Phân lập và tuyển chọn chủng xạ khuẩn streptomyces sp sinh tổng hợp aminoethyoxy Vinylglycine(AVG) có tác dụng ức chế sinh tổng hợp etylen trong quả tươi

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG XẠ KHUẨN
STREPTOMYCES SP. SINH TỔNG HỢP AMINOETHYOXY
VINYLGLYCINE (AVG) CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ SINH TỔNG HỢP
ETYLEN TRONG QUẢ TƯƠI

Giáo viên hướng dẫn

: ThS.Nguyễn Văn Nguyện

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Trang

Lớp

: CNSH 12-01

HÀ NỘI - 2016


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG XẠ KHUẨN
STREPTOMYCES SP. SINH TỔNG HỢP AMINOETHYOXY
VINYLGLYCINE (AVG) CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ SINH TỔNG HỢP
ETYLEN TRONG QUẢ TƯƠI

Giáo viên hướng dẫn

: ThS.Nguyễn Văn Nguyện

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Trang

Lớp

: CNSH 12-01

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến ThS Nguyễn
Văn Nguyện đang công tác tại Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sau thu
hoạch, Viện Cơ điện Nông Nghiệp và Công Nghệ sau thu hoạch, người đã
tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện tốt cho em trong suốt quá trình thực tập
tại viện.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ nhân viên Bộ Môn
Nghiên Cứu Công Nghệ Sau Thu Hoạch, Viện Cơ Điện Nông Nghiệp &
Công Nghệ Sau Thu Hoạch đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực

hiện đề tài.
Tiếp theo em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy cô giáo khoa
Công Nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội đã tận tình chỉ bảo, giúp
đỡ em trong suốt 4 năm học vừa qua đồng thời cũng tạo điều kiện cho em
được thực tập và bảo vệ một cách tốt nhất.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè, những người
đã động viên , giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập để em có được kết quả
như ngày hôm nay.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 25 tháng 4 năm 2016
Sinh viên
Nguyễn Thị Trang


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội
MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

iv

DANH MỤC BẢNG BIỂU

v

DANH MỤC HÌNH ẢNH

vi

MỞ ĐẦU

1

I.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1.

TỔNG QUAN VỀ AVG

3

1.2.

TÁC DỤNG CỦA AVG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHÍN CỦA

4

QUẢ
1.2.1.

Sự tổng hợp etylen

4

1.2.2.

Cơ chế hình thành ethylen

5

1.2.3

Vai trò của ethylene đối với sự chín của quả

6

1.2.4

Cơ chế ức chế sinh tổng hợp etylen trong quả tươi của AVG.

6

1.3.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG AVG TRÊN THẾ

7

GIỚI VÀ VIỆT NAM
1.3.1.

Các nghiên cứu ứng dụng AVG trên thế giới

1.3.2.

Các nghiên cứu ứng dụng AVG trong nước

1.4.

XẠ KHUẨN STREPTOMYCES VÀ KHẢ NĂNG SẢN

7

9

XUẤT AVG
1.4.1.

Sự phân bố của chủng Streptomyces trong tự nhiên

1.4.2.

Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa và phân loại của xạ khuẩn

9
10

theo ISP.
1.4.3.

Khả năng sản xuất AVG của chủng Streptomyces

13

1.4.4.

Các phương pháp phân tích AVG sinh tổng hợp từ xạ khuẩn

14

Streptomyces
1.4.5

Các phương pháp bảo quản chủng giống

SV: Nguyễn Thị Trang

i

17

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

II.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

20

2.1.

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

20

2.1.1.

Các mẫu đất sử dụng cho phân lập xạ khuẩn Streptomyces

20

2.1.2.

Các hóa chất dùng cho phân tích AVG

20

2.1.3.

Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

20

2.1.4.

Môi trường

20

2.2.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

22

2.2.1.

Phân lập xạ khuẩn Streptomyces

22

2.2.2.

Đánh giá sơ bộ hoạt tính sinh tổng hợp AVG của chủng

23

Streptomyces bằng phương pháp khuếch tán thạch.
2.2.3.

Phương pháp đánh giá khả năng sinh tổng hợp AVG của các

24

chủng Streptomyces sp
2.2.4.

Các phương pháp bảo quản chủng giống ở nhiệt độ thấp

26

2.2.5.

Phương pháp đánh giá tính ổn định hoạt tính sinh tổng hợp

27

AVG của chủng giống sau bảo quản
2.2.6.

Định tên thông qua hình thái và các sản phẩm trao đổi chất

27

theo ISP
2.2.7.

Khả năng sử dụng các nguồn carbon

28

III.

KẾT QUẢ

30

3.1.

Phân lập chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.

30

3.2.

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp AVG của các chủng xạ

36

khuẩn Streptomyces sp. phân lập.
3.3.

Đánh giá tính ổn định trong sinh tổng hợp AVG của các

37

chủng Streptomyces tuyển chọn được
3.3.1.

Đánh giá tính ổn định của các chủng Streptomyces sp. đã lựa

38

chọn trong sinh tổng hợp AVG qua cấy truyền và lên men.

SV: Nguyễn Thị Trang

ii

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp
3.3.2.

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Ảnh hưởng của các điều kiện bảo quản đến tính ổn định trong

38

sinh tổng hợp AVG của các chủng Streptomyces tuyển chọn
được
3.4

Định tên các chủng Streptomyces sp. có khả năng sinh tổng

39

hợp AVG cao đến mức độ loài
3.4.1.

Định tên chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. S1

39

3.4.2.

Định tên chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. S6

43

IV.

KẾT LUẬN

48

TÀI LIỆU THAM KHẢO

50

PHỤ LỤC

52

SV: Nguyễn Thị Trang

iii

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AVG

Aminoethyoxy Vinylglycine

MET

Acid amin Methionine

SAM

S-adenosyl Methionine

ACC

1- aminocyclopropane 1-cacboxylic acid

ACS

ACC synthase

MTA

5′-Methylthioadenosine

HK

Homoserine Kinase

1-MCP

1-Methylcyclopropene

CA

Controlled Atmosphere

ISP

International Streptomyces Project

SV: Nguyễn Thị Trang

iv

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội
DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1.

Các thông số so sánh về chất lượng của cam tiêu sau

9

24h
Bảng 3.1.

Khả năng sinh tổng hợp AVG của các chủng

36

Streptomyces sp. trong môi trường lên men
Bảng 3.2.

Đặc điểm khuẩn lạc của chủng Streptomyces sp. S1

40

Bảng 3.3.

Khả năng tạo sắc tố melanin trên các môi trường khác

40

nhau của chủng Streptomyces sp. S1
Bảng 3.4.

Khả năng đồng hóa nguồn C của chủng Streptomyces

41

sp. S1
Bảng 3.5.

So sánh đặc điểm phân loại của chủng Streptomyces sp.

42

S1 với chủng Streptomyces canarius
Bảng 3.6.

Đặc điểm khuẩn lạc của chủng Streptomyces sp. S6

44

Bảng 3.7.

Khả năng tạo sắc tố trên các môi trường khác nhau của

44

chủng Streptomyces sp. S6
Bảng 3.8.

Khả năng đồng hóa nguồn C của chủng xạ khuẩn

45

Streptomyces sp. S6
Bảng 3.9.

So sánh đặc điểm phân loại của chủng Streptomyces sp.

46

S6 với chủng Streptomyces luteogriseus

SV: Nguyễn Thị Trang

v

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội
DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1.

Khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh

3

cháy lá Erwinia amylovora
Hình 1.2.

Con đường hình thành ethylene trong thực vật

5

Hình 1.3.

Cơ chế ức chế hoạt động enzyme ACC synthase

7

Hình 1.4.

Sơ bộ phân loại xạ khuẩn

10

Hình 1.5.

Hình thái khuẩn lạc và chuỗi bào tử chủng xạ khuẩn

12

HLD 3.16
Hình 1.6.

Màu sắc khuẩn lạc một số loại xạ khuẩn

13

Hình 1.7.

Sơ đồ mô tả con đường sinh tổng hợp AVG trong xạ

14

khuẩn
Hình 1.8.

Bình sắc ký lớp mỏng

15

Hình 1.9.

Các bước của quá trình sắc ký lớp mỏng

16

Hình 3.1.

Khuẩn lạc (a) và khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia

31

amylovora (b) của chủng Streptomyces S1
Hình 3.2.

Khuẩn lạc (a) và khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia

31

amylovora (b) của chủng Streptomyces S2
Hình 3.3.

Khuẩn lạc (a) và khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia

32

amylovora (b) của chủng Streptomyces S3

Hình 3.4.

Khuẩn lạc (a) và khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia

33

amylovora (b) của chủng Streptomyces S4
Hình 3.5.

Khuẩn lạc (a) và khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia

33

amylovora (b) của chủng Streptomyces S5
Hình 3.6.

Khuẩn lạc (a) và khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia

34

amylovora (b) của chủng Streptomyces S6
Hình 3.7.

Khuẩn lạc (a) và khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia

35

amylovora (b) của chủng Streptomyces S7

SV: Nguyễn Thị Trang

vi

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp
Hình 3.8.

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khuẩn lạc (a) và khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia

35

amylovora (b) của chủng Streptomyces S8
Hình 3.9.

Tính ổn định trong sinh tổng hợp AVG của các chủng

37

Streptomyces sp. trong 3 lần cấy truyền và lên men liên
tiếp
Hình 3.10. Tính ổn định của các chủng Streptomyces sp. trong sinh

38

tổng hợp AVG trên môi trường thạch đặc
Hình 3.11. Chuỗi bào tử và bào tử chủng Streptomyces sp. S1

39

Hình 3.12. Chuỗi bào tử và bào tử chủng Streptomyces sp. S6

43

PHỤ LỤC

51

Hình 1

Tách khuẩn lạc các chủng xạ khuẩn đã phân lập

51

Hình 2

Bộ chủng giống Streptomyces sp

51

Hình 3

Định tính sinh tổng hợp AVG của chủng Streptomyces

52

sp. S6 bằng sắc kí bản mỏng (TLC)

Hình 4

Đông khô các chủng Streptomyces sp.

52

Hình 5

Sắc kí HPLC AVG chuẩn

53

SV: Nguyễn Thị Trang

vii

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội
MỞ ĐẦU

Cây ăn quả ngày càng có vị trí quan trọng trong phát triển kinh tế của
quốc gia nói chung và kinh tế hộ gia đình của người dân Việt Nam nói riêng,
nhất là trong vài thập kỷ gần đây, khi vấn đề an ninh lương thực cơ bản đã được
giải quyết. Tuy nhiên, có một thực tế là phần lớn chúng ta thiếu công nghệ điều
khiển thời điểm thu hoạch dẫn đến thực trạng thu hoạch ồ ạt, không tiêu thụ kịp
nên thường bị thương lái ép giá, tổn thất sau thu hoạch rất lớn do không kìm

hãm được sự chín, hỏng của rau quả.
Trước thực trạng trên, các nhà khoa học Việt Nam đã và đang rất tích
cực nghiên cứu để làm chậm tiến trình chín của trái cây giúp nhà trồng trọt có
thể chủ động trong tiêu thụ nông sản và đảm bảo cho người tiêu dùng sử dụng
những trái cây tươi có giá trị dinh dưỡng. Vì những mục tiêu đó, một số chế
phẩm làm chậm chín quả đã được nghiên cứu và ứng dụng.
Trong các chế phẩm để kéo dài thời gian thu hoạch, chế phẩm RetainAVG (Aminoethoxyvinylglycine) hiện được thế giới ứng dụng rộng rãi và rất
được các nhà nghiên cứu trong nước quan tâm. Retain - AVG là một chất điều
hoà sinh trưởng thực vật, có chứa 15% thành phần hoạt động đó là AVG có
nguồn gốc sinh tổng hợp từ xạ khuẩn Streptomyces. Retain - AVG là một hợp
chất có tác dụng ức chế một cách hoàn toàn hoạt động của enzym ACCsynthetaza, là enzym giữ vai trò quan trọng trong việc xúc tác quá trình hình
thành ethylene. Retain được biết đến là một chất có khả năng ức chế khả năng
sinh ethylene trong tế bào, làm trì hoãn quá trình chín của quả, duy trì được
hương thơm của quả trong quá trình bảo quản.
Retain giúp kéo dài mùa vụ thu hoạch, có tác dụng làm quả cứng, thịt
quả mọng nước, mùi vị tự nhiên, cải thiện màu sắc vỏ quả, chống nứt quả,
không gây hại cho côn trùng có ích. Hiệu quả của AVG trong kéo dài thời gian
thu hoạch quả tươi đã được chứng minh, tuy nhiên, các chế phẩm AVG đều
phải nhập khẩu từ Úc, Mỹ… mà chưa có công trình nào trong nước nghiên cứu
để sản xuất chế phẩm AVG. Để chủ động trong kéo dài thời gian thu hoạch quả
SV: Nguyễn Thị Trang

1

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

tươi, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm AVG ở Việt Nam là rất cần thiết. Để
sản xuất được chế phẩm AVG, việc phân lập, tuyển chọn để có được chủng
Streptomyces sp. có khả năng sinh tổng hợp AVG với hàm lượng cao và ổn
định là vô cùng cần thiết. Xuất phát từ yêu cầu trên, chúng tôi thực hiện đề tài:
“Phân lập và tuyển chọn chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. sinh tổng hợp
aminoethyoxyl vinylglycine (AVG) có tác dụng ức chế sinh tổng hợp etylen
trong quả tươi”.
MỤC TIÊU
Phân lập và tuyển chọn được 1-2 chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. có
khả năng sinh tổng hợp AVG cao và ổn định.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU


Phân lập, tuyển chọn chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. có khả năng sinh

tổng hợp AVG cao, đạt trên 50mg/l.


Đánh giá tính ổn định trong sinh tổng hợp AVG của các chủng

Streptomyces sp. đã tuyển chọn.


Định tên chủng Streptomyces sp. đã tuyển chọn được đến mức độ loài.

SV: Nguyễn Thị Trang

2

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
TỔNG QUAN VỀ AVG
AVG (Aminoethyoxyl vinylglycine) có tên khoa học là L-trans-2-amino4-(2 acetamidoethoxy)-3-butenoic acid, thuộc nhóm hợp chất tự nhiên
vinylglycine được sản xuất bởi một số vi khuẩn đất như Streptomyces sp,
Pseudomonas aeruginosa (Ruan X. cộng sự, 1993).
AVG (L-trans-2-amino-4-(2 acetamidoethoxy)-3-butenoic acid) là
amino acid thu được trong quá trình lên men chủng vi khuẩn Streptomyces được
phát hiện đầu tiên bởi nhà khoa học Hoffman LaRoche Inc., Nutley,NJ. và được
công bố chính thức trên US Patent 3,751,459 năm 1973 nhờ khả năng kháng
mạnh mẽ nhiều vi sinh vật gây hại như Escherichia coli (gây bệnh đường ruột
nghiêm trọng), Bacillus simplex, Staphylococcus aureus, Streptomyces
cellulosae, Bacillus cereus, với nồng độ rất thấp (mM) [1], Erwinia amylovora
[2]. Như vậy, ngay từ lúc được phát hiện, AVG đã chứng tỏ được khả năng ứng
dụng rất cần thiết cho bảo vệ sức khỏe con người và cây trồng.

Hình 1.1. Khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh cháy lá
Erwinia amylovora [2]
Nhiều nghiên cứu trong suốt hơn 20 năm sau đó với AVG được thực hiện
ở nhiều trường đại học và các nhà nghiên cứu ngành công nghiệp ở mức độ
phân tử cho thấy tác động đặc biệt của AVG đối với sinh lý của các mô thực
vật (Boller, et al, 1979; .. Yu, et al, 1979). Ngoài khả năng kháng nhiều vi sinh
SV: Nguyễn Thị Trang

3

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

vật gây hại cho người, động vật và thực vật, AVG còn được phát hiện với khả
năng ức chế đặc hiệu và mạnh mẽ sự sinh tổng hợp ethylene (Abeles et al.,
1992). AVG đã được sử dụng để nghiên cứu sự tham gia của tổng hợp ethylene
trong chồi (Pereira-Netto, 2001), phân vùng vật chất khô trong gạo (Mohapatra
và cộng sự, 2000), trái cây chín (Clayton và cộng sự, 2000; Wang và Dilley,
2001), nấm bệnh (Robison và cộng sự, 2001), những mấu nhỏ ở cây họ đậu
(Mann và cộng sự, 2001; Spronsen và cộng sự, 2001), phản ứng với stress lạnh
(Hong và Gross, 2000). Đến năm 1997, AVG mới chính thức được đăng ký
thương mại bởi tập đoàn Valent BioSciences. AVG có khả năng ứng dụng rộng
rãi với hiệu quả cao thể hiện cùng tất cả phương thức khác nhau như phun lên
lá, tưới vào đất hoặc phương pháp nhúng.
Trong lên men sinh tổng hợp AVG từ chủng Streptomyces species X-l
1085, chủng sau khi nuôi bào tử trên môi trường dinh dưỡng agar được chuyển
sang tăng sinh trong môi trường Trypticase Soy Broth (Baltimore Biological
Laboratories) lắc ở 240 rpm ở 280C trong 72 giờ. Sau đó hút 2ml của dịch nuôi
cấy được bổ sung vào bình tam giác chứa 100ml môi trường gồm (g/l): glucose
-20; Bacto peptone (Difco) 5.0, Bacto yeast extract 3.0, ferrous ammonium
sulfate hexahydrate [ (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O]- 0.03, pH 7, lắc ở 240 rpm ở 280C
trong 4 ngày.
TÁC DỤNG CỦA AVG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHÍN CỦA QUẢ
Sự tổng hợp etylen

Ethylene là một hydrocacbon dạng khí có cấu tạo hóa học C2H4 và khối
lượng phân tử 28.5 đơn vị Cacbon. Ethylene được sinh ra từ rất nhiều nguồn
khác nhau trong tự nhiên như khí thải từ các động cơ đốt trong, bếp lò, khói
thuốc, khí ga rò rỉ và các cơ quan thực vật. Ethylene không chỉ được coi là
hormon của sự chín mà còn đóng vai trò quan trọng trong những hoạt động sinh
lý khác của thực vật như quá trình nở của hoa, sự rụng lá hoặc các bộ phận thực
vật khác, sự biến màu của sắc tố chlorophyll [3].Trong thực vật tồn tại hai hệ
thống sản sinh ethylene. Hệ thống thứ nhất hoạt động trong suốt quá trình sinh
SV: Nguyễn Thị Trang

4

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

trưởng và phát triển bình thường của thực vật. Hệ thống thứ hai mặc dù được
khởi động bởi hệ thống thứ nhất nhưng chỉ hoạt động trong quá trình chín của
quả và quá trình già hóa của các bộ phận thực vật. Hệ thống thứ nhất có cơ chế
tự ức chế, nghĩa là ethylene ngoại sinh có thể kìm hãm quá trình tổng hợp
ethylene. Ngược lại, hệ thống thứ hai lại bị kích thích bởi ethylene và vì vậy có
cơ chế tự xúc tác sự tổng hợp ethylene ở giai đoạn chín.

Hình 1.2. Con đường hình thành ethylene trong thực vật
(S.F.Yang và cộng sự , 1984)
Cơ chế hình thành ethylen
Đường hướng sinh tổng hợp ethylene trong thực vật đã được S.F.Yang

và cộng sự phát hiện năm 1984. Xuất phát ban đầu của chu trình là acid amin
methionine (MET), đi qua hai sản phẩm trung gian là S-adenosyl methionine
(SAM) và 1- aminocyclopropane 1-cacboxylic acid (ACC), tạo ra sản phẩm
cuối cùng là ethylene. Từ methionine (MET) chuyển hoá thành S-adenosyl
methionine (SAM) nhờ tác dụng xúc tác của enzym SAM-synthetase.
Từ SAM chuyển hóa theo 2 con đường khác nhau: một phần tổ hợp lại
acid amin MET để tiếp tục quá trình sinh tổng hợp trong cơ thể sinh vật; một
phần chuyển hóa thành 1-aminocyclopropane 1-cacboxylic acid (ACC) nhờ tác

SV: Nguyễn Thị Trang

5

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

dụng xúc tác của enzym ACC- synthetase. Khi quả còn xanh, con đường hình
thành trở lại MET xảy ra mạnh và sự hình thành ACC là yếu hơn. Quá trình
này sẽ diễn ra ngược lại khi quả chín dần. Từ ACC chuyển hoá thành ethylene
(C2H4 ) nhờ tác dụng xúc tác của enzym ACC-oxydase.
/>Vai trò của ethylene đối với sự chín của quả
Ở quả hô hấp đột biến, ethylene là hormon đóng vai trò khởi đầu sự chín
của quả thông qua việc đẩy nhanh sự hoàn thiện màu sắc, sự mềm hóa, sự tạo
hương và làm tăng cường độ hô hấp của quả.
Tác động của ethylene dựa trên cơ sở làm tăng tính thấm của màng tế
bào do ái lực cao của ethylene với lipid (thành phần chủ yếu cấu tạo nên màng

tế bào), dẫn đến giải phóng các enzym vốn tách rời với cơ chất do màng ngăn
cách. Các enzym này có điều kiện tiếp xúc với cơ chất và gây ra các phản ứng
có liên quan đến quá trình chín và các quá trình sinh lý, sinh hoá khác của quả.
Cơ chế ức chế sinh tổng hợp etylen trong quả tươi của AVG.
Aminoethoxyvinylglycine(AVG) là tương tự như Vinyl Glycine có công
thức hóa học [NH2–CH2–CH2–OC=CH–CH–(NH2)–COOH], AVG là một
trong nhóm chất ức chế hoạt động hiệu quả và được sử dụng rộng rãi trong
những năm gần đây. Mặc dù có tính chất tương tự như vinyl glycine nhưng nó
lại là một chất ức chế ngược của ACS. AVG được sử dụng với tên thương mại
là Retain.
Những kết quả này chỉ ra rằng AVG ức chế việc chuyển đổi của SAM
thành ACC. Việc chuyển đổi từ SAM để ACC được xúc tác bởi ACC synthase
(ACS), các enzyme thứ hai trong lộ trình sinh tổng hợp ethylene từ methionine
(Arshad và Frankenberger, năm 2002); Konze và Kwiatowski, 1981). ACS đòi
hỏi pyridoxal phosphate cho hoạt động và rất nhạy cảm với pyridoxal
phosphate chất ức chế như AVG (McKeon và Yang, 1987). Theo Adams và
Yang (1979) ACS xúc tác sự hình thành của ACC và MTA từ SAM của một α,
γ-loại bỏ cơ chế phản ứng. Khi SAM trải qua một β, γ-loại bỏ phản ứng nó tạo
SV: Nguyễn Thị Trang

6

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

một dẫn xuất vinylglycine và kết quả ankyl hóa không thể phục hồi bất hoạt

các enzym. Retain giúp hạn chế sự sinh ethylene (ethylen là một loại chất được
tạo ra từ nhiều loại cây, thúc đẩy quá trình mau chín và quá trình già hóa cây
trồng, hoa cắt cành, trái cây và rau quả).
Thành phần hoạt động của Retain là một chất có nguồn gốc tự nhiên
AVG(aminoetheoxyvinylglycine hydrochoride) được tạo ra từ quá trình lên
men. Chất này có khả năng làm giảm sự sinh ethylene bằng cách ngăn cản sự
hình thành enzyme ACC (ACC synthase) từ quá trình sinh tổng hợp [4].
Theo Satoh, S., and Yang, S. F. (1989) (Plant Physiol. 91, 1036-1039),
L-Vinylglycine có khả năng bất hoạt 60% ACC synthase sau 5 phút và 90%
sau 40 phút. AVG là một dạng vinyglycine có khả năng tác động trực tiếp lên
nhóm chức pyridoxal photphat của enzyme ACC synthase. AVG được đánh giá
là chất ức chế cạnh tranh có hiệu quả nhất trong nhóm chất có khả năng ức chế
sinh tổng hợp ethylen trong quả nhờ khả năng kết hợp với enzyme ACC
synthase, tạo phức ACC synthase – AVG (Arshad và Frankenberger, 2002), bất
hoạt enzyme ACC synthase:

ACC synthase

Hình 1.3. Cơ chế ức chế hoạt động enzyme ACC synthase
(Guido Capitani và cộng sự, 2005) [5]
TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG AVG TRÊN THẾ GIỚI VÀ
VIỆT NAM
Các nghiên cứu ứng dụng AVG trên thế giới
Rath và cộng sự đã sử dụng Retain(15% AVG) với hai giống đào
“Golden Queen” và “Taylor Queen” trong vùng Thung lũng Goulburn của

SV: Nguyễn Thị Trang

7

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Australia. Retain được phun vào thời điểm 7-14 ngày trước khi thu hoạch với
liều lượng 830 g trong 1.000-1.500 lít nước / ha (554-830 ppm AVG). Kết quả
cho thấy Retain làm chậm biến đổi màu 3-6 ngày đối với đào không xử lý,
ngoài ra kích thước và trọng lượng quả tăng 7.5% và độ cứng của thịt quả cao
hơn 7-58% so với mỗi đối chứng.
Robinson và cs đã sử dụng AVG xử lý trên 2 giống táo “McIntosh”
/M.26 tại 2 và 4 tuần trước khi thu hoạch. Kết quả cho thấy việc sử dụng AVG
trước khi thu hoạch 2 tuần làm giảm khả năng sinh ethylene, tăng độ cứng và
cải thiện màu sắc hơn với mẫu đối chứng [6].
AVG được sử dụng ở nồng độ 125ppm cho các loại cây táo (unbagged)
ở 3-4 tuần trước khi thu hoạch thương mại làm giảm khả năng sản xuất ethylene
kết quả là quả chín chậm và giảm rụng quả trước thu hoạch (giảm trung bình
từ 58.9% xuống 10.4%), tinh bột biến đổi chậm và giảm sản xuất ethylene [7].
Hai giống táo “Royal Gala” và “Imperial Gala” ở vườn cây ăn trái tại ở
miền Nam Brazil được xử lý AVG với hàm lượng 120g /ha ở thời điểm 4 tuần
trước khi thu hoạch. Quả được thu hoạch từ 5 đến 7 ngày, bắt đầu từ 2-3 tuần
trước khi thu hoạch, sau đó mẫu được xử lý 1μl/l (1-MCP) vào ngày thu hoạch,
và được lưu trữ cho 3.5 và 7 tháng trong không khí (0.5°C), hoặc trong khí
quyển kiểm soát (CA, 1.5 kPa O2 + 2.5 kPa CO2 ở mức 0.5°C).
Kết quả cho thấy việc xử lý bằng AVG làm chậm quá trình chín trên cây
như giảm hàm lượng ethylene, tăng độ cứng, màu sắc vỏ quả so với mẫu đối
chứng không xử lý AVG và AVG có tác dụng tốt khi xử lý kết hợp với 1- MCP
[8]

Retain-AVG được xử lý trên hai giống lê “Camusina di Genova”,
“Camusina” và “Bonarcado” ở hai nồng độ (125, 250)mg/l vào thời điểm 2 tuần
trước khi thu hoạch và sau đó được bảo quản 180C trong 10 ngày, kết quả cho
thấy ở hai nồng độ trên màu sắc và độ cứng của sản phẩm cải thiện đáng kể so
với mẫu đối chứng. Thêm vào đó cường độ hô hấp và nồng độ ethylene giảm,
đặc biệt ở nồng độ 250mg/l, hạn chế sự phát triển của sâu và các mầm bệnh [9].
SV: Nguyễn Thị Trang

8

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Một nghiên cứu khác đối với quả lê, chất kháng ethylene (Retain- AVG)
giúp duy trì hương thơm và độ cứng của quả. Người ta tiến hành phun Retain AVG lên cây lê với các nồng độ khác nhau đó là: 560, 720, 830 mg/l. Kết quả
cho thấy rằng các quả lê thu hoạch ở những cây có sử dụng Retain AVG cho
màu sắc, kích thước, độ cứng đồng đều hơn so với những quả lê từ cây không
có sử dụng Retain - AVG. Trong đó, các quả lê được xử lý ở nồng độ 720 mg/l
là cho chất lượng quả tốt nhất.
Các nghiên cứu ứng dụng AVG trong nước
Nguyễn Văn Toàn và cs, 2009) đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất kháng
ethylene Retain-AVG (aminoethoxyvinylglycine) ở các nồng độ khác nhau
(0.0; 0.65; 0.8; 0.95; 1.1 g/l) kết hợp với bảo quản ở nhiệt độ thấp đến thời gian
bảo quản tươi cam tiêu. Kết quả nghiên cứu cho thấy: với nồng độ chất kháng
ethylene AVG 0.95g/l (thích hợp nhất), có kết hợp bảo quản nhiệt độ thấp ở
130C, thời gian bảo quản tươi cam tiêu kéo dài tới 43 ngày, so với 24 ngày khi

không sử dụng AVG.
Bảng 1.1. Các thông số so sánh về chất lượng của cam tiêu sau 24h [10].
Các thông số

Sử dụng AVG

Không sử dụng AVG

Cường độ hô hấp

5,02 mlCO2/kg.h

13,47 mlCO2/kg.h

Độ cứng

38,13 N/cm2

4,65 N/cm2

Hàm lượng đường tổng

2,98%

18,13%

Hàm lượng acid tổng

0,29%

1,25%

Tỷ lệ hư hỏng

0,91%

3,63%

XẠ KHUẨN STREPTOMYCES VÀ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT AVG
Sự phân bố của chủng Streptomyces trong tự nhiên
Streptomyces là chi lớn nhất của ngành Actinobacteria và là một chi
thuộc nhánh Streptomycetaceae. Có hơn 500 loài vi khuẩn Streptomyces đã
SV: Nguyễn Thị Trang

9

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

được mô tả. Giống như hầu hết các Actinobacteria khác. Vi khuẩn này được
tìm thấy chủ yếu trong đất và thảm thực vật mục nát. Streptomyces được nghiên
cứu rộng rãi và được biết đến nhiều nhất là chi của họ xạ khuẩn (Actinomyces).
Streptomyces thường sống ở đất có vai trò là vi sinh vật phân hủy rất quan
trọng. Chủng vi sinh này sản xuất hơn một nửa số thuốc kháng sinh trên thế
giới và đó là sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế.

Hình 1.4. Sơ bộ phân loại xạ khuẩn
Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa và phân loại của xạ khuẩn theo
ISP.
1.4.2.1. Đặc điểm hình thái.
Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Wakman và
Henrici đặt tên năm 1943. Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất. Các
đại diện này có hệ sợi khí sinh và hệ sợi cơ chất phát triển phân nhánh. Đường
kính sợi xạ khuẩn khoảng 1-10µm, khuẩn lạc thường không lớn có đường kính
khoảng 1-5mm.
Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất. Bề mặt khuẩn lạc
thường được phủ bởi khuẩn ty khí sinh dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi
có tính kị nước.Khuẩn lạc tạo thành từng cụm, bề mặt khô ráp, xù xì, dạng
phấn, không trong suốt, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ.
- Khuẩn lạc có chân khá vững chắc, khó tách ra khỏi môi trường nuôi cấy.
SV: Nguyễn Thị Trang

10

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

- Khuẩn ty cơ chất tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố hòa tan
trong nước, có sắc tố chỉ hòa tan trong dung môi hữu cơ.
- Khuẩn ty cơ chất mọc trong môi trường nuôi cấy, không phân cách trong
suốt quá trình phát triển.
- Khuẩn ty khí sinh: khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian dài trong

không khí thành những khuẩn ty khí sinh và có đường kính từ 1,0-1,4 µM.
Chuỗi bào tử được hình thành từ khuẩn ty ký sinh có nhiều hình dạng
khác nhau: thẳng, móc câu, xoắn, uốn cong.
Bào tử trần được hình thành do sự phân cắt của sợi bào tử, là cơ quan
sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bào tử trần có hình cầu, hình elipsoid, hình que,
hình trụ, các bào tử tập hợp với nhau thành chuỗi 3-50 bào tử hoặc nhiều hơn.
Bề mặt của bào tử có thể trơn nhẵn, xù xì, có gai hoặc có tóc.
1.4.2.2. Đặc điểm sinh lý sinh hóa
- Streptomyces là vi sinh vật dị dưỡng, có tính oxy hóa cao. Để phát triển
chúng phân giải các hydrat cacbon làm nguồn thức ăn cung cấp vật chất và
nguồn năng lượng đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh
bột. Chúng có thể khử nitrat thành nitrit.
- Streptomyces là vi sinh vật có thành tế bào là axit L-2,6 diaminopimelic
(L-ADP) và glyxin.
- Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia thành 4 loại: sắc tố hòa tan,
sắc tố khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid, sắc tố khuẩn lạc.
- Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu của chủng
thường là 25-300C, một vài loài có thể mọc ở nhiệt độ cao hơn, pH tối ưu của
chúng từ 6,8-7.5.
1.4.2.3. Các khóa phân loại xạ khuẩn
Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử, trên đầu sợi khí
sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào tử có những
hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc vòng...Bào tử
được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp phân đoạn và
SV: Nguyễn Thị Trang

