Phân lập tuyển chọn vi sinh vật liên kết hải miên có hoạt tính đối kháng với một số vi sinh vật kiểm định

Viện đại học Mở Hà Nội

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi lời cám ơn tới toàn bộ ban giám hiệu Viện Đại
học Mở Hà Nội, đặc biệt là các thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học đã
dạy dỗ em trong suốt 4 năm học tại trường, trang bị cho em nền tảng kiến thức
khoa học và tạo điều kiện tốt nhất cho em được làm bài báo cáo tốt nghiệp
này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến, Trung tâm Sinh học
phân tử – Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung – Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam và PGS.TS Phạm Việt Cường, Viện trưởng Viện Nghiên cứu
Khoa học Miền Trung– Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam và
NCS Trần Thị Hồng, người đã truyền cho em phương pháp học tập và nghiên cứu
khoa học, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên
cứu vừa qua.
Đồng thời, em cũng gửi lời cám ơn tới các cô chú, các anh chị, các bạn trong
Trung tâm Sinh học phân tử – Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung đã giúp đỡ
em rất nhiều trong thời gian thực tập.
Cuối cùng, em xin gửi tới gia đình, người thân, bạn bè lời cám ơn sâu sắc vì
đã luôn giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian học tập.
Sinh viên
Nguyễn Thị Mai Anh

Nguyễn Thị Mai Anh

Pagei


Viện đại học Mở Hà Nội

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................................................i
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................................................ v
DANH MỤC CÁC BẢNG ..........................................................................................................................vi
LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................................... 4
1.1. Tổng quan về hải miên. ....................................................................................................................... 4
1.1.1. Khái niệm về Hải miên ....................................................................................................................... 4
1.1.2. Đặc tính hóa học của hải miên. .......................................................................................................... 4
1.2. Vi sinh vật liên kết hải miên. ............................................................................................................... 5
1.3. Chất kháng sinh. .................................................................................................................................. 6
1.3.1. Khái niệm về chất kháng sinh. ........................................................................................................... 6
1.3.2. Lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh. ................................................................................................. 7
1.3.3. Sự hình thành chất kháng sinh ở vi sinh vật. .................................................................................... 9
1.3.4. Các nhóm kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật .......................................................................... 10
1.4. Khái quát về một số vi sinh vật gây bệnh ........................................................................................ 10
1.4.1. Escherichia Coli ................................................................................................................................ 10
1.4.3. Bacillus subtilis ................................................................................................................................. 15
1.4.4. Candidaalbicans. ............................................................................................................................... 18
1.4.5. Aspergillus niger ............................................................................................................................... 20
1.5. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật liên kết hải miên ngoài nước. .................................................... 22
1.6. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật liên kết hải miên trong nước. .................................................... 25
2.1.Đối tượng nghiên cứu, vật liệu nghiên cứu, hóa chất và thiết bị ...................................................... 27
Nguyễn Thị Mai Anh

Pageii


Viện đại học Mở Hà Nội
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................................................... 27

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................................................... 27
2.1.3 Hóa chất, thiết bị và môi trường nuôi cấy......................................................................................... 27
2.1.3.3. Môi trường nghiên cứu. ................................................................................................................. 28
2.2 . Phương pháp nghiên cứu. ............................................................................................................... 34
2.2.1. Phương pháp phân lập vi sinh vật liên kết hải miên ....................................................................... 34
2.2.3. Phương pháp nhuộm Gram .............................................................................................................. 35
2.2.4. Phương pháp sinh học phân............................................................................................................. 36
2.2.4.1. Quy trình tách chiết ADN genom vi khuẩn................................................................................... 36
2.2.4.6 . Xác định trình tự nucleotit của gen ............................................................................................. 41
2.2.4.7. Xử lý trình tự ADN và phân tích số liệu bằng phần mềm máy tính. ........................................... 42
CHƯƠNG 3 : KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN ........................................................................................... 43
3.1 Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật liên kết hải miên có hoạt tính đối kháng một số VSV kiểm
định ............................................................................................................................................................. 43
3.1.1. Kết quả phân lập vi sinh vật liên kết hải miên ................................................................................. 43
3.1.2. Kết quả tuyển chọn vi sinh vật liên kết hải miên có hoạt tính đối kháng với một số vi sinh vật
kiểm định ..................................................................................................................................................... 46
3.2.1 Tách ADN genome ............................................................................................................................. 50
3.2.2 Nhân gen 16S ADN riboxom ............................................................................................................. 51
3.2.3 Giải trình tự gen của các chủng vi khuẩn nghiên cứu..................................................................... 52
Chương 4: Kết luận và khuyến nghị ........................................................................................................ 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................................................... 59
Tài liệu tiếng Việt ....................................................................................................................................... 59
Tài liệu tiếng Anh:...................................................................................................................................... 59

