THU NHẬN ENZYM PAPAIN ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LỜI CẢM ƠN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


Để hoàn thành chƣơng trình cao học và luận văn này, em đã
nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, giúp đỡ và góp ý nhiệt tình của quý thầy cô

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

khoa Hóa trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên.
Trƣớc hết, em xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô khoa Hóa
trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TpHCM, đặc biệt là những thầy
cô đã tận tình dạy bảo cho em trong suốt thời gian học tập tại trƣờng.
Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Trần Kim Qui, TS. Lê

THU NHẬN ENZYM PAPAIN ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO

Việt Tiến đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hƣớng dẫn nghiên

PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH

cứu và giúp em hoàn thành luận văn này.

DẦU ĐẬU PHỘNG

Nhân đây, em cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị nghiên
cứu sinh đã động viên và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình hoàn
thành luận văn.

CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ
MÃ SỐ: 604427

Em xin chân thành cảm ơn anh Hồ Anh Vũ, anh luôn động viên
và đồng hành cùng em trong suốt thời gian học tập cũng nhƣ thời
gian em thực hiện luận văn này.

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình
đã cho con có đƣợc thành quả nhƣ ngày hôm nay.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thiện luận văn bằng tất cả

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
GS.TS. TRẦN KIM QUI

sự nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi
những thiếu sót, rất mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp quý báu
của quý thầy cô và các bạn.

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2009

Tp.HCM – Ngày 12 tháng 09 năm 2009


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
Chương 1
TỔNG QUAN ...................................................................................2

1.1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN ......................................................2
1.1.1 Cysteine protease .................................................................................2
1.1.2 Papain ....................................................................................................2
1.1.2.1 Nguồn gốc .......................................................................................2
1.1.2.1.1. Giới thiệu về cây đu đủ. ..........................................................3
1.1.2.1.2. Phân bố sinh thái của cây đu đủ. ............................................4
1.1.2.1.3. Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong
cây đu đủ .................................................................................................4
1.1.2.2 Tính chất của papain .....................................................................5
1.1.2.2.1 Tính chất vật lý .........................................................................5
1.1.2.2.2 Tính chất hóa học .....................................................................5
a) Cấu tạo hóa học ...........................................................................5
b) Cấu trúc không gian .....................................................................6
c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain .............................................7
d) Phản ứng của papain ...................................................................7
e. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain ................9
1.1.2.3 Ứng dụng của enzyme papain .................................................10
1.1.2.3.1 Trong y học: .......................................................................10
1.1.2.3.2 Trong công nghiệp thực phẩm: ..........................................10
1.1.2.3.3 Trong các ngành công nghiệp khác: ..................................10
1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG ................10
1.3 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG ...........................12
1.3.1 Khái niệm phản ứng thủy phân ............................................................12
1.3.2 Quy trình thực hiện phản ứng thủy phân ............................................13
1.3.3 Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân: .............................14
1.3.4 Tính chất của sản phẩm sau thủy phân ...............................................14
1.3.5 Ƣu và nhƣợc điểm của phản ứng thủy phân: ......................................15
1.3.5.1 Ƣu điểm: ...........................................................................................15
1.3.5.2 Nhƣợc điểm: .....................................................................................15
1.4 ỨNG DỤNG ENZYME PAPAIN LÀM XÚC TÁC CHO PHẢN ỨNG

THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG ....................15
Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................................17
2.1. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ........................................................................17
2.1.1. Hóa chất .................................................................................................17
2.1.2. Thiết bị ...................................................................................................18
2.2 PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN ...................................................................18
2.2.1 Phƣơng pháp trích nhựa đu đủ từ trái.................................................18
2.2.2 Phƣơng pháp thu nhận papain tinh khiết ............................................19

2.2.2.1 Loại bỏ các chất không tan ở pH 9. ................................................20
2.2.2.2 Quá trình phân đoạn bằng amonium sulfate .................................20
2.2.2.3 Quá trình phân đoạn bằng NaCl .....................................................20
2.2.2.4 Kết tinh..............................................................................................20
2.2.2.5 Tái kết tinh ........................................................................................21
2.2.2.6 Đông khô chân không. .....................................................................21
2.2.3 Xác định lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry .............................22
2.2.4 Xác định hoạt tính protein theo phƣơng pháp Anson ........................23
2.2.5 Xác định đạm tổng số theo phƣơng pháp Kjeldahl ............................24
2.2.5.1 Nguyên tắc: ......................................................................................24
2.2.5.2 Cách tính: .........................................................................................24
2.2.6 Phƣơng pháp xác định đạm formol (phƣơng pháp Sorensen) ..........25
2.2.6.1 Nguyên tắc........................................................................................25
2.2.6.2 Tiến hành .........................................................................................25
2.2.6.3 Cách tính ..........................................................................................26
2.2.7 Xác định đạm amoniac ..........................................................................26
2.2.7.1 Nguyên tắc........................................................................................26
2.2.7.2 Tiến hành .........................................................................................27
2.2.7.3 Cách tính ..........................................................................................27
2.2.8 Phƣơng pháp chung tiến hành phản ứng thủy phân bánh dầu đậu
phộng với xúc tác papain thô. ........................................................................27

2.2.8.1 Phƣơng pháp loại béo: ....................................................................27
2.2.8.2 Phƣơng pháp thực hiện phản ứng .................................................27
2.2.8.3 Hiệu suất thủy phân ........................................................................28
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................30
3.1 KHẢO SÁT LƢỢNG NHỰA Ở QUẢ ĐU ĐỦ ...........................................30
3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SƠ CHẾ NHỰA TƢƠI .....................................30
3.3 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THU NHẬN PAPAIN TỪ NHỰA KHÔ .......31
3.4 PHƢƠNG PHÁP LOWRY XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG PROTEIN .......33
3.5 PHƢƠNG PHÁP ANSON XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE ........34
3.6 KHẢO SÁT LƢỢNG ENZYME THU ĐƢỢC SAU CÁC GIAI ĐOẠN
TINH CHẾ. ..........................................................................................................35
3.7 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA ENZYME SAU CÁC GIAI ĐOẠN
TINH CHẾ ...........................................................................................................37
3.8 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI LƢỢNG PROTEIN TRONG CÁC CHẾ
PHẨM PROTEASE THU ĐƢỢC THEO THỜI GIAN ..................................39
3.9 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI HOẠT TÍNH CỦA CÁC CHẾ PHẨM
THEO THỜI GIAN. ...........................................................................................41
3.10 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA
ENZYME PAPAIN. ............................................................................................44
3.10.1. Khảo sát ảnh hƣởng của pH ...............................................................44
3.10.2 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ .......................................................45


3.11 KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO
THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN. .........................................46
3.12 KHẢO SÁT PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG
VỚI XÚC TÁC PAPAIN THÔ. .........................................................................49
3.12.1. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.25% so
với cơ chất theo thời gian............................................................................50

3.12.2. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.50% so
với cơ chất theo thời gian............................................................................57
3.12.3. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.75% so
với cơ chất ....................................................................................................65
3.12.4. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 1.00% so
với cơ chất ....................................................................................................72
KẾT LUẬN ..............................................................................................................80
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................81
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Tính chất vật lý của papain ..........................................................................5
Bảng 1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu phộng ....................................................10
Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong bánh dầu đậu phộng ......................................11
Bảng 1.4 Thành phần hóa học của bã đậu phộng đã loại béo ...................................11
Bảng 1.5. Thành phần amino acid trong đậu phộng .................................................11
Bảng 3.1. Hàm lượng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau. .....30
Bảng 3.2. Các phương pháp làm khô nhựa đu đủ .....................................................30
Bảng 3.3. Mật độ quang của albumin ở bước sóng 750nm ......................................33
Bảng 3.4. Mật độ quang của tyrosin ở bước sóng 720nm ........................................34
Bảng 3.5. Lượng protein thu được ở các phân đoạn tinh chế khác nhau. .................36
Bảng 3.6. Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế .......................38
Bảng 3.7. Hàm lượng protein của các chế phẩm theo thời gian ..............................40
Bảng 3.8. Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian ..................................42
Bảng 3.9. Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH .........................................44
Bảng 3.10. Hoạt tính của protein P(UI) trong nhựa khô biến đổi theo nhiệt độ ......45
Bảng 3.11: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.25%
so với cơ chất. ...........................................................................................................47
Bảng 3.12: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.50%
so với cơ chất. ...........................................................................................................47
Bảng 3.13: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 1.00%
so với cơ chất. ...........................................................................................................47

Bảng 3.14: Biến thiên hàm lượng đạm amoniac ở các nồng độ enzyme khác nhau 48
Bảng 3.15. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....51
Bảng 3.16. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....51
Bảng 3.17. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....52
Bảng 3.18. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....53
Bảng 3.19. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25%.....53
Bảng 3.20. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....54

3.11 KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO
THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN. .........................................46
3.12 KHẢO SÁT PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG
VỚI XÚC TÁC PAPAIN THÔ. .........................................................................49
3.12.1. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.25% so
với cơ chất theo thời gian............................................................................50
3.12.2. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.50% so
với cơ chất theo thời gian............................................................................57
3.12.3. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.75% so
với cơ chất ....................................................................................................65
3.12.4. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 1.00% so
với cơ chất ....................................................................................................72
KẾT LUẬN ..............................................................................................................80
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................81
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Tính chất vật lý của papain ..........................................................................5
Bảng 1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu phộng ....................................................10
Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong bánh dầu đậu phộng ......................................11
Bảng 1.4 Thành phần hóa học của bã đậu phộng đã loại béo ...................................11
Bảng 1.5. Thành phần amino acid trong đậu phộng .................................................11
Bảng 3.1. Hàm lượng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau. .....30
Bảng 3.2. Các phương pháp làm khô nhựa đu đủ .....................................................30

Bảng 3.3. Mật độ quang của albumin ở bước sóng 750nm ......................................33
Bảng 3.4. Mật độ quang của tyrosin ở bước sóng 720nm ........................................34
Bảng 3.5. Lượng protein thu được ở các phân đoạn tinh chế khác nhau. .................36
Bảng 3.6. Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế .......................38
Bảng 3.7. Hàm lượng protein của các chế phẩm theo thời gian ..............................40
Bảng 3.8. Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian ..................................42
Bảng 3.9. Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH .........................................44
Bảng 3.10. Hoạt tính của protein P(UI) trong nhựa khô biến đổi theo nhiệt độ ......45
Bảng 3.11: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.25%
so với cơ chất. ...........................................................................................................47
Bảng 3.12: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.50%
so với cơ chất. ...........................................................................................................47
Bảng 3.13: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 1.00%
so với cơ chất. ...........................................................................................................47
Bảng 3.14: Biến thiên hàm lượng đạm amoniac ở các nồng độ enzyme khác nhau 48
Bảng 3.15. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....51
Bảng 3.16. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....51
Bảng 3.17. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....52
Bảng 3.18. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....53
Bảng 3.19. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25%.....53
Bảng 3.20. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....54


Bảng 3.21. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....55
Bảng 3.22. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....56
Bảng 3.23. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....56
Bảng 3.24. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....58
Bảng 3.25. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....59
Bảng 3.26. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....59
Bảng 3.27. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....60

Bảng 3.28. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....61
Bảng 3.29. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....61
Bảng 3.30. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....62
Bảng 3.31. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....63
Bảng 3.32. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....63
Bảng 3.33. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....65
Bảng 3.34. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....66
Bảng 3.35. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....66
Bảng 3.36. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....68
Bảng 3.37. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....68
Bảng 3.38. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....69
Bảng 3.39. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....70
Bảng 3.40. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....70
Bảng 3.41. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....71
Bảng 3.42. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....72
Bảng 3.43. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....73
Bảng 3.44. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....74
Bảng 3.45. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....75
Bảng 3.46. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....75
Bảng 3.47. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....76
Bảng 3.48. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....77
Bảng 3.49. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....77
Bảng 3.50. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....78
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 2.1. Các loại hoa và trái của cây đu đủ. .............................................................3
Hình 1.2 Cấu trúc bậc 3 của papain ............................................................................6
Hình 1.3 Cấu trúc tâm hoạt động của papain ..............................................................7
Hình 1.4. Phản ứng hóa học của papain ......................................................................8
Hình 1.8. Sơ đồ phản ứng thủy phân.........................................................................13
Hình 2.1 Cách lấy nhựa đu đủ ...................................................................................19

Hình 2.2 Sơ đồ thu nhận papain từ nhựa đu đủ đông khô.........................................21
Hình 3.1a. Điện di đồ của nhựa khô ở trái non sơ chế bằng dung môi etanol .........31
Hình 3.1 b. Điện di đồ của chế phẩm Merk và papain tinh chế từ nhựa đu đủ đông
khô. ............................................................................................................................32

Hình 3.2. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ
albumin. .....................................................................................................................33
Hình 3.3. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ
tyrosin. .......................................................................................................................34
Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên lượng protein sau mỗi giai đoạn tinh chế. .36
Hình 3.5. Sự biến thiên hoạt tính của protein sau các giai đoạn tinh chế. ................39
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng protein theo thời gian .............40
Hình 3.7. Sự biến đổi hoạt tính của các chế phẩm theo thời gian .............................42
Hình 3.8 Hoạt tính của protein P(UI/ml) trong nhựa khô biến đổi theo pH .............44
Hình 3.9:Hoạt tính của protein trong nhựa khô theo nhiệt độ ..................................46
Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian
phản ứng. ...................................................................................................................48
Hình 3.11. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm
lượng xúc tác là 0.25%. .............................................................................................52
Hình 3.12. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm
lượng xúc tác là 0.25%. .............................................................................................55
Hình 3.13. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm
lượng xúc tác là 0.25%. .............................................................................................57
Hình 3.14. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm
lượng xúc tác là 0.50%. .............................................................................................60
Hình 3.15. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm
lượng xúc tác là 0.50%. .............................................................................................62
Hình 3.16. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm
lượng xúc tác là 0.50%. .............................................................................................64
Hình 3.17. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm

lượng xúc tác là 0.75%. .............................................................................................67
Tại pH 7.0, hiệu suất phản ứng ở mỗi nhiệt độ khác nhau được trình bày trong bảng
3.36 – 3.38. ................................................................................................................67
Hình 3.18. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm
lượng xúc tác là 0.75%. .............................................................................................69
Hình 3.19. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm
lượng xúc tác là 0.75%. .............................................................................................71
Hình 3.20. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm
lượng xúc tác là 1.00%. .............................................................................................74
Hình 3.21. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm
lượng xúc tác là 1.00%. .............................................................................................76
Hình 3.22. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm
lượng xúc tác là 1.00%. .............................................................................................78
Hình 3.23 Kết quả điện di của dung dịch sau phản ứng ở các hàm lượng xúc tác
khác nhau...................................................................................................................79


1

2

MỞ ĐẦU

TỔNG QUAN

Chương 1

Hiện nay vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm và ô nhiễm môi trường đang là
vấn đề được quan tâm hàng đầu. Trong quá trình sản xuất nước chấm có hàm lượng
đạm cao, người ta thường dùng các phương pháp thủy phân protein tạo thành các

dung dịch amino acid. Có 3 phương pháp tiến hành phản ứng thủy phân protein:
Phương pháp hóa học: thủy phân protein với xúc tác acid, thời gian tiến hành
phản ứng là 24 giờ. Nhược điểm của phương pháp này là tạo thành sản phẩm phụ 3-

1.1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN
1.1.1 Cysteine protease [8, 9,

19, 34, 43]

Cysteine proteases (EC.3.4.22) là nhóm các protein có trọng lượng phân tử
trong khoảng 21-30 kDa, các protein này có khả năng xúc tác để thủy phân các loại
liên kết: peptide, amide, ester thiol. Đây cũng là những enzyme có nhóm –SH trong
tâm hoạt động.
Người ta đã tìm thấy hơn 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) và nhiều

MCPD, một chất độc gây ung thư.
Phương pháp dùng men vi sinh: sử dụng chủng nấm Aspergillus oryzae để
xúc tác phản ứng thủy phân protein. Nhược điểm của phương pháp này là thời gian

enzyme trong số này (papain, bromelain, ficain, animal cathepsins) được ứng dụng
rộng rãi trong công nghiệp.
Có

thực hiện phản ứng khá dài khoảng từ 6 – 8 tháng.
Phương pháp hóa sinh: sử dụng xúc tác là các enzyme protease có nguồn gốc
động thực vật làm xúc tác. Phương pháp này có thời gian phản ứng ngắn và không
tạo sản phẩm phụ có khả năng gây ung thư.

hai

carboxypeptidase

loại
B)

cysteine
và

proteases

endopeptidases

là

exopeptidase

(bromelain,

(cathepsin

ficain,

X,

cathepsin...).

Exopeptidase thủy phân liên kết peptide ở đầu N hoặc đầu C tự do trong khi đó
endopeptidase cắt đứt các liên kết peptide ở giữa chuỗi polypeptide.
1.1.2 Papain

Các phản ứng sử dụng xúc tác enzyme được ứng dụng rất rộng rãi trong lĩnh

1.1.2.1 Nguồn gốc[2,17, 19, 32 ]

vực này vì chúng không những cho hiệu suất cao mà thời gian thực hiện phản ứng

Papain (EC 3.4.22.3) là cysteine protease được biết đến nhiều nhất và được

cũng ngắn hơn so với phản ứng được tiến hành theo phương pháp cổ điển. Hơn nữa

phân lập lần đầu tiên vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya). Đây cũng

các enzyme thường được phân bố rất rộng rãi trong tất cả các mô, cơ quan động vật

là enzyme đầu tiên được xác định cấu trúc tinh thể (Drenth et al., 1968; Kamphuis

và thực vật, tế bào vi sinh vật nên tương đối dễ tìm.

et al., 1894). Trong nhựa đu đủ ngoài enzyme papain còn có các loại protease khác

Trong phạm vi luận văn này chúng tôi sẽ tiến hành thu nhận enzyme papain

như chymopapain, caricain, glycyl endopeptidase và một số enzyme khác (Baines

có trong nhựa đu đủ và ứng dụng tính chất thủy phân protein của enzyme papain để

and Brock-lehurst, 1979). Nhựa đu đủ có hàm lượng và hoạt tính papain cao nhất

làm xúc tác cho phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng đã được ép

tập trung ở vùng có nắng nóng và độ ẩm ổn định quanh năm.

lấy dầu. Chúng tôi chọn enzyme papain vì đây là enzyme có hoạt tính protease cao,
hiện diện nhiều trong nhựa trái đu đủ, một loại cây được trồng rất phổ biến ở nước
ta.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


3

4

1.1.2.1.1. Giới thiệu về cây đu đủ.[7, 8, 41]

1.1.2.1.2. Phân bố sinh thái của cây đu đủ.[7, 26, 33]
Chi Carica L. có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ. Ở vùng núi cao
(1500-3000m), từ Panama đến Bolivia, cây đu đủ trồng hiện nay rất có thể là giống
lai tự nhiên của loài C. peltata Hook & Ann. Vào khoảng thế kỷ 16, người Tây Ban
Nha đã đưa đu đủ vào trồng ở vùng Caribê và một số nước Đông Nam Á. Từ các địa
điểm này, cây tiếp tục được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanca, châu Đại Dương và
châu Phi.
1.1.2.1.3. Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu

A: hoa cái

B: hoa lưỡng tính

C: hoa đực

đủ

[8,41, 45]

1. Nhựa đu đủ có thể gây viêm da.
2. Ở Trung Mỹ, trong dân gian, người ta sử dụng đu đủ để điều trị bệnh lỵ
amip (Entamoeba histolytica), một loại ký sinh trùng gây tiêu chảy dạng lỵ và biến
chứng áp- xe gan.
3. Ở Samoa, người dân dùng phần dưới vỏ thân cây đu đủ để chữa chứng
nhức răng.
D: trái của cây cái

E: trái lưỡng tính

F: cây đực

Hình 2.1. Các loại hoa và trái của cây đu đủ.
Tên khoa học: Carica papaya L., thuộc họ đu đủ - Caricaceae
Cây đu đủ còn được gọi thù đủ ở Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan
qua thụ, lô hong phlê (Campuchia), mắc hung (Lào), má hống (Thái).
Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên
phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái. Vài cây đu đủ cũng có thể

4. Nhựa đu đủ có chứa papain, là một trong hai loại men tiêu hủy protein

(proteolytic enzymes) có tác dụng làm mềm thịt bắp. Chính do tác dụng này, khi
dùng đu đủ hầm chung với thịt, thịt sẽ mềm hơn. Người dân vùng Ca-ri-bê, Trung
Mỹ cho biết họ có thể dùng khẩu phần với số lượng lớn thịt cá nhưng vẫn không hề
gì nếu ăn đu đủ xanh sau đó.
5. Phần cơm đu đủ là thành phần chính của các loại mỹ phẩm như kem nền
(mặt), kem đánh răng, xà bông gội đầu.

trổ cả ba loại hoa nói trên. Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực,

6. Các ứng dụng quan trọng trong y học của nhựa đu đủ là chiết xuất papain

cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa. Khuynh hướng

để dùng trong phẫu thuật cột sống (là một loại "dao phẫu thuật tự nhiên" để mở đĩa

thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra tỉ như khô hạn và thay đổi nhiệt độ.

đệm). Nghiên cứu cho thấy chiết xuất papain có hoạt tính kháng sinh (antibiotic
activity) với tác dụng chống vi khuẩn gram dương (gram-positive bacteria). Nó còn
được dùng để điều trị lở loét, làm tiêu giả mạc trong bệnh bạch hầu, chống kết dính
sau phẫu thuật, làm thuốc giúp tiêu hóa. Trong công nghiệp, papain được dùng để

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

5

6

tinh chế bia; xử lý len và lụa trước khi nhuộm; là phụ gia trong công nghệ chế biến

b) Cấu trúc không gian

cao su; khi tinh chế dầu gan cá tuna, người ta tiêm papain vào gan trước khi chiết

Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36x48x36Ao và mạch chính

xuất, làm cho thành phẩm giàu Vitamin A và D hơn. Khoảng 1,500 quả đu đủ xanh

bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt

cỡ vừa cho được khoảng 650g papain.

của khe này, nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe và nhóm

1.1.2.2 Tính chất của papain[8]

histidine 159 nằm bên phải khe. Phần xoắn  chiếm 20% toàn bộ các amino acid có

1.1.2.2.1 Tính chất vật lý

trong phân tử.

Bảng 1.1 Tính chất vật lý của papain

Tính chất vật lý
Điểm đẳng điện

Giá trị
pI = 8.75

Hằng số sa lắng S20

2.42 ± 0.04
-7

2

Hằng số phân tán D20 (10 giây.cm )

10.27 ± 0.13

Phân tử lượng

20,700

Độ triền quang []

D
20

-66.7o

Độ xoắn

17%

Vòng hiệu ứng cotton

290nm

Thể tích riêng phần V(mL/g)

0.724

Trị số ma sát f/fo

1.16

Bột màu vàng hay màu nâu nhạt, tùy thuộc phương pháp sấy, không tan
trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong H2O hay glycerine.
Bền nhiệt.
1.1.2.2.2 Tính chất hóa học[8, 34]
a) Cấu tạo hóa học
Theo kết quả phân tích bằng tia X, phân tử papain được cấu tạo bởi 212 acid

Hình 1.2 Cấu trúc bậc 3 của papain
Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt động là Cys25 và His159. Khoảng

amin trong đó không có chứa methionine. Phân tử lượng khoảng 23,350 Da, phân tử

pH hoạt động của papain khá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất. Khi cơ chất là

là một mạch polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc

casein thì hoạt tính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt độ thích

cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 không có chức

hợp là 50 – 57OC.

năng sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vị
trí 25.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


7

8

c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain

R'

Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen
bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với

NH2

R'

Cys25 S
H

Asp 175 bởi liên kết hydrogen.

N
C

Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid

Cys25 S

C

O

NH
O

NH
R

His159

HN

S - acyl hóa

R

His159

N

H2O

là:
RCO-NHR'

Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys.

R'NH2

Liên kết với chất nền
H

Theo các nghiên cứu của Lowe, chuỗi polypeptide trong trung tâm hoạt động

H

O

của papain gần giống như của ficin hay trypsin, mặc dù chúng có nguồn gốc khác

Cys25 S

25

C

O

Cys S

nhau.

NH
R

NH

Ficin: Arg-Glu-Glu-Gly-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys.

N

His159

HN

His159

Thủy phân

Trypsin: Lys-Asp-Ser-Cys-Glu-Gly-Gly-Asp-Ser.
RCOOH

OH

Cys25 S

C

O
NH

R

Đề acyl hóa

Papain

S-S-CH3 + R- SH

Không hoạt động

NH2+
C NH2
NH
(CH2)3

Hình 1.3 Cấu trúc tâm hoạt động của papain
d) Phản ứng của papain [21, 22, 23, 35]
Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các acid amin, nó đóng
vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase.

C HNHC

C

O

O

HN

Papain

His159

SH + R-S-S-CH3

Hoạt động
NH2+
C NH2 Cl

Cl

NH2

NH

Papain

(CH2)3

SH

NO2

C

HNHC

O

C OH3 +
O

NO2

Không màu

Có màu

Hình 1.4. Phản ứng hóa học của papain
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


9

10

e. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain[8, 6, 38]
 Nhiệt độ: Papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa

như TCA 10%, guanidine hydrochloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch về độ
quay quang học và hoạt tính của papain.

khô papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 100oC. Còn ở dạng dung dịch papain bị

1.1.2.3 Ứng dụng của enzyme papain[7, 8, 25, 29, 46]

mất hoạt tính sau 30 phút ở 82.5oC và nếu nhiệt độ tăng cao hơn (>100oC) thì nó sẽ

1.1.2.3.1 Trong y học:

bị mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch.
Điều này là do ở dạng dung dịch khi tăng lên đến nhiệt độ lớn hơn 100oC thì cấu
trúc tâm hoạt động của papain bị phá hủy hoàn toàn.

Papain được dùng làm thuốc chống giun sán, ăn không tiêu, chống biếng
ăn,… papain còn dùng làm thuốc rửa ráy tai, dùng trong phẫu thuật.
Papain có tác dụng lên hệ mạch dùng trị bệnh bạch cầu, viêm họng…

Điều đáng lưu ý là sau khi đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain
có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong nhựa, do trong nhựa còn chứa các protein

1.1.2.3.2 Trong công nghiệp thực phẩm:
Papain được dùng để làm mềm thịt, dùng để thủy phân gan cá ngừ làm thuốc
bổ. Papain còn được dùng trong sản xuất bia vì nó giúp tiêu hóa các protein còn hòa

khác có tác dụng bảo vệ papain.
Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 4oC bền trong nhiều tháng. Trong dung
dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng. Trong
khi đó hầu hết các enzyme mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự phân hủy hoặc oxy

tan trong bia.
1.1.2.3.3 Trong các ngành công nghiệp khác:
Papain được dùng làm mềm da trong ngành công nghiệp thuộc da, dùng tẩy
các vết máu trên quần áo. Trong công nghiệp mỹ phẩm, papain được dùng để tẩy

hóa.
Khi thủy phân các protein khác nhau, thì tùy thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ
thích hợp cho papain cũng khác nhau chẳng hạn đối với cơ chất là casein thì nhiệt
o

độ tối ưu cho phản ứng là 37 C. Papain dạng ổn định ở trạng thái khô có thể chịu
nhiệt độ sấy ở 115oC trong thời gian 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được 90%.
 pH: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4.5-8.5 nhưng lại

các vết nám, tàn nhang trên da.
1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG
Đậu phộng có hàm lượng lipid cao nên thường được dùng để ép dầu. Đậu
phộng sau khi ép lấy dầu được gọi là bánh dầu phộng.
Theo tài liệu công bố, trung bình trong hạt đậu phộng có thành phần như bảng 1.2:
Bảng 1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu phộng
Thành phần
Hàm lượng (%)

dễ biến tính trong môi trường acid có pH < 4.5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh
có pH > 12.

Khi phản ứng với cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu
sẽ khác nhau. Chẳng hạn, papain phản ứng với casein ở pH tối ưu là 7-7.5.
Papain dạng ổn định tức là dạng mà cấu trúc không gian của enzyme được ổn
định, có thể chịu được các pH = 1.5 và pH = 8.5 trong 90 phút.
 Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong dung môi là
methanol 70% và không thay đổi độ nhớt trong dung môi methanol 50%. Trong
dung dịch dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M không làm

Protein

20 – 34

Lipid

40 – 60

Hydrat carbon

6.0 – 22

Xenlulo

2.0 – 4.5

Tro

1.8 – 4.6

Trong protein của đậu phộng thì glubumin có hàm lượng cao nhất chiếm
khoảng 97%, ngoài ra còn có một số hàm lượng không đáng kể albumin, prolamin,

giảm hoạt tính cũng như thay đổi cấu hình của papain. Các chất gây biến tính mạnh

glutein.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


11

12

Trong lipid của đậu phộng có hai loại acid béo no và không no với hàm
lượng tính theo phần trăm như bảng 1.3:

1.3 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG
1.3.1 Khái niệm phản ứng thủy phân[13, 14, 15]

Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong bánh dầu đậu phộng
Tên acid béo Không no (%) No (%)

Phản ứng thủy phân là phản ứng phân hủy các chất có sự tham gia của nước.
Phản ứng thủy phân là phản ứng quan trọng trong các ngành công nghiệp, đặc biệt

Oleic

50 – 70

6 - 11

là trong công nghiệp thực phẩm. Người ta ứng dụng phản ứng thủy phân trong công

Linoleic

13 – 26

2–6

nghiệp thực phẩm để sản xuất ra hàng loạt sản phẩm mới khác xa với tính chất của

Linolenoic

13 – 26

5–7

nguyên liệu ban đầu về tính cảm quan, về tính dinh dưỡng của sản phẩm. Tuy

Bánh đậu phộng đã tách dầu có thành phần theo bảng 1.4:
Bảng 1.4 Thành phần hóa học của bã đậu phộng đã loại béo

nhiên, trong nhiều trường hợp phản ứng thủy phân có hại cho các sản phẩm thực
phẩm trong quá trình bảo quản.
Phương trình tổng quát của phản ứng thủy phân

Thành phần

Hàm lượng (%)

Protein

48

Acid amin

12.7

Hydrat carbon

26.5

Lipid

8.0

hay các enzyme hydrolase trong đó đặc biệt được ứng dụng rộng rãi là các enzyme

Tro

4.8

có nguồn gốc vi sinh vật và thực vật.

R1R2 + H2O

(H+, HO-)

R1OH + R2H

Các tác nhân làm xúc tác cho phản ứng thủy phân thường là các acid, base

Hàm lượng acid amin bao gồm các acid amin cơ bản theo bảng 1.5 :
Bảng 1.5. Thành phần acid amin trong đậu phộng
Tên cấu tử

Hàm lượng (%)

Tryptophan

0.5

Leucin

3.5

Isoleucin

1.5

Valin

1.65

Threonin

0.75

Lysin

1.5

Methionin

0.6

Phenylalanin

2.7

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

Enzym

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

Trong phản ứng thủy phân có sự tham gia của một lượng nước rất lớn do đó
tốc độ của phản ứng thủy phân chỉ tùy thuộc vào nồng độ của cơ chất. Như vậy,
phản ứng thủy phân xúc tác bởi enzyme là phản ứng đơn phân có thứ bậc 1.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

13

14

Ở đây E là enzyme papain và S là protein đậu phộng, ES là phức hợp trung

1.3.2 Quy trình thực hiện phản ứng thủy phân

gian giữa enzyme và cơ chất, P là sản phẩm (chủ yếu là các acid amin và các peptid
cấp thấp).
Sự tạo thành và chuyển biến của hợp chất trung gian ES xảy ra qua 3 bước:
Bước 1: Enzyme kết hợp với protein tạo thành phức enzyme – protein (ES).

e

Bước 2: Có sự thay đổi mật độ điện tử và sự biến dạng hình học của các mối liên
kết đồng hóa trị trong phân tử cơ chất S cũng như trung tâm hoạt động của E.
Bước 3: Giai đoạn tạo thành acid amin hay peptid cấp thấp và giải phóng enzyme.
1.3.3 Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân:
Những nghiên cứu về sự liên kết enzyme và cơ chất đề ra giả thuyết: phần
lớn các enzyme trở nên hấp thụ với bề mặt ngoài của protein đậu phộng theo một
tiến trình tương đối nhanh, sau đó sự khuếch tán những phân tử enzyme vào trong
e

những thành phần này xảy ra chậm hơn. Sự thủy phân những nối peptid của protein
đậu phộng có thể chia làm hai pha:
Pha nhanh (pha động): xảy ra ở giai đoạn đầu. Trong suốt pha này, một số
lớp peptid bị phá hủy trong một đơn vị thời gian và một phần chất hòa tan được
phóng thích vào trong dung dịch.
Pha chậm (pha tĩnh): tốc độ thủy phân càng về sau càng giảm, tiến trình hầu

như ít có sự thay đổi cho đến khi phản ứng thủy phân kết thúc.
1.3.4 Tính chất của sản phẩm sau thủy phân[16]
Tính chất quan trọng nhất của sản phẩm là tính dinh dưỡng. Chiều dài chuỗi

Hình 1.8. Sơ đồ phản ứng thủy phân
Quá trình chuyển từ protein bánh đậu phộng thành acid amin là một quá trình

peptid của sản phẩm thủy phân có tầm quan trọng đặc biệt. Khả năng hòa tan, khả
năng nhũ tương, vị đắng …đều phụ thuộc ít nhiều vào kích thước và trọng lượng

khá phức tạp. Dưới điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân, enzyme sẽ tham

phân tử của các loại proteint có trong sản phẩm. Tất cả các sản phẩm thủy phân đều

gia phản ứng theo sơ đồ sau:

có vị đắng ở những mức độ khác nhau làm hạn chế rất nhiều tính cảm quan của sản
phẩm. Vị đắng là nhược điểm chung của các sản phẩm thủy phân với xúc tác

E + S ---> ES --> S + P
Người ta cho rằng ban đầu enzyme sẽ liên kết với cơ chất (bánh dầu đậu

enzyme và được cho là có liên quan đến những peptid có trọng lượng phân tử thấp

phộng), sau đó mới diễn ra sự thủy giải và tạo ra các sản phẩm là các acid amin và

(khoảng 6,000 Da). Ta không thể khử được vị đắng nhưng có thể giảm bớt được

các đoạn peptid ngắn.
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


15

16

bằng cách kiểm soát mức độ thủy phân để cho những peptid có phân tử lượng lớn
chiếm ưu thế.

 Định lượng và hoạt tính của enzyme papain sau mỗi giai đoạn tinh
chế.

Việc sử dụng enzyme làm xúc tác có nhược điểm là thủy phân không triệt để,
sau thủy phân còn khoảng 20% nitơ tổng số vẫn không tan, do đó người ta thường
phối hợp thủy phân bằng hóa chất để nâng cao hiệu suất thủy phân.
1.3.5 Ƣu và nhƣợc điểm của phản ứng thủy phân:

 Khảo sát sự biến đổi lượng và hoạt tính enzyme papain theo thời gian.
 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain.
2. Khảo sát phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng
 Xác định hàm lượng đạm formol và đạm amoniac theo thời gian phản

1.3.5.1 Ƣu điểm:

ứng

Do enzyme hydrolase có tính đặc hiệu cao nên ít hoặc hầu như không tạo
thành sản phẩm phụ. Dịch thủy phân thu được có độ thuần khiết cao.

 Khảo sát sự thay đổi hàm lượng xúc tác, pH và nhiệt độ ảnh hưởng
đến hiệu suất phản ứng thủy phân.

Sử dụng enzyme xúc tác phản ứng có thể định hướng được phản ứng xảy ra
và sản phẩm tạo thành.
Có thể điều chỉnh được phản ứng nhằm tạo ra sản phẩm mong muốn.
Hiệu suất thủy phân của enzyme khá cao, chỉ cần một lượng nhỏ enzyme
cũng có thể thủy phân được một lượng rất lớn cơ chất.
Trong phản ứng xúc tác bởi enzyme thì yêu cầu về độ thuần khiết của cơ
chất không cao.
Không như một số phản ứng hóa học khác, phản ứng thủy phân với xúc tác
enzyme xảy ra ở những điều kiện ít khắc nghiệt hơn.
Phản ứng thủy phân bằng enzyme có biệt tính chọn lọc lập thể cao.
1.3.5.2 Nhƣợc điểm:
Thời gian thủy phân với xúc tác enzyme thường kéo dài hơn so với thủy
phân với xúc tác acid.
Dịch sau thủy phân thường khó lọc.
1.4 ỨNG DỤNG ENZYME PAPAIN LÀM XÚC TÁC CHO PHẢN ỨNG
THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG
Trong luận văn này, chúng tôi điều chế enzyme papain để thủy phân protein
trong bánh dầu đậu phộng với các nội dung sau:
1. Thu nhận enzyme papain từ nhựa trái đu đủ
 Khảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


17

18

Bánh dầu đậu phộng lấy mẫu tại chợ Lái Thiêu.
2.1.2. Thiết bị

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

Máy quang phổ UV Aglient 8453.
Máy đông khô chân không Christ, Alpha 1- 2 Ldplus
Cùng các thiết bị khác của phòng thí nghiệm : máy ly tâm, máy khuấy từ gia

2.1. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

nhiệt...

2.1.1. Hóa chất

2.2 PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN

Thuốc thử Folin – Merck, Đức.

2.2.1 Phƣơng pháp trích nhựa đu đủ từ trái[3, 8, 11, 16, 10, 20]

Tyrosin – Merck, Đức.

Quả: