine
sulfate để chữa bệnh này.
Cây dừa cạn chữa bạch cầu cấp (bệnh máu trắng) bằng cách sắc dùng
thân và lá cây dừa cạn (khoảng 15 gam thân, lá khô/ngày) sắc uống.
Điều trị zona: Dừa cạn (sao vàng hạ thổ) 16g, thổ linh 16g, bạch linh
10g, kinh giới 12g, chi tử 10g, nam tục đoạn 16g, cam thảo đất 16g, hạ khô
thảo 16g. Sắc uống ngày 1 thang, sắc 3 lần, uống 3 lần. Thuốc đắp: lá dừa cạn
kết hợp với lá cây hòe. Hai thứ lượng bằng nhau, giã nhỏ đắp lên các tổn
thương, băng lại. Tác dụng làm giảm đau nhức.
Điều trị lị trực trùng: Đi ngoài nhiều lần, bụng đau từng cơn, phân có chất
nhầy, có máu mũi, sút cân nhanh. Bài thuốc: dừa cạn (sao vàng hạ thổ) 20g, cỏ
sữa 20g, cỏ mực 20g, chi tử 10g, lá khổ sâm 20g, hoàng liên 10g, rau má 20g,
đinh lăng 20g. Đổ 3 bát nước sắc lấy 1,5 bát, chia 3 lần uống trong ngày.
Cây dừa cạn điều trị u xơ tuyến tiền liệt: Dừa cạn 12g, huyền sâm 12g,
xuyên sơn 10g, chè khô 12g, hoàng cung trinh nữ 5g, cát căn 16g, bối mẫu 10g,
đinh lăng 16g. Sắc uống ngày 1 tháng, chia ba lần.
1.2. Hợp chất alkaloid và tác dụng
1.2.1. Alkaloid
Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ
gia thực phẩm có giá trị. Những sản phẩm này được biết như là các chất trao
đổi thứ cấp, thường được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức
năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ. Chúng là sản phẩm các phản ứng hóa

học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ chống lại vi sinh vật và động
vật. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát
triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ XX. Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp
trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside [2], [27].

6


Alkaloid có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh
lý trên tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid
bao gồm codein, nicotine, caffeine và morphine [2], [27].
Một số loại thực vật chứa nhiều alkaloid như là cây thuốc phiện, cây cà
độc dược, cây thuốc lá và khoai tây. Đôi khi toàn cây chứa alkaloid, cũng có
khi chỉ tập trung trong lá. Trong cùng một cây có thể tùy theo bộ phận của cây
mà tạo ra các alkaloid khác nhau. Tùy theo từng loại alkaloid mà tác dụng lên
các bộ phận khác nhau như lên hệ thần kinh, hệ cơ, mạch máu và hệ hô hấp [2].
Hàm lượng alkaloid trong cây phụ thuộc vào nhiều yếu tố như khí hậu,
ánh sáng, chất đất, phân bón, giống cây, bộ phận thu hái và thời kỳ thu hái. Vì
vậy, đối với mỗi loại dược liệu cần nghiên cứu cách trồng trọt, thu hái và bảo
quản để có hàm lượng hoạt chất cao [2].
1.2.1.1. Đặc điểm chung của alkaloid
Alkaloid là những chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ và có tính base,
thường gặp trong nhiều loại thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài
động vật. Ngoài ra, alkaloid còn được sử dụng rộng rãi để bào chế thuốc
(cafeine, cocaine, ephedrin...) [11].
Đặc biệt, alkaloid có hoạt tính sinh lý rất cao đối với cơ thể con người và
động vật nhất là đối với hệ thần kinh. Tùy vào hàm lượng alkaloid nó có thể là
chất độc gây chết người nhưng có khi nó là thần dược trị bệnh đặc hiệu [12].
Alkaloid có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối này dễ kết
tinh. Hàm lượng alkaloid có thể đạt tới 10% trong các loại rau quả thông dụng

như khoai tây, chè, cà phê. Alkaloid là hợp chất thiên nhiên rất quan trọng về
nhiều mặt. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có
giá trị chữa bệnh cao [12].
1.2.1.2. Phân loại alkaloid
Các alkaloid thông thường được phân loại theo đặc trưng phân tử chung
của chúng, dựa theo kiểu trao đổi chất được sử dụng để tạo ra phân tử.

7


Khi người ta chưa biết nhiều về tổng hợp sinh học của alkaloid, thì
chúng được gộp nhóm theo tên gọi của các hợp chất đã biết. Ví dụ: do các cấu
trúc phân tử xuất hiện trong sản phẩm cuối cùng nên các alkaloid thuốc phiện
đôi khi còn được gọi là các “phenanthrene”. Hay gọi tên dựa theo nhóm
động/thực vật từ đó chiết xuất ra các alkaloid, ví dụ như các alkaloid chiết từ
cây dừa cạn vinca thì được gọi chung là các vinca alkaloid [12].
Các nhóm alkaloid hiện nay, gồm có nhóm pyridine (piperine, coniine,
trigonelline, arecaidine, guvacine, pilocarpine, cytisine, nicotine, spartein,
pelletierine); nhóm pyrrolidine (hygrine, cuscohygrine, nicotine) nhóm tropan
(atropine, cocaine, ecgonine, scopolamine); nhóm quinoline (quinine,
quinidine, dihydroquinine, dihydroquinidine, strychnine, brucine, veratrine,
cefradine); nhóm isoquinoline (morphine, codeine, thebaine, papaverine,
narcotine, sanguinarine, narceine, hydrastine, berberine); nhóm phenethylamine
(mescaline, ephedrine, dopamine, amphetamine); nhóm indole gồm các
tryptamine (DMT, N-metyltryptamine, psilocybin, serotonine), ergoline
(alcaloid từ ngũ cốc/cỏ như ergine, ergotamine, axid lysergic v.v), betacacbolin (harmin, harmaline, yohimbine, reserpine, emetine) và các alkaloid từ
chi Ba gạc (Rauwolfia) (reserpine); nhóm purine bao gồm xanthine (caffeine,
theobromine, theophylline); nhóm terpenoid gồm các alkaloid aconitin, steroid
(solanine), samandarin (muscarine, choline, neurin) [12].
1.2.1.3. Tính chất của alkaloid

Phần lớn alkaloid trong tự nhiên, công thức cấu tạo có oxy thường ở
thể rắn ở nhiệt độ thường. Ví dụ: Morphine (C17H19NO3), codeine
(C18H21NO3), strychnine (C21H22N2O2), quinine (C20H24N2O2), reserpine
(C33H40O9N2)…. Những alkaloid trong thành phần cấu tạo không có oxy
thường ở thể lỏng. Ví dụ như: Coniine
sparteine (C15H26N2) [27].

8

(C8H17N), nicotine

(C10H14N2),


Tuy nhiên, cũng có vài chất trong thành phần cấu tạo có oxy vẫn ở thể
lỏng như arecoline (C8H13NO2), pilocarpidine (C10H14N2O2) và có vài chất
không có oxy vẫn ở thể rắn như sempecviren (C 19H16N2), conexine (C24H40N2).
Các alkaloid ở thể rắn thường kết tinh và có điểm chảy rõ ràng, nhưng cũng
có một số alkaloid không có điểm chảy vì bị phân hủy bởi nhiệt độ trước khi
chảy [27].
Đa số alkaloid không mùi, có vị đắng và một số ít có vị cay như
capsaicin, piperine… Hầu hết các alkaloid đều không màu, trừ một số alkaloid
có màu vàng như berberine, palmatine, chelidonine. Các alkaloid base không
tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, ether,
chloroform, benzen… Muối của alkaloid dễ tan trong nước, hầu như không tan
trong các dung môi hữu cơ. Dựa vào độ tan khác nhau của alkaloid base và
muối alkaloid người ta sử dụng dung môi thích hợp để chiết xuất và tinh chế
alkaloid. Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi muối của
nó bằng dung dịch kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, NaOH… [27].
Qua nghiên cứu định tính và định lượng alkaloid trong các bộ phận khác

nhau của cây và theo dõi sự vận chuyển của chúng, người ta nhận thấy nơi tạo
ra alkaloid không phải là nơi tích tụ nhiều alkaloid. Nhiều alkaloid được tạo ra
ở rễ sau đó vận chuyển lên phần trên của cây. Sau khi thực hiện những biến đổi
thứ cấp chúng được tích lũy ở lá, quả và hạt. Ví dụ: L-hyoscryamine trong cây
cà độc dược (Atropa belladonna) được tạo ra ở rễ, sau đó chuyển lên phần trên
của cây. Khi cây 1 tuổi thân cây chứa nhiều alkaloid hơn lá, khi cây 2 tuổi thân
cây hóa gỗ nhiều hơn, hàm lượng alkaloid giảm xuống, hàm lượng alkaloid ở
phần ngọn đạt được mức tối đa vào lúc cây ra hoa và giảm đi khi quả chín [6].
Ngoài ra, hàm lượng của alkaloid trong cây cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố
như khí hậu, ánh sáng, chất lượng đất, giống cây và bộ phận thu hái [32].

9


1.2.2. Alkaloid trong cây dừa cạn
1.2.2.1. Một số alkaloid chính trong cây dừa cạn
Lá và hoa cây dừa cạn có hàm lượng vindoline, catharanthine và anhydro
vinblastine cao, trong khi ở rễ lại tích lũy hàm lượng ajmalicine, vindolinine và
serpentine cao hơn ở các vị trí khác trong cây [25].
Cây ở giai đoạn sinh trưởng khác nhau thì mức độ sản sinh alkaloid khác
nhau. Hàm lượng alkaloids indole mono giảm, trong khi alkaloid bisindole tăng
với lá già và khi cây ngừng phát triển [24].
Alkaloid toàn phần có ở lá dừa cạn với hàm lượng 0,37% - 1,15%, thân
0,40%, rễ chính 0,7% - 2,4%, rễ phụ 0,9% - 3,7%, hoa 0,14% - 0,84%, vỏ quả
1,14%, hạt 0,18%. Trong khoảng 150 loại alkaloid đã được chiết từ cây dừa
cạn, người ta đặc biệt chú ý 20 nhóm alkaloid dimeric là những nhóm có hoạt
tính chống ung thư bao gồm vincristine và vinblastine [22].
Vinblastine có ở lá với hàm lượng 0,013% - 0,063%, ở bộ phận trên mặt
đất 0,0015%, ở rễ 0,23%. Nếu cây bị bệnh asteryllow-virus thì sẽ không
có vinblastine. Vincristine có hàm lượng thấp hơn 0,0003% - 0,0015% [23].

Lá dừa cạn thu thập ở nhiều địa phương khác nhau chứa 0,7% - 1,2%
alkaloid toàn phần. Vinblastine có với hàm lượng 1,6 – 2 phần vạn ở lá. Thời
gian thu hái nguyên liệu tốt nhất để trên cây có hàm lượng hoạt chất cao là vào
cuối tháng 8 đến giữa tháng 9 dương lịch [20].
1.2.2.2. Tác dụng của alkaloid trong cây dừa cạn
Các nhà khoa học đã nghiên cứu chiết xuất từ cây dừa cạn hai alkaloid
vinblastin và vincristin, là những chất ức chế mạnh sự phân bào. Các alkaloid
này liên kết đặc hiệu với Tubulin, là protein ống vi thể ở thoi phân bào ngăn
cản sự tạo thành các vi ống và gây ngừng phân chia tế bào ở pha giữa. Cho nên,
chúng hạn chế hình thành bạch cầu thừa ở bệnh nhân ung thư máu. Vì vậy,
vinblastin và vincristin được sử dụng làm nguyên liệu bào chế thuốc điều trị
ung thư [5].