Nguyễn Thị Mai Anh

Pageiii


Viện đại học Mở Hà Nội

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

VSV

Vi sinh vật

DNA

Axit deoxyribonucleotit

ARN

Axit ribonucleotit

CKS

Chất kháng sinh

Agar

Agarose

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

PCR

Polymerase Chain Reaction

SDS

Sodium dodecyl sulfate

UV

Ultraviolet

Gr+

Gram dương

Gr_

Gram âm

Kb

Kilobase

Bp

Base paire

E.coli

Escherichia coli

VP

Vibrio parahemotycus

B.sutilis

Bacillus sutilis

A.niger

Aspergillus niger

CA

Candida albicans

Nguyễn Thị Mai Anh

Pageiv


Viện đại học Mở Hà Nội
VK

Vi khuẩn

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1.Hình ảnh Hải Miên..............................................................................4
Hình1.2.AlexanderFleming.................................................................................7
Hình1.3.E.coli.....................................................................................................11
Hình1.4.Vibrioparahaemolyticus.....................................................................13

Hình1.5.Bacillussubtilis.......................................................................................6
Hình1.6.Candidaalbicans..................................................................................18
Hình1.7.Aspergillusniger...................................................................................21
Hình2.1.Sơ đồ phảnứngPCR.............................................................................39
Hình3.1. Hình ảnh phân lập vsv trên 1 số môi trường nuôi cấy....................46
Hình 3.2. Hình ảnh đối kháng của một số chủng vsv.................................... .49
Hình 3.3.Hình thái tế bào của 2 chủng đối kháng V4HM11 Ma và V5HM9
Ma........................................................................................................................49
Hình3.4.ADN tổng số của V4HM11 Ma vàV5HM9Ma......................................51
Hình3.5.Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S-rRNA của 2 chủng nghiên cứu
..............................................................................................................................52
Hình3.6. Kết quả so sánh trên Blast của chủngV4HM1Ma.............................53
Hình 3.7. Kết quả so sánh trên Blast của chủng V5HM9 Ma..........................54

Nguyễn Thị Mai Anh

Pagev


Viện đại học Mở Hà Nội

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1.: Tên hóa chất và hãng sản xuất sử dụng trong thí nghiệm...........27
Bảng 2.2.Tên thiết bị máy móc và hãng sản xuất sử dụng.............................28
Bảng 2.3: Trình tự và thông số cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR cho vi
khuẩn..................................................................................................................38
Bảng 2.4.: Thành phần phản ứng PCR cho vi khuẩn....................................40
Bảng 3.1. Hình ảnh phân lập vsv trên một số môi trường nuôi cấy..............43
Bảng 3.2.Khả năng đối kháng một số nguồn bệnh nấm của các chủng vk...46
Bảng 3.3.Hình thái tế bào của 2 chủng đối kháng V4HM11 Ma và V5HM9

Ma........................................................................................................................49
Bảng 3.4.Kết quả xác định tỷ lệ A260/A280 và nồng độ ADN (µg/ml)
của 2 chủng nghiên cứu.....................................................................................50
Bảng 3.5. Kết quả nhận dạng 2 chủng vi sinh vật nghiên cứu sau khi so sánh
bằng BLAST......................................................................................................53

Nguyễn Thị Mai Anh

Pagevi


Viện đại học Mở Hà Nội

Nguyễn Thị Mai Anh

Pagevii


LỜI MỞ ĐẦU
Việt Nam ta nằm trong khu vực nhiệt đới cận xích đạo, có khí hậu nóng
ẩm, mưa nhiều, độ ẩm cao (khoảng trên 80%), nên nước ta được thiên nhiên
ban tặng một hệ động thực vật đa dạng và phong phú với hàng ngàn loài khác
nhau. Nước ta có bờ biển trải dài, có khí hậu thuận lợi tạo điều kiện phát triển
cho nhiều loài hải miên. Các loài hải miên có vai trò rất quan trọng trong các
ngành nghiên cứu khoa học. Nhiều loài có các chất có hoạt tính sinh học giá
trị làm thuốc chữa bệnh như ung thư, kháng khuẩn, khử độc... Gần đây loài
sinh vật biển này đặc biệt được chú trọng các ngành khoa học vật liệu và
công nghệ sinh học... Trên thế giới, các nhà khoa học đã rất chú ý đến hải
miên và coi đây là một đối tượng nghiên cứu thú vị với nhiều hoạt chất sinh
học được phát hiện.

Hải miên được biết là vật chủ của cộng đồng vi sinh vật lớn và vai trò của
những vi sinh vật này thay đổi theo nguồn dinh dưỡng và sự cộng sinh, hỗ sinh
với hải miên. Chức năng liên đới của vi khuẩn liên kết với hải miên gồm thu
dinh dưỡng, ổn định khung hải miên, xử lý (processing) chất thải trao đổi chất và
sản sinh các chất trao đổi thứ cấp. Có giả thuyết là các vi sinh vật biển liên đới
với hải miên là các nhà sản xuất gốc các hợp chất hoạt tính sinh học. Bằng chứng
thí nghiệm đầu tiên ủng hộ giả thuyết này là của Faulkner và cs, xác định vị trí
của các sản phẩm tự nhiên trong vi sinh vật liên kết hải miênTheonella
swinho,ei. Với mục đích này, quần thể tế bào được tách bằng ly tâm và nghiên
cứu bằng hóa học. Bằng cách đó đã có thể định vị được cytotoxic macrolide
swinholide A và peptide theopalauamide trong vi khuẩn đơn bào dị dưỡng và vi
khuẩn sợi dị dưỡng, tương ứng (Thomas et al., 2010; Penesian et al., 2011).

