Tối ưu hóa phương pháp tách chiết adn tổng số từ răng, xương người phục vụ công tác giám định adn tại viện khoa học hình sự bộ công an

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

KHOA HỌC HÌNH SỰ - BỘ CÔNG AN

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2013
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Đề tài :

KHOA HỌC HÌNH SỰ - BỘ CÔNG AN

Học viên:

Chuyên ngành:

Sinh học thực nghiệm

Mã số:

60 42 01 14

Ngƣời hƣớng dẫn:

PGS. TS. Nguyễn Văn Hà

HÀ NỘI - 2013
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/

HÀ NỘI - 2013


LỜI CẢM ƠN

–

PGS.
–

–

tôi

nghiên cứu và

này.
Viện Khoa học hình sự, Lãnh đạo

Tôi xin ch
Trung Tâm và toàn thể
–

–
.

.

.
11 năm 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/


M
................................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................6
1. Một số vấn đề về giám định gen ti thể ...............................................................6
.........................................6
1.2. Khái niệm về giám định gen ti thể ..................................................................7
1.3. Cơ sở khoa học và thực tiễn ............................................................................7

1.3.1. Ti thể và hệ gen ti thể ...............................................................................7
1.3.2. Cơ sở khoa học của giám định gen ti thể ...............................................10
1.4. Dị chất (heteroplasmy) trong ti thể ...............................................................15
1.5. Vùng chỉ thị ADN ti thể (vùng có tính đa hình cao) và các phương pháp
giám định ADN ti thể ...........................................................................................15
2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về lĩnh vực liên quan đến đề tài .17
2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước .................................................................17
2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .................................................................18
NG PHÁP NGHIÊN CỨU ................22
..............................................................................................................22
1.1. Thiết bị ...........................................................................................................22
1.1.1 Th

....................................................................................22
...................................................................................................23

1.2. Hóa chất .........................................................................................................23
2. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................23
2.1. Phương pháp làm sạch mẫu ..........................................................................24
2.2. Phương pháp nghiền mẫu..............................................................................24
2.3. Phương pháp tách chiết ADN ti thể ..............................................................24
2.4. Phương pháp tinh sạch ADN ti thể ...............................................................25
2.5. Phương pháp định lượng ADN ti thể............................................................25
2.6. Phương pháp PCR .........................................................................................25
2.7. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR, gắn BigDye ...................................26
2.8. Phương pháp chạy điện di, giải trình tự ADN ti thể ....................................26
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/

2.9. Tối ưu hóa phương pháp tách chiết ADN ti thể từ mẫu răng và xương người..26
2.9.1. Tối ưu hóa nồng độ chelex 100TM ........................................................26
......................................27
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN...........................28
1. Kết quả nghiên cứu..........................................................................................28
1.1. Kết quả tách chiết ADN ti thể .......................................................................28
1 đến 5 năm): ............28
từ 5 đến 10 năm): ..........29
1.2. Kết quả tối ưu hóa phương pháp tách chiết ADN ti thể từ mẫu răng và
xương người..........................................................................................................30
1.2.1. Kết quả tối ưu hóa nồng độ Chelex 100TM ..........................................30
..........................31
.......................32
1.3.1. Làm sạch mẫu răng và xương ................................................................32
1.3.2. Nghiền mẫu răng và xương ....................................................................32
1.3.3. Tách chiết ADN ti thể từ xương và răng bằng chelex 100™................33
1.3.4. Tách chiết ADN ti thể từ xương và răng bằng tách hữu cơ ..................33
1.3.5. Tách chiết ADN ti thể từ xương và răng bằng Kit Prepfiler .................34
1.3.6. Tinh sạch ADN sử dụng bộ kit DNA IQTM System ............................36
1.3.7. Định lượng ADN sử dụng bộ kit Human DNA Quantification ............36
1.3.8. Chuẩn bị và chạy phản ứng Nested PCR nhân bội sản phẩm ADN .....37
1.3.9. Phản ứng Sequencing (gắn Big Dye) .....................................................38
1.3.10. Chuẩn bị mẫu cho điện di giải trình tự.................................................38
1.3.11. Giải trình tự trên máy ABI 310 ............................................................39
..........................................................................................................41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................................43
1. Kết luận:............................................................................................................43
2. Kiến nghị: .........................................................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................45

PHỤ LỤC ....................................................................................................... 47
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/


- ADN

: Axit deoxyribonucleic

- ARN

: Axit ribonucleic

- CSĐT

: Cảnh sát điều tra

- DTT

: Dithiothreitol (tên hoá chất)

- KHHS

: Khoa học hình sự

- PCR

: Polymerase chain reaction (phản ứng nhân bội gen)

- PrK

: Proteinaza K

- STR

: Short tandem repeat (đoạn lặp lại ngắn)

- TS

: Tiến sĩ

- VNTR : Variable number of tenderm repeat (đoạn lặp có độ dài
trung bình)
-X
-R

: xương
: răng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/


Số hiệu bảng

Tên Bảng

1.1

3.1

Trang
12

Kết quả định lượng 3 phương pháp tách chiết đối với

28

mẫu răng, xương (thời gian chôn cất từ 1-5 năm)
3.2

Kết quả định lượng 3 phương pháp tách chiết đối với

30

mẫu răng, xương (thời gian chôn cất từ 5-10 năm)
3.3

Kết quả định lượng tối ưu hoá nồng độ chelex đối với

31

mẫu răng, xương (thời gian chôn cất từ 1-5 năm)
3.4

Kết quả định lượng tối ưu hoá thể tích d/d hạt từ đối

32

với mẫu răng, xương(thời gian chôn cất từ 5-10 năm)

HÌNH
Số hiệu hình

Tên hình

Trang

1.1

Ti thể trong tế bào người

8

1.2

Cấu trúc hệ gen ti thể người

11

1.3

Phả hệ xác định di truyền theo dòng mẹ ADN ti thể

14

inheritance (maternal)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/


Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công
tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

:
Giám định gen
90

20
không chỉ khắc phục được

những hạn chế của các phương pháp huyết thanh học trước đây mà còn giải
quyết được những vụ án bế tắc trước đó, những vụ án mà ADN là bằng chứng
duy nhất. Tính ưu việt của giám định gen là truy nguyên được cá thể người,
xác định huyết thống cha-con, xác định hài cốt…

giám định gen

tách chiết ADN nhân trong
máu, lông, tóc, tế bào niêm mạc miệng....Tuy nhiên, trong
công tác giám định kỹ thuật hình sự nói chung và đặc biệt là giám định ADN
hình sự nói riêng, đối tượng giám định thường là những mẫu vật đã ít nhiều
biến tính không còn nguyên vẹn nhiều khi chỉ là một chiếc răng hoặc một
mảnh xương gẫy vỡ lẫn trong môi trường tự nhiên một thời gian dài, với
những mẫu vật như vậy ADN nhân tế bào hầu như không còn tồn tại, để giải

quyết các yêu cầu điều tra đặt ra là xác định tung tích nạn nhân, đòi hỏi phải
tiến hành giám định ADN ti thể. Năm 2003 Viện Khoa học hình sự (KHHS)
được viện trợ một máy giải trình tự nhằm nâng cao năng lực giám định ADN
tại Viện, khi chuyển giao công nghệ các chuyên gia có giới thiệu về phương
pháp giám định ADN ti thể với một số hóa chất và thiết bị phụ trợ do họ sản
xuất, sau khi được tiếp cận với phương pháp giám định ADN ti thể mặc dù
chưa được trang bị hoàn chỉnh, thiếu qui trình chuẩn nhưng trước đòi hỏi ngày
càng cấp thiết của công tác điều tra phá án, phòng giám định gen Viện KHHS
đã vừa làm, vừa học thực hiện thành công một số vụ giám định ADN ti thể
nhưng kết quả nhiều khi không ổn định do chưa có qui trình phù hợp từ khâu

Nguyễn Xuân Quyền

1

Mã số: 60.42.01 14


Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công
tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

xử lý mẫu đến tách chiết, tinh sạch ADN ti thể. Tham khảo một số phương
pháp tách chiết ADN ti thể cả trong và ngoài nước nhận thấy có những
phương pháp tách chiết tận thu được ADN ti thể, bảo đảm chất lượng cho
phản ứng nhân gen (PCR) và giải trình tự, xong đều không phù hợp với điều
kiện chất lượng mẫu vật gửi giám định ADN ti thể ở nước ta hoặc cả về thời
gian tính, giá thành cũng như

.C

, các phương pháp tách chiết ADN ti thể thực hiện tại Viện KHHS - Bộ
không cho kết quả ổn định bởi vì đây là những phương pháp

Công an

được ứng dụng tự phát mang tính chất thăm dò và

, chưa đồng bộ

và có tính rủi ro cao, chưa trở thành quy trình chuẩn để áp dụng rộng rãi,
trong khi yêu cầu giám định ADN ti thể từ các mẫu răng và xương người
nhằm giải quyết các vụ án ngày một cao[16]. Theo thống kê tại phòng thí
nghiệm giám định gen tại Viện KHHS cho thấy năm 2004 có 4 yêu cầu, năm
2005 có 7 yêu cầu, năm 2006 có 12 yêu cầu, năm 2007 có 14 yêu cầu
17 yêu cầu

20 yêu cầu và năm 2012 là 22 yêu cầu với số

lượng ngày một nhiều
10 năm.
,

:

“Tối ƣu hoá phƣơng pháp tách chiết ADN
phục vụ công tác

từ răng, xƣơng ngƣời

–

”.
:

1. Đề tài hoàn thành sẽ đưa ra phương pháp tách chiết ADN ti thể hoàn
chỉnh từ mẫu răng và xương người ,

tối ưu

t

phù hợp với điều kiện phßng thÝ nghiÖm hiÖn cã t¹i ViÖn KHHS.
2. Góp phần hoàn thiện quy trình giám định ADN ti thể từ các mẫu
xương, răng người và

sẽ là quy trình chuẩn được áp

dụng để giám định ADN ti thể phục vụ giải quyết các vụ án hình sự cũng

Nguyễn Xuân Quyền

2

Mã số: 60.42.01 14


Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công

tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

như các yêu cầu dân sự. hoàn thiện hoá tính pháp lý của các quy trình
giám định ADN hình sự.
3. Hoàn thiện cơ sở lý luận về giám định ADN nói chung và ADN ti thể
nói riêng phục vụ cho công tác thực tiễn cũng như nghiên cứu và giảng dạy.
2. Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu thực nghiệm các phương pháp tách chiết ADN ti thể khác
nhau trên các mẫu răng, xương thu từ 02 bộ hài cốt người
1-5 năm và từ 5-10 năm.
- ADN tổng số bao gồm cả ADN nhân và ADN ti thể, trong khuôn khổ hạn
hẹp của đề tài, chúng tôi chỉ đặt ra mục tiêu và tập trung tối ưu hoá phương
pháp tách chiết ADN ti thể, để thu được lượng ADN ti thể có chất lượng cao
nhất, thu từ 02 bộ hài cốt người
1-5 năm và từ 5-10 năm, với tổng số 12 mẫu nghiên cứu là bột
răng và xương

phục vụ cho quá trình thực nghiệm.

- Quá trình nghiên cứu được tiến hành trong phòng thí nghiệm của Viện KHHS.
3. Nội dung nghiên cứu
Tham khảo tài liệu, dựa trên nguyên lý tách chiết ADN; nghiên cứu các
phương pháp tách chiết đang được sử dụng đề xuất 3 phương pháp tách chiết
có tính ưu việt khác nhau để tiến hành thử nghiệm đối với 12 mẫu răng xương
hài cốt gửi giám định.
1. Sử dụng 3 phương pháp:
+ Phương pháp 1: sử dụng chelex 100™ ở các nồng độ khác nhau (5%,
10% và 20%)
+ Phương pháp 2: sử dụng hỗn hợp Phenol-clofom-izoaminalcohol theo tỉ
lệ 25:24:1.

+ Phương pháp 3: sử dụng kit tách chiết Prepfiler (ABI System - Mỹ) với tỉ
lệ

Nguyễn Xuân Quyền

là 10µl, 15µl và 20µl.

3

Mã số: 60.42.01 14


Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công
tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

* Từ mẫu răng, xương

khoảng

(

từ 1 năm tới 5 năm) trên cùng một vị trí, sau khi nghiền, bột được chia đều
vào 6 ống ependoff 1,5ml để thực hiện đủ cho ba lô nghiên cứu với 3 phương
pháp tách chiết: 1 ống sử dụng chelex 100™ 10%, 1 ống sử dụng phương pháp
tách chiết hữu cơ sử dụng hỗn hợp phenol-clorofom-izoamilalcohol theo tỉ lệ
25:24:1 và 1 ống sử dụng bộ kit tách chiết Prepfiler với
là 10µl. như vậy trong mỗi lô, cả 3 phương pháp tách chiết đều
được tiến hành trên xương, răng của cùng một người với số lượng và chất

lượng như nhau. đây là điều kiện cần thiết để đánh giá, so sánh chính xác hiệu
quả của từng phương pháp tách chiết, tiến hành thực nghiệm 3 lần. Từ đó
.
* Từ mẫu răng, xương

khoảng từ 5

(

năm tới 10 năm) cũng sử dụng phương pháp tách chiết như trên để đánh giá
tối ưu được phương pháp tách chiết nào là hiệu quả nhất
.
2. Sản phẩm tách chiết được tinh sạch bằng kit tinh sạch IQ SystemTM và
định lượng bằng phương pháp Real-time PCR. Mỗi lô sau khi tách chiết ADN
bằng 3 phương pháp khác nhau sẽ được chạy phản ứng PCR tất cả các mẫu để
nhân bội đoạn HVI hoặc HVII.
3.Toàn bộ sản phẩm tách chiết bởi các phương pháp khác nhau được so
sánh, đánh giá bằng hình ảnh điện di đồ trên máy ABI 310 từ đó rút ra
phương pháp tách chiết cho kết quả tốt nhất.
4. Đánh giá tổng kết rút ra phương pháp tách chiết tối ưu.
5. Hoàn thiện quy trình giám định ADN ti thể đạt tiêu chuẩn trong khuôn
khổ đề tài.

Nguyễn Xuân Quyền

4

Mã số: 60.42.01 14