10


Nhờ thực nghiệm trên chuột, các nhà khoa học Canada đã phát hiện tác
dụng làm giảm bạch cầu của một số chất tách được từ dừa cạn và phát hiện ra
chất vincaleucoblastine và 3 ankaloid khác cũng có tác dụng chống khối u là
leurosine, leurocristine và leurosidine. Ngoài ra, các nhà khoa học còn phát hiện
ra tác dụng tẩy giun khá mạnh, tác dụng lợi tiểu của catharanthine, vindolinine
và vincolidin [33].
Các alkaloid được chiết xuất từ dừa cạn được dùng dưới dạng muối
sulfate. Vinblastine sulfate được coi là lựa chọn hàng đầu để điều trị ung thư
biểu mô tinh hoàn, ngoài ra nó rất hiệu quả trong liệu pháp trị bệnh Hodgkin,
ung thư nhau, ung thư biểu mô da đầu và ung thư biểu mô thận. Hơn nữa,
vinblastine sulfate còn được dùng để điều trị u nguyên bào thần kinh, ung thư
vú, ung thư cổ tử cung và ung thư dạng nấm da [30].
Vincristine sulfate là một trong những thuốc chống ung thư được dùng
rộng rãi hàng đầu, đặc biệt đối với các bệnh ung thư máu, thường được dùng để

làm thuyên giảm bệnh bạch cầu lympho cấp. Đây là lựa chọn hàng đầu để điều
trị bệnh Hodgkin, u bạch huyết không - Hodgkin, ung thư biểu mô phổi, u
Wilm, bạch cầu tủy bào mạn (đợt cấp tính), sarcom Ewing và sarcom cơ vân.
Ngoài ra, ở dạng dùng phối hợp, vincristine sulfate còn được dùng cho ung thư
biểu mô vú, ung thư cổ tử cung, u nguyên bào thần kinh và bệnh bạch cầu
lympho mạn tính [30].
Hiện nay, y khoa vẫn chưa tìm ra phương pháp nào điều trị bệnh bạch
cầu tốt hơn vinblastine và vincristine nên cây dừa cạn càng trở nên có giá trị.
Tuy nhiên, để chữa được bệnh ung thư cần sử dụng vincristine, vinblastine với
hàm lượng rất cao. Nhưng dùng các thành phần này, cần có sự hướng dẫn của
bác sỹ điều trị, nếu không dễ bị ngộ độc [9].
Vinblastine được chuyển hóa chủ yếu ở gan để thành desacetyl vinblastine.
Thuốc này được thải trừ qua mật vào phân và nước tiểu, một số đào thải dưới
dạng thuốc không biến đổi [9].

11


1.2.2.3. Quá trình sinh tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn
Sự khác nhau của alkaloid trong cây dừa cạn phụ thuộc vào loại terpenoid
indole alkaloid (TIA). Chúng gồm hai nửa bắt nguồn từ hai quá trình chuyển
hóa riêng biệt là quá trình mevalonate cho nửa không chứa tryptophan và quá
trình tryptophan cho nửa chứa tryptophan. Cấu trúc phức tạp của những
alkaloid này luôn có mặt hai nguyên tử nitơ. Một là indole nitơ (nửa bắt nguồn
từ tryptophan) và nguyên tử nitơ thứ hai được tạo thành từ sự tách rời của hai
carbon tại vị trí β của vòng indole. Nửa không có tryptophan bắt nguồn từ
mevalonic acid và nó là một C 10-geraniol (monoterpenoid). Geraniol được tạo
thành, thông qua một chuỗi chuyển hóa sẽ chuyển thành dạng loganin và sau đó
là secologanin (một monoterpenoid glucoside) [7].

