Đánh giá khả năng kháng nấm bệnh thán thư của dịch chiết chùm ngây, nano đồng ở điều kiện in vitro

PHẦN 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, khi kinh tế ngày càng phát triển, chất lượng cuộc sống ngày
càng được nâng cao. Khi đó, thực phẩm không chỉ đơn thuần là đồ ăn mà còn
phải đáp ứng các yêu cầu khắt khe về thị hiếu và chất lượng của người tiêu
dùng. Một trong những nguồn thực phẩm không thể thiếu đó chính là rau quả.
Chúng là nguồn dinh dưỡng thiết yếu, là thực đơn hằng ngày của nhiều người.
Rau quả tươi, an toàn về chất lượng, hàm lượng dinh dưỡng cao luôn được
người tiêu dùng quan tâm. Để đáp ứng nhu cầu cấp thiết đó của xã hội cần tăng
sản lượng và chất lượng của các loại rau quả. Tuy nhiên, với điều kiện hiện nay
của nước ta, các tổn thất, tỉ lệ hư hỏng còn cao, khoảng 25 - 30% do nhiều
nguyên nhân khác nhau.
Bệnh thán thư sau thu hoạch là một trong những nguyên nhân làm ảnh
hưởng đến số lượng và chất lượng của các loại rau quả. Bệnh thán thư chủ yếu
do các loại nấm Colletotrichum spp. gây nên, chúng là nguyên nhân làm tổn
thương các mô tế bào trên vỏ, do đó vỏ quả bị biến sắc, hình dạng, ảnh hưởng
đến giá trị cảm quan, từ đó làm suy giảm về mặt số lượng, chất lượng của rau
quả sau thu hoạch.
Đã có nhiều biện pháp được áp dụng để hạn chế và phòng ngừa sự nhiễm
nấm như biện pháp canh tác, biện pháp vật lí, hóa học và cả sinh học. Tuy nhiên,
việc sử dụng biện pháp canh tác, vật lí cơ giới hiệu quả thấp; biện pháp hóa học
có tác dụng đáng kể nhưng hậu quả do nó mang lại tương đối lớn như: ô nhiễm
môi trường, mất cân bằng sinh thái và đặc biệt là ảnh hưởng nghiêm trọng đến
sức khỏe con người. Do đó, việc tìm ra một chế phẩm tự nhiên kháng lại nấm
gây bệnh thán thư trên rau quả sau thu hoạch là một điều cần thiết.
Sử dụng dịch chiết của một số loài thực vật hay các kim loại ở kích thước
nano với liều lượng thấp có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm,… sẽ mang lại
những lợi ích lâu dài cho người sản xuất như: làm tăng năng suất của cây trồng,
giảm chi phí đầu tư, thân thiện với môi trường sinh thái, ít ảnh hưởng đến sức
khỏe của người và vật nuôi, góp phần quan trọng trong việc phát triển nền nông
nghiệp hữu cơ bền vững và hiệu quả.

Xuất phát từ những vấn đề trên nên chúng tôi đã thực hiện đề tài “Đánh
giá khả năng kháng nấm bệnh thán thư của dịch chiết chùm ngây, nano
đồng ở điều kiện in vitro”.
1


PHẦN 2
TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1. Tổng quan về cây chùm ngây
2.1.1. Đặc điểm hình thái thực vật [9]
Chùm ngây hay ba đậu dại (Moringa oleifera) là loài thực vật thân gỗ phổ
biến nhất trong chi chùm ngây (Moringa) thuộc họ chùm ngây (Moringaceae),
xuất xứ từ vùng Nam Á nhưng cũng mọc hoang và được trồng, khai thác, sử
dụng nhiều nơi trên thế giới do có giá trị kinh tế cao.
Trong tiếng Anh, cây chùm ngây có nhiều tên gọi khác nhau như "cây
thần diệu" (Miracle tree), "cây kỳ quan" (Wonder tree), "cây vạn năng"
(Multipurpose tree), "cây độ sinh" (Tree of life, theo quan điểm nhà Phật), "cây
cải ngựa" (Horseradish tree, do rễ non của cây có vị của cải ngựa, mù tạt), "cây
dùi trống" (Drumstick tree, do thân/quả cây giống dùi trống), "cây dầu bel" (Beloil tree, do dầu ép từ hạt cây được bán với tên gọi bel-oil).

Hình 2.1. Cây chùm ngây
Cây chùm ngây (Moringa oleifera) thuộc loại cây tiểu mọc sống ở môi
trường khô ráo, không thích nghi môi trường úng nước.
Thân: là cây thân gỗ nhỏ, cao khoảng 5 - 6m (có thể đến 10m) phân cành
nhiều.
Lá: lá kép ba lần dạng lông chim, dài 30 - 60cm, lá chét hình tròn hay
hình trái xoan, dài 10 - 12cm, màu xanh lục mốc, không lông, mọc đối từ 6 - 9
đôi, lá bẹ bao lấy chồi.
2

Hoa: hoa màu trắng, to, có cuống, mọc thành chùm ở nách lá, trông hơi
giống hoa đậu, 5 cánh hoa, dảnh lên; 5 tiểu nhị thụ, xen với 5 tiểu nhị lép; noãn
sào 1 buồng, đính phôi trắc mô ba, có hương thơm, hoa nấu ăn được. Sau trồng
8 tháng là cây bắt đầu cho hoa. Mùa hoa thường vào tháng 1 hằng năm.
Quả: quả nang treo, dài 25 - 30 cm (có khi đến 55 cm), ngang 2 - 3 cm, có
hình dáng giống quả đậu cô ve, có 3 mảnh, dọc theo quả có khía rãnh.
Hạt: quả cho nhiều hạt tròn, có 3 cạnh, cỡ hạt đậu Hà Lan 0,5cm, có cánh
mỏng bao quanh.
Cây chùm ngây được trồng ở những vùng đất khô, nhiệt đới hoặc bán
nhiệt đới. Cây này chuộng đất ráo nước, đất cát dù là đất xấu nhưng cũng dễ
mọc, chịu được hạn hán.
Ở Việt Nam, cây chùm ngây trồng ở độ cao dưới 500m, lá ăn được như
rau, trái dùng làm bột cà ri… Cây gặp nhiều ở các tỉnh miền Nam như Nha
Trang, Phan Rang và Phan Thiết.
2.1.2. Nguồn gốc và phân bố
 Nguồn gốc:
Cây có nguồn gốc ở Tây Bắc Ấn Độ sau được đưa vào trồng rộng rãi ở
Ấn Độ, Hy Lạp, Philippin, Thái Lan, Malaysia, Cuba,…
 Phân bố:
Trên thế giới: hiện nay tồn tại quần thể chùm ngây mọc hoang ở cận
Hymalaya, từ vùng Chenab đến phía đông của Sarda (Ấn Độ). Ngoài ra, người
ta còn tìm thấy chùm ngây phân bố ở Châu Phi, Madagascar [11], [16].
Ở nước ta: chùm ngây là loài duy nhất của Chi chùm ngây được phát hiện
mọc hoang từ lâu đời tại nhiều nơi như Thanh Hóa, Ninh Thuận, Bình Thuận,
vùng Bảy Núi ở An Giang, đảo Phú Quốc…Tuy vậy trước đây cây ít được chú
ý, có nơi trồng chỉ để làm hàng rào và chỉ trong vài chục năm trở lại đây khi hạt
cây từ nước ngoài được mang về Việt Nam, được trồng có chủ định và qua
nghiên cứu người ta thấy cây có nhiều tác dụng đặc biệt nên tưởng là cây mới du
nhập [1], [2], [8], [16].

