KHẢO SÁT độ ổn ĐỊNH CỦA KIT THỬ RPM để ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN THỊ HÀ

KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA KIT THỬ
RED PYROGALLOL-MOLYBDAT
ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh
2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN THỊ HÀ

KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA KIT THỬ
RED PYROGALLOL-MOLYBDAT
ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Giảng viên hướng dẫn: ThS. NGUYỄN THỊ MINH THUẬN

Thành phố Hồ Chí Minh
2014


Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học
Năm học 2013-2014
KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA KIT THỬ RED PYROGALLOL
MOLYBDAT ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU
Sinh viên thực hiện: Trần Thị Hà
Thầy hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Minh Thuận
Đặt vấn đê
Cũng như các thành phẩm thuốc, các sản phẩm thuốc thử sử dụng trong sinh hóa
cũng cần đảm bảo hiệu quả và chất lượng từ khi sản xuất đến khi hết hạn dùng. Bởi
vậy nhà sản xuất phải nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm để xác định tuổi thọ của
chế phẩm và đưa ra hạn. Chúng tôi thực hiện đề tài với mục tiêu khảo sát độ ổn định
của kit thử red pyrogallol – molybdat để định lượng protein niệu với quy trình đa
được tối ưu hoá.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Pha chế 3 lô thuốc thử red pyrogallol molybdat và tiến hành định lượng protein niệu
bằng phương pháp đo quang theo quy trình đa được tối ưu hóa. Thẩm định quy trình
này. Sau đó khảo sát độ ổn định của 3 lô thuốc thử red pyrogallol molybdat được
sản xuất theo công thức được tối ưu hóa bằng các phương pháp dài hạn, lao hóa cấp
tốc và gây stress. Dựa vào số liệu tiến hành độ ổn định để tính tuổi thọ của của 3 lô
theo phương pháp Van’t Hoff và tính tuổi thọ trung bình của thuốc thử.
Kết qua
Quy trình tối ưu đạt các yêu cầu thẩm định. Tuổi thọ của thuốc thử tính toán được
theo phương pháp Van’t Hoff của thuốc thử tính là 30 tháng.

Kết luận
Chúng tôi xác định được tuổi thọ của thuốc thử red pyrogallol molybdat pha được là
30 tháng.


Final essay for the degree of B.S.Pharma
Academic year: 2013 -2014
EXAMINE THE STABILITY OF THE PYROGALLOL RED MOLYBDATE
TEST KIT FOR QUANTITATIVE PROTEINURIA
Tran Thi Ha
Supervisor: MA. Nguyen Thi Minh Thuan
Abstract
Introduction and objectives: Like other drug products, reagents products use in
biochemistry should also ensure efficiency and quality from production to the end
use. So manufacturers have to study the stability of preparations to determine the
longevity of medication and take out of life shelf. We take this subject with the aim
of examining the stability of pyrogallol red test kit-molybdates proteinuria to
quantify the processes optimized.

Matherials and method: Three batches of reagent red pyrogallol molybdate were
mixed. Proteinuria was determined by a spectrophotometry method using RPM
reagent with the process optimized. This process was evaluated. Then, 3 batches of
red pyrogallol molybdate reagents produced according to the formula which is
optimized were examined the stability by using the long term, accelerate and cause
stress method. Based on demographic to calculate the longevity of 3 batches
according to Van't Hoff approach and calculated the average life expectancy of a
reagent.
Results: Optimal quantitative process achieves the required of validation criteria.
The lifespan of reagent is calculated by the Van't Hoff method is 30 months.
Conclusion: We determined the longevity of red pyrogallol molybdat reagent which

is mixed was 30 months.


5

LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành đến cô ThS. Nguyễn Thị Minh Thuận
đa tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ, vạch ra những hướng đi cũng như hướng giải quyết
những khó khăn trong suốt thời gian em thực hiện đề tài để em có thể hoàn thành tốt
khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn cô PGS.TS. Võ Thị Bạch Huệ đa dành thời gian góp y
phản biện giúp cho đề tài khóa luận của em được hoàn chỉnh hơn.
Em xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS. Trần Thanh Nhan đa hướng dẫn và truyền
đạt những kinh nghiệm quy giá cho khóa luận của em được hoàn thành tốt và đúng
thời hạn.
Em xin chân thành cảm ơn các anh chị ở Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thành phố
Hồ Chí Minh và công ty dược phẩm OPC đa giúp đỡ em trong việc gửi mẫu và lấy
mẫu trong quá trình thực hiện đề tài.
Em xin cảm ơn các thầy cô, các anh chị trong bộ môn Hóa Sinh và các bạn đa nhiệt
tình giúp đỡ trong thời gian thực hiện khóa luận.

