NGHIÊN cứu đặc điểm SINH học, PHÂN tử của CUCUMBER MOSAIC VIRUS TRÊN cây KHOAI

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA NÔNG HỌC
-------  -------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, PHÂN TỬ CỦA CUCUMBER
MOSAIC VIRUS TRÊN CÂY KHOAI TỪ “

Người hướng dẫn

: TS. NGUYỄN ĐỨC HUY

Bộ môn

: BỆNH CÂY

Người thực hiện

: PHAN THỊ THÙY DƯƠNG

Lớp

: BVTVB

Khóa

: 57

Hà Nội - 2016

LỜI CẢM ƠN
Sau 6 tháng thực hiện đề tài tại Bộ môn bệnh cây, Khoa Nông học và
Trung tâm nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới - Học viện Nông nghiệp Việt Nam,
dưới sự giúp đỡ, chỉ bảo và dìu dắt tận tình của thầy giáo và các cán bộ nghiên
cứu tại Trung tâm, cùng với sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, em đã hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp

. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, PHÂN TỬ CỦA

CUCUMBER MOSAIC VIRUS TRÊN CÂY KHOAI TỪ “

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Nguyễn Đức Huy,
giảng viên bộ môn Bệnh cây, khoa Nông học đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi
điều kiện tốt cho em thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn chỉnh đề tài này.
Qua đây em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô trong Bộ
môn bệnh cây cũng như các thầy cô trong khoa Nông học đã tận tình giảng dạy,
dìu dắt em trong suốt thời gian em học tập và rèn luyện tại trường.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tất cả người thân, bạn bè,
những người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ em trong quá trình học tập và
thực hiện đề tài này.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2016

Sinh viên

Phan Thị Thùy Dương

i


MỤC LỤC

2.1 Giới thiệu về cây khoai từ ................................................................................50
2.1.1 Đặc điểm của cây khoai từ.......................................................................................................50
2.1.2 Giá trị dược liệu của cây khoai từ ...........................................................................................52
2.1.3 Sự phân bố số lượng giống khoai từ .......................................................................................53

2.3 Giới thiệu về Cucumber mosaic virus...............................................................54
2.3.1 Lịch sử nghiên cứu Cucumber mosaic virus.............................................................................54
2.3.1.1 Nguồn gốc của Cucumber mosaic virus............................................................................54
2.3.1.2 Phân loại Cucumber mosaic virus.....................................................................................54
2.3.1.3 Ký chủ của Cucumber mosaic virus...................................................................................55
2.3.1.4 Cấu trúc của Cucumber mosaic virus................................................................................56
2.3.1.5 Tính chất lý hóa của Cucumber mosaic virus....................................................................58
2.3.1.6 Sự truyền bệnh của Cucumber mosaic virus ....................................................................58
2.3.1.7 Triệu chứng bệnh do Cucumber mosaic virus gây ra........................................................60
2.3.1.8 Biện pháp kiểm soát.........................................................................................................60

2.4 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về Cucumber mosaic virus trong thời gian
gần đây.................................................................................................................61
2.4.1 Cucumber mosaic virus.................................................................................61
2.4.1.1 Tình hình nhiên cứu ngoài nước..................................................................61
Bahadra Murthy Vemulapati và cs năm 2009 đã nghiên cứu trình tự gen protein vỏ chứng minh
rằng CMV lây nhiễm ớt cựa gà (Capsicum annuum L.) ở Ấn Độ thuộc nhóm IB...........................61

Kouakou Théodore Kouadio và cs năm 2014 đã viết một bản báo cáo đầu tiên về sự

xuất hiện của satRNA kết hợp với CMV phân lập từ chuối (Musa sp.) tại Bờ Biển
Ngà.......................................................................................................................62
2.4.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước.....................................................................................62

3.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu........................................64
ii


3.1.1 Đối tượng nghiên cứu..............................................................................................................64
3.1.2 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu................................................................................................64
3.1.2.1 Vật liệu:.............................................................................................................................64
3.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu...........................................................................................66

3.3 Phương pháp nghiên cứu..................................................................................66
3.3.1 Phương pháp điều tra thành phần, diễn biến bệnh khảm lá khoai từ ngoài đồng ruộng........66
3.3.2 Thí nghiệm trong phòng..........................................................................................................67
3.3.2.2 Chẩn đoán virus bằng kỹ thuật ELISA................................................................................72
3.3.3 Thí nghiệm trong nhà lưới.......................................................................................................74

4.1 Thành phần bệnh hại khoai từ tại một số tỉnh ....................................................75
4.2 Kết quả điều tra mức độ phổ biến, thu mẫu và đánh giá tình hình bệnh virus có
triệu chứng khảm lá trên đồng ruộng......................................................................77
4.2.1 Kết quả điều tra mức độ nhiễm bệnh khảm lá trên khoai từ tại một số tỉnh phía Bắc............77

4.2 Kết quả điều tra mức độ phổ biến, thu mẫu và đánh giá tình hình bệnh virus có
triệu chứng khảm lá trên đồng ruộng......................................................................78
4.2.1 Kết quả điều tra mức độ nhiễm bệnh khảm lá trên khoai từ tại một số tỉnh phía Bắc............78
4.2.2 Điều tra diễn biến bệnh khảm lá khoai từ ...............................................................................78
4.2.2.1 Kết quả điều tra diễn biến bệnh khảm lá tại Can Lộc – Hà Tĩnh .......................................79

4.4 Đánh giá khả năng lây nhiễm CMV và bằng kỹ thuật lây nhân tạo....................82
4.4.1 Kết quả lây nhiễm nhân tạo CMV ............................................................................................83
4.4.1.1 Kết quả lây nhiễm CMV lên cây rau muối.........................................................................83
4.3.2. Kết quả lây nhiễm nhân tạo CMV trên cây khoai từ...............................................................86
4.3.3 Kết quả đánh giá sự lây nhiễm virus truyền qua củ giống .......................................................88

