Bài thuyết trình Phát hiện nhanh chóng và chuyên biệt cho loài mới Xanthomonas oryzae pv. oryzae K3a bằng phương pháp PCR dựa vào Marker có nguồn gốc từ phương pháp AFLP.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------

• Môn học: Vi sinh nông nghiệp.
• Chủ đề:
PCR-Based Assay for Rapid and Specific Detection of the
New Xanthomonas oryzae pv. oryzae K3a Race Using an
AFLP-Derived Marker
J. Microbiol. Biotechnol. (2014),24(6), 732–739.
Eun-Sung Song, Song-Yi Kim, Tae-Hwan Noh, Heejung Cho, Soo-Cheon Chae, and Byoung-Moo Lee

GVHD: Th.S Trương Kim Phượng


I. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
II. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
III.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU


I. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• Phát hiện nhanh chóng và chuyên biệt cho
loài mới Xanthomonas oryzae pv. oryzae
K3a bằng phương pháp PCR dựa vào
Marker có nguồn gốc từ phương pháp
AFLP.


II. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.Bệnh cháy bìa lá lúa (bacterial blight of rice)

- Bệnh nghiêm trọng nhất trên lúa ở các nước châu Á, có thể gây
thiệt hại cao đến 50% khi đồng ruộng bị nhiễm bệnh nghiêm trọng
- Bệnh do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra.
- Cách thức lây truyền: xâm nhập thông qua các lỗ thủy khổng hoặc
vết thương của lá.

(Mew TW, Alvarez AM, Leach JE, Swing J. 1993. Focus on bacterial blight of rice. Plant Dis. 77:5-12)


• Triệu chứng: Phiến lá có những đường kẻ dài
không đều, có những vết có màu vàng khô
chạy dọc theo hai bìa lá (Agrios, 2005), rìa lá
bị quăn queo và lan ra khắp lá (Shamar, 2006).

Hình 1:
Biểu hiện của
bệnh cháy bìa
lá lúa.


2. Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae
(Xoo)
- Vi khuẩn Gram (–), hình que ngắn, 2 đầu tròn,
có một đuôi.
- Có vỏ giáp mô bao bọc (capsule) bảo vệ ngay
cả khi ở trong nước.
- Nhiệt độ thích nghi của vi khuẩn từ 26-30°C.
- Nguồn lây nhiễm: Nước kênh rạch, nước ruộng,
gốc rạ và rễ lúa.

3. Phương pháp PCR
(Polymerase chain reaction)

Hình 2: Minh họa phương pháp PCR


4. Phương pháp AFLP
( Amplified Fragment Length
Polymorphisms)
- Là sự đa dạng của các đoạn
DNA được nhân lên có định
hướng sau khi bị cắt bởi 2
enzyme giới hạn, sử dụng những
phân đoạn DNA làm khuôn cho
phản ứng khuếch đại PCR.
- Hình 3: Quy trình thực hiện
AFLP
Bước 1: Phản ứng cắt
Bước 2: Phản ứng nối
Bước 3: Tiền khuếch đại
Bước 4: Khuếch đại chọn lọc


III. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu
-. Sử dụng 119 chủng vi khuẩn Xanthomonas trong
nghiên cứu.
-. Nguồn vật liệu: Korean Agricultural Culture
Collection (KACC, Hàn Quốc), the Ministry of

Agriculture, Forestry and Fisheries (MAFF, Nhật Bản),
Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms
(BCCM, Bỉ) và Tiến sĩ T. H. Noh tại National Institute
of Crop Science (RDA, Hàn Quốc).


2. Phương pháp
a. Nuôi cấy vi khuẩn
-. Chủng Xanthomonas được nuôi cấy trên môi
trường YDC (2% D-glucose, 2% CaCO3, 1%
chiết xuất nấm men, và 1,5% agar) ở 28°C/ 48
giờ.
-. Các dòng Escherichia coli tăng trưởng ở
37°C/24 h trong môi trường Luria-bertani (LB)
có chứa 200μg/ml Ampicillin.


b. Xây dựng marker
nhận biết chuyên biệt cho
loài Xoo K3a nhờ
phương pháp AFLP
- Hình 4: Quy trình xây
dựng marker nhận biết
chuyên biệt loài Xoo K3a
 Dựa vào trình tự có
được từ phương pháp
AFLP, bộ mồi K3aF và
K3aR được thiết kế để
nhận biết chuyên biệt cho
loài Xoo K3a.