Trần Thị Hà


6

MỤC LỤC


7

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Từ gốc

Ý nghĩa

Abs

Absorbance

Độ hấp thu

BCA

Bicinchoninic acid

BN

Bệnh nhân

CV

Coefficient of variation

EDTA

Ethylen diamin tetraacetic acid

LLOQ

Lower limit of quantitation

Giới hạn định lượng dưới

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantitation

Giới hạn định lượng

N/A

Not available

Dữ liệu không xác định

NKM

Người khỏe mạnh

RH

Relative Humidity

RP

Red Pyrogallol

RPM

Red Pyrogallol – Molybdat

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Standard deviation

Độ lệch chuẩn

TB

Trung bình

UV – Vis

Ultraviolet – Visible

VNĐ

Việt Nam Đồng

WHO

World Health Organization

Hệ số biến thiên

Độ ẩm tương đối

Tử ngoại – khả kiến
Tổ chức Y tế thế giới


8

DANH MỤC HÌNH


9

DANH MỤC BẢNG


10

DANH MỤC PHỤ LỤC

11

Chương 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Cũng như các thành phẩm thuốc, các sản phẩm thuốc thử sử dụng trong sinh hóa
cũng cần đảm bảo hiệu quả và chất lượng từ khi sản xuất đến khi hết hạn dùng. Bởi
vậy ở bất kì nước nào, khi nghiên cứu đưa ra thị trường một chế phẩm thuốc hay
thuốc thử, bên cạnh các nghiên cứu công thức, hiệu quả, tác dụng… nhà sản xuất
phải nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm để xác định tuổi thọ của chế phẩm và đưa
ra hạn dùng. Phương pháp nghiên cứu đa được ly thuyết hóa theo các quy định
chung nhất. Có thể nghiên cứu độ ổn định theo phương pháp bảo quản dài hạn ở
điều kiện bảo quản tự nhiên hay bảo quản ngắn hạn ở điều kiện lao hóa cấp tốc hoặc
cả hai.
Theo quy chế đăng kí lưu hành thuốc của Bộ y tế Việt Nam, một trong những điều
kiện để chế phẩm được lưu hành là phải có đề cương và kết quả nghiên cứu độ ổn
định của chế phẩm, tuổi thọ của chế phẩm phải lớn hơn hạn dùng [4].
Protein niệu là một trong những xét nghiệm thường quy đóng vai trò quan trọng
trong chẩn đoán và điều trị các bệnh liên quan đến thận, tim và chức năng tuyến
giáp. Thuốc thử red pylogallol – molybdat (RPM) được sử dụng rộng rai trên thế
giới và Việt Nam trong xác định protein niệu. Nhưng ở nước ta hiện nay chưa có cơ
sở nào sản xuất thuốc thử này. Trong các nghiên cứu trước đây, Phùng Thị Hoàng
Nhi đa thực hiện đề tài “Thiết kế và tối ưu hóa quy trình định lượng protein niệu
bằng phương pháp red pyrogallol molybdat”. Tuy nhiên đề tài mới chỉ xây dựng
được công thức thuốc thử và quy trình tiến hành định lượng protein niệu tối ưu mà
chưa tiến hành khảo sát độ ổn định của thuốc thử.
Vì vậy nhằm hướng đến mục tiêu sản xuất rộng rai bộ kit thử RPM để phục vụ công
tác nghiên cứu và sử dụng trong xét nghiệm, chúng tôi tiếp tục thực hiện đề tài
“Khảo sát độ ổn định của kit thử red pyrogallol – molybdat để định lượng protein
niệu” với quy trình đa được tối ưu hóa bằng phần mềm INForm v4.0, 2010
(Intelligensys Ltd) [9]. Mục tiêu của đề tài là:

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 1. Đặt vấn đê


12
1. Khảo sát độ ổn định của kit thử RPM đa tối ưu hóa bằng các phương pháp tự nhiên
và lao hóa cấp tốc.
2. Xác định tuổi thọ và hạn dùng của bộ kit thử RPM.