2.1.3. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học thay đổi tùy theo từng bộ phận cây chùm ngây.
Rễ cây chùm ngây: chứa các hợp chất glucosinolat như: 4-(α-Lrhamnosyloxy) benzylglucosinolat (khoảng 1%), sau khi chịu tác động của
enzyme myrosinase sẽ cho 4-(α-L-rhamnosyloxy) benzylisothiocyanat,
glucotropaeolin (khoảng 0,05%) và benzylisothiocyanat.
3


Nhựa cây chùm ngây (Gôm): gôm chiết từ vỏ cây có chứa arabinose,
galactose, acid glucuronic. Từ gôm, chất leucoanthocyanin đã được chiết và xác
định là leucodelphinidin, galactopyranosyl, glucopyranosid.
Lá cây: chứa các hợp chất thuộc nhóm flavonoid và phenolic như
kaempferol 3-O- α-rhamnosid, kaempferol, syringic acid, gallic acid, rutin,
quercetin 3-O-β- glucosid. Các flavonol glycosid được xác định đều thuộc nhóm
kaempferid nối kết với các rhamnosid hay glucosid.
Hoa: hoa chứa polysaccharid được dùng làm chất phụ gia trong kỹ nghệ
dược phẩm.
Hạt: hạt chứa glucosinolat như trong rễ, có thể lên đến 9% sau khi hạt đã
được khử chất béo. Các acid loại phenol carboxylic như 1- β - D - glucosyl 2, 6
dimethyl benzoat. Ngoài ra, hạt còn chứa chất béo (33 - 38%) được dùng trong
dầu ăn và kỹ nghệ hương liệu, thành phần chính gồm các acide béo như: acide
oleic (60 - 70%), acide palmitic (3 - 12%), acide stearic (3 - 12%) và các acide
béo khác như: acide behenic, acide eicosanoic và acide lignoceric [14].
2.1.4. Lợi ích, công dụng và giá trị dinh dưỡng của cây chùm ngây
 Lợi ích và công dụng
Lá chùm ngây đã được cho là một nguồn thức ăn giàu β-carotene, protein,
vitamin C, canxi và kali, và các chất chống oxy hóa tự nhiên. Dịch chiết lá chùm
ngây giúp nâng cao thời gian tồn tại của chất béo có trong thực phẩm do sự hiện
diện của các loại hợp chất chống oxy hóa như acide ascorbic, flavonoid, phenol
và carotenoids [14].

Lá chùm ngây ăn được và có giá trị dinh dưỡng cao. Nó được tiêu thụ
khắp Tây Phi cũng như một số nước châu Á. Chùm ngây có chứa vitamin A
nhiều hơn so với cà rốt, calcium hơn sữa, nhiều sắt hơn rau bina, vitamin C hơn
cam và kali hơn chuối, lưu ý rằng chất lượng protein của chùm ngây là đối thủ
của sữa và trứng. Hơn nữa, tổng số tiêu hóa protein của các lá này là cao (85%
đến 90%) và thành phần amino acide của nó đã chứng thực với các protein tham
khảo FAO cho phát triển trẻ em. Các lá cũng được miễn tố antinutritive như
phenol, tannin và saponin [9].
Điều trị: các bộ phận của cây như lá, rễ, hạt, vỏ cây, quả và hoa… có
những hoạt tính như kích thích hoạt động của tim và hệ tuần hoàn, hoạt tính
chống u bướu, hạ nhiệt, chống kinh phong, chống sưng viêm, trị ung loét, chống
co giật, lợi tiểu, hạ huyết áp, hạ cholesterol, chống oxy - hóa, trị tiểu đường, bảo
vệ gan, kháng sinh và chống nấm. Cây đã được dùng để trị nhiều bệnh trong y
học dân gian tại nhiều nước trong vùng Nam Á [9].
4


Ngoài ra, các sản phẩm thô của cây chùm ngây được thương mại hóa bán
trên thị trường như lá tươi, quả non, hoa, rễ tươi, rễ khô, cành nhánh phơi khô,…
cũng đã có nhiều công ty sản xuất thực phẩm dinh dưỡng và thực phẩm chức
năng từ chùm ngây như nước giải khát, trà, sản phẩm làm đẹp, viên chùm ngây,
bột chùm ngây,…
Dưới đây là một số sản phẩm được chế biến từ cây chùm ngây:

Hình 2.2. Sản phẩm nước giải khát và trà từ chùm ngây
 Dinh dưỡng
Lá chùm ngây giàu dinh dưỡng hiện được hai tổ chức thế giới WHO và
FAO xem như là giải pháp ưu việt cho các bà mẹ thiếu sữa và trẻ em suy dinh
dưỡng và là giải pháp lương thực cho thế giới thứ ba.
Hàm lượng dinh dưỡng của quả, lá tươi và bột khô của lá cây chùm ngây

có thể được tóm tắt:

Bảng 2.1. Phân tích hàm lượng dinh dưỡng của Moringa
STT
01
02

Thành phần dinh
dưỡng/100gram
Nước( %)
Năng lượng

Trái
tươi
86,9 %
26

Lá tươi
75,0 %
92

Bột lá
khô
7,5 %
205
5


03
04

05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32

Protein (g)

Chất béo (g)
Carbohydrate (g)
Chất xơ (g)
Chất khoáng (g)
Ca (mg)
Mg (mg)
P (mg)
K (mg)
Cu (mg)
Fe (mg)
S (g)
Acid Oxalic (mg)
Vitamin A - Beta Carotene (mg)
Vitamin B - choline (mg)
Vitamin B1 - thiamin (mg)
Vitamin B2 - Riboflavin (mg)
Vitamin B3 - nicotinic acid (mg)
Vitamin C(mg)
Vitamin E - tocopherol acetate
Arginine (g/16gN)
Histidine (g/16gN)
Lysine (g/16gN)
Tryptophan (g/16Gn)
Phenylanaline (g/16gN)
Methionine (g/16gN)
Threonine (g/16gN)
Leucine (g/16gN)
Isoleucine (g/16gN)
Valine (g/16gN)

2,5
0,1
3,7
4,8
2,0
30
24
110
259
3,1
5,3
137
10
0,11
423
0,05
0,07
0,2
120
_
3,66
1,1
1,5
0,8
4,3
1,4
3,9
6,5
4,4
5,4

6,7
1,7
13,4
0,9
2,3
440
25
70
259
1,1
7,0
137
101
6,8
423
0,21
0,05
0,8
220
_
6,0
2,1
4,3
1,9
6,4
2,0
4,9
9,3
6,3

7,1

27,1
2,3
38,2
19,2
_
2003
368
204
1324
0,054
28,2
870
1,6
1,6
_
2,64
20,5
8,2
17,3
113
1,33 %
0,61%
1,32%
0,43%
1,39 %
0,35%
1,19 %
1,95%

0,83%
1,06%

2.1.5. Cơ chế kháng vi sinh vật của chùm ngây [36]
Ngày nay, sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên như phương thuốc cổ
truyền đang có nhu cầu rất lớn. Có nhiều nghiên cứu đã được công bố là trong
dịch chiết xuất từ lá chùm ngây có các thành phần như: phenol, acide phenolic,
flavonoid là chất chống oxy hóa, chống viêm, kháng khuẩn và kháng nấm rất
tốt.
6


Trong đó, các hợp chất phenol và acide phenolic có khả năng ức chế sự
phát triển của nấm sợi và ngừa các bệnh có thể xảy ra trong quá trình bảo quản
sau thu hoạch. Vị trí và số lượng các nhóm hydroxyl trong vòng phenol được
cho là có liên quan đến độc tính của chúng đối với các loài vi sinh vật, bằng
chứng là tăng sự hydroxyl hóa thì sẽ tăng độc tính, phenol ở trạng thái oxy hóa
càng cao thì khả năng ức chế vi sinh vật càng tăng. Cơ chế được cho là nguyên
nhân dẫn đến độc tính của các hợp chất phenolic này đối với vi sinh vật, bao
gồm sự ức chế enzyme của các hợp chất oxy hóa, có thể thông qua phản ứng với
nhóm sulfhydryl hoặc thông qua sự tương tác không đặc hiệu của nó với protein.
Flavonoid trong lá chùm ngây được tổng hợp để ngăn ngừa sự nhiễm
khuẩn. Chúng đã được nghiên cứu trên tế bào vi sinh vật và được cho là hợp
chất có tác dụng kháng khuẩn đối với nhiều loài vi sinh vật. Hoạt tính của chúng
là do khả năng tạo phức với protein tan ngoại bào và tạo phức với thành tế bào
vi khuẩn. Flavonoid càng ưa béo thì càng có khả năng phá vỡ màng tế bào vi
sinh vật.
Ngoài ra, dịch chiết còn có khả năng ức chế sự phát triển của các chủng vi
sinh vật khiến chúng trở nên không hoạt động và không thể tăng trưởng do tạo
môi trường bất lợi làm ảnh hưởng đến khả năng sử dụng các chất dinh dưỡng