Nguyễn Thị Mai Anh

Page 1


Việc sử dụng kháng sinh không đúng cách và thiếu kiểm soát làm xuất
hiện sự kháng thuốc của các nguồn bệnh, và nó trở thành vấn đề sức khỏe chính
trên toàn thế giới. Cùng với sự phát triển của xã hội và những thay đổi sinh thái,
các bệnh truyền nhiễm xảy ra và tái xảy ra đã ảnh hưởng cực mạnh lên toàn xã
hội. Với khả năng tiến hóa của nguồn bệnh, các bệnh truyền nhiễm mới và các
chủng kháng thuốc càng làm cho vấn đề trở nên trầm trọng hơn.
Sự phát tán rộng rãi của vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc và sự cần thiết
ngày càng tăng đối với các phân tử có hoạt tính sinh học với các đặc tính dược
học mới hoặc cải thiện thúc đẩy sự quan tâm tới việc phát hiện các chất kháng
sinh mới. Hiện nay, các phương pháp truyền thống để tìm các loại thuốc mới
gồm nuôi cấy vi sinh vật đất không còn triển vọng, đó là do tỉ lệ tái phát hiện các
kháng sinh đã được biết cao, chiếm tới 99,9%.

Đã có báo cáo cho thấy tỉ lệ vi sinh vật liên kết với động vật không xương
sống ở biển có hoạt tính đối kháng vi sinh vật cao hơn từ các nguồn khác.
Ở Việt Nam, một số nghiên cứu về thành phần hải miên ở vịnh Hạ Long,
Nha Trang cho thấy thành phần loài của chúng rất đa dạng , một số công bố về
tách chiết các chất có hoạt tính sinh học từ hải miên biển Việt Nam. Những
nghiên cứu về vi sinh vật liên kết động vật biển nói chung và hải miên nói riêng
chưa được chú ý. Đến nay chỉ có một số công trình về phân lập và xác định hoạt
tính sinh học của vi sinh vật biển của các nhà khoa học trong nước .
Xuất phát từ ý nghĩa tiễn đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Phân lập tuyển
chọn vi sinh vật liên kết hải miên có hoạt tính đối kháng với một số vi sinh
vật kiểm định”.
Mục tiêu đề tài:
- Tuyển chọn được một số chủng vi sinh vật liên kết với hải miên có hoạt tính
kháng với một số vi sinh vật kiểm định(E.coli, V.parahemolyticus, B.subtillis,
C.albicans, A.niger).
Nguyễn Thị Mai Anh

Page 2


- Định danh 1-2 chủng vi sinh vật liên kết với hải miên có hoạt tính đối kháng
mạnh nhất.
Nội dung nghiên cứu:
- Phân lập vi sinh vật liên kết hải miên
- Sàng lọc hoạt tính đối kháng với một số vi sinh vật kiểm định(E.coli,
V.parahemolyticus, B.subtillis, C.albicans, A.niger).
- Định danh 1-2 chủng vi sinh vật có hoạt tính cao nhất

Nguyễn Thị Mai Anh

Page 3


1.1.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Tổng quan về hải miên.

1.1.1. Khái niệm về Hải miên
Hải miên là động vật thân lỗ hay còn gọi là bọt biển là một nghành động vật
đa bào nguyên thủy. Thường sống dưới biển có cấu trúc tế bào tách biệt. Cơ thể
động vật thân lỗ có hình cốc gồm các tế động vật đa bào sớm nhất, phát triển từ
các tập đoàn tế bào. Đây là ngành động vật đơn giản và nguyên thủy nhất, có
những mô khác nhau nhưng không có cơ, hệ thần kinh, cơ quan bên trong, hay
khả năng vận động. Chúng đã từng được xem là đã tách ra từ các động vật khác
trước đây. Chúng thiếu tổ hợp phức tạp được tìm thấy trong hầu hết các ngành
khác. Các tế bào của chúng khác biệt nhưng trong hầu hết các trường hợp không
được tổn chức thành các mô riêng biệt.

Hình1.1. Hình ảnh hải miên

1.1.2. Đặc tính hóa học của hải miên.
Hai thành phần hóa học chủ yếu của loài hải miên là các axit béo không no
và các hợp chất steroit. Trong đó đáng quan tâm nhất là các hợp chất béo không

Nguyễn Thị Mai Anh

Page 4

no bị brom hóa. Các hợp chất này thể hiện nhiều đặc tính quý báu như : kháng
vi sinh vật, gây độc tế bào, một số còn ức chế enzyme HIV protease.
1.2.