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 1. Đặt vấn đê


13

Chương 2. TỔNG QUAN
2.1.

ĐẠI CƯƠNG VỀ PROTEIN NIỆU

Trong nước tiểu bình thường chỉ có một ít protein huyết tương có kích thước nhỏ
qua được cầu thận nhưng lại được tái hấp thu hoàn toàn hoặc gần hoàn toàn khi qua
ống thận. Vì thế với các phương pháp xét nghiệm thông thường xem như âm tính
không có protein, với các phương pháp có độ nhạy cao có thể đo được lượng
protein trong nước tiểu 24 giờ có khoảng 30 mg trong đó 30% albumin và 70% là
globulin. Thực tế thì trong nước tiểu có khoảng 50 – 150 mg protein/ 24 giờ [8],
[10].
Lượng protein đào thải hằng ngày phụ thuộc vào tuổi, giới tính, tư thế đứng lâu,
hoạt động của cơ, chế độ ăn [3].

2.2.

PHÂN LOẠI PROTEIN NIỆU

Phân tích protein niệu bằng điện di, người ta phân biệt được hai loại protein niệu
nguồn gốc cầu thận và nguồn gốc ống thận [10].

2.2.1. Protein niệu do cầu thận
Thường do tăng tốc độ lọc qua cầu thận hoặc do tăng độ khuếch tán khi nồng độ
protein trong máu cao [10]. Khi lượng protein trên 3500 mg trong nước tiểu mỗi
ngày thì gọi là hội chứng thận hư [3].
Protein niệu do độ lọc cầu thận tăng khi nước tiểu có albumin huyết tương (như:
hemoglobin, chuỗi nhẹ của globin trong u tủy…). Trường hợp này thường do tổn
thương cầu thận làm tăng độ thẩm thấu của thận, gặp ở các bệnh ly như viêm cầu
thận, viêm thận nhiễm mỡ [10].
Protein niệu do độ khuếch tán tăng là khi nước tiểu có albumin và các protein có
kích thước lớn hơn albumin. Thường gặp trong trường hợp nồng độ protein ở máu
cầu thận tăng hoặc khi có sự ứ đọng lưu lượng cầu thận tiếp giáp với màng lọc như
protein niệu do suy tim, tắc tĩnh mạch thận, có thai …[10].
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 2. Tổng quan


14

2.2.2. Protein niệu do ống thận
Trường hợp này ít gặp hơn, trong nước tiểu xuất hiện các protein có trọng lượng
phân tử nhỏ hơn albumin (đặc biệt là α1 và β2 microglobulin). Nguyên nhân là do rối
loạn tái hấp thu protein đa được lọc bình thường bởi cầu thận. Thường gặp trong
các trường hợp tổn thương bẩm sinh ống thận ở trẻ em, ngộ độc bởi kim loại nặng.
Ngoài ra, cũng có thể gặp protein niệu do viêm hoặc tổn thương đoạn dưới của
đường tiết niệu, bàng quang hay niệu quản, gọi là protein niệu sau thận [10].
Tỷ lệ albumin/ globulin trong protein niệu từ 5 – 10. Tỷ lệ này tăng trong viêm thận

mạn tính, viêm thận cấp tính, thận hư… do albumin thoát ra ngoài nước tiểu quá
nhiều, giảm trong viêm thận cấp tính nặng, thoái hóa thận do globulin ra ngoài nước
tiểu quá nhiều [8].

2.3.

CÁC BỆNH LÝ LIÊN QUAN ĐẾN PROTEIN NIỆU
Khi chẩn đoán các bệnh liên quan đến thận, cầu thận cần phân biệt rõ về mặt triệu
chứng học. Nếu tình trạng protein niệu xảy ra liên tục (hay thường xuyên) thì có thể
là do các bệnh ly về thận gây ra. Nếu tình trạng protein niệu xảy ra không liên tục
(gián đoạn) thì có thể là do rối loạn chức năng, trường hợp này thường do gắng sức,
lao động nặng, đứng lâu hay do vận mạch, rét, cảm động [10].