một cách hiệu quả của chúng. Quá trình trao đổi chất của chúng có thể đã bị vô
hiệu hóa trong khi chờ đợi cho môi trường trở lại tình trạng bình thường. Mặt
khác, dịch chiết tác dụng, phá vỡ màng tế bào và thẩm thấu vào bên trong làm
cho các ion và các chất quan trọng trong tế bào bị thoát ra ngoài dẫn đến quá
trình tự phân hủy, tế bào chết. Các thành phần trong dịch chiết ức chế hoạt động
của glucosyl transferase làm ảnh hưởng đến sự hình thành glucan tạo môi trường
không thuận lợi cho sự phát triển của các chủng vi sinh vật.
2.2. Tổng quan về vật liệu nano Cu
2.2.1. Giới thiệu về hạt nano kim loại
Các hạt nano kim loại đã được biết đến từ rất lâu. Người ta đã tìm thấy
các hạt kim loại vàng và bạc trong thủy tinh từ trên 2000 năm trước dưới dạng
các hạt nano. Năm 1981, Michael Faraday đã nghiên cứu và chứng minh rằng
những màu sắc đặc biệt của các hạt kim loại là do kích thước rất nhỏ của chúng
chứ không phải là do trạng thái cấu trúc của chúng mang lại.
Hạt nano kim loại được phân chia theo 2 tiêu chuẩn:
- Hạt nano (nanoparticle): vật liệu với một hay nhiều chiều ở kích thước
nano mét.
7


- Tỉ lệ nano (nanoscale): vật liệu với một hay nhiều chiều ở kích thước
100nm hay nhỏ hơn.
Đây là sự thống nhất với giới hạn được sử dụng trong hệ thống khoa học
mặc dù có một vài mức độ chưa rõ ràng liên quan tới giới hạn kích thước cao
hơn. Các hạt và vật liệu với mức độ kích cỡ nhỏ hơn cho tới 1 µm, thậm chí tới
vài µm đôi khi vẫn được coi là “nano”, tuy nhiên điều này không phổ biến với
sự gia tăng sự chuẩn hóa trong khoa học nano.
2.2.2. Các phương pháp chế tạo [4]
Vật liệu nano được chế tạo bằng hai phương pháp: phương pháp từ trên
xuống (top-down) và phương pháp từ dưới lên (bottom-up). Phương pháp từ trên

xuống là phương pháp tạo hạt kích thước nano từ các hạt có kích thước lớn hơn,
phương pháp từ dưới lên là phương pháp hình thành hạt nano từ các nguyên tử.
2.2.2.1. Phương pháp từ trên xuống
Nguyên lý của phương pháp: dùng kỹ thuật nghiền và biến dạng để biến
vật liệu thể khối với tổ chức hạt thô thành cỡ hạt kích thước nano. Đây là
phương pháp đơn giản, rẻ tiền nhưng khá hiệu quả, có thể tiến hành cho nhiều
loại vật liệu với kích thước khá lớn. Trong phương pháp nghiền, vật liệu ở dạng
bột được trộn lẫn với những viên bi được làm từ các vật liệu rất cứng và đặt
trong cái cối. Máy nghiền có thể là nghiền lắc, nghiền rung hoặc nghiền quay.
Các viên bi cứng va chạm vào nhau và phá vỡ bột đến kích thước nano. Kết quả
thu được là vật liệu nano không chiều. Phương pháp biến dạng được sử dụng với
các kỹ thuật đặc biệt nhằm tạo ra sự biến dạng cực lớn mà không làm phá hủy
vật liệu. Nhiệt độ có thể được điều chỉnh tùy thuộc vào từng trường hợp. Nếu
nhiệt độ gia công lớn hơn nhiệt độ kết tinh lại thì được gọi là biến dạng nóng,
còn ngược lại thì được gọi là biến dạng nguội. Kết quả thu được là các vật liệu
nano 1 chiều hoặc 2 chiều.
2.2.2.2. Phương pháp từ dưới lên
Nguyên lý của phương pháp là hình thành vật liệu nano từ các nguyên tử
hoặc ion. Phương pháp từ dưới lên được phát triển rất mạnh mẽ vì tính linh động
và chất lượng của sản phẩm cuối cùng. Phần lớn các vật liệu nano mà chúng ta
dùng hiện nay được chế tạo từ phương pháp này. Phương pháp từ dưới lên có
thể là phương pháp vật lý, hóa học hoặc kết hợp cả hai phương pháp hóa - lý.
2.2.3. Cơ chế tác động của Cu lên tế bào vi sinh vật

8


Ở nồng độ tương đối thấp, các hợp chất đồng khá độc cho thực vật
nguyên sinh (ví dụ các loại nấm, vi khuẩn và tảo). Độc tính này đã được sử dụng
trong hơn 100 năm để kiểm soát nấm và các bệnh do vi khuẩn của thực vật. Ở

thời niên đại học, các tài liệu tham khảo đầu tiên được biết đến với việc sử dụng
hóa chất để điều trị nấm gây bệnh vào khoảng năm 470 trước Công Nguyên bởi
Pliny. Các tài liệu tham khảo được biết đến sớm nhất về việc sử dụng đồng như
là một loại thuốc diệt nấm năm 1761 bởi Schulthess, người sử dụng đồng
sunfate để điều khiển buồm trên hạt lúa mì. Vào năm 1807, Prevost được tín
dụng để khám phá sự ức chế bào tử nảy mầm bằng đồng và ông đã dành nhiều
thời gian của mình để nghiên cứu muối đồng và đồng. Ngoài ra, năm 1846 báo
cáo của một nhà báo từ Wales: bạc lá khoai đã vắng mặt trong các khu vực tiếp
giáp với một nhà máy luyện đồng [34].
Các thuốc có chứa thành phần kim loại đồng được gọi là thuốc nhóm gốc
đồng, thuốc gốc đồng có phổ tác dụng rộng có thể phòng trừ được nhiều loại
bệnh gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau. Cơ chế tác động của thuốc gốc
đồng là chất đồng có thể xâm nhập vào tế bào vi sinh vật, ức chế các phản ứng
sinh học trong tế bào, làm chết vi sinh vật [37]. Các tác dụng kháng nấm của vật
liệu nano đồng trên bào tử và sự phát triển tuyến tính có thể được quy cho các
ion đồng có thể xúc tác cho sự sản xuất các gốc hydroxyl cao, tiếp theo là sự rò
rỉ của lipid, protein, DNA và phân tử sinh học khác, ảnh hưởng đến tính toàn
vẹn của màng mà chắc chắn sẽ dẫn đến mất khả năng di động của bào tử nấm.
Nồng độ đồng khác nhau đã được chứng minh là ức chế sự nảy mầm của bào tử
nấm Colletotrichum gloeosporioides, các nghiên cứu hiện nay cho thấy rằng vật
liệu đồng có thể trực tiếp ức chế sự tăng trưởng của Colletotrichum
gloeosporioides ở điều kiện in vitro [29].
Thuốc diệt nấm dựa trên đồng được phê duyệt để canh tác và chúng vẫn là
một trong những đại diện hiệu quả nhất cho việc kiểm soát nhiều bệnh thực vật
[26]. Giữa những năm 1930, hỗn hợp Bordeaux phần lớn đã bị thay thế bằng
oxit đồng, oxychloride đồng và phosphate đồng, thời kỳ này trùng hợp với sự ra
đời của kim loại hữu cơ và thuốc diệt nấm hữu cơ, chẳng hạn như thuốc bảo vệ
thực vật: dithiocarbamate và dicarboximide. Sau đó đến chất hữu cơ khác như
chlorothalonil và benzimidazole systemics như benomyl và thiophanate methyl [34].
2.3. Tổng quan về các loại nấm gây hại rau quả dùng trong nghiên cứu

2.3.1. Nấm Colletotrichum capsici gây bệnh thán thư trên ớt
2.3.1.1. Đặc điểm hình thái và sinh học
9


Colletotrichum capsici (C. capsici) là một trong những loài gây bệnh thán
thư chủ yếu trên ớt, hồ tiêu, nho, khoai tây [32]. Đĩa cành trên quả, lá và thân,
tròn hoặc thon dài, kích thước khoảng 350µm. Lông gai màu nâu, có từ 1-5 vách
ngăn, cứng, phình to ở phía gốc, phía đỉnh nhọn, mảnh và màu sắc nhạt dần,
kích thước khoảng 250 x 6µm. Bào tử phân sinh hình lưỡi liềm, trong suốt, đỉnh
nhọn, đơn bào, không có vách ngăn, kích thước 3 - 4 x 17 - 28 µm có giọt dầu
bên trong, được hình thành từ cành bào tử hình trụ màu nâu nhạt [13]. Cuống
sinh bào tử C. capsici có đường kính 70 - 100 µm. Bào tử phân sinh của nấm nảy
mầm trong nước sau 4 giờ, nhiệt độ thích hợp cho nấm gây bệnh là 28 - 30oC [23].