Vi sinh vật liên kết hải miên.
Rất nhiều hải miên có cộng đồng vi sinh vật cực kỳ đa dạng trong mô của

chúng. Sự đa dạng này có thể giải thích một phần bởi sự thay đổi các điều kiện
lý, hóa, sinh trong hải miên, có thể ảnh hưởng đến sinh thái vi sinh vật và tiến
hóa. Vi sinh vật liên đới với hải miên có cả nội bào và ngoại bào. Những nghiên
cứu đầu tiên về vi sinh vật liên đới với hải miên sử dụng các kỹ thuật vi sinh
nuôi cấy truyền thống, hoặc kiểm tra mô hải miên dưới kính hiển vi. Những
nghiên cứu này cho thấy vi sinh vật có thể chiếm đến 50% thể tích hải miên, và
cộng đồng này đặc hiệu cho hải miên.
Trong những năm gần đây, bằng các kỹ thuật sinh học phân tử không phụ
thuộc nuôi cấy rất nhiều nghiên cứu đã khảo sát tính đa dạng của vi sinh vật cộng
sinh hải miên ở các hệ sinh thái biển khác nhau và một số tác giả thấy rằng vi
khuẩn liên đới hải miên bền vững theo không gian và thời gian. Nhưng một số
tác giả khác lại thay đổi giảthuyết này. Ví dụ, mặc dù Cymbastela concentrica có
cộng đồng vi sinh vật ít thay đổi giữa các khoảng cách địa lý nhỏ, nhưng cộng
đồng vi sinh vật của Cymbastela concentrica vùng ôn đới khác với cộng đồng vi
sinh vật trong Cymbastela concentrica ttừ nước vùng nhiệt đới của Australia
(Hill et al., 2006; Ouyang et al., 2009).
Hải miên được biết là vật chủ của cộng đồng vi sinh vật lớn và vai trò của
những vi sinh vật này thay đổi theo nguồn dinh dưỡng và sự cộng sinh, hỗ sinh
với hải miên. Dựa trên những nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật bằng các phương
pháp như Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), 16S rRNA gene
sequencing and Fluorescence In Situ Hybridization (FISH), người ta nhận thấy
cộng đồng vi khuẩn liên kết với hải miên có tới hơn 25 phyla, trong đó có
Nguyễn Thị Mai Anh

Page 5


Proteobacteria, Nitrospira, Cyanobacteria, Bacteriodetes, Actinobacteria,
Chloroflexi, Planctomycetes, Acidobacteria, Poribacteria và Verrucomicrobia,
ngoài các thành viên của domain Archaea. Các quần thể vi sinh vật khác sống
trong hải miên là fungi và microalgae. Rất ít biết về virus trong hải miên, mặc
dù các hạt giống như virus được phát hiện trong nhân tế bào của Aplysina
(Verongia) cavernicola. Có 2 con đường để hải miên tạo nên vi khuẩn liên kết,
một là hấp thu vi khuẩn đặc hiệu từ nước xung quanh khi nước đi qua hải miên
trong quá trình ăn lọc và hai là truyền thẳng vi khuẩn liên đới thông qua giao tử
(gametes) của hải miên bằng cách đưa cả vi khuẩn vào noãn bào (oocytes) hoặc
ấu trùng (larvae) (Wang et al., 2006; Li et al., 2007).
Chức năng liên đới của vi khuẩn liên kết với hải miên gồm thu dinh
dưỡng, ổn định khung hải miên, xử lý (processing) chất thải trao đổi chất và sản
sinh các chất trao đổi thứ cấp. Có giả thuyết là các vi sinh vật biển liên đới với
hải miên là các nhà sản xuất gốc các hợp chất hoạt tính sinh học. Bằng chứng thí
nghiệm đầu tiên ủng hộ giả thuyết này là của Faulkner và cs, xác định vị trí của
các sản phẩm tự nhiên trong vi sinh vật liên kết hải miênTheonella swinhoei. Với
mục đích này, quần thể tế bào được tách bằng ly tâm và nghiên cứu bằng hóa
học. Bằng cách đó đã có thể định vị được cytotoxic macrolide swinholide A và
peptide theopalauamide trong vi khuẩn đơn bào dị dưỡng và vi khuẩn sợi dị
dưỡng, tương ứng (Thomas et al., 2010; Penesian et al., 2011).
1.3.

Chất kháng sinh.

1.3.1. Khái niệm về chất kháng sinh.
Chất kháng sinh được hiểu là các chất hóa học xác định, không có bản

chất enzyme có nguồn gốc sinh học ( trong đó phổ biên nhất là từ vi sinh vật) với
đặc tính là ngay từ nồng độ thấp ( hoặc rất thấp ) đã có khả năng ức chế mạnh mẽ

Nguyễn Thị Mai Anh

Page 6


hoặc tiêu diệt được các vi sinh vật gây bệnh mà vẫn đảm bảo cho người hoặc
động vật được điều trị.
1.3.2. Lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh.
Sự phát triển về vi sinh vật học và bước ngoặt lịch sử là phát minh vĩ đại về chất
kháng sinh của Alexander Fleming vào năm 1928 đã mở ra kỷ nguyên mới trong
y học.
Thuật ngữ ” Chất kháng sinh ” lần đầu được Pasteur và Joubert (1877) sử dụng
để mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillusanthracis
trên động vật nhiễm bệnh nếu tiêm vào các động vật này một số loại vi khuẩn
hiếu khí lành tính khác. Babes (1885) đã nêu ra hoạt tính kháng khuẩn của một
chủng có đặc tính tổng hợp được các hợp chất hóa học có hoạt tính kìm hãm các
chủng đối kháng.