2.3.1. Protein niệu sinh ly
Protein xuất hiện ít (<150 mg/ 24h) và không thường xuyên trong các trường hợp:
Ở trẻ sơ sinh khi thận chưa hoạt động tốt, thường sau 4 – 10 ngày thì hết; sau bữa ăn
nhiều chất đạm; do tư thế đứng và gắng sức hay gặp ở trẻ và thanh thiếu niên, ít gặp
ở người lớn tuổi [8].

2.3.2. Protein niệu bệnh ly
Khi điện di protein niệu, người ta phân biệt được 4 loại protein niệu bệnh ly [10]:
− Protein niệu toàn phần: Có mặt tất cả các thành phần protein huyết thanh, gặp
trong viêm cầu thận nặng.

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 2. Tổng quan


15
− Protein niệu chọn lọc: Chủ yếu có albumin huyết thanh và β – globulin, gặp
trong hội chứng thận có tổn thương nhỏ ở cầu thận.

− Globulin niệu chọn lọc: Chủ yếu có α1 và β – globulin. Tỷ lệ albumin huyết
thanh thấp do nguồn gốc ống thận, gặp trong viêm ống thận kẽ cấp, viêm ống
thận bẩm sinh, bệnh Wilson, galactose niệu.
− Protein niệu Bence – Jones có β, γ– globulin với sự hiện diện của albumin huyết
thanh hoặc không, còn gọi là protein nhiệt tan (chỉ tủa ở 60 – 70 oC) gặp trong
đau tủy xương.

2.4.

CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU
2.4.1. Phương pháp đo độ hấp thu tử ngoại
Có hai phương pháp đo độ hấp thu tử ngoại là đo độ hấp thu ở bước sóng 205 nm và
ở bước sóng 280 nm.

2.4.1.1. Đo độ hấp thu ở bước sóng 205 nm
Nguyên tắc: Liên kết peptid hấp thụ ánh sáng ở bước sóng tối đa dưới 210 nm. Tuy
nhiên, đỉnh hấp thu rộng của liên kết peptid cho phép đo ở các bước sóng dài hơn,
có thể có nhiều lợi thế thực tế về thiết bị và sự chính xác của phép đo. Do sự tác
động từ các dung môi và các thành phần của đệm sinh học, độ hấp thu thường được
đo ở bước sóng từ 214 – 220 nm [22], [24].
Ưu điểm: Dễ thực hiện, nhạy hơn và ít biến đổi hơn phép đo ở 280 nm do trong
phân tử protein có một lượng lớn liên kết peptid. Định lượng các dung dịch pha
loang. Có thể sử dụng để đo lường liên tục trong sắc ky cột hoặc để phân tích các
chuỗi acid amin chứa rất ít acid amin thơm [22], [24].
Nhược điểm: Độ chính xác không cao, bị ảnh hưởng bởi các chất can thiệp như chất
tẩy rửa, acid nucleic, các giọt mỡ [22], [24].

2.4.1.2. Đo độ hấp thu ở bước sóng 280 nm

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 2. Tổng quan

16
Protein thể hiện phổ hấp thu tử ngoại đặc trưng khoảng 280 nm vượt trội từ acid
amin thơm tyrosin và tryptophan [22], [24]. Đo độ hấp thu mẫu thử ở bước sóng
này và so với đường chuẩn để tính nồng độ protein.
Ưu điểm: Nhanh, đơn giản [22].
Nhược điểm: Độ chính xác không cao, kém nhạy, nếu chuỗi ban đầu chứa ít hoặc
không chứa những acid amin tyrosin và tryptophan thì phương pháp này sẽ cho kết
quả không đúng và cần dung dịch chuẩn có thành phần acid amin tương tự mẫu thử.
Dễ bị các yếu tố khác tác động (trilon X-100, acid nucleic, các giọt mỡ) [22], [24].