A

B

C

Hình 2.3. Hình thái của nấm Colletotrichum capsici
A. Lông cứng nấm C. capsici. B. Bào tử nấm C. capsici. C. Tản nấm
Tản nấm trên môi trường PDA đầu tiên có màu trắng sau chuyển dần
thành màu xám. Sợi nấm hình thành mịn, màu đen đến xám tối trên bề mặt tản
nấm. Đôi khi vào ban ngày có thể nhìn thấy những khoang màu trên bề mặt tản
nấm. Lông gai được hình thành trên những vùng mỏng hơn, hạch nấm hiếm gặp
hoặc không có. Cụm bào tử màu nâu sẫm đến màu da cam. Giác bám và các cấu
trúc phụ của chúng hình thành với số lượng lớn áp vào bề mặt đĩa pettri. Trên
môi trường PCA sợi nấm mọc thưa thớt, màu sắc mờ nhạt và có rất ít cụm bào

tử. Giác bám màu nâu đỏ, kích thước 9 - 14 x 6,5 - 11,5 dạng hình chùy hoặc
hình cứng [13].
2.3.1.2. Triệu chứng bệnh

10


Nấm Colletotrichum capsici Bul and Bis gây bệnh thán thư trên ớt là bệnh
nguy hiểm gây thối quả ớt hàng loạt. Bệnh phổ biến ở rất nhiều nước trên thế
giới, đặc biệt là các nước ở vùng nhiệt đới. Bệnh gây nặng trên hầu hết các vùng
trồng ớt ở nước ta. Colletotrichum capsici gây hại trên nhiều bộ phận của cây
như lá, thân và quả.
Trên lá vết bệnh hình tròn hoặc không có
hình dạng nhất định, xếp theo chiều dài của gân
lá. Lúc đầu, đốm bệnh ở mặt dưới lá có màu
nâu nhạt, sau chuyển màu nâu sậm, có viền đỏ,
lan rộng và lõm sâu.
Trên cuống lá và thân cây vết bệnh cũng
lõm xuống tạo thành vết dọc màu nâu đen. Cây
bị bệnh kém phát triển, lá vàng và rụng sớm.
Thiệt hại nặng nhất là bệnh tấn công trên
quả gây thối hàng loạt. Vết bệnh lúc đầu là một
đốm nhỏ hơi lõm, thường có hình thoi, phân Hình 2.4. Bệnh thán thư trên ớt [27]
ranh giới giữa mô bệnh là một đường màu đen
chạy dọc theo vết bệnh. Trên bề mặt vết bệnh có những chấm nhỏ là đĩa cành
của nấm gây bệnh. Các vết bệnh có thể liên kết với nhau làm quả bị thối, vỏ khô
có màu trắng vàng. Trước đây, bệnh gây hại chủ yếu trong mùa mưa, nhưng vài
năm gần đây bệnh có chiều hướng phát sinh và gây hại cả trong màu khô, nhất là
những nơi trồng ớt liên tục nguồn bệnh được tích lũy do không biết cách phòng
trừ. Bệnh thường gây hại từ khi trái già chín trở đi, nhưng nếu gặp điều kiện

thuận lợi bệnh có thể xuất hiện và gây thiệt hại nặng nề trên diện rộng [10].
2.3.1.3. Biện pháp phòng trừ
Bệnh thán thư một khi bùng phát thì chúng thường gây thiệt hại rất lớn
cho nông dân, có khi người nông dân phải chịu mất trắng. Đặc biệt nghiêm trọng
hơn là một khi mẫu ruộng đã bị nhiễm bệnh thì có thể lây lan cho tới mùa vụ
sau. Chính vì vậy việc sử dụng các biện pháp phòng trừ bệnh thán thư hết sức
cần thiết và cấp bách. Ở Việt Nam, đã có rất nhiều các biện pháp được đưa ra để
giải quyết vấn đề trên bao gồm: biện pháp canh tác, biện pháp hóa học và biện
pháp sinh học.
 Biện pháp canh tác

11


Đối với biện pháp canh tác trước khi trồng cần thu gom cây, trái ớt vụ
trước, đem tiêu hủy để tránh nguồn bệnh lây lan cho vụ sau. Chọn giống ớt (quả,
hạt) từ những ruộng không bị nhiễm bệnh tuyệt đối không sử dụng những ruộng
ớt bị bệnh làm giống. Nên chọn các giống kháng bệnh (giống ớt chỉ thiên ít
nhiễm bệnh thán thư). Lên luống cao và thoát nước tốt, nên phủ bạt nilon trên
mặt liếp trồng để hạn chế sâu bệnh hại từ đất lây lan lên cây. Luân canh ớt với
những cây trồng khác họ. Trồng ớt ở mật độ thích hợp, tránh trồng dày vì sẽ tạo
độ ẩm cao trong tán cây ớt tạo điều kiện cho nấm bệnh phát triển [38].
Sử dụng phân bón hợp lý, tránh bón phân thừa đạm, nên sử dụng phân
canxi nitrat để giúp cây ớt phát triển tốt đồng thời tăng cường khả năng chống
chịu bệnh. Khi cây ớt bắt đầu ra hoa đậu trái, không được tưới nước phủ từ trên
tán cây xuống để tránh lây lan phát tán bào tử nấm. Thăm đồng thường xuyên và
diệt côn trùng hại quả [13], [38].
 Biện pháp hóa học

Sử dụng biện pháp hóa học bằng thuốc trừ bệnh Ringo - L20SC khi bệnh

mới phát triển do nó có khả năng hạn chế sự phát triển của bệnh bảo vệ được
cành, đọt non, hoa và trái sau vài giờ phun thuốc.
Thuốc trừ nấm cổ truyền được sử dụng để hạn chế bệnh thán thư trên ớt là
Manganese ethylenebisdithiocarbamate, tuy nhiên thuốc này không có hiệu quả
lớn khi bệnh đã phát triển mạnh. Các thuốc trừ nấm (Quadris), trifloxystrobin
(Flint) và pyraclostrobin (Cabrio) gần đây đã được đưa ra để phòng trừ bệnh
thán thư ớt, các loại thuốc này có hiệu quả phòng chống bệnh thán thư ngay cả
khi bệnh thán thư đã gây hại nặng [13]. Ngoài ra, có thể sử dụng một số loại
thuốc sau: Benlate 50WP 1 kg/ha; Topsin M 70 WP 0,4 - 0,6 kg/ha; Score
250ND 0,5 lít/ha [38].
Các biện pháp sử dụng thuốc hóa học để diệt nấm thán thư có vẻ như
mang lại hiệu quả cao cho việc tiêu diệt bệnh. Tuy nhiên việc sử dụng đơn lẻ
một loại thuốc kéo dài, tính chống thuốc của nấm gây bệnh thán thư sẽ hình
hành, không những thế dư lượng thuốc trừ sâu còn tồn dư có thể ảnh hưởng tới
con người, gây ô nhiễm môi trường và tăng chi phí sản xuất [38].
 Biện pháp sinh học