5.1 Kết luận...........................................................................................................90
5.2 Đề nghị...........................................................................................................91

iii


DANH

MỤC

iv

BẢNG


DANH MỤC HÌNH

v


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
STT

Chữ viết tắt

1

AVRDC

2
3
5
6
7
8
8
9
10
11

CMV
CP
CS
Da
DAS-ELISA
ELISA
OD
PTR-ELISA
PVMV
RNA

12

RT-PCR

13
14
15

SD
TB
HVNNVN

Từ viết tắt
Asian Vegetable Research and
Development Center
Cucumber Mosaic Virus
Coat Protein
Cộng sự
Dalton
Double Antibody Sandwich – ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Optical Density
Plate-trapped antigen – ELISA
Pepper Veinal Mottle Virus
Ribonucleic Acid
Reverse transcription - Polymerase
Chanin Reaction
Standard Deviation
Trung bình
Học viện nông nghiệp Việt Nam

vi

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Khoai từ (Dioscorea esculenta) thuộc họ củ nâu (Dioscoreaceae) là một
họ thực vật một la mầm bao gồm 8-9 chi với khoảng 750-785 loài. Chi củ nâu
(Dioscorea) được đặt theo tên nhà vật lý học và thực vật học Hy lạp cổ đại
Dioscorides. Chi này có trên 600 loài thực vật bản địa ở các vùng nhiệt đới và
vùng có khí hậu ẩm. Một số loài trong chi củ nâu cho củ là nguồn lương thực
quan trọng ở một số nước nhiệt đới. Nhiều loài củ trong chi này chứa độc tố
trong củ tươi nhưng độc tố này bị phân hủy trong quá trình chế biến nhiệt.Các
loài quan trọng trong chi củ nâu là: củ mài, củ mài trắng, khoai mỡ, nắng nghệ
và đặc biệt là cây khoai từ.Khoai từ (Diosorea esculenta) gồm các dạng khoai từ
(củ từ), củ từ lông (có loài nhiều hoặc ít lông). Ở Việt Nam, loại có gai (var,
spinosa) phân bố ở Phú Quốc, loại không gai (var, fasiculata) phân bố rộng rãi,
ngoài ra còn có củ từ nước (Dioscorea pierrel) mọc ở các tỉnh miền Đông Nam
Bộ.Khoai từ được dùng làm lương thực, thực phẩm và nó còn là vị thuốc với
nhiều công dụng. Ở Việt Nam, trong số các loại khoai còn được ít nhắc đến
khoai từ nhưng nó được phân bố rải rác ở khắp mọi nơi và được tập trung nhiều
nhất ở vùng trung du và bán sơn địa. Cây khoai từ là cây dễ trồng, chịu nhiệt tốt
và rất ít sâu bệnh tuy nhiên chúng ta vẫn thường bắt gặp trên chi này bệnh thán
thư, loét và đặc biệt là triệu chứng bệnh khảm lá. Bệnh có khả năng truyền bệnh
qua hạt giống với tỷ lệ 1-10%, đây là nguồn bệnh sơ cấp trên đồng ruộng. Ngoài
ra, bệnh có thể lây lan thứ cấp trên đồng ruộng từ cây này sang cây khác qua
vector rệp muội. Cũng giống như tất cả những virus thực vật khác,bệnh khảm
hoàn toàn không gây hại đến sức khoẻ con người và động vật nếu ăn phải cây bị
bệnh, tuy nhiên, chúng lại gây ảnh hưởng khá nhiều đến hình thức, chất lượng
của cây trồng. Tuy nhiên virus gây ra triệu chứng này chưa được xác định và
48

công bố.Xuất phát từ vấn đề nêu trên, được sự phân công của bộ môn Bệnh cây,
khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, dưới sự hướng dẫn của TS.
Nguyễn Đức Huy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đặc
điểm sinh học phân tử của Cucumber mosaic virus trên cây khoai từ”
1.2 Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
- Điều tra mức độ và xác định virus gây triệu chứng khảm lá trên cây
khoai từ
- Nghiên cứu, xác định đặc điểm sinh học và phân tử của CMV bằng lây
nhiễm nhân tạo
1.2.2. Yêu cầu
- Điều tra thành phần bệnh hại trên cây khoai từ tại các tỉnh Hà Nội, Bắc
Giang, Hà Tĩnh , Thái Bình
- Điều tra diễn biến bệnh hại trên cây khoai từ tại các tỉnh Hà Nội, Bắc
Giang, hà Tĩnh , Thái Bình
- Xác định virus bằng kỹ thuật DAS-ELISA và RT-PCR.
- Đánh giá tính gây bệnh của virus bằng phương pháp lây bệnh nhân tạo
- Kiểm tra/ xác định CMV bằng kỹ thuật RT – PCR sử dụng mồi đặc hiệụ

49


Phần 2
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
2.1 Giới thiệu về cây khoai từ
2.1.1 Đặc điểm của cây khoai từ
Cây khoai từ (Dioscorea esculenta) là loại cây leo, có củ sống lâu năm.
Thân tròn mảnh, có gai nhỏ ở gốc, to và cong về phia trên. Khoai từ là cây có củ
mọc thành hình cầu, dạng trứng hay có thùy, nhẵn hay có gai (ở một số giống