Hình 1.2: Sơ đồ tổng hợp vinblastine và vincristine
Chất trung gian hình thành các monoterpenoid indole alkaloid là 3α (S)strictosidine. Enzyme chịu trách nhiệm cho phản ứng kết hợp giữa trytamine và

12


secologanin là strictosidine synthase. Strictosidine sau đó sẽ hình thành cấu
trúc cathenamine (alkaloid loại coryanthe). Cathenamine phải trải qua một
chuỗi các phản ứng để dẫn đến sự hình thành catharanthine (alkaloid loại
iboga) và vindoline (alkaloid loại aspidosperma). Catharanthine và vindoline là
các alkaloid monomeric indole, xuất hiện tự do trong cây. 3’,4’Anhydrovinblastine được hình thành do từ sự ghép nối của catharanthine và
vindoline, với sự xúc tác của peroxidase. Sau đó, 3’,4’- Anhydrovinblastine
được chuyển thành vinblastine cuối cùng là vincristine [6]. Vincristine cũng có
cấu trúc tương tự như vinblastine nhưng thay nhóm fromyl bằng một nhóm
methyl trên phân tử nitrogen indole của vindoline [24].

Hình 1.3: Công thức hóa học của vinblastine (C48H58N4O9)

Hình 1.4: Công thức hóa học của vincristine (C46H56N4O10)
Việc nghiên cứu sáng tỏ con đường chuyển hóa tổng hợp các alkaloid
nói chung, vinblastine và vincristine nói riêng ở cây dừa cạn, cùng sự phát hiện
các enzyme xúc tác cho các quá trình tổng hợp và các gen mã hóa tổng hợp các
enzyme tương ứng tạo cơ sở thuận lợi cho việc nghiên cứu tạo cây dừa cạn

13


chuyển gen có khả năng tổng hợp các alkaloid có lợi với hàm lượng cao phục
vụ điều chế thuốc chữa trị ung thư có hiệu quả.
1.2.3. Peroxidase và gen mã hóa peroxidase

Quá trình tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn có sự tham gia của nhiều nhân
tố phiên mã và các gen chức năng như DAT, ORCA3, Prx… [34].
Peroxidase là loại enzyme thực vật có khả năng sử dụng H 2O2 để oxy hóa
một số chất cho quá trình chuyển hóa trung gian, đặc biệt là hợp chất phenol.
Những enzyme này được định vị trên thành tế bào hoặc trong không bào, đây là
sản phẩm của quá trình chuyển hóa trung gian. Chức năng sinh hoá của
peroxidase trong cây dừa cạn đã được phát hiện bởi những nghiên cứu về khả
năng oxy hóa các hợp chất phenol sử dụng H2O2. Phân tích các hợp chất phenol
từ không bào lá người ta đã phát hiện sự có mặt của 3 axit caffeoylquinic và 4
flavonoid trong bào quan này. Điều thú vị là peroxidase hoạt động trong không
bào chiếm tỷ lệ lên tới hơn 90% peroxidase tổng số trong lá [10].
Gen mã hoá enzyme peroxidase đã được phân lập từ cây dừa cạn bởi
Kumar và cs (2007) có kích thước 1357 bp, vùng mã hoá gồm 993 nucleotide, từ
nucleotide số 41 đến nucleotide số 1034. Gen Prx mã hóa một sản phẩm protein
gồm 330 amino acid với 21 amino acid của peptide tín hiệu. Khối lượng phân tử
của Prx ước tính 37,43 kDa và có giá trị pI 8,68. mRNA và Prx đã được tìm thấy
trong lá của cây dừa cạn và đã được xác định bằng phương pháp Northern blot
và Western blot [16].
Để có được một cái nhìn sâu sắc về trình tự hoàn chỉnh của CrPrx, Kumar
và cs (2007) đã thực hiện phản ứng PCR bằng cách sử dụng cặp mồi PFLF1 và
PFLR1, được thiết kế bám để bảo tồn vùng 5' - UTR và vùng 3' - UTR trên DNA
của cây dừa cạn. Sản phẩm khuếch đại khi nhân bản và trình tự được tìm thấy dài
1793 bp. CrPrx bao gồm bốn exon (268 bp, 189 bp, 172 bp, 405 bp, dừng lại ở
UAG) và ba intron (95 bp, 435 bp, 79 bp). Intron thứ hai trong CrPrx đã được tìm
thấy có kích thước lớn nhất và lớn hơn so với các exon, sự phát hiện cấu trúc CrPrx