2.4.2. Phương pháp huỳnh quang
Nguyên tắc: Nồng độ protein được xác định dựa trên sự phát huỳnh quang của các
acid amin thơm như tryptophan, tyrosin, phenylalanin. Các acid amin này tạo huỳnh
quang với thuốc thử trong môi trường kiềm pH từ 8,0 – 10,5. Bước sóng kích thích
là 340 nm và bước sóng phát xạ từ 440 – 455 nm. Sự phát quang của mẫu thử được
đo và tính toán dựa trên đường chuẩn được hình thành từ các mẫu chuẩn protein
[22], [24].
Ưu điểm: Cải thiện độ nhạy, khoảng tuyến tính so với phương pháp đo độ hấp thu
[24].
Nhược điểm:
− Có sự khác biệt giữa các loại protein tùy thuộc số lượng các acid amin. Bị tác động
bởi các glycin và amin có chứa đệm, các ion amoni, và thiol phổ biến trong nhiều
hệ đệm sinh học [24].
− Thường đo huỳnh quang của tryptophan vì tỷ lệ phát xạ của phenylalanin là không
đáng kể, còn tyrosin cũng không còn phát xạ nếu ở dạng ion hay ở gần một nhóm
amin, carboxyl hay L- tryptophan.

2.4.3. Phương pháp đo độ đục

Nguyên tắc chung: Protein bị kết tủa bởi các tác nhân hóa học, sau đó đem đo độ
đục trên máy đo quang.
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 2. Tổng quan


17

2.4.3.1. Phương pháp dùng acid sulfosalicylic
Nguyên tắc: Acid sulfosalicylic kết hợp với protein tạo thành tủa. Đo độ đục của
dung dịch ở bước sóng 600 nm [2], [16].
Ưu điểm: Đặc hiệu, nhạy với albumin hơn các protein khác.
Nhược điểm: Độ chính xác không cao, bị cản trở bởi một số chất khác trong nước
tiểu.

2.4.3.2. Phương pháp dùng acid tricloracetic
Nguyên tắc: Acid tricloracetic gây kết tủa protein. Dung dịch thu được đem đo độ
đục ở bước sóng 420 nm [16].
Ưu điểm: Ít bị ảnh hưởng bởi các chất trong nước tiểu hơn phương pháp acid
sulfosalicylic.
Nhược điểm: Bị ảnh hưởng bởi các thuốc, phải bảo quản nước tiểu luôn luôn ở 20 –
25 oC.

2.4.3.3. Phương pháp dùng benzethonium clorid
Nguyên tắc: Benzethonium clorid tạo tủa với protein trong môi trường kiềm. Đo độ
đục ở bước sóng 505 nm [16].
Ưu điểm: Độ đục ổn định, ít bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ hơn hai phản ứng trên.
Nhược điểm: Tạo độ đục khác nhau đối với các protein khác nhau.

2.4.4. Phương pháp đo màu
2.4.4.1. Phương pháp biuret

Nguyên tắc: Phản ứng biuret dựa trên sự hình thành phức hợp của các ion Cu 2+ với
các protein trong môi trường kiềm (pH ≥ 12). Thêm đồng sulphat vào dung dịch
protein trong dung dịch kiềm mạnh, hình thành phức hợp giữa các ion Cu 2+ và các
liên kết peptid tạo ra dung dịch có màu tím, đem đo quang ở bước sóng 545 nm [1],
[19], [27].
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 2. Tổng quan


18

Hình 2.1. Phản ứng biuret
Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện.
Nhược điểm: Kém nhạy so với các phản ứng màu khác, bị ảnh hưởng bởi các thành
phần dung dịch (đệm tris, ion amoni, sucrose, dextran và glycerol).

2.4.4.2. Phương pháp Lowry
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng biuret, gồm 2 giai đoạn [15], [22], [24], [27]:
− Giai đoạn 1: Phản ứng Biuret: Phản ứng biến đổi Cu 2+ thành Cu+ bằng protein trong
môi trường kiềm có chứa tartrat ở nhiệt độ phòng.
− Giai đoạn 2: Phản ứng của các acid amin tyrosin, tryptophan (chủ yếu), cystein,
cystin, histidin (ít) với thuốc thử Folin – Ciocalteau (hỗn hợp phosphomolybdat và
phosphotungstat). Thuốc thử này bị khử thành heteropolymolybdenum có màu
xanh. Đo quang ở bước sóng 650 – 750 nm, hấp thu cực đại ở bước sóng 750 nm
[15], [22], [24], [27].
Ưu điểm: Đơn giản, nhạy, chính xác.
Nhược điểm: Phụ thuộc thành phần acid amin trong protein, dễ bị tác động bởi các
chất khác như acid mạnh, amoni sulfat, chất tẩy rửa, ion kali, natri phosphat … [21],
[26].