mọc hoang), có rễ cứng và biến thành gai. Củ khoai từ có vỏ mỏng, trong có
chất bột dính, màu ngà, củ khoai từ hình bầu dục dài khoảng 15-20 cm, đường
kính 6 – 8cm, trọng lượng trung bình lên tới 0,25 – 1 kg. Lá đơn, mọc so le,
nhọn hay có mũi, dài và rộng khoảng 8cm, gân 9 – 13cm, phiến lá mềm có lông
mi hoặc có khi nhẵn có mép nguyên.Củ là phần được sử dụng của khoai từ.
Thành phần chính của củ tươi là nước chiếm khoảng 2/3 khối lượng củ tươi. Tỷ
lệ chất khô trong củ chiếm khoảng 20 – 30% tùy thuộc vào giống và thời gian
thu hoạch. Hydratcacbon là thành phần chất khô chính của củ, chiếm ¼ khối
lượng củ. Phần lớn hydratcacbon là các hạt tinh bột amylopectin mạch nhánh,
tồn tại trong các tế bào dưới dạng các hạt tinh bột hình elip. Như vậy chúng ta
có thể thấy giá trị dinh dưỡng của củ từ tương đương với củ khoai tây.Ngoài
công dụng làm lương thực, thực phẩm thì khoai từ còn được xuất khẩu. Hiệu
quả kinh tế khoai từ mang lại cao gấp 2 lần so với trồng lúa trên cùng diện tích,
nếu thâm canh tốt thì có thể cho hiệu quả gấp 4 – 7 lần.Thông thường người
nông dân trồng khoai từ vào khoảng tháng 2-4 dương lịch khi bắt đầu có mưa,
và thu hoạch vào khoảng tháng 9 – 11. Nó phát triển tốt nhất tại những nơi có
nhiệt độ ban ngày khoảng 28 - 32 ° C, nhưng có thể chịu đựng được 17 – 45 ° C,
dưới 9° C cây sẽ chết. Lượng mưa trung bình thích hợp khoảng 800 – 2000 mm
nhưng có thể chịu được trong khoảng 600 – 8000 mm. Để đạt năng suất cao nhất
thì thoát nước tốt là yếu tố đáng chú ý nhất. Khoai Từ là một trong số 10 loài
50


quan trọng nhất có giá trị kinh tế thuộc chi Dioscorea, đặc biệt là nguồn thực
phẩm quan trọng đối với các quốc gia có thu nhập thấp và đang phát triển. Khoai
Từ và các loài thuộc chi Dioscorea có ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với người
dân Nigieria và các nước Tây Phi, cung cấp hơn 200 calo/ngày/người cho hơn
150 triệu người ở Tây Phi, nguồn thu nhập quan trọng cho người nghèo ở các
nước Tây và Trung phi. Đồng thời, chúng là cây giàu tinh bột, chế biến được
nhiều món ăn và được trồng quanh năm mang lại nguồn lương thực quan trọng

và an ninh lương thực cho người dân châu Phi vùng cận sa mạc Sahara. Củ
Khoai Từ là nguồn nguyên liệu quan trọng trong công nghiệp dược phẩm và y
học, chất Diosgenin có trong củ Khoai Từ được sử dụng để tổng hợp Cortisone,
Pregnenolone, Progesterone và các sản phẩm steroid khác có hoạt tính estrogen
có tác dụng làm giảm cholesterol trong máu.Chất Diosgenin trong của được sử
dụng để điều trị bệnh phong thấp và đau viêm khớp.Củ Khoai Từ được sử dụng
như một loại thuốc trong y học truyền thống Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản.
Trong Khoai Từ có chứa hợp chất allantoine là một hợp chất hóa học azote có
công thức C4H6N4O3 nguồn gốc hữu cơ hay thực vật. Chất này có nhiều tác dụng
sinh học như chống ung thư, chống tăng sinh, kháng khuẩn, làm lành vết thương
và các hoạt động kháng khuẩn bao gồm cả hoạt động chống oxy hóa và được
dùng trong kỹ nghệ mỹ phẩm...Trong tự nhiên, Khoai Từ tái sinh thông qua hạt
hay đoạn thân tươi hay củ. Nhưng năng suất củ giảm do nhiễm virus và các loài
tuyến trùng, củ bị nhiễm được truyền cho thế hệ sau làm giảm chất lượng củ
.Nhân giống Khoai Từ bằng phương pháp truyền thống đã trở nên phổ biến đối
với hầu hết người nông dân, song kỹ thuật nhân giống trên cho hiệu quả thấp.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một phương pháp nhân giống đem lại hiệu quả
cao mà người nông dân nên áp dụng để tăng năng suất cây trồng.

51


Bảng 2.1 : Thành phần hóa học của một số giống khoai từ ( theo khối lượng
khoai tươi)
Thành phần
Nước
Carbohydrate
Tinh bột
Protein
Chất béo thô

Chất xơ
Khoáng
Photpho
Canxi
VitaminC
Iron
Năng lượng
β-carotene
Vitamin B1
Vitamin B2
Vitamin B3
Vitamin A

Đơn vị
%
%
%
%
%
%
%
Mg
Mg
mg/100g
Mg
Kcal
Μg
Mg
Mg
Mg

Mg

Hàm lượng
65-78,6
22-31
16,7-28
1,1-3,1
<0,1-0,6
1,4-3,8
0,7-2,1
28-52
28-38
2,0-8,2
5,5-11,6
140
5-10
0,05-0,1
0,03-0,04
0,5
0,017

2.1.2 Giá trị dược liệu của cây khoai từ
Khoai từ còn gọi là sơn dược, củ mài, củ từ, khoai mài, hoài sơn…, chẳng
những là một loại thực phẩm quý, còn là loại thực phẩm tư bổ. Phân tích khoa
học cho thấy, khoai từ giàu tinh bột, protein, arginin, lipid, muối vô cơ và nhiều
loại vitamin (như B1, B2, acid nicotinic, acid ascorbic, caroten)…, ngoài ra còn
chứa nhiều chất xơ và thành phần chất niêm dịch.
Khoai từ có thể cung cấp lượng lớn protein niêm dịch cho cơ thể người.
Đây là hợp chất giữa protein và polysacc-harid, có tác dụng bảo vệ sức khỏe cho
cơ thể, có thể phòng tránh lắng đọng lipid ở hệ thống tim mạch, duy trì tính đàn

hồi của
Lipid dưới da, tránh xuất hiện tình trạng béo phì.