14


đã góp phần làm rõ thêm quan điểm về nguồn gốc của peroxidases ở cây dừa cạn từ

một gen tổ tiên chung với các loài khác có ba intron và bốn exon [16].

Hình 1.5: Cấu trúc intron và exon của CrPrx [14]
Phân tích Northern Blot cho thấy biểu hiện của CrPrx khác nhau trong
các cơ quan khác nhau. Trong các mô sinh dưỡng, biểu hiện nhiều nhất trong
các mô liên nút gốc, tiếp theo là rễ, lá non và lá trưởng thành. Trong các mô
sinh sản, biểu hiện nhiều nhất trong quả, tiếp theo là nụ hoa. Sự biểu hiện
CrPrx đã không được phát hiện trong lá già và hoa [16].
Maria Manuela và cs (2008) đã phân lập được gen mã hóa enzyme
anhydrovinblastine synthase từ DNA genome, gen này được xác định thuộc
peroxidase III có mặt trong lá cây dừa cạn và đặt tên CrPrx1. CrPrx1 có 1388
nucleotide, vùng mã hóa từ nucleotide số 43 đến nucleotide số 1134, trình tự
amino acid suy diễn tương ứng gồm 363 amino acid, trong đó có đoạn peptide
tín hiệu nằm ở đầu tận cùng N điều khiển sự vận chuyển loại protein này trong
tế bào [19].
Gen Arabidopsis Prx (AtPrx12) là gen có tương đồng cao nhất với
CrPrx1. Gen AtPrx12 chứa hai intron, có vùng mã hóa gần như hoàn toàn
giống với các vùng tương ứng trong CrPrx1. Thiết kế mồi ở vị trí giả định của
intron đã khuếch đại được một intron. Intron I của CrPrx1 bao gồm 828 bp,
được lắp vào vị trí 300 của cDNA, và hai bên là các dinucleotide - GT và –
AG. Intron thứ hai cũng có mặt và có khả năng cùng ở trong một vị trí tương
đương với intron II của gen AtPrx12. Tuy nhiên, để khuếch đại intron II

15


CrPrx1 bằng các cặp mồi oligoT không thành công. Việc khuếch đại intron II
của gen CrPrx1 rất khó khăn có thể là do kích thước lớn. Bằng phương pháp
Southern blots người ta đã xác định được số lượng bản sao gen của CrPrx1 và
kích thước của intron II. Kết quả, xuất hiện một băng duy nhất, điều đó cho

