DỊCH CHIẾT LÁ HIBISCUS SABDARIFFA CẢM ỨNG CƠ CHẾ TỰ CHẾT CỦA TẾ BÀO UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT NGƯỜI IN VITRO VÀ INVIVO

Dịch chiết lá Hibiscus sabdariffa cảm ứng cơ chế
tự chết của tế bào ung thư tuyến tiền liệt người
invitro và invivo


Nội dung
Tổng quan
Nguyên liệu và phương pháp
Kết quả
Thảo luận


Tổng quan
Dược liệu Hibiscus sabdariffa Linne (Malvaceae)
Tên Việt Nam: Bụp giấm
Xuất xứ: Châu Phi
Đài hoa: dùng làm thức uống, mứt và rau
Ở châu Á: điều trị cao huyết áp, sốt và
suy gan
Dịch chiết hoa: hiệu quả trong điều trị
bệnh bạch cầu và u dạ dày.
Dịch chiết lá: hạ đường huyết, hạ lipid
máu, chống oxy hóa và tác dụng giống
estrogen.


Tổng quan
Bệnh ung thư tuyến tiền liệt (CaP)
Tuyến tiền liệt là 1 phần của hệ sinh
dục nam, sản xuất và lưu trữ tinh dịch.
Vị trí: bao quanh niệu đạo.

bệnh liên quan đến tuyến tiền liệt
ảnh hưởng việc đi tiểu và xuất tinh.
CaP là bệnh ác tính phổ biến thứ 2 trên
thế giới trong số những bệnh ung thư ở
nam.
Tế bào tuyến tiền liệt biến đổi thành tế
bào ung thư, cần androgen để hoạt
động.
có thể dùng những dược liệu có
glucocorticoid hoặc hiệu quả giống
estrogen để điều trị CaP


Tổng quan
Apoptosis – sự chết tế bào theo chương trình


Tổng quan
Apoptosis – sự chết tế bào theo chương trình


Nguyên liệu và phương pháp
Chuẩn bị dịch chiết lá và nghiên cứu thành
phần chức năng
Phân tích HPLC dịch chiết và phân lập
những hợp chất phenolic
Thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào CaP
Thử nghiệm in vivo trên chuột Nude

Chuẩn bị dịch chiết lá và nghiên cứu
thành phần chức năng
Chuẩn bị dịch chiết lá H. sabdariffa
100g lá khô H. sabdariffa
Ngâm với 4000 ml
nước nóng (95 oC)
trong 2 h

Dịch chiết
Bay hơi dưới áp
suất thấp tại -85 oC

Dịch cô (26.6 g)
Làm khô lạnh, bảo
quản ở to = -25 oC


Chuẩn bị dịch chiết lá và nghiên cứu
thành phần chức năng
Xác định nồng độ polyphenol theo phương pháp Folin-Ciocalteau
0.1 mg dịch chiết + 1 ml nước cất + 0.5 ml TT Folin-Ciocalteau
(0.5N)
Trộn đều
Sau 3 phút
+ 3 ml dd Na2CO3 2%

Đo độ hấp thu tại bước sóng 750 nm bằng máy quang phổ kế Hitachi (U-3210)
Chất chuẩn: acid gallic

Chuẩn bị dịch chiết lá và nghiên cứu
thành phần chức năng
Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần theo phương pháp Jia
0.5 mg dịch chiết + 1.25 ml nước cất + 75 µl dd NaNO2 2%
Trộn đều
Sau 6 phút

+ 150 µl dd AlCl3.6H2O 10%
Trộn đều
Sau 5 phút

+ 0.5 ml NaOH 1M và 2.5 ml nước cất
Đo độ hấp thu tại bước sóng 510 nm
Chất chuẩn: rutin


Chuẩn bị dịch chiết lá và nghiên cứu
thành phần chức năng
Xác định hàm lượng anthocyanin toàn phần theo phương pháp Fuleki và
Francis (phương pháp pH vi sai)
10 mg dịch chiết pha loãng thành 50 ml với đệm pH 1.0 và 4.5
Đo độ hấp thu tại bước sóng 535
nm Mẫu chuẩn: nước cất
Hàm lượng anthocyanin được tính dựa trên hiệu số độ hấp thu toàn phần tại
pH 1.0 và pH 4.5


Chuẩn bị dịch chiết lá và nghiên cứu
thành phần chức năng
Hàm lượng các chất trong dịch chiết

Polyphenolic
compound

Peak
no.

Catechin

3

Hàm lượng
dịch chiết
(%)
4.25 ± 1.43

Ellagic acid

5

28.20 ± 8.63

Polyphenol toàn phần
(phương pháp FolinCiocalteau)

5.22 ± 0.06

Flavonoid toàn phần
(phương pháp Jia)

20.98 ±1.65

Anthocyanin toàn phần
( phương pháp Fuleki
và Francin)

1.93 ± 1.24


Phân tích HPLC cho dịch chiết và phân
lập những hợp chất phenolic
• Thiết bị: Hệ thống Hewlett-Packard Vectra 436/33 N với đầu
dò diode array
– Cột RP-18, đường kính trong 4.6 × 150 mm

• Dịch chiết (DC) được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 0.45
µm
• Đo sắc ký ở bước sóng 285 và 345 nm.
• Pha động:
– Dung môi A: acid formic/nước = 10:90
– Dung môi B: acid formic/nước/acetonitril = 10:60:30
– Pha động chạy bởi phương pháp gradient tuyến tính tại to phòng từ 10%
đến 40% B, v = 1 ml/ph, trong 25 ph

• 1 peak đơn tại 345 nm, theo thời gian lưu trữ: ellagitannin
• Thu được 1.5 mg ellagic acid (EA), tinh khiết hóa bằng kết tinh
trong methanol


Thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào CaP
Nuôi cấy tế bào

• Dòng tế bào CaP: LNCaP, PC3 và DU 145 được lấy từ Trung tâm
tài nguyên sinh học toàn cầu - ATCC (Hoa Kỳ).
• Nuôi cấy: cấy trong thạch tăng trưởng (theo khuyến nghị của
ATCC), cung cấp 10% FBS, 2 mM glutamine và 100 U/ml
penicillin-streptomycin
• Môi trường: nhiệt độ 37 oC, độ ẩm có 5% CO2
• Mật độ: 7 × 104
• Thời gian cấy: 24 giờ trước khi điều trị
• Để ức chế tăng sinh tế bào: thêm kháng sinh đơn dòng Nok-1 và
peptide ức chế V5 trước khi điều trị bằng dịch chiết (DC)


Thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào CaP
Đánh giá khả năng sống của tế bào
• Tế bào được cấy với mật độ 7 × 104, được ủ với DC lá hoặc
EA tại nồng độ khác nhau trong thời gian quy định (0-24 h)
• Môi trường thay đổi, thêm 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide (MTT, 0.1 mg/ml) trong 4 h.
Số tế bào còn sống tương ứng với sản lượng formazan, được
hòa tan với isopropanol, đo quang phổ tại 563 nm
• Đánh giá ảnh hưởng của thuốc lên sự phát triển tế bào và xác
định nồng độ của thuốc ức chế 50% tế bào sống (IC50)


Thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào CaP
Nhuộm TUNEL
Tế bào chết được đo số lượng bằng pp TUNEL
(terminaol deoxynucleotidyl transferase-mediated
dUTP nick endlabelling): kiểm tra mảnh vỡ DNA
bằng kit xét nghiệm ApoAlert.
• Màng TB được tẩy bằng dd đệm Dulbecco’s phosphate và được ổn

định với paraformaldehyd 4% trong 30 ph tại nhiệt độ phòng.
• TB ổn định được thấm với 0.1% Triton X-100 trong Na citrat 0.1%.
• Sau khi tẩy TB được ủ với hỗn hợp phản ứng trong 60 ph tại 37 oC.
• TB đã nhuộm được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang với màng
lọc kích thích 340/380 nm, phóng đại 400×.
• Có 3 thí nghiệm riêng biệt được thực hiện, và ít nhất 300 TB được
đếm trong mỗi thí ngiệm


Thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào CaP
Phân tích vòng đời TB và lượng hóa sự chết TB
Đo dòng TB LNCaP bằng pp FAScan trong 24 h nuôi cấy.
TN được nhuộm 2 lần với dd PBS. Dịch treo TB được ly tâm 1500 vòng/ph
trong 5 ph tại to phòng
Ủ tại -20 oC ít nhất 24 h
+ 1ml dd nhuộm propidium iodide (20 µg/ml PI, 20 µg/ml Rnase A và 0.1%
Triton X-100), ủ 15 ph trong bóng tối tại to phòng
PI được kích thích tại 488 nm và dấu hiệu huỳnh quang được phân tích trên quy
mô logarit với huỳnh quang PI (đỏ) được phát hiện trên 600 nm
Dựa trên cường độ huỳnh quang, đếm số TB có hàm lượng DNA dưới pha subG1, G0/G1, S và G2/M với phần mềm CellQuest phiên bản 3.3


Thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào CaP
Phương pháp Western blot = pp lai thấm protein

Là pp có độ nhạy cao dựa trên đặc hiệu của kháng thể để phát hiện
protein đã được điện di trên gel SDS-PAGE và chuyển lên màng lai
Protein được phân tách bằng điện di trên gel 8-15% SDS-polyacrylamic
Các protein được chuyển đến màng lai nitrocellulose
Màng TB tạo khối với 5% sữa đông khô không béo, ủ qua đêm tại 4 oC với

kháng thể (kháng thể kháng caspase 3, caspase 8, caspase 9, Bcl-2, Bcl-XL,
Mcl-1, Bax, t-Bid, cytocrom c, TNFα, TNFR1, Fas, FasL, và COX IV và
kháng β-lactin )
Màng TB được ủ với kháng thể thứ cấp có enzym horseadish peroxidase đi
kèm. Kháng thể thứ cấp sẽ bám vào kháng thể sơ cấp
Phát hiện bằng thuốc thử phát quang hóa học tăng cường


Thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào CaP
Thử nghiệm màng điện áp ty thể


Thử nghiệm in vivo trên chuột Nude
Nghiên cứu khối u bằng kĩ thuật ghép dị loài
Chuột nude 8 tuần tuổi được nuôi trong lồng, nhiệt độ 22
± 2 độ C và độ ẩm 65 ± 5% trong điều kiện tiện nghi đối
với động vật, chu kì sáng tối 12 h, uống nước theo nhu
cầu
8 × 106 tế bào LNCaP trong 100 ml gel protein được cấy vào sườn phải của
chuột, dẫn tới hình thành khối u
Chuột được chia ngẫu nhiên thành 3 nhóm (mỗi nhóm 12 chuột), được nuôi
với chế độ ăn 5 g/ngày bao gồm 50 (1%) hoặc 100 (2%) µg/ml dịch chiết H.
sabdariffa trong 90 ngày
Sau khi chuột bị giết, khối u được phân tách cho thể tích cuối và đo khối lượng ướt
Thực hiện đánh giá mô học.
Sử dụng phương pháp Western blotting với dịch mô từ chuột



Kết quả

Thành phần dịch chiết lá H.
sabdariffa
Kết quả thử nghiệm in vitro
trên dòng tế bào CaP
Kết quả thử nghiệm in vivo
trên chuột Nude



Cảm ơn sự chú ý lắng nghe của
cô và các bạn