2.4.4.3. Phương pháp Bicinchoninic Acid (BCA)

Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng biuret, gồm 2 giai đoạn:

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 2. Tổng quan


19
− Giai đoạn 1: Phản ứng Biuret: Cu 2+ phản ứng với các acid amin cystein, cystin,
tryptophan, tyrosin và các liên kết peptid tạo thành Cu+.
− Giai đoạn 2: BCA tạo phức chelat với Cu+ tạo thành sản phẩm màu tím đậm. Đo độ
hấp thu ở bước sóng 540 – 590 nm, hấp thu cực đại ở 562 nm [22], [24], [27].

Hình 2.2. Phản ứng BCA với Cu+
Ưu điểm: Tăng độ nhạy cảm và khoảng tuyến tính so với phương pháp Lowry.
Nhược điểm: Bị tác động bởi nhiều chất cũng có khả năng tạo phức với Cu +
(EDTA, đường khử…).

2.4.4.4. Phương pháp Bradford
Nguyên tắc: Dựa trên sự thay đổi màu sắc của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant
Blue G – 250 khi tạo phức với protein trong môi trường acid dẫn đến sự thay đổi
bước sóng hấp thu cực đại. Khi chưa kết hợp với protein, thuốc nhuộm tồn tại ở
dạng cation có màu nâu xanh lá hấp thu cực đại ở 465 nm. Khi đa tạo phức với
protein sẽ chuyển thành dạng anion có màu xanh dương hấp thu cực đại ở 595 nm
[14], [22], [27].

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 2. Tổng quan


20

Hình 2.3. Phản ứng của Coomassie Brilliant Blue G – 250

Ưu điểm: Đơn giản, tiện lợi, nhanh (thời gian màu hình thành khoảng 2 phút), chính
xác, ít bị ảnh hưởng bởi các chất cản trở, nhạy hơn những phương pháp trên nhiều
[17] [21], [26], [30].
Nhược điểm: Màu thuốc thử dính cốc, còn bị tác động bởi một số chất (chất tẩy rửa,
tris 100 …) [17] [21], [26], [30].

2.4.4.5. Phương pháp Red Pyrogallol – Molybdat
Nguyên tắc: Thuốc nhuộm red pyrogallol kết hợp với molybdat tạo thành phức hợp
màu đỏ có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 470 nm trong môi trường acid [20]. Khi
cho phức hợp này phản ứng với nhóm acid amin trong phân tử protein sẽ tạo thành
phức hợp màu tím, có bước sóng hấp thu cực đại từ 578 – 612 nm, thường được đo
ở bước sóng 600 nm. Độ hấp thu này tỉ lệ thuận với nồng độ protein [12], [23], [25],
[26], [28] [33].

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 2. Tổng quan


21

Hình 2.4. Phản ứng kết hợp của red pyrogallol với molybdat
Ưu điểm: Đơn giản, nhanh, chính xác, nhạy, khoảng tuyến tính rộng [12].
Nhược điểm: Bị ảnh hưởng bởi nhóm aminoglycosid. Tùy thuộc nồng độ thuốc
nhuộm trong thuốc thử, bị ảnh hưởng bởi loại protein [27].

2.5.

ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
2.5.1. Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu hay tính chọn lọc của một quy trình định lượng là khả năng cho phép
xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi sự có

mặt của các chất khác có trong mẫu thử [6], [32].

2.5.2. Tính tuyến tính
Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả của phương
pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được
và nồng độ [6], [32].
Để xây dựng đường tuyến tính, sử dụng day nồng độ thường gồm từ 6 đến 8 mẫu,
trong đó có mẫu ở nồng độ giới hạn định lượng dưới (LLOQ). Để đường chuẩn có y
nghĩa thì ít nhất 4 trong 6 mẫu định lượng có độ lệch thực nghiệm ≤ 20% (đối với
mẫu ở nồng độ LLOQ) hoặc ≤ 15% (đối với các mẫu có nồng độ lớn hơn LLOQ)
[6].
Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng hệ số tương quan R hay giá trị bình phương
của hệ số tương quan R2. Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có khoảng khảo sát đường
biểu diễn là một đoạn thẳng tuân theo phương trình [6]: y = bx + b0.