52


Hai là, có thể phòng tránh teo rút mô liên kết trong thận và gan, phòng
tránh phát sinh bệnh chất tạo keo duy trì độ hoạt nhuận ở đường tiêu hóa, đường
hô hấp và hốc khớp.
Ba là, chất polysac-harid niêm dịch trong khoai từ sau khi kết hợp với
muối vô cơ có thể hình thành chất xương, giúp xương sụn có độ đàn hồi nhất
định.
Bốn là, enzym tiêu hóa trong khoai từ có thể thúc đẩy phân giải protein và
tinh bột.
Vì vậy, nó là thực phẩm bổ dưỡng cho người suy yếu do nhiều bệnh như
cơ thể hư nhược, tinh thần mệt mỏi, ăn không ngon miệng, tiêu hóa kém, hư lao
ho nhiều, di tinh đổ mồ hôi trộm, phụ nữ bạch đới, bệnh tiểu đường
2.1.3 Sự phân bố số lượng giống khoai từ
Các giống khoai từ, vạc được phân bố rộng rãi trên các vùng miền Bảng
1 cho thấy 102 mẫu giống trong tập đoàn được thu thập từ 7 vùng sinh thái trong
cả nước. Vùng Đông Bắc là vùng thu được số lượng mẫu giống cao nhất (44
mẫu giống chiếm tỷ lệ 43.14%). Khu vực Nam Trung Bộ và Tây Nguyên có số
lượng mẫu giống thu thập ít nhất (01 mẫu giống chiếm tỷ lệ 0.98 %)
Bảng 2.2: Sự Phân bố của các loại giống khoai từ, khoai vạc.
STT
1
2
3
4
5

6
7
8

Vùng
Tây Bắc
Đông Bắc
Châu Thổ Sông Hồng
Bắc Trung Bộ
Nam Trung Bộ và Tây Nguyên
Đông Nam Bộ
Đồng Bằng Sông Cửu Long
Tổng

53

Số lượng giống
14
44
4
29
1
3
7
102

Tỷ Lệ %
13,73
43,14
3,92

28,43
0,98
2,94
6,86
100%


2.3 Giới thiệu về Cucumber mosaic virus
2.3.1 Lịch sử nghiên cứu Cucumber mosaic virus
2.3.1.1 Nguồn gốc của Cucumber mosaic virus
Bệnh khảm do Cucumber mosaic virus (CMV) gây ra là bệnh khá phổ
biến trên nhiều đối tượng cây trồng. Bệnh được công bố đầu tiên vào năm 1916
(Doolittle, 1916) và là một trong những bệnh hại thực vật gây ra bởi virus được
phát hiện sớm nhất.
Trong thời gian đầu, những công cụ để xác định sự tồn tại của virus
chuyên biệt này còn rất hạn chế. Sau đó, bệnh cũng được biết là do Cucumber
mosaic virus gây ra (Kaper và Waterworth, 1981). Cho tới thời điểm hiện tại đã
có rất nhiều dòng CMV được mô tả. Dữ liệu di truyền hiện nay chứa trình tự của
khoảng 60 protein khác nhau cùng với 15 trình tự genome virus hoàn chỉnh.
Chủng CMV gồm 2 nhóm là I và II với khoảng 25% trình tự nucleotit khác nhau
nên virus có khả năng thích ứng cao và tiến hóa lạ thường. Nhóm I được phân
thành IA và IB dựa trên sự khác biệt triệu chứng trên cây đậu đũa do CMV gây
ra, chủng nhóm IA gây triệu chứng khảm hệ thống trên lá còn chủng nhóm IB
gây triệu chứng hoại tử cục bộ trên lá (Thomas A. Zitter và John F. Murphy,
2009). Các nghiên cứu cho thấy rằng virus CMV trên cây khoai từ được lây
nhiễm từ cây khoai lang.
CMV phân bố ở khắp nơi trên thế giới, chủ yếu ở vùng có khí hậu ôn hòa.
Úc, Canada, Pháp, Ấn Độ, Nhật Bản, Triều Tiên, Ma – rốc, New Zealand, Phần
lan, Tây Ba Nha, Mỹ.
2.3.1.2 Phân loại Cucumber mosaic virus

Virus có các tên khác nhau như: banana infectious chlorosis virus, coleus
mosaic virus ( creager, 1945; Holcomb và Valverde, 1991), Cowpea banding
mosaic virus, Cowpea ringspot virus, cucumber virus 1, Lily ringspot virus (
Brierley và Travis, 1958), Pea top necrosis, Peanut yellow mosaic virus,
Southern celery mosaic virus(DooLittle, 1916; Price, 1935; Wellman, 1934),
54


Soybean stunt virus (Hanada và Tochihara, 1982), Spinach blight virus, Tomato
fern left virus, Pea western ringspot virus và ICTV đã chấp nhận với tên là
Cucumber mosaic virus (CMV)
Cucumber mosaic virus thuộc họ Bromoviridae. Họ này bao gồm 5 chi:
Cucumovirus, Alfamovirus, Bromovirus, Ilarvirus và Oleavirus. Trong đó, CMV
là loài điển hình của chi Cucumovirus.
Theo Devergne (1975), các dòng của virus này được biết đến như: ACMV, E-CMV, L-CMV, N-CMV, P-CMV, Z-CMV và WAI/WAII. Dòng này
có 2 nhóm kháng nguyên là ToRS và DLT. RNA3 của tất cả các loài virus trong
chi có thể được trao đổi với nhau trong khi đó RNA1 và RNA2 chỉ có thể trao
đổi trong loài. Những trình tự tương đồng cho thấy virus có quan hệ Brome
Mosaic Virus và trình tự của RNA1 và RNA2 cho thấy có quan hệ với Alfalfa
Mosaic Virus và Tobaco Mosaic Viruses (Lâm Ngọc Hạnh, 2005).
2.3.1.3 Ký chủ của Cucumber mosaic virus
Cucumber mosaic virus có phổ ký chủ rộng, gây hại 1200 loài thực vật
thuộc hàng trăm họ thực vật khác nhau của cây 1 và 2 lá mầm, bao gồm nhiều
loại rau, cây cảnh, cây thân thảo, thân gỗ và bán gỗ (Thomas A. Zitter và John F.
Murphy, 2009).
Một trong số những cây rau cải quan trọng bị ảnh hưởng bởi CMV là ớt
(Capsicum annuum L.), họ bầu bí, cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.). Ở
Hawaii, CMV còn xuất hiện trên một loài cỏ dại có tên Comellina spp. Những
cây ký chủ khác như: dưa chuột, dưa thơm, bí, rau bina, cần tây, cải xoong nước,
củ cải, khoai lang, su su, dưa hấu, bí ngô, bầu, đậu lima, đậu phộng, hành tây, cà

tím, khoai tây, đại hoàng, cà rốt, rau thìa là, rau mùi tây (Chupp and Sherf,
1960), mướp (Huang và cs., 1987), atiso (Chabbouh Cherif, 1990), cây khoai từ.
Ký chủ là cây cảnh bao gồm: Thúy cúc Trung Quốc, hoa cúc, cây phi yến,
hoa sô đỏ, cây phong lữ, lily, lay ơn, cây vòi voi, lục bình, phi yến, hoa huệ, cúc
vạn thọ, rau muống, cây sen cạn, cây dừa cạn, dã yên thảo, loại hoa có nhiều
55


màu sắc, hoa mõm chó, tulip và cây cúc zinnia ( Chupp and Sherf,1960; Agrios,
1978).
2.3.1.4 Cấu trúc của Cucumber mosaic virus
Dưới kính hiển vi điện tử CMV có dạng hình cầu, đường kính 28-30 nm.
Virion của CMV không có vỏ. Có nhiều loại virion nhưng kích thước tương đối
giống nhau. Trọng lượng phân tử là 5,0-6,7.106 Da.

Hình 2.1. Cấu trúc CMV
(Thomas J. Smith và CTV, 2000)
Thành phần cấu tạo
 Acid nucleic
Sợi đơn RNA thông2 tin (mRNA), chiếm khoảng 18% trọng lượng phân
tử. Tỉ lệ G: A: C: U khoảng 24: 23: 23: 30.Theo Thomas A. Zitter và John F.
Murphy (2009), CMV là một virus đa thành phần với 3 phân tử RNA lần lượt là
RNA 1, RNA 2, RNA 3.Ngoài ra CMV có một phân tử RNA subgenomic (hình
thành trong quá trình tái sinh virus) không cần cho quá trình gây bệnh gọi là
RNA 4. RNA 1 chứa khoảng 3350 nucleotide, mã hóa cho protein 1a (khoảng
111kDa). RNA 2 chứa khoảng 3050 nucleotide, mã hóa trực tiếp protein 2a
(97kDa), RNA 4A chứa 691 nucleotide, có nguồn gốc từ RNA 2 mã hóa cho
protein 2b (15kDa). RNA 3 chứa 2200 nucleotide, mã hóa trực tiếp protein di
chuyển (30kDa) và RNA 4 chứa 1034 nucleotide mẫ hóa protein vỏ (24.5kDa).
Protein 1a, 2a kết hợp với những protein của ký churtaoj thành enzyme

56


“replicase” của CMV. Protein 2b liên quan đến sự ức chế đáp ứng kháng nhiễm
của ký chủ. Proten 3a là protein di chuyển của virus, protein 3b là protein vỏ và
nó chứa những yếu tố quyết sự lan truyền bởi rệp. Cả hai loại protein 3a và
protin vỏ đều cần thiết cho sự di chuyển ở khoảng cách dài.
Virus cũng chứa các RNA khác có kích thước nhỏ hơn ở mức độ thấp, đó
là RNA 4A, RNA 5 và RNA 6. RNA 4A thu được ở dòng Q, có kích thước 682
nucleotide, có nguồn gốc từ RNA 2, mã hóa cho gen 2b. RNA 5 thu được ở
dòng Q, có kích thước 309 nucleotide, có nguồn gốc từ đầu 3’ không mã hóa của
RNA 2 và RNA 3. RNA 6 có kích thước 79-80 nucleotide có nguồn gốc từ
tRNA của cây và những đoạn RNA của CMV. Mỗi RNA 5 và RNA 6 chiếm 12% RNA tổng số của virus (Huỳnh Vĩnh Khang, 2006).
Tất cả 3 phân tử RNA của CMV đều có đầu 5’ chứa mũ 7-methyl
guanosine được gọi là protein liên kết với genome (VPg), trình tự mũ này là
m7G5'ppp5 (trên cả 4 RNA). Đầu 3’ của genome không có đuôi poly A, đầu 3’
của tất cả các RNA của CMV đều có cấu trúc giống tRNA.

Hình 2.2 Hệ gen 3 RNA mã hóa cho 5 khung đọc mở hay mã hóa cho 5
protein (Courtesy J. F. Murphy) (trích dẫn từ Thomas A. Zitter và John F.
Murphy, 2009)

57


Protein
Virion chứa 82% protein. Phần vỏ chứa 180 tiểu đơn vị protein tương
đồng, có khối lượng khoảng 24.500. có thể thu protein vỏ bằng cách phá vỡ hạt
virus và kết tủa RNA với LiCl.
2.3.1.5 Tính chất lý hóa của Cucumber mosaic virus