11

Lớp: CNSH 1201

Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường
kình khoảng 1,5µm. Màng bào tử có thể nhẵn gai, khối u, nếp nhăn... tùy thuộc
vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy.
Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucose, các bào tử biểu
hiện các đặc điểm rất rõ. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng rất khác
nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi khi nuôi
cấy trên môi trường khác nhau. Vì vậy, Ủy ban Quốc tế về phân loại xạ khuẩn
(ISP) đã nêu ra các môi trường chuẩn và phương pháp chung để phân loại nhóm
vi sinh vật này.
Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn
Gram dương, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là 25300C, pH tối ưu 6,5-8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc
thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh).
Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các chất kháng sinh
ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật.
Cho đến nay, để xác định thành phần loài của chi Streptomyces, các nhà phân
loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác nhau [11,
12. 13, 14].

Hình 1.5. Hình thái khuẩn lạc và chuỗi bào tử chủng xạ khuẩn HLD 3.16

SV: Nguyễn Thị Trang

12

Lớp: CNSH 1201

Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Hình 1.6. Màu sắc khuẩn lạc một số loại xạ khuẩn
Khả năng sản xuất AVG của chủng Streptomyces
Cho đến nay, AVG (aminoethoxyvinylglycine) vẫn chủ yếu sản xuất
bằng con đường sinh học là sinh tổng hợp từ vi sinh vật mà cụ thể chủ yếu là
chủng Streptomyces sp.. Cũng có một số ít nghiên cứu sản xuất bằng con đường
tổng hợp hóa học với mục đích hạ giá thành sản phẩm (như sản xuất AVG từ
L-methionine (L. T. Chen và cộng sự, 2013) nhưng chưa có nghiên cứu nào
thành công mà mới chỉ dừng lại ở mức độ thăm dò, khảo sát.
Theo Mosnica Fernández và cộng sự, các gen hom, thrB và thrC, mã
hóa homoserine dehydrogenase, homoserine kinase (HK) và threonine
synthase, tương ứng, tham gia vào công đoạn cuối sinh tổng hợp threonine đã
được nghiên cứu trong Streptomyces sp. NRRL 5331 nhằm xác định vai trò của
các gen trên trong sinh tổng hợp của AVG. Tiến hành đột biến định hướng một
trong ba gen, kết quả cho thấy gen thrC không có ảnh hưởng đến sản xuất của
AVG, trong khi sự gián đoạn của thrB chặn HK hoạt động và giảm đáng kể
năng suất của chất chuyển hóa AVG, có thể là do sự tích tụ. Sự gián đoạn gen
hom (thrA) khiến sự sinh tổng hợp AVG hoàn toàn bị chặn. AVG cũng được
chứng minh là một sản phẩm ngoại bào của vi khuẩn Streptomyces sp..

SV: Nguyễn Thị Trang

13

Lớp: CNSH 1201

Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Hình 1.7. Sơ đồ mô tả con đường sinh tổng hợp AVG trong xạ khuẩn
Streptomyces NRRL 5331 (Mosnica Fernández và cộng sự, 2002)
Các phương pháp phân tích AVG sinh tổng hợp từ xạ khuẩn
Streptomyces
1.4.4.1. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng là hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography),
dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn
hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất trơ (thí dụ
như: silicagel hay oxid alumin). Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều,
phủ lên nền phẳng nhưtấm kiếng, tấm nhôm hay tấm plastic. Do chất hấp thu
được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp
mỏng.
 Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp
đậy.
 Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm của một loại hợp chất hấp thu
(silicagel, alumin,..) được tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên tấm kiếng, tấm

SV: Nguyễn Thị Trang

14

Lớp: CNSH 1201

Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

nhôm, hay tấm plastic. Chất hấp thu trên nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh
bột hay một lọai polymer hữu cơ.
 Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực
khác nhau. Sử dụng khoảng 1ul dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng 2-5%,
nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phái trên
cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng chứa trong bình.

Hình 1.8. Bình sắc ký lớp mỏng
 Pha động: dung môi hay hỗn hợp 2 dung môi, di chuyển chầm chậm dọc
theo tấm lớp mỏng, và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển càng
cao nhờ tính mao quản. Mỗi thành phần chất sẽ di chuyển với vận tốc khác
nhau, đi phía sau mực của dung môi. Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các
lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh
và tùy thuộc vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi.
 Ưu điểm:
- Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích
- Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều
kiện phân tích.
- Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc
ký lớp mỏng.

SV: Nguyễn Thị Trang

15

Lớp: CNSH 1201