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 2. Tổng quan


22

2.5.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
2.5.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn phát hiện của một quy trình là lượng thấp nhất của chất cần phân tích
trong mẫu mà còn có thể phát hiện được nhưng không nhất thiết phải chính xác hàm
lượng [6], [32].

2.5.3.2. Giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn định lượng của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất cần
phân tích có trong mẫu thử còn có thể xác định với độ đúng, độ chính xác thích hợp
[6].

2.5.4. Độ chính xác
Độ chính xác là mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng biệt so với giá trị trung
bình thu được. Để xác định độ chính xác, thường sử dụng ba mức nồng độ khác
nhau của mẫu thử là thấp (trong giới hạn không quá 3 lần giới hạn định lượng dưới
LLOQ), trung bình (khoảng giữa của khoảng tuyến tính) và cao (gần đường biên
trên của khoảng tuyến tính). Mỗi nồng độ tiến hành với ít nhất 5 mẫu thử. Độ chính
xác được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) hay hệ số phân tán (CV%)
và phải nằm trong khoảng 15% hoặc trong khoảng 20% đối với giá trị ở giới hạn
định lượng dưới [32].
Trong phân tích sinh học, độ chính xác được phân biệt thành độ chính xác cùng
ngày (tương đương độ lặp lại trong phân tích hóa học) và độ chính xác khác ngày
(tương đương độ chính xác trung gian) [6], [32].

2.5.5. Độ đúng
Độ đúng là mức độ sát gần của các giá trị tìm thấy và giá trị thực của cùng một mẫu
thử trong điều kiện nhất định [6], [32].
Độ đúng thường được xác định với 3 mức nồng độ khác nhau như xác định độ
chính xác. Mỗi nồng độ tiến hành với ít nhất 5 mẫu thử [32].

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 2. Tổng quan


23
Độ đúng không nhất thiết phải là 100% nhưng phải ổn định và chính xác trong giới
hạn cho phép. Độ lệch thực nghiệm giữa giá trị trung bình đo được và giá trị thực
nên nằm trong khoảng 15% hoặc 20% đối với giá trị ở giới hạn định lượng dưới
[32].

2.6.

ĐỘ ỔN ĐỊNH
2.6.1. Đại cương vê độ ổn định
2.6.1.1. Một số khái niệm

− Độ ổn định của thuốc là khả năng của thuốc (nguyên liệu hay thành phẩm) giữ
nguyên các đặc tính vốn có về vật ly, hóa học, vi sinh học, các đặc tính trị liệu và
độc tính trong một khoảng thời gian nhất định được bảo quản trong đồ bao gói
chuyên dụng trong một điều kiện bảo quản nhất định [7], [34].
− Tuổi thọ của thuốc là khoảng thời gian mà thuốc còn đáp ứng các yêu cầu chất
lượng như đa quy định trong điều kiện bảo quản đúng [7].
Hiện nay, hạn dùng là khoảng thời gian mà [7]:
• Thuốc vẫn được ổn định khi được bảo quản trong những điều kiện qui định.
• Thuốc vẫn còn giữ được 90% hàm lượng hoạt chất ghi trên nhan (trừ một số
trường hợp đặc biệt)
• Tạp phân hủy chưa vượt quá giới hạn cho phép
Hạn dùng = tuổi thọ + thời điểm xuất xưởng
− Vùng khí hậu: theo WHO, thế giới được chia thành 4 vùng khí hậu như bảng 2.1
[34].
Bang 2.1. Vùng khí hậu theo WHO
Vùng khí hậu

Tính chất

Điêu kiện bao quan

Nước tiêu biểu

I

Ôn hòa

21 oC – RH = 45 %

Bắc Âu, Canada

II

Cận nhiệt đới

25 oC – RH = 60 %

Đông Âu, my

III

Nóng, khô

30 oC – RH = 35 %

Trung Đông, Iran

IV

Nóng, ẩm

30 oC – RH = 75 %

Asian, brazil

Theo sự phân chia này, Việt Nam thuộc vùng khí hậu IV.
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 2. Tổng quan


24

2.6.1.2. Mục tiêu nghiên cứu độ ổn định
Độ ổn định là một yếu tố quan trọng của chất lượng, độ an toàn và hiệu lực của chế
phẩm. Chế phẩm sau khi sản xuất và trước khi đến tay người tiêu dùng phải trải qua
một quá trình từ khâu tồn trữ, vận chuyển. Độ ổn định là một yêu cầu chung của chế
phẩm có chất lượng [7].
Thuốc phải ổn định trong thời gian dự kiến. Độ ổn định của thuốc được đặc trưng
bằng hạn dùng. Vì vậy nghiên cứu độ ổn định để xác định tuổi thọ, từ đó có thể xác
định hạn dùng của chế phẩm. Đây là một nghiên cứu bắt buộc trước khi làm hồ sơ
đăng ky xin phép lưu hành ngoài thị trường. Do vậy thuốc trước khi đưa vào sản
xuất rộng rai cần phải nghiên cứu độ ổn định để tránh:
− Sự giảm hàm lượng thuốc trong quá trình sản xuất, tồn trữ dẫn đến giảm tác dụng trị
liệu dưới mức quy định so với hàm lượng ghi trên nhan.
− Sự xuất hiện các tạp chất do thuốc bị phân hủy trong quá trình bảo quản, vận
chuyển [7].

2.6.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định
Độ ổn định của chế phẩm chịu ảnh hưởng của 2 yếu tố chủ yếu là:
− Yếu tố nội tại: phụ thuộc bản chất của chế phẩm.
− Yếu tố ngoại cảnh: bao gói, môi trường…

 Yếu tố nội tại
Bao gồm:
− Cấu trúc hóa học của dược chất và nguyên phụ liệu.
− Nồng độ, hàm lượng hoạt chất trong chế phẩm.

− Độ tinh khiết của nguyên liệu.

 Yếu tố ngoại canh
Bao gồm:
− Nhiệt độ: Ảnh hưởng đến tốc độ của phản ứng phân hủy chế phẩm.
− Ánh sáng: Làm phân hủy hoặc chuyển dạng đồng phân.
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 2. Tổng quan


25
− Độ ẩm: Độ ẩm cao thúc đẩy phản ứng phân hủy do thủy phân, làm thay đổi tính
chất ly học của chế phẩm.
− Không khí.
− Đồ bao gói: pH, độ kín…
Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa có tính chất cơ bản là nóng ẩm. Nhiệt độ và
độ ẩm cao ở Việt Nam tạo rất nhiều trở ngại trong công tác bảo quản thuốc. Vì vậy
mỗi chế phẩm phải có điều kiện bảo quản và đồ bao gói nhất định.

2.6.2. Nghiên cứu độ ổn định
Bao gồm một loạt các thử nghiệm để đảm bảo độ ổn định của một thành phẩm
thuốc, đó là khả năng duy trì các tiêu chuẩn chất lượng của thành phẩm được đóng
gói trong bao bì thích hợp và bảo quản ở điều kiện đa thiết lập trong một khoảng
thời gian xác định [7].

2.6.2.1. Lựa chọn lô thử
Để sử dụng cho thử nghiệm nghiên cứu độ ổn định, cần chuẩn bị ba lô chế phẩm
cùng công thức pha chế, cùng dạng bào chế đựng trong bao bì sẽ sử dụng khi đưa
chế phẩm ra thị trường. Hai trong ba lô phải đủ cho quá trình thử nghiệm, lô còn lại
có thể ít hơn. Nếu có thể, ba lô đem thử nên được sản xuất từ ba lô nguyên liệu khác
nhau [13], [18], [34].

2.6.2.2. Các phương pháp nghiên cứu độ ổn định
Các tài liệu đề cập tới ba phương pháp: phương pháp thử dài hạn, phương pháp lao
hóa cấp tốc, phương pháp sử dụng điều kiện khắc nghiệt (gây stress) [13], [18],
[34].
 Phương pháp dài hạn
Là phương pháp nghiên cứu độ ổn định trong điều kiện bảo quản được ghi trên
nhan chế phẩm. Là thử nghiệm đánh giá tính chất hóa ly, sinh học, vi sinh học của
một sản phẩm trong suốt thời gian dự kiến tuổi thọ của thuốc trong điều kiện bảo
quản phù hợp [7], [13], [18], [34].
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương 2. Tổng quan