Hình1.2. Alexander Fleming
Nicolle (1907) là người đầu tiên phát hiện ra hàng loạt kháng khuẩn của
Bacillus subtilis có liên quan đến quá trình hình thành bào tử của loại trực khuẩn

Nguyễn Thị Mai Anh

Page 7

này. Gratia và đồng nghiệp (1925) đã tách được từ nấm mốc một chế phẩm có
thể sử dụng để điều trị hiệu quả các bệnh truyền nhiễm trên da do cầu khuẩn.
Mặc dù vậy trong thực tế mãi tới năm 1925 thuật ngữ ”Chất kháng sinh”
mới được Alexander Fleming mô tả một cách đầy đủ và chính thức trong báo
cáo chi tiết về penicilin. Penicillin trở nên nổi tiếng vì đã cứu sống nhiều người
trong chiến tranh thế giới II .Thập kỷ 40 và 50 của thế kỷ XX đã ghi nhận những
bước tiên vượt bậc của ngành công nghệ sản xuất kháng sinh non trẻ với hàng
loạt sự kiện như:
Khám phá ra hàng loạt chất kháng sinh :Griseofulvin (1939), Gramiidin S
(1942), Streptomycin (1943), Bacitracin (1945), Chloramphenicol và Polymycin
(1947),Chloteracyline và Cephalosporin (1948).....
Áp dụng phối hợp các kỹ thuật tuyển chọn và tạo giống tiên tiến 9( đặc biệt
là các kỹ thuật gây đọt biến, kỹ thuật dung hợp tế bào, kỹ thuật tái tổ hợp gen...)
đã tạo ra những biến chủng công nghiệp có năng lực ” siêu tổng hợp” các chất
kháng sinh cao gấp hàng ngàn vạn lần các chủng ban đầu.
Triển khai thành công công nghệ lên men chìm quy mô snar xuất công
nghiệp để sản xuất Penicilin G (1942) và việc hoàn thiện công nghệ lên men này
trên các sản phẩm khác.
Việc phát hiện tinh chế và sử dụng axit6-aminopenicillanic (6-APA, 1959)
làm nguyên liệu để sản xuất các chất kháng sinh penicilin bán tổng hợp đã cho
phép tạo ra hàng loạt dẫn xuất penicilin và một số kháng sinh β-lactam bán tổng
hợp khác.
Đến năm 1972 đã có khoảng 4.076 kháng sinh được tìm thấy . Ngày nay
số kháng sinh mới phân lập được hằng năm là khoảng 100 loại và tỷ lệ có xu
Nguyễn Thị Mai Anh

Page 8


hướng giảm dần. Chưa kể hiện nay, càng ngày càng nhiều các VSV gây bệnh

kháng với các kháng sinh hiện có. Do vậy, các nghiên cứu cần tập trung làm thế
nào để vượt qua tính kháng thuốc kháng sinh và phát hiện các kháng sinh mới có
cơ chế hoạt động khác nhau.
1.3.3. Sự hình thành chất kháng sinh ở vi sinh vật.
Một trong những tính chất của các chất kháng sinh (CKS) có nguồn gốc từ vi
sinh vật (VSV) nói chung là có tác dụng chọn lọc. Mỗi CKS chỉ có tác dụng
vớimột nhóm VSV nhất định. Hầu hết CKS có nguồn gốc xạ khuẩn đều có phổ
kháng khuẩn rộng. Khả năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc điểm quan
trọng để phân loại xạ khuẩn.
Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS. Một số tác giả
cho rằng sự hình thành CKS là do cơ chế giúp cho VSV tồn tại trong môi trường
tự nhiên. Số khác cho rằng, sự hình thành CKS là do sự cạnh tranh trong môi
trường dinh dưỡng. Hầu hết các tác giả cho rằng kháng sinh là sản phẩm
chuyển hóa thứ cấp được hình thành vào cuối pha tích lũy thừa, đầu pha cân bằng
của chu kỳ sinh trưởng.
Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng,
nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định.
-

CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một

chuỗi phản ứngenzym.
-

CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóa sơ cấp khácnhau.

CKS được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất chuyển hóa sơ cấp,
sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác.
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS
có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau. Quá trình sinh tổng hợp CKS

phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gene, ngoài các gene chịu trách nhiệm tổng
Nguyễn Thị Mai Anh

Page 9


hợp CKS, còn có cả các gene chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym
vàcofactor.
1.3.4. Các nhóm kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật
Các kháng sinh từ vi sinh vật có thể chia làm các nhóm:
Nhóm β lactam( bao gồm nhóm penicillin và cephalosporin)
Nhóm aminoside
Nhóm phenicol
Nhóm lincosamie
Nhóm macrolide
Nhóm tetracylin
Nhóm kháng sinh chống nấm
Một số nhóm phụ khác như nhóm quinolone, nitroimidazole, các dẫn xuất của
sulfanilamide và các glycopeptide.
1.4.

Khái quát về một số vi sinh vật gây bệnh

1.4.1. Escherichia Coli
a)

Đặc điểm
E.coli còn được gọi là vi khuẩn đại tràng là một trong những loài vi khuẩn

chính ký sinh trong đường ruột của động vật máu nóng (bao gồm chim và động

vật có vú). Có nhiều loại E. coli, nhưng phần lớn là vô hại. Chúng cần thiết cho
qúa trình tiêu hóa thức ăn và là thành phần của khuẩn lạc ruộttrợ giúp hệ thống
tiêu hóa, sản xuất vitamin K, và hấp thụ thức ăn trong ruột già. Nó vừa là vi
khuẩn cộng sinh ở đường tiêu hóa vừa là vi khuẩn gây bệnh ( Lê Văn Tạoet al.,
1997 ).Tuy nhiên, một số E. coli có thể gây tiêu chảy và loại phổ biến nhất trong
nhóm E. coli có hại này là E. coli O157 H7.Sự có mặt của E.coli trong nước
ngầm là một chỉ thị thường gặp cho ô nhiễm phân.E.coli thuộc họ vi khuẩn
Nguyễn Thị Mai Anh

Page 10


Eterobacteriacese và thường được sử dụng làm sinh vật mô hình cho các nghiên
cứu về vi khuẩn.
E.coli là trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, có lông, di động, không
hình thành nha bào. Trong cơ thể ,vi khuẩn có hình thành cầu trực khuẩn, đứng
riêng rẽ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn.
b)

Cơ chế gây bệnh

Vi khuẩn E.coli gây bệnh bởi tổng hợp nhiều yếu tố, có yếu tố là độc và có
yếu tố không phải là độc bao gồm khả năng bám dính, khả năng tạo Colicin V
và khả năng sinh độc.
- Khả năng bám dính: yếu tố gây bệnh đặc biệt quan trọng được thực hiện
bởi kháng nguyên bám dính F đây là yếu tố gây bệnh đặcbiệt quan trọng giúp vi
khuẩn thực hiện bước đầu tiên của quá trình gây bệnh..
- Khả năng tạo Colicin V: Colicin V là một chất kháng khuẩn có khả năng
ức chế hoặc tiêu diệt các loại vi khuẩn khác ( Smith.H.V và cset al., 1967)E.coli
sản sinh Colicin V thông qua Plasmid Col, Theo Brown V (1981) hầu hết các

chủng E.coli gây bệnh đều có một loại plasmid có chứa gen sản xuất Colicin V.
- Khả năng sinh độc: E.coli thuộc loại nội độc tố có khả năng chịu nhiệt
ngoài ra một số chủng đột biến có khả năng sinh ngoại độc tố có khả năng tác
động lên tế bào thần kinh. E.coli còn có khả năng sinh độc tố Shiga gây chết tế
bào Vero.
Mỗi nhóm có độc lực khác nhau được qui định bởi gen độc lực. Một số
gen độc lực quan trọng của E.coli gồm:
+

Gen stx1, stx2, stx2e, hly của nhóm STEC (Shiga toxin producing

E.coli)
+

Gen eae của nhóm STEC và EPEC (Enteropathogenic E.coli).

+

Gen sta, stb, lt-1 của nhóm ETEC (Enterotoxigenic E.coli)

Nguyễn Thị Mai Anh

Page 11


c)

Đặc tính kháng kháng sinh
E.coli có chứa các kháng nguyên :
+ Kháng nguyên thân O: yếu tố độc lực ở thành tế bào có liên hệ trực

tiếp với hệ thống miễn dịch
+ Kháng nguyên lông H
+ Kháng nguyên vỏ K : không chịu nhiệt, được chia thành 59 týp
+ Kháng nguyên bám dính F
E.coli có khả năng sinh ra enzyme β-lactamase (là loại enzyme có thể thủy

phân các liên kết amid của β-lactam gây mở vòng β-lactam và làm mất tác dụng
diệt khuẩn của kháng sinh họ β-lactam). (Võ Thành Thìn, Lê Đình Hải, Vũ Khắc
Hùng, 2010) .
Yếu tố quy định khả năng kháng sinh của E.coli nằm trong Plasmid. Các tế
bào Plasmid trong tế bào vi khuẩn nói chung và E.coli nói riêng có khả năng tồn
tại nhân lên và chuyển giao giữa các chủng vi khuẩn. Do vậy nó có vai trò rất
quan trọng trongkháng thuốc. Các nhân tố R ( Plasmid mang một hay nhiều gen
kháng thuốc) không những có thể truyền sang nhiều E.coli khác nhau mà còn có
khả năng truyền cho phẩy khuẩn tả, trực khuẩn nhiệt thán, vi khuẩn dịch hạch (
Falkowet al.,1975)

Nguyễn Thị Mai Anh

Page 12


1.4.2. Vibrio Parahemolyticus
a) Đặc điểm
Vibrio parahaemolyticuslà vi khuẩn Gram âm được tìm thấy trong nước lợ
và nước mặn, gây ra bệnh tiêu hóa ở người(Daniels et al., 2000) và các động vật
dưới nước như tôm( Austinet al., 1993). Theo khóa phân loại của Bergey, cũng
giống như các thành viên khác của chi Vibrio, loài này di chuyển được bằng
roi,hình dấu phẩy, có tiêm mao ở một đầu, di động, kỵ khí tùy tiện và ưa môi
trường kiềm mặn. Người ta đã phân lập được chúng trong cát, bùn và nước biển,

cũng như ở hải sản .Có khả năng lên men glucose trong cả hai điều kiện hiếu khí
và kị khí.