12


Phòng trừ bệnh thán thư trên ớt trong nhiều năm lệ thuộc vào thuốc hóa
học cũng phát sinh nhiều vấn đề, cần thay thế bằng biện pháp khác có hiệu quả
trên đồng ruộng. Phòng trừ bệnh thán thư trên trái ớt bằng các loại thuốc gốc
thảo mộc trích từ củ, thân và lá của cây xương bồ (Acorus calamus L.), dầu cây
sả hồng (Cymbopogon martinii), lá cây hương nhu tía (Ocimum sanctum), lá cây
xoan (Azadirachia indica) có thể hạn chế phát triển của nấm bệnh thán thư trên
ớt [20]. Tại Ấn Độ, trong khảo nghiệm nước trích lá cây xoan (Azadiracta
indica), vạn thọ (Targates erecta), trầu không, tiêu (Piper longum), dừa cạn
(Vinca rosea), trâm ổi (Lantana camara), cà độc dược (Datura matel), nghệ
(Curcuma longa), khoai sọ (Colocasia antiquorum), củ gừng, củ tỏi,… cũng có

tác dụng ức chế sự hình thành và phát triển của thán thư [27].
Phòng trừ sinh học bằng vi sinh vật được cho là gần gũi với thiên nhiên
và thân thiện môi trường so với các thuốc trừ nấm đang sử dụng.
Trichoderma và các chế phẩm của nó được nghiên cứu và sử dụng ở nhiều nước.
Sử dụng nấm Trichoderma là biện pháp hiệu quả dễ tiếp nhận vì nó phổ biến, dễ
nuôi cấy, nhân nhanh trên nhiều loại môi trường và tiêu diệt được nhiều loại
nấm bệnh. Trichoderma tác động như là vi ký sinh (mycoparasite), cạnh tranh
hữu hiệu nguồn thức ăn và địa bàn phát triển, sản xuất chất kháng sinh và có hệ
thống enzyme có khả năng tấn công được nhiều chủng loại nấm bệnh. Hơn nữa,
Trichoderma còn ngăn cản hay phân hủy pectinase và các enzyme khác của nấm
bệnh giúp chúng xuyên qua biểu bì lá. Tác động mạnh nhất của các
dòng Trichoderma là tạo raenzyme lytic trên vách tế bào và biến dưỡng thứ cấp
chống lại nấm bệnh. Do đó có nhiều nghiên cứu về chất trích ly từ thảo mộc và
nấm Trichoderma ngăn chặn nảy mầm của bào tử và phát triển ống mầm nấm
bệnh thán thư C. Capsici [33].
Ngoài Trichoderma, các nhà khoa học còn phân lập được một số dòng xạ
khuẩn Streptomyces spp. thử nghiệm trên nấm Colletotrichum gloeosporioides gây
bệnh thán thư trên trái ớt. Trong đó có dòng NSP-1 được phun ở nồng độ 0,5 tới
2,0 g/lít cho kết quả kích thích miễn dịch rất tốt [35].
Bệnh thán thư không những ảnh hưởng tới cây ớt trước thu hoạch mà
ngay cả sau thu hoạch nếu mầm bệnh còn tồn tại trên quả khi gặp điều kiện
thuận lợi sẽ phát triển làm hư hại và làm giảm chất lượng của ớt. Chính vì thế
các biện pháp không những kiểm soát hạn chế và tiêu diệt bệnh thán thư hại ớt
trong quá trình sản xuất thu hoạch mà những biện pháp sau thu hoạch cũng cần
được quan tâm đến. Hiện nay, không ít các nghiên cứu của các nhà khoa học
13


đang hướng đến việc sử dụng các chế phẩm sinh học vừa có tác dụng ức chế có
hiệu quả sự phát triển của bệnh thán thư sau thu hoạch và còn có tác động tích

cực tới môi trường, con người và mang lại hiệu quả kinh tế, chitosan và các dẫn
xuất của chúng là vật liệu đã được nghiên cứu tới.
2.3.2. Nấm Colletotrichum Gloeosporioides gây bệnh trên xoài
2.3.2.1. Đặc điểm hình thái và sinh học
Nấm Colletotrichum gloeosporioides thuộc họ Melanconiaceae, bộ
Melanconiales, lớp Nấm Bất Toàn. Giai đoạn hữu tính là Colletotrichum
cingulata thuộc lớp Nấm Túi.
Nấm có phạm vi ký chủ rộng, gây hại chủ yếu trên xoài, bơ, hành, chanh,
cam, bưởi, quýt,... Ngoài ra, Colletotrichum gloeosporioides còn tồn tại trên các
loại cây ký chủ thứ yếu như cây thích, cây muông, cây trúc, khoai sọ, cây bạch
đàn,…
Cành hình thành trên vết bệnh gồm các lông gai tròn, hơi dài hoặc không
đều, kích thước có thể lên tới 500 µm, có 1 - 4 vách ngăn, màu nâu, thường
phồng nhẹ ở góc và thon nhẹ ở đỉnh. Bào tử đôi khi cũng sinh ra trên lông gai.
Bào tử phân sinh hình trụ với các đầu hơi tù, đôi khi hơi nhọn, đỉnh tròn, cuống
hẹp trong suốt, không có vách ngăn, kích thước 9 - 24 x 3 - 6 µm hình thành trên
các bào tử phân sinh hình trụ trong, khối bào tử có màu hồng nhạt [7]. Sợi áp
(appressoria) có kích thước 6 - 20 x 4 - 12 µm, hình chùy hoặc có thể không
tuân theo quy luật nào [28].
Tản nấm trên môi trường PDA có màu trắng xám đậm, giai đoạn hữu tính
thường hình thành trên lá hoặc ngọn đã chết. Quả thể mở thường hình thành
riêng lẽ hoặc tập trung thành đám, hình cầu hoặc hình quả lê với kích thước 85 350 µm lỗ mở hơi nhú lên hình tròn, các túi (có 8 bào tử túi) hình chùy với đáy
trụ, dày lên ở đỉnh túi và có kích thước 35 - 80 x 8 - 14 µm. Các túi nằm rải rác
với các sợi nấm vô tính nằm ở đáy quả thể. Các bào tử túi thường cong hình con
nhộng hơi cong nhẹ, đơn bào.
Colletotrichum gloeosporioides là loại nấm hoại sinh phổ biến và xâm
nhập chủ yếu trên các mô chết và mô bị tổn thương. Bào tử nảy mầm đòi hỏi độ
ẩm gần 100%. Tuy nhiên, bệnh vẫn có thể xuất hiện ở điều kiện khô hơn khi bào
tử hoặc sợi nấm tiềm sinh xâm nhập trên mô bị tổn thương và mô già. Đây là
một trong những đặc điểm quan trọng trong nhiều vụ dịch bệnh, đặc biệt trên

quả.
14


2.3.2.2. Triệu chứng bệnh
Nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. phân bố rộng khắp
trên thế giới, đặc biệt là ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới hơn là vùng ôn đới. Đây
là một trong những loại nấm không chỉ gây hại riêng ở cây xoài mà còn gây hại
trên nhiều loại cây trồng khác. Mặc dù, cây xoài được trồng ở nước ta đã lâu
nhưng các nghiên cứu về bệnh thán thư xoài còn rất ít. Tác giả Hoàng Thị Mỹ
(1966) đã đưa ra danh mục một số bệnh hại xoài, trong đó bệnh thán thư do nấm
Colletotrichum gloeoporioides gây ra. Theo tác giả Vũ Công Hậu (1966) bệnh
thán thư là bệnh nghiêm trọng nhất trên xoài. Bệnh thán thư đã làm giảm giá trị
thương phẩm và thời gian bảo quản của quả.
Hầu hết bệnh nhiễm vào quả khi quả còn xanh, mầm bệnh ở trạng thái
“ngủ”, chưa có biểu hiện rõ ràng. Sau khi thu hoạch hoặc quả chín, hệ thống
kháng bệnh của quả yếu dần thì bệnh phát triển, vết bệnh xuất hiện lớn dần và
kết hợp lại với nhau gây thối quả [10].
Bệnh gây hại trên tất cả các bộ phận trên mặt đất của cây.
Trên lá: lá xoài non, đặc biệt ở giai đoạn màu đồng thiếc đến giai đoạn
màu xanh nhạt dễ mẫn cảm với bệnh hơn lá già. Vết bệnh đầu tiên là các đốm
đen nhỏ, sau đó vết bệnh mở rộng và liên kết hình thành các vết bệnh lớn hơn.
Các vết bệnh điển hình có tâm màu nâu vàng nhạt bao quanh là một viền màu
nâu đen hoặc nâu sẫm, xung quanh có một quần màu hồng gạch theo vòng đồng
tâm, ở phần bị hại có màu nâu. Khi trời khô, vết bệnh khô, màu nâu, rạn nứt và
thủng.
Trên hoa: vết bệnh là những đốm nhỏ, không đều, màu đen ở trên cả trục
và nhánh hoa. Các vết đốm nhỏ này mở rộng và liên kết lại với nhau thành đám
màu nâu đen. Bệnh nặng gây rụng hoa và chết khô cành hoa.
Trên thân cành: bệnh hại chủ yếu trên cành non mới ra. Ban đầu các vết

đốm màu nâu vàng, nhỏ, sau liên kết với nhau tạo vết bệnh màu nâu tối, khi gặp
điều kiện ẩm ướt các vết bệnh mở rộng, khi gặp trời khô vết bệnh bao bọc quanh
thân cành làm cành khô héo.
Trên quả: quả non thường xuất hiện các vết đốm nâu ở cuống quả sau lan
rộng và gây rụng quả. Quả sau khi thu hoạch có thể hình thành các vết đốm đen
nhỏ sau lan rộng thành các vết bệnh lớn, hình dạng khồn đều, màu nâu đậm tới
màu đen, mô bệnh không có ranh giới rõ rệt so với mô khỏe. Trong điều kiện ẩm
ướt thấy các khối bào tử màu hồng gạch xuất hiện theo vòng đồng tâm trên mô
bị bệnh.
15


Hình 2.5. Bệnh thán thư trên xoài
Bệnh phát triển mạnh khi có ẩm độ và nhiệt độ cao. Nấm có thể sinh
trưởng ở nhiệt độ tới 4 oC, nhưng tối thích là 25 - 29 oC. Bề mặt mô bệnh ẩm ướt
kéo dài có ảnh hưởng đến sự nảy mầm, xâm nhiễm và sinh trưởng của C.
gloeosporioides. Bệnh thán thư xuất hiện ở hầu hết các tháng trong năm. Bệnh
hại ở các giai đoạn vườn ươm. Trên vườn kinh doanh, giai đoạn ra hoa và đậu
quả là giai đoạn xung yếu của cây, ở giai đoạn ra hoa mức độ hại là cao nhất.
Bệnh hại nặng nhất vào tháng 3 và tháng 7 trong năm do điều kiện ẩm độ không
khí cao thuận lợi cho sự phát triển của bệnh.
2.3.2.3. Biện pháp phòng trừ
- Biện pháp canh tác: cắt tỉa cành, lá tạo không gian thoáng để hạn chế sự
phát triển của bệnh. Nấm C. gloeosporioides là tác nhân bệnh có tính cơ hội, do
đó việc tránh tổn thương cho cây trồng có tính quan trọng đặc biệt.
Sử dụng giống chống chịu với bệnh và cây non sạch bệnh.
- Biện pháp hóa học: xoài được xử lý bằng Benomyl nồng độ 1000ppm ở
48 - 52oC phòng trừ được bệnh thán thư, thối cuống và đốm đen nhưng vỏ bị gây
hại. Trong một thời gian dài Benomyl được phép sử dụng ở một số nước trong
xử lý sau thu hoạch. Tuy nhiên gần đây tổ chức FAO đã khuyến cáo không nên

sử dụng chất này cho mục đích bảo quản [17].
Tác giả Thái Thị Hòa và Đỗ Minh Hiền - Viện nghiên cứu rau quả miền
Nam xử lý xoài cát Hòa Lộc sau thu hoạch bằng cách ngâm xoài 2h trong dung
dịch CaCl2 4% hay 6% cho phép kéo dài thời gian bảo quản trái thêm khoảng 4
- 5 ngày ở 15oC, độ ẩm 85 - 90% và vẫn duy trì được chất lượng thương phẩm
của trái sau khi chín [19].
- Biện pháp sinh học: CA là phương pháp bao gói, thành phần không khí
bên trong được điều chỉnh với một tỷ lệ ổn định trong suốt quá trình bảo quản.
16


Thành phần không khí trong môi trường bảo quản phải phù hợp cho từng
loại trái. Thông thường điều chỉnh hai thành phần khí chính là CO 2 và O2, ngoài
ra còn điều chỉnh khí N2. CO2 có khả năng ức chế vi sinh vật hiếu khí (hàm
lượng O2 còn lại 2-5%), nấm mốc khi nồng độ CO2 lớn hơn 20% [22].
2.4. Những nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài
2.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Cây chùm ngây đa số được sử dụng để ăn và chữa một số bệnh. Theo sự
phát triển của khoa học người ta đã bắt đầu nghiên cứu các tính chất của cây
chùm ngây để ứng dụng trong y học, kháng khuẩn và kháng nấm…
Năm 2012, Đặng Thúy Nhung và Huỳnh Thị Mỹ Lệ tại Trường Đại học
Nông Nghiệp Hà Nội đã cho thấy dịch chiết hạt chùm ngây có khả năng ức chế
mạnh đối với sinh trưởng của vi khuẩn gram dương Staphylococcus, làm giảm
số lượng vi khuẩn hiếu khí, diệt được vi khuẩn hiếu khí và yếm khí trong nước
thải trực tiếp từ chuồng lợn, diệt được vi khuẩn từ nước sau hầm biogas của trại
chăn nuôi lợn [5].
Năm 2015, tác giả Nguyễn Đức Chung cùng cộng sự đã nghiên cứu hoạt
tính kháng khuẩn của lá chùm ngây. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn trên 3
chủng vi khuẩn Ecoli, Salmonella, Bacillus subtillis cho thấy dòng chùm ngây
có hoạt tính kháng khuẩn mạnh, có triển vọng khai thác đại trà thay kháng sinh

phòng trị nhiều bệnh cho gia súc lẫn động vật thủy sản [3].
Năm 2014, Nguyễn Thị Dung đã thực hiện công trình nghiên cứu so sánh
khả năng kháng khuẩn của nano đồng và dung dịch đồng sunfat. Kết quả cho
thấy, ở cùng một nồng độ, khả năng kháng khuẩn của nano đồng so với dung
dịch đồng sunfat là mạnh hơn; các phần tử nano đồng dễ dàng xâm nhập và tấn
công làm thủng màng tế bào dẫn đến hiệu quả tiêu diệt vi khuẩn cao hơn [6].
Năm 2011, Nguyễn Thị Phương Phong và cộng sự đã tiến hành nghiên
cứu thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của vật liệu nano đồng. Kết quả thử
nghiệm được tiến hành trên chủng nấm Corticium salmonicolor cho thấy ở nồng
độ 3ppm thì hiệu lực ức chế sinh trưởng đạt 90%, đến khi tăng nồng độ lên
5ppm và 7ppm thì hiệu lực ức chế sinh trưởng đạt 100% [12].
2.4.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Năm 2010, nghiên cứu tại Institute of Bioagricultural Sciences, Academia
Sinica, Đài Bắc (Đài Loan) ghi nhận dịch chiết từ lá và hạt chùm ngây có hoạt tính
17


diệt được nấm gây bệnh loại Trichophyton rubrum, Trichophytonmentagrophyte,
Epidermophyton floccosum và Microsporum canis [31].
Năm 2011, Abdulmoneim M. Saadabi và I.E.Abu Zaid đã tiến hành thí
nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch chiết chùm ngây đối với vi
khuẩn Staphylococcus aureus. Kết quả cho thấy ở nồng độ 0,01g/ml kích thước
vòng kháng khuẩn đạt được đối với Staphylococcus aureus là 45mm còn ở nồng
độ 0.08g/ml kích thước vòng kháng khuẩn là 48mm. Từ kết quả trên cho thấy hoạt
động kháng khuẩn của dịch chiết chùm ngây đạt được là khá mạnh [18].
Năm 2006, các tác giả Ping-Hsien Chuang, Chi-Wei Lee, Jia-Ying Chou,
M. Muragang, Bor-Jinn Chieh, Hueih-Min Chen đã tiến hành các khảo sát để
đánh giá hoạt tính kháng nấm từ chiết xuất dầu thô và tinh dầu của cây chùm
ngây. Các chiết xuất từ môi trường ethanol cho thấy hoạt động chống nấm trong
điều kiện in vitro có khả năng chống lại các tác nhân nấm gây bệnh ngoài da

như Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagro-phytes, Epidermophyton
Xoccosum và Microsporum canis. GC - MS phân tích các thành phần hóa học
của tinh dầu từ lá chùm ngây thu được tổng số có 44 hợp chất. Điều này mở ra
triển vọng cho sự phát triển trong tương lai của ngành y học để chống lại các tác
nhân gây bệnh ở da [31].
Năm 2014, Arowora K.A và Adetunji C.O. đã tiến hành nghiên cứu đánh
giá khả năng kháng nấm của dịch chiết chùm ngây đối với chủng nấm
Aspergillus niger. Kết quả nhiên cứu cho thấy, sau 7 ngày nuôi cấy, ở nồng độ
dịch chiết 0,03g/ml sự phát triển của nấm bắt đầu bị ức chế, khi tăng nồng độ lên
0,19g/ml hiệu lực ức chế đạt 100% [21].
Năm 2015, Pegah Kalatehjari, Mahdi Yousefian và Mohammad Ali
Khalilzadeh tiến hành nghiên cứu đánh giá khả năng kháng nấm Saprolegnia
spcủa vật liệu nano đồng. Các tác giả tiến hành thực hiện kháng nấm ở các nồng
độ 10, 50, 100, 500, 1000, 2000, 4000 ppm. Kết quả thí nghiệm cho thấy, ở
nồng độ 10 ppm, khả năng phát triển của nấm Saprolegnia sp giảm 40%; khi
tăng nồng độ lên thì khả năng phát triển của nấm tiếp tục giảm xuống cho đến
khi nồng độ kháng đạt 4000 ppm thì hiệu lực ức chế đạt 100% [30].
Việc sử dụng các loại cây thực vật có tính kháng nấm, kháng khuẩn trong
phòng trừ các loại nấm hại đã được nghiên cứu và cho hiệu quả kháng cao. Tuy
nhiên, chưa có một công bố nào về việc sử dụng dịch chiết chùm ngây trong
phòng trừ bệnh thán thư sau thu hoạch cũng như ứng dụng với vật liệu nano
đồng để đưa ra một hướng bảo quản mới. Do đó, việc nghiên cứu sử dụng dịch
18


chiết từ chùm ngây để kháng nấm Colletotrichum capsici và Colletotrichum
gloeosporioidescó ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao.

19

PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu
- Chủng nấm Colletotrichum capsici và Colletotrichum gloeoporioides:
được phân lập từ phòng thí nghiệm vi sinh của khoa Cơ khí - Công nghệ,
trường Đại học Nông lâm Huế.
- Dịch chiết thu từ lá và hạt chùm ngây.
- Chế phẩm nano Cu nồng độ 200 ppm được cung cấp từ PTN Hóa môi
trường, trường Cao đẳng Công nghiệp Huế.
3.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết thu được từ chùm ngây đến khả
năng kháng nấm gây bệnh thán thư trong điều kiện in vitro.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm nano Cu đến khả năng kháng nấm
gây bệnh thán thư trong điều kiện in vitro.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết thu được từ chùm ngây có bổ sung
chế phẩm nano Cu đến khả năng kháng nấm gây bệnh thán thư trong điều kiện
in vitro.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp thu chế phẩm
Chế phẩm thu được từ lá và hạt của cây chùm ngây trong nghiên cứu sử
dụng trực tiếp dung dịch sau khi chiết, từ đó tiến hành pha loãng đến các nồng
độ theo yêu cầu.
3.3.1.1. Phương pháp thu chế phẩm từ lá chùm ngây
Lá chùm ngây sau khi thu hoạch còn chứa nhiều tạp chất, để cho quá trình
tách chiết đạt hiệu quả cao thì tiến hành loại bỏ tạp chất, rửa sạch, để ráo. Lá cây
sau khi ráo nước được đưa đi sấy khô ở nhiệt độ 45 oC đến khối lượng không đổi,
cắt thành từng miếng nhỏ và nghiền thành bột. Cho 5 (g) bột nghiền mịn vào
bình tam giác và 20ml ethanol đã được thêm vào bình. Sau 48h các chiết xuất
được đi qua một miếng vải và được lọc với giấy lọc Whatman loại 1. Dịch lọc

thu được được bốc hơi đến khô ở 45oC.

20


3.3.1.2. Phương pháp thu chế phẩm từ hạt chùm ngây
Hạt chùm ngây sau khi thu hoạch còn chứa nhiều tạp chất, để cho quá
trình tách chiết đạt hiệu quả cao thì tiến hành loại bỏ tạp chất, rửa sạch, để ráo.
Hạt sau khi ráo nước được đưa đi sấy khô ở nhiệt độ 45oC đến khối lượng không
đổi rồi đem nghiền thành bột. Cho 5 (g) bột nghiền mịn vào bình tam giác và
20ml ethanol đã được thêm vào bình. Sau 48h các chiết xuất được đi qua một
miếng vải và được lọc với giấy lọc Whatman loại 1. Dịch lọc thu được được bốc
hơi đến khô ở 45oC.
3.3.2. Phương pháp đánh giá khả năng kháng nấm của dịch chiết thu được từ
lá chùm ngây khô và tươi
3.3.2.1. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết chùm ngây đến sự phát
triển của nấm
 Cách tiến hành:
Mỗi dịch chiết thu được từ lá và hạt chùm ngây được bố trí với 5 công
thức (CT), lặp lại 3 lần trên môi trường PDA ½, sử dụng đĩa ø9 để cấy nấm.
Mỗi đĩa ø9 cho 14ml môi trường PDA ½ có bổ sung dịch chiết từ lá và
hạt để đạt được các nồng độ kháng tương ứng với 5 CT là: CT I (C 1 = 0g/ml)
(ĐC); CT II (C2 = 0,025g/ml); CT III (C3 = 0,05g/ml); CT IV (C4 = 0,1g/ml); CT
V (C5 = 0,2g/ml).
Dùng đục lỗ kiểu nút chai để lấy tản nấm có đường kính là 2mm từ rìa
mép đĩa cách đều với tâm đĩa từ đĩa nấm đã được nuôi sau 7 ngày ở 28 oC. Sau
đó dùng que kẹp đặt tản nấm vào tâm đĩa chứa môi trường đã được chuẩn bị ở
trên.
Các thao tác được thực hiện trong buồng cấy vô trùng. Dụng cụ và môi
trường trước khi sử dụng đều được khử trùng (121 oC trong 15 phút) để tránh tạp

nhiễm.
Ủ đĩa nấm đã cấy ở 28oC, tiến hành theo dõi tốc độ phát triển của tản nấm
và đo đường kính tản nấm bằng thước đo panme, 2 ngày/lần đo.
 Chỉ tiêu theo dõi:
- Tốc độ phát triển và đường kính tản nấm (mm).
- Mức độ phát triển của đường kính tản nấm theo từng CT được xác định
theo đường cong tiến triển bệnh AUDPC (Area Under Disease Progress Curve)
[24].
21


Trong đó:
AUDPC: đường cong tiến triển chung của bệnh
yi, yi+1: đường kính vết bệnh trong lần theo dõi thứ i và thứ i+1 (mm)
ti, ti+1: thời gian theo dõi bệnh thứ i và thứ i+1 (h)
n: tổng số lần theo dõi
- Hiệu lực ức chế được tính theo tỷ lệ phần trăm (%) ức chế tốc độ phát
triển của đường kính tản nấm, PIRG(%) (Percentage Inhibition of Radial
Growth) [20].
Trong đó:
R1: đường kính tản nấm ở công thức đối chứng
R2: đường kính tản nấm ở công thức thí nghiệm
3.3.2.2. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết chùm ngâyđến sinh khối
sợi nấm
 Cách tiến hành:
Mỗi dịch chiết thu được từ lá và hạt chùm ngây được bố trí trên môi
trường PDB ½ với 5 CT lặp lại 3 lần, trên đĩa ø9. Dịch chiết từ lá và hạt dùng để
kháng có các nồng độ như sau: CT I (C 1 = 0g/ml) (ĐC); CT II (C 2 = 0,025g/ml);
CT III (C3 = 0,05g/ml); CT IV (C4 =0,1g/ml); CT V (C5 = 0,2g/ml) tương ứng
với 5 CT kháng.

Dùng đục lỗ kiểu nút chai để lấy tản nấm có đường kính là 2mm từ rìa
mép đĩa cách đều với tâm đĩa từ đĩa nấm đã được nuôi sau 7 ngày, ở 28 oC. Sau
đó dùng que kẹp đặt tản nấm vào tâm đĩa chứa môi trường đã được chuẩn bị ở trên.
Ủ đĩa nấm ở 28oC trong 7 ngày, dùng giấy lọc lọc sinh khối của tản nấm,
cho vào tủ sấy sấy đến khối lượng không đổi ở các CT trên.
 Chỉ tiêu theo dõi:
Theo dõi sinh khối của sợi nấm khô để xác định hiệu lực ức chế của chế
phẩm sử dụng [20].
Hiệu lực ức chế (%) =

C −T
× 100
C

Trong đó:
22


C: sinh khối sợi nấm khô của tản nấm ở công thức đối chứng (g)
T: sinh khối sợi nấm khô của tản nấm ở công thức thí nghiệm (g)
3.3.3. Phương pháp đánh giá khả năng kháng nấm của chế phẩm nano Cu
3.3.3.1. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm nano Cu đến sự phát
triển của nấm
 Cách tiến hành:
Thí nghiệm được bố trí với 5 CT, lặp lại 3 lần trên môi trường PDA ½, sử
dụng đĩa ø9 để cấy nấm.
Mỗi đĩa cho 14ml môi trường PDA ½ có bổ sung chế phẩm nano Cu ở các
nồng độ kháng tương ứng với 5 CT là: CT I (C 1 = 0 ppm) (ĐC); CT II (C2 = 10
ppm); CT III (C3 = 20 ppm); CT IV (C4 = 40 ppm); CT V (C5 = 80 ppm).
Dùng đục lỗ kiểu nút chai để lấy tản nấm có đường kính là 2mm từ rìa

mép đĩa cách đều với tâm đĩa từ đĩa nấm đã được nuôi sau 7 ngày ở 28 oC. Sau
đó dùng que kẹp đặt tản nấm vào tâm đĩa chứa môi trường đã được chuẩn bị ở
trên.
Các thao tác được thực hiện trong buồng cấy vô trùng. Dụng cụ và môi
trường trước khi sử dụng đều được khử trùng (121 oC trong 15 phút) để tránh tạp
nhiễm.
Ủ đĩa nấm đã cấy ở 28oC, tiến hành theo dõi tốc độ phát triển của tản nấm
và đo đường kính tản nấm bằng thước đo panme, 2 ngày/lần đo.
 Chỉ tiêu theo dõi:
- Tốc độ phát triển và đường kính tản nấm (mm).
- Mức độ phát triển của đường kính tản nấm theo từng CT được xác định theo
đường cong tiến triển bệnh AUDPC (Area Under Disease Progress Curve) [24].

Trong đó:
AUDPC: đường cong tiến triển chung của bệnh
yi, yi+1: đường kính vết bệnh trong lần theo dõi thứ i và thứ i+1 (mm)
ti, ti+1: thời gian theo dõi bệnh thứ i và thứ i+1 (h)
n: tổng số lần theo dõi

23


- Hiệu lực ức chế được tính theo tỷ lệ phần trăm (%) ức chế tốc độ phát triển của đường kính
tản nấm, PIRG(%) (Percentage Inhibition of Radial Growth) [20].

Trong đó:
R1: đường kính tản nấm ở công thức đối chứng
R2: đường kính tản nấm ở công thức thí nghiệm
3.3.3.2. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm nano Cu đến sinh khối
sợi nấm

 Cách tiến hành:
Thí nghiệm được bố trí trên môi trường PDB ½ với 5 CT lặp lại 3 lần,
trên đĩa ø9. Mỗi đĩa cho 14ml môi trường PDB ½ có bổ sung chế phẩm nano Cu
ở các nồng độ kháng tương ứng với 5 CT là: CT I (C 1 = 0 ppm) (ĐC); CT II (C2
= 10 ppm); CT III (C3 = 20 ppm); CT IV (C4 =40 ppm); CT V (C5 = 80 ppm)
tương ứng với 5 CT kháng.
Dùng đục lỗ kiểu nút chai để lấy tản nấm có đường kính là 2mm từ rìa
mép đĩa cách đều với tâm đĩa từ đĩa nấm đã được nuôi sau 7 ngày, ở 28 oC. Sau đó
dùng que kẹp đặt tản nấm vào tâm đĩa chứa môi trường đã được chuẩn bị ở trên.
Ủ đĩa nấm ở 28oC trong 7 ngày, dùng giấy lọc lọc sinh khối của tản nấm,
cho vào tủ sấy sấy đến khối lượng không đổi ở các CT trên.
 Chỉ tiêu theo dõi:
Theo dõi sinh khối của sợi nấm khô để xác định hiệu lực ức chế của chế
phẩm sử dụng [20].
Hiệu lực ức chế (%) =

C −T
× 100
C

Trong đó:
C: sinh khối sợi nấm khô của tản nấm ở công thức đối chứng (g)
T: sinh khối sợi nấm khô của tản nấm ở công thức thí nghiệm (g)
3.3.4. Phương pháp đánh giá khả năng kháng nấm của dịch chiết thu được từ
lá chùm ngây khô có bổ sung chế phẩm nano Cu
3.3.4.1. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết chùm ngây có bổ sung
chế phẩm nano Cu đến sự phát triển của nấm
 Cách tiến hành:
24

Thí nghiệm được bố trí với 5 CT, lặp lại 3 lần trên môi trường PDA ½, sử
dụng đĩa ø9 để cấy nấm.
Mỗi đĩa cho 14ml môi trường PDA ½ có bổ sung chế phẩm nano Cu và
dịch chiết từ lá ở các nồng độ kháng tương ứng với 5 CT là: CT I (C 1 = 0g/ml 0ppm) (ĐC); CT II (C2 = 0,025g/ml - 10ppm); CT III (C3 = 0,025g/ml - 20ppm);
CT IV (C4 = 0,2g/ml - 10ppm); CT V (C5 = 0,2g/ml - 20ppm).
Dùng đục lỗ kiểu nút chai để lấy tản nấm có đường kính là 2mm từ rìa
mép đĩa cách đều với tâm đĩa từ đĩa nấm đã được nuôi sau 7 ngày ở 28 oC. Sau
đó dùng que kẹp đặt tản nấm vào tâm đĩa chứa môi trường đã được chuẩn bị ở
trên.
Các thao tác được thực hiện trong buồng cấy vô trùng. Dụng cụ và môi
trường trước khi sử dụng đều được khử trùng (121 oC trong 15 phút) để tránh tạp
nhiễm.
Ủ đĩa nấm đã cấy ở 28oC, tiến hành theo dõi tốc độ phát triển của tản nấm
và đo đường kính tản nấm bằng thước đo panme, 2 ngày/lần đo.
 Chỉ tiêu theo dõi:
- Tốc độ phát triển và đường kính tản nấm (mm).
- Mức độ phát triển của đường kính tản nấm theo từng CT được xác định theo
đường cong tiến triển bệnh AUDPC (Area Under Disease Progress Curve) [24].

Trong đó:
AUDPC: đường cong tiến triển chung của bệnh
yi, yi+1: đường kính vết bệnh trong lần theo dõi thứ i và thứ i+1 (mm)
ti, ti+1: thời gian theo dõi bệnh thứ i và thứ i+1 (h)
n: tổng số lần theo dõi
- Hiệu lực ức chế được tính theo tỷ lệ phần trăm (%) ức chế tốc độ phát
triển của đường kính tản nấm, PIRG(%) (Percentage Inhibition of Radial
Growth) [20].

Trong đó:

R1: đường kính tản nấm ở công thức đối chứng
25