Virion có tỷ trọng nổi trong CsCl là 1,367 g cm -3 (sau khi cố định với
formaldehyde). Hệ số lắng là 99 S 20w. Điểm đẳng điện ở pH là 5,5 (chủng Q). Tỷ
lệ A260/A280 là 1.7, TIP là 55-70°C, LIV là 1-10 ngày. Sự lây nhiễm vẫn duy
trì hoặc giảm đi khi phân giải với protease, nhưng vẫn duy trì khi xử lý với
phenol hoặc chất tẩy rửa (ICTVdB - The Universal Virus Database, 2006).
2.3.1.6 Sự truyền bệnh của Cucumber mosaic virus
Virus truyền từ cây bệnh sang cây khỏe bằng tiếp xúc cơ học thông qua
vết thương cơ giới. Theo Thomas A.Zitter và John F. Murphy (2009), để nâng
cao hiệu quả lây nhiễm hơn người ta cho vào đệm phosphate với Ph 7.0 bằng
một chất khử Natri sulphite 10mM, chất khử này có tác dụng làm ổn định virus
trong quá trình nghiền dịch và làm tăng hiệu quả hoạt động của virus hơn so với
dụng dịch đệm phosphate thường.
Virus được lây truyền bởi hơn 80 loài rệp muội theo kiểu lan truyền
không bền vững. Hai loại rệp muội quan trọng cho quá trình truyền bệnh pải kể
đến rệp đào (Myzus persicae) và rệp bông (Aphisgossypii). Theo kiểu truyền
không bền vững này côtn rung có thời gian chích nạp ngắn, thường ít hơn 1
phút, sau đó khả năng truyền bệnh giảm xuống sau khoảng 1 phút và mất
khoảng sau vài giờ.
Theo Frank Henry (2011), DEPI khảo sát khu vực trồng trọt Wimmera
qua một

số năm, các vecto rệp muội truyền CMV đã tìm thấy như

Acyrthosiphon kondoi, Aphis craccivora, Aulacorthum solani, Myzus ornatus,
Myzus persicae, Brevicoryne brassicae, Hypermyzus lactucae, Uroleocon
sonchi. Theo Thomas A. Zitter và John F. Murphy (2009), trên đậu que thì các
58


vecto quan trọng nhất là rệp vừng đậu nành ( Aphis glycines) gần đây đã được

giới thiệu ở Hoa Kỳ, rệp cỏ ba lá màu vàng (Thrioaphis trifolii) và ít quan trọng
hơn là rệp đậu Hà Lan ( Acryrthosiphon pisum). Mức độ bệnh phụ thuộc vào số
lượng rệp có sẵn để truyền virus vào mùa xuân hoặc mùa thu của vùng trồng.
Nếu vào mùa xuân hoặc mùa thu mát mẻ và ẩm ướt số lượng rệp giảm và virus
lây lan ít ngược lại vào mùa thu ấm áp mưa ít các quần thể rệp tăng nhanh chóng
trên các cây trồng đã bị lây nhiễm CMV lâu năm lây lan nhanh sang cây trồng
nhỏ. Trong trường hợp này, tỷ lệ lây nhiễm có thể lên tới 100 % và các cây
trồng có thể bị bỏ hoang. Tính trung bình, mức độ thiệt hại năng suất phổ biến từ
10% - 20% và trong một số trường hợp các cây trồng vẫn có thể thu hoạch
nhưng sản phẩm nông nghiệp có chất lượng kém hơn.
Phạm vi kí chủ CMV rất rộng nên nguồn bệnh tồn tại ở hoa, cây trồng
khác và cỏ dại lâu năm. Các loại cỏ dại chứa CMV trong rễ, củ qua suốt mùa
đông và mùa xuân rệp muội sẽ truyền bệnh cho cây khỏe. Các loại cỏ dại có thể
kể đến như Asclepias syriaca, Barbarea vulgaris, Rorippa islandica, Linaria
vulgaris, chúng được chứng minh là nơi chứa nguồn bệnh quan trọng gây ra
nhiễm CMV trên rau diếp ở ngoại ô New York. Cây tràng sao cũng được chứng
minh rằng mang nguồn bệnh CMV quan trọng gây hại trên rau diếp ở Anh
(Thomas A.Zitter và John F. Murphy (2009),) điều đặc biệt là cỏ dại nhiễm
CMV không xuất hiện triệu chứng, virus được truyền qua ít nhất 10 loại dây tơ
hồng và virus có thể tái bản trong dây tơ hồng.
Virus truyền qua hạt giống, phổ biến trong 19 loài thực vật, các họ thực
vật thường bị nhiễm CMV qua hạt là Amaranthaceae (syn. Chenopodiaceae)
( cải bó xôi), Brassicaceae, Fabaceae (syn. Leguminosae) ( đậu, đậu xanh Ấn
Độ, đậu đũa, đậu lăng, đậu lapi). Theo Frank Henry (2011), tại bang Victoria,
các DEPI khảo sát sự truyền bệnh CMV qua hạt giống cho thấy rằng trong 7%
mẫu hạt đậu lăng và 9% mẫu hạt đậu tằm thì có đến 0,2% đậu lăng và 0,1 % đậu
tằm bị nhiễm CMV. Ở Tây Úc, thí nghiệm truyền qua hạt giống cho thấy tỷ lệ
59

lây truyền của CMV lên đến 1% trong đậu lăng, 2% trong đậu xanh và 0,8%
trong đậu narbon, và lần đầu tiên cho thấy CMV là truyền qua hạt giống đậu.
2.3.1.7 Triệu chứng bệnh do Cucumber mosaic virus gây ra
Vết bệnh đầu tiên là những vết khảm đốm màu vàng nhạt xen kẽ các vết
xanh đậm, thùy lá ngừng phát triển, lá nhỏ hẹp, xoăn cong. Cây bệnh kém phát
triển, thân mảnh. Quả bị bệnh thường nhỏ, biến dạng, trên vỏ quả có các vết
đậm, nhạt loang lổ. Trên cây bí xanh, bầu, mướp CMV cũng gây ra triệu chứng
tương tự.
Triệu chứng bệnh trên cây khoai từ: Triệu chứng chỉ xuất hiện trên lá gây
ra khảm loang lổ xanh đậm xen kẽ xanh nhạt, nếu bệnh bị nặng sẽ gây ra lá biến
dạng và cây không phát triển bình thường.
2.3.1.8 Biện pháp kiểm soát
- Sử dụng giống kháng bệnh, giống sạch bệnh từ nguồn nuôi cấy mô và
xử lý nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy mô có thể hạn chế được virus gây bệnh.
- Luân canh với cây trồng không là ký chủ của bệnh.
- Nhổ bỏ cây bệnh.
- Làm sạch cỏ dại xung quanh ruộng.
- Phòng trừ rệp bằng thuốc hóa học và bằng con đường sinh học.
- Do khả năng sinh sản của rệp rất lớn nên rất dễ xuất hiện rệp kháng
thuốc. Vì thế, sau 3 ngày phun thuốc phải kiểm tra lại, nếu thấy số lượng rệp
không giảm thì phải thay thuốc khác.
- Khử trùng dụng cụ, phương tiện thu hái, hạn chế vết thương xây sát
trong quá trình chăm sóc.
- Bón phân cân đối, chăm sóc để cây sinh trưởng tốt, bảo vệ cây, tránh
nhiễm vào giai đoạn cây con.

60


2.4 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về Cucumber mosaic virus trong

thời gian gần đây
2.4.1 Cucumber mosaic virus
2.4.1.1 Tình hình nhiên cứu ngoài nước
Ki Hyun Ryu và cs vào năm 1998 đã chứng minh rằng protein vỏ của
CMV quy định dãy ký chủ của CMV khi nhiễm vào ngô.
Năm 2006, Neeraj Verma và cs đã chứng minh trình tự protein vỏ cho
thấy phân lập CMV từ hoa phong lữ (Pelargonium spp.) thuộc nhóm II.
Khalid Pervaiz Akhtar và cs năm 2008 đã lây truyền CMV qua rệp đào
(Myzus persicae) trên cà chua tại vùng Faisalabad của Pakistan và kiểm tra lại
bằng kỹ thuật RT-PCR đã phát hiện ra rằng CMV thuộc nhóm IA.
Bahadra Murthy Vemulapati và cs năm 2009 đã nghiên cứu trình tự gen
protein vỏ chứng minh rằng CMV lây nhiễm ớt cựa gà (Capsicum annuum L.) ở
Ấn Độ thuộc nhóm IB.
Vào năm 2010, Dheepa và cs đã dùng kỹ thuật DAC-ELISA để kiểm tra
việc truyền CMV vào chuối bởi rệp và cơ học.
Heiko Ziebell và cs năm 2011 đã chứng minh protein 2b có thể ảnh hưởng
gián tiếp tới sự truyền của CMV thông qua rệp muội.
Mùa hè năm 2012, Mehdi Safaeizadeh và cs đã dùng kỹ thuật DASELISA để thử các virus khác nhau trên 4 mẫu lá cây Ibicella lutea ở miền
Varamin thuộc vùng Tehran của Iran và tất cả các mẫu này đều biểu hiện dương
tính với CMV và âm tính với các virus khác. Sau đó, sự xuất hiện CMV còn
được kiểm chứng bằng các thí nghiệm lây trên các cây thân thảo khác và bằng
cả kỹ thuật RT-PCR. Kết quả cho thấy sự kiểm chứng này là đúng và còn phát
hiện ra CMV thuộc nhóm IA. Đây là báo cáo đầu tiên về sự xuất hiện CMV trên
cây Ibicella lutea tại Iran.

61


Tháng 7, năm 2012, triệu chứng khảm sọc và đốm bất thường được Rong
Wang và cs tìm thấy trên lá ngô ở Bắc Kinh – Trung Quốc. Tác nhân gây bệnh

được xác định là CMV dựa trên kỹ thuật RT-PCR, Elisa, phương pháp Western
Blot và thực hiện theo quy tắc Koch. Chủng virus này có tên là ZMBJ – CMV.
Trình tự đầy đủ của RNA3 của ZMBJ – CMV đã được xác định và đồng nhất
với chủng K – CMV (95.3%) và SD – CMV (94.96%). Qua phân tích sự phát
sinh chủng loài cho thấy ZMBJ – CMV được nhóm vào K – CMV vầ SD –
CMV trong nhóm phụ IB. Đây là báo cáo đầu tiên về sự lây nhiễm và phân tích
sự phát sinh củng loài của CMV trên ngô tại Trung Quốc.
Kouakou Théodore Kouadio và cs năm 2014 đã viết một bản báo cáo
đầu tiên về sự xuất hiện của satRNA kết hợp với CMV phân lập từ chuối
(Musa sp.) tại Bờ Biển Ngà.
2.4.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Nói chung, các nghiên cứu về bệnh virus Cucumber mosaic virus tại Việt
Nam còn khá mới, chỉ có một số các nghiên cứu sau đây:
Nguyễn Ngọc Bích, trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh năm
2003 đã bước đầu nghiên cứu một số bệnh virus chính trên vùng thuốc lá tỉnh
Tây Ninh. Dùng DAS-ELISA để chẩn đoán một số virus trên thuốc lá như
TSWV, CMV, TMV đồng thời điều tra tình hình bệnh virus trên địa bàn tỉnh
Tây Ninh. Kết quả cho thấy các virus này đang phát triển khá mạnh ở vùng
thuốc lá tỉnh Tây Ninh.
Lâm Ngọc Hạnh, trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh vào năm
2005 đã tiến hành đánh giá tình hình nhiễm bệnh virus TMV, CMV, TSWV trên
cà chua ở tỉnh Lâm Đồng, sử dụng kỹ thuật DAS-ELISA và xây dựng quy trình
chẩn đoán TMV bằng kỹ thuật RT-PCR.
Huỳnh Vĩnh Khang, trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh vào
năm 2006 đã tiến hành nghiên cứu một số virus (TMV, CMV) gây bệnh trên cây

62


Ớt tại huyện Củ Chi, TP. Hồ Chí Minh bằng kỹ thuật ELISA và xây dựng quy

trình phát hiện CMV bằng kỹ thuật RT-PCR.
Nhóm các nhà khoa học thuộc Viện Công nghệ sinh học (Viện Khoa
học và Công nghệ Việt Nam) năm 2007-2008, đã ứng dụng thành công kỹ thuật
di truyền RNAi trong nghiên cứu tạo cây trồng chuyển gen kháng bệnh
virus. Tạo cây thuốc lá mang cấu trúc RNAi của gen mã hóa protein vỏ virus đó
là đề tài đã thiết kế thành công 6 cấu trúc RNAi, vượt mức dự kiến 3 cấu trúc.
Bao gồm 3 cấu trúc RNAi đăng ký (CMV-CPi, PVY-CPi và PRSV-CPi) và 3
cấu trúc vượt mức (TbLCV-CPi, TMV-CPi và TMV-CMV-CPi). Trong đó, cấu
trúc đa đoạn RNAi TMV-CMV-CPi là sự kết hợp hai đoạn gen CPi của virus
TMV và CMV với mục đích có khả năng tạo cây kháng được cả hai virus này
cùng lúc; tạo được vài trăm dòng thuốc lá chuyển gen K326 ở thế hệ T0 mang
cấu trúc RNAi đã thiết kế ở trên, những dòng T0 đã được chuyển ra nhà kính để
kiểm tra. Kiểm tra tính kháng virus bằng gây bệnh nhân tạo ở thế hệ T0 thu
được có tỷ lệ kháng (số dòng kháng hoàn toàn/số dòng kiểm tra) virus CMV là
70,9% (100/141), PVY là 84,1% (58/69), TMV là 74,5% (70/94) và đồng thời
hai loại virus TMV và CMV là 70,8% (34/48).
Phạm Thị Vân và cộng sự tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam, năm 2009 đã xác định virus gây bệnh khảm dưa chuột
(Cucumber mosaic virus) trên cây thuốc lá tại Cao Bằng và Hà Tây thông qua
tách dòng và giải trình tự gien mã hóa protein MP và CP. Kết quả cho thấy, đã
tách dòng và xác định thành công trình tự đoạn gen mã hóa cho protein MP và
CP của hai thể phân lập CMV. Hai đoạn gen này có độ dài và mã số đăng ký
trong Ngân hàng gien quốc tế là 1913 nucleotit, AM048831 (Hà Tây) và 1908
nucleotit, AM048830 (Cao Bằng). Đoạn gien mã hóa cho protein MP và CP của
hai thể phân lập có kích thước tương ứng là 840 và 657 nucleotit. Phân tích cây
phân loại cho biết hai thể phân lập CMV Cao Bằng và Hà Tây thuộc nhóm IB.

63

Phần 3
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu
+ Bệnh khảm lá khoai từ ở một số tỉnh phía (Hà Nội, Hưng Yên, Bắc
Giang, Thái Bình, Hà Tĩnh )
+ Nghiên cứu Cucumber mosaic virus trên cây khoai từ
3.1.2 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu
3.1.2.1 Vật liệu:
- Một số giống khoai từ đang được trồng ngoài sản xuất
- Một số cây chỉ thị: Cây họ rau muối (Chenopodiaceae) như
Chenopodium amaranticolor, Chenopodium quinoa, họ cà (Solanaceae) như
Nicotiana banthamiana, Nicotiana tabacum var. Xanthi.
3.1.2.2 Dụng cụ
- Dụng cụ thu và điều tra mẫu: bao nilon, máy chụp ảnh, lọ chứa
silicagen.
- Dụng cụ nghiền mẫu: chày, cối sứ, ống eppendorft 1.5 ml, 0.5ml
- Ống đong 10 - 1000 ml.
- Bình thủy tinh loại 50 – 1000ml.
- Pipet tự động một đầu côn: 10-20 μl, 100 μl, 200 μl …
- Bản Elisa: bằng nhựa (polystyrene), 96 giếng, liên kết không đặc hiệu
các loại protein.
- Máy đọc Elisa: 1 loại thiết bị so màu vị phiến nhằm lượng hóa màu
phản ứng.
- Chất nền: nhiều loại, tùy thuộc emzyme.
- Kháng thể các loại.

64

- Enzyme: nhiều loại, cần có chất tương ứng, phổ biến nhất là alkaline
phosphatase (cơ chất tương ứng là NPP).
- Các loại dung dịch đệm: Đệm nghiền mẫu (PBS – T – 2% PVP), đệm
pha kháng thể (đệm carbonate), đệm rửa (PBS - Tween), đệm pha chất nền (cơ
chất) (đệm Substrate).
3.1.2.3 Hóa chất
Bột cacboradum, nước cất, silicagen.
Các hóa chất pha dung dịch đệm lây: đệm Phosphate pH 7.0 (0.01 M)
Cách chuẩn PPB buffer: Cân 0.87 g K2HPO4 pha với 500 ml nước cất và
0.69 g KH2PO4 với 500 ml. Rồi sau đó trộn đều để được 1000 ml dung dịch đệm
Phosphate pH 7.0. Đem hấp 15 phút tại 1.5 atm rồi để nguội đem giữ trong tủ
lạnh 4oC.
 Lây nhiễm nhân tạo: bột Carborundum 600 mesh, hoá chất pha đệm
(K2HPO4, KH2PO4, Na2SO3, nước cất).
 Kỹ thuật RT-PCR:
Chiết RNA tổng số từ mô cây: đệm CATB (Cetyl trimethyl amoni
bromua), LiCl2 10M, Chloroform, Isoamylalcohol, β-Mercaptoethanol (BME),
Ethanol 70% (cồn 70%).
Phản ứng RT-PCR: nước cất, GoTaq Mix (2x) (đệm PCR có sắn taq,
dNTPs), cặp mồi chung cho vùng gene CI (mồi xuôi dòng, mồi ngược dòng), MMuLV (enzyme phiên mã ngược xúc tác phản ứng tổng hợp sợi cDNA đầu tiên
từ RNA và tổng hợp chuỗi DNA đầu tiên).
Điện di agarose: agarose, nước cất, đệm TAE (Tris, acetic acid, EDTA).
Tinh sạch DNA virus: sử dụng bộ kit chiết thương mại của hãng gồm:
đệm Binding (Binding Buffer), đệm rửa (Wash Buffer), đệm Elution.
 Bảo quản mẫu: silica gel.

65