Hình 1.4. Vibrio parahaemolyticus
b) Cơ chế gây bệnh
Trong khi nhiễm trùng có thể xảy ra bởi các tuyến đường phân và
miệng,nuốt phải vi khuẩn có trong hải sản sống hoặc nấu chưa chín, thường là
hàu . V.parahaemolyticus nguyên nhân chủ yếu gây cấp tính viêm dạ dày ruột.
Nhiễm trùng do vết thương cũng xảy ra, nhưng ít phổ biến hơn so với bệnh thủy
sản gây ra. Cơ chế bệnh của V.parahaemoliticuschưa được làm sáng tỏ hoàn toàn
( Finkelstein RAet al.,1996).

Nguyễn Thị Mai Anh

Page 13


Tuy nhiên, không phải chủng V. parahaemolyticus nào cũng gây bệnh do
chúng mang các gen độc tố khác nhau. Trong số đó, hemolysin là loại độc tố phổ
biến nhất ở các loài Vibrio gây bệnh. Đây là ngoại độc tố làm phân giải tế bào
hồng cầu và giải phóng hemoglobin. Ở loài V. parahaemolyticus, có ba gen độc
tố hemolysin chính bao gồm tdh và trh mã hóa các hemolysin bền nhiệt và tlh mã
hóa hemolysin không bền nhiệt. Cả hai gen tdh và trh đều nằm trên operon độc
tố Vp-toxRS, được điều hòa bởi gen toxR có trình tự bảo tồn cao trong loài
(Nishibuchi, Kaper, 1995).
V.parahemolyticus có chứa gen T3SS có khả năng tiêm độc vào tế bào chủ
để phá vỡ chức năng tế bào chủ hoặc gây chết tế bào do apoptosis ( Natsumi
Okada và cs, 2009).
c) Khả năng kháng kháng sinh.
Vi khuẩn có 3 loại kháng nguyên :

+ Kháng nguyên thân 0: chịu nhiệt, được chia thành 12 týp.
+ Kháng nguyên lông H.
+ Kháng nguyên vỏ K : không chịu nhiệt, được chia thành 59 týp
V.Parahemolyticus cũng có chứa enzyme β-lactamase trong tế bào nên
kháng được với kháng sinh β-lactamin.
Vi khuẩn tập hợp và hình thành màng sinh học khi chúng bám vào lớp kitin
trên bề mặt dạ dày, màng sinh học ngăn chặn sự tấn công của kháng sinh và các
vi sinh vật khác muốn cạnh tranh chỗ bám của chúng. Sau đó chúng bắt đầu nhân
lên và lớp màng bao này ngày càng hoàn thiện, màng sinh học exopoly sacharide

Nguyễn Thị Mai Anh

Page 14


này có tác dụng bảo vệ chúng chống lại kháng sinh, chất sát trùng... trong khi
vẫn cho phép vi khuẩn hoạt động trao đổi chất bình thường.
1.4.3.
a)

Bacillus subtilis

Đặc điểm.
Bacillus subtilislà một loại vi khuẩn gram dương, catalase dương tính.

Thuộc chi Bacillus,Bacillus subtilis là trực khuẩn hình que, có khả năng tạo bào
tử, có khả năng chịu đựng các điều kiện môi trường khắc nghiệt.
Mặc dù loài này thường được tìm thấy trong đất, tuy nhiên nhiều bằng
chứng cho thấy B. subtilis cũng tồn tại trong ruột người, động vật. Nghiên cứu
gần đây so sánh số lượng bào tử được thực hiện bởi đất (~106 bào tử/g) so với

mức được tìm thấy trong phân người (~ 104 bào tử /g).B. subtilis được coi là
nghiên cứu tốt nhất vi khuẩn Gram dương và một sinh vật mô hình để nghiên
cứu nhân bản nhiễm sắc thể của vi khuẩn và biệt hóa tế bào.
Trong các món ăn cổ truyền loài vi khuẩn Bacillus subtilis nổi tiếng với
khả năng sinh ra nhiều enzyme, trong đó nhiều nhất là các men tiêu hóa amylase
và protease. Ngoài ra Bacillus subtilis còn có nhiều tác dụng khác có lợi cho sức
khỏe, ví dụ như: chống đông máu (Arima và đồng sự, 1968), kích thích hệ miễn
dịch (Huang và đồng sự, 2008), phòng tránh nhiễm khuẩn đường tiết niệu ở
người cao tuổi (Meroni và đồng sự, 1983)…vì vậy có thể sử dụng chế phẩm từ
B.subtilis làm thực phẩm chức năng để bổ sung hệ vi khuẩn có ích và các men
tiêu hóa có lợi cho đường ruột, nhờ đó giúp phòng ngừa rối loạn tiêu hóa đặc biệt
sau khi dùng kháng sinh kéo dài.
Các nghiên cứu mới nhất chỉ ra rằng Bacillus subtilis Rlà chủng vi khuẩn
được phát hiện có khả năng tạo bào tử, nảy mầm và sinh sôi ở điều kiện yếm khí
khắc nghiệt trong hệ tiêu hóa của người( Tam và đồng sự , 2016) góp phần quan
Nguyễn Thị Mai Anh