thấy rằng CrPrx1 tồn tại như một gen đơn bản sao trong cây dừa cạn, kích
thước ước tính của intron II là 3,5 – 4 kb [19].
Năm 2011, Kumar và cộng sự đã tách dòng và giải trình tự của hai gen
peroxidase III là CrPrx3 và CrPrx4 từ cDNA cây dừa cạn. Chiều dài đầy đủ của
CrPrx3 phân lập từ DNA genome là 1233 bp, mã hóa chuỗi polypeptid gồm 330
amino acid, CrPrx4 phân lập từ DNA genome dài 1055 bp, có vùng mã hóa gồm
956 nucleotide và mã hóa cho 318 amino acid. Giả định mô hình cấu trúc 3-D
của CrPrx3 và CrPrx4 đã phát hiện sự hiện diện của hai Ca(+2) bằng các liên kết
ion ở hai đầu, và một nhóm heme phối hợp tại vị trí trung tâm. CrPrx3 và CrPrx4
đều có một bản sao duy nhất trong cây dừa cạn. Cả hai gen trên đều có mặt trong
một loạt các mô thực vật. Định lượng CrPrx3 và CrPrx4 bằng real-time PCR đã
xác nhận được, chúng biểu hiện tối đa trong thân tiếp theo là hoa [17].
Costa và cs (2008) nghiên cứu cấu trúc của peroxidase III isoenzyme
hiện diện trong lá của cây dừa cạn và enzyme này tham gia vào quá trình sản
xuất các alkaloid có tác dụng chống ung thư [8].
Nói chung, trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về Prx ở
thực vật và số ít ở động vật. Tuy nhiên, việc nghiên cứu về gen này trên cây
dừa cạn còn hạn chế.
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về cây dừa cạn chỉ được tập trung vào
khảo sát hàm lượng alkaloid, phương pháp nuôi cấy và phương pháp chiết rút
để thu sản phẩm alkaloid từ cây dừa cạn. Tuy nhiên, nghiên cứu sinh học phân
tử các gen liên quan đến cơ chế sinh tổng hợp các alkaloid ở dừa cạn còn ít
được đề cập tới.

16


1.3. Các nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine
ở cây dừa cạn
1.3.1. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở

cây dừa cạn bằng phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật
Marfori và Alejar (1993) đã nghiên cứu khả năng sản xuất alkaloid của
những mô sẹo có nguồn gốc từ rễ, thân, lá và hoa của hai giống cây dừa cạn
trắng và hồng tím. Kết quả thu được tám dòng mô sẹo bằng cách sử dụng môi
trường LS bổ sung BA 3mg/l, 2,4-D 0.5mg/l và nước dừa. Sau khi các mô được
hình thành chuyển vào môi trường LS không có chất điều hòa sinh trưởng và
được nuôi trong 1 năm. Hàm lượng alkaloid cao nhất là trong cây màu hồng
tím và trong mô sẹo có nguồn gốc từ rễ [18].
Pietrosiuk và cs (1999) đã tạo được hai dòng mô sẹo cây dừa cạn trắng
và xanh trên môi trường Gamborg rắn bổ sung kinetin 0,1mg/l và IAA 1mg/l.
Mô sẹo được lấy từ những đoạn trụ dưới lá mầm của cây cây dừa cạn. Dòng mô
sẹo trắng đã được chọn từ những mô sẹo xanh phát triển trong pha tĩnh. Trái
ngược với sự rắn chắc của dòng mô sẹo màu xanh, dòng màu trắng lại mịn và
mềm. Phương pháp HPLC đã phân tích các chất chiết từ mô sẹo của cả hai
dòng mô sẹo xanh và mô sẹo trắng cho thấy, các indole alkaloid tồn tại ở dạng
vết và không có dược tính [26].
Bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC), nghiên cứu của Junaid
Aslam và cs (2009) cho thấy, có sự khác nhau về hàm lượng vincristine trong
các loại mô sẹo (mô sẹo phôi và không phải mô sẹo phôi) thu được từ nuôi cấy
in vitro. Hàm lượng vincristine trong các giai đoạn của sự phát triển phôi (phôi
chín, phôi nảy mầm), các bộ phận khác nhau của cây (lá, rễ…) trồng ngoài tự
nhiên cũng có sự khác nhau. Nghiên cứu đã khẳng định, hàm lượng vincristine
cao trong mô sẹo lá và phôi nảy mầm. Lá của cây nuôi cấy trong ống nghiệm
có hàm lượng hàm lượng vincristine cao hơn lá của cây nuôi trồng ngoài tự
nhiên cũng ở giai đoạn tương tự [15]. Kết quả nghiên cứu này góp phần định

17