- Bảng 2: Oligonucleotide adapters và primers sử
dụng cho phương pháp AFLP


c. Thiết kế mồi và PCR đặc hiệu
- Thiết kế mồi

- Phản ứng PCR đặc hiệu:
Thành phần phản ứng PCR
– 50ng DNA mạch khuôn
– 10pmol K3aF
– 10pmol K3aR
– Tổng thể tích phản ứng: 20μl.


- Chu trình nhiệt phản ứng:
96 oC 960C
5s
5m
1X

600C
15s

720C 720C
5m
30s
25x

1X

40C

∞


d. Thử nghiệm PCR để xác định tác nhân gây bệnh
trên ruộng lúa
• Những lá của giống lúa IR24 50 ngày tuổi được làm
nhiễm nhân tạo bằng cách cắt đỉnh lá, ngâm vào
dịch vi khuẩn Xoo chủng HB0100 với mật độ 109 tế
bào/ 1ml, trồng trong nhà kính với nhiệt độ 25300C, với độ ẩm tương đối 60%.
• Mẫu lá được thu nhận với kích thước từ 1-8 cm từ vị
trí tổn thương vào ngày thứ 1, 2, 3, 4, 5 ngày.
• Mỗi mẫu được ngâm trong 200μl nước cất trong 20
phút. Lấy 10 μl dịch tiết làm mẫu cho thử nghiệm
PCR.


IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Nhận biết chuyên biệt loài Xoo K3a nhờ marker
có nguồn gốc từ AFLP
-. Bộ mồi K3aF và K3aR khuếch đại được sản phẩm
có kích thước 1.024 bp  Nhận biết chuyên biệt
loài Xoo K3a.
-. Kết quả: Bộ mồi đã nhận biết chuyên biệt được 13
mẫu thuộc loài Xoo K3a trong 119 mẫu thuộc chủng
Xanthomonas.

- Bảng 1: Danh sách dòng vi khuẩn sử dụng trong bài


- Hình 5: Điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR
khuếch đại dòng Xoo sử dụng bộ mồi chuyên biệt
K3aF và K3aR


- Hình 6: Điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR
khuếch đại từ loài Xoo K3a và chủng Xanthomonads khác,
sử dụng bộ mồi chuyên biệt K3aF và K3aR

+ Lane 1 – 13: loài Xoo K3a ( thứ tự 73 – 85 ở bảng 1)
+ Lane 14 – 39: dòng Xanthomonads khác ( thứ tự 94 – 119 trong bảng 1)


2. Phương pháp PCR xác định loài Xoo K3a gây
bệnh trên ruộng lúa
- Hình 7: Phương pháp PCR phát hiện loài Xoo
K3a trên lá lúa
(A) Lá lúa sau 5 ngày tiêm
nhiễm nhân tạo vi khuẩn Xoo
HB01001
(B) Phương pháp PCR phát hiện
tác nhân từ những vị trí khác
nhau của mẫu lá lúa (A)
Lane M: Thang kích thước phân
tử

Lane C: Đối chứng dương Xoo
HB01001
Lane 1-8: Mẫu lầy từ vị trí 1 – 8
cm từ vị trí thương tổn


- Hình 8: Phương pháp PCR phát hiện tác nhân trên lá
lúa từ 0 -5 ngày sau khi tiêm nhiễm nhân tạo Xoo
HB01001
Lane M: Thang
kích thước phân tử
Lane C: Đối chứng
dương Xoo
HB01001
Lane 0 -5: Mẫu lá
sau 0 -5 ngày tiêm
nhiễm nhân tạo Xoo
HB01001


NHÓM THỰC HIỆN – NHÓM 3
1. Trần Thị Thùy Trinh 1253012428
2. Nguyễn Thị Nga 1253012214
3. Phạm Thị Thu An1253010003
4. Thiều Hồng Huệ 1253010139
5. Nguyễn Thị Hương 1253012147
6. Nguyễn Anh Khuyến

1253010136

7. Lâm Thị Thanh Tâm1253010325
8. Nguyễn Quỳnh Anh 1253012008
9. Nguyễn Trần Hải Nam 1253012208
10.Trương Thị Xuân Diểm 1253010048
11.Lương Thị Bích Thuận 1253010378
12. Phan Trần Anh Tuấn

0853011035


Xin cảm ơn cô và các
bạn đã lắng nghe