Page 15


trọng tạo ra và duy trì hệ sinh vật có lợi cho đường ruột. Tính chất này đặc biệt
quan trọng đối với người sử dụng kháng sinh kéo dài bởi vì số lượng vi khuẩn có
lợi ở những người này bị suy giảm nghiêm trọng. Để khôi phục lại hệ vi sinh vật
có lợi, việc đưa Bacillus subtilis lợi khuẩn bào tử vào sẽ giúp phòng ngừa một số
triệu chứng thường gặp khi dùng khángsinh kéo dài, ví dụ như tiêu chảy, táo bón
và co thắt ruột.

b) Cơ chế gây bệnh
Một số chủng B.Subtilis cũng như họ hàng của chúng như B.pumulis,
B.megaterium, B.licheniformis có khả năng sản xuất lecithinase, một enzyme có

khả năng phá vỡ màng tế bào động vật. Tuy nhiên, vẫn chưa có bằng chứng nào
cho thấy lecithinase gây bệnh trên người.
Một số nghiên cứu cho thấy B.subitilis cũng liên quan đến vài trường hợp
ngộ độc thực phẩm.

Nguyễn Thị Mai Anh

Page 16


B.subitilis có khả năng sản xuất độc tố ngoại bào Subtilisin, mặc dù
subtilisin có độc tính thấp nhưng trong thành phần protein của nó có khả năng
gây dị ứng đối với những người tiếp xúc trong thời gian dài gây những bệnh như
viêm da, viêm đường hô hấp. Nó có tính độc thấp đối với người vì nó sản xuất
enzyme ngoại bào và các tác nhân gây độc không đủ để có thể gây hại cho người
ngoại
Trừ trường hợp có đột biến trong tế bao vi khuẩn hay hệ thông miễn dịch
của người qua suy yếu. Người ta vẫn phát hiện có sự hiện diện của B.subitilis ở
những bệnh nhân bị ung thư phổi, hoại tử bạch cầu...Tuy nhiên, tỷ lệ này rất
hiếm chỉ có 2/24 trường hợp nhiễm Bacillus là do B.Subtilis.
B.sutilis cũng được phát hiện trong một số trường hợp bò cừu sảy thai tuy
nhiên nó không được coi là nguyên nhân gây bệnh.
B.subtilis gây phân hủy pectin và polysacharides của mô thực vật dẫn đến
thối khoai tây , gây ra những vết lở loét trên một số cây rừng.
c)

Tính kháng khuẩn và nấm.
B.subitilis có khả năng tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau :

subitilin, subitilosin A, Tas A,.... với những đặc tính kháng khuẩn và nấm hữu

hiệu.
+

Với vi sinh vật gây bệnh

Tác dụng chủ yếu của kháng sinh đối với vi khuẩn có thể biểu hiện theo 3
hướng:
•

Làm ngừng tổng hợp màng tế bào do đó phá hủytính chất thẩm thấu của tế

bào, các ion sẽ thoát ra ngoài tế bào chủ.

Nguyễn Thị Mai Anh

Page 17


•

Ảnh hưởng tới quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn. Chất kháng sinh

có thể phong bế quá trình tổng hợp protein bằng cách ngăn cản ribosome tổng
hợp chuỗi polypeptid.
•

Ảnh hưởng đối với acid acetic cụ thể phá hủy sự trao đổi ADN và

ARN bằng cách ức chế men RNA polymerase gắn vào các base làm đứt đọn
chuỗi xoắn kép.

+

Đối với nấm

Khi nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số
lượng lớn sẽ dẫn tới cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống. Vi khuẩn phát
triển nhanh hơn sử dụng phần lớn dinh dưỡng và tạo ra kháng sinh khiến nấm bị
ức chế.
1.4.4. Candidaalbicans.
a)

Đặc điểm.
NấmCandida là một loại nấm men có hình tròn hoặc hình bầu dục với

kích thước khoảng 2-5 µm. Loại nấm này thường sống hoại sinh trong đường
tiêu hóa của người, động vật …Đối với những người khỏe mạnh, nấm Candida
thường xuất hiện khoảng 30% ở miệng, 39% ở âm đạo, 17% ở phế quản, 35% ở
ruột…Theo các chuyên gia, nấm Candida có thể phát triển ở bất kỳ bộ phận nào
trên cơ thể nhưng chủ yếu ở da và niêm mạc.Candida còn được biết đến là một
loại nấm men sinh sản bằng đơn bào nảy chồi. Ở bên cạnh đó có thể còn có sợi
nấm giả gồm các tế bào dài dính vào nhau bởi một điểm nhỏ và dễ gẫy.
Theo các chuyên gia, có 2 loại nấm men là:
– Nấm men có nang đảm : sinh sản bằng nang đảm (ascus) trong đó điển
hình là nấm men saccharomyces.
Nguyễn Thị Mai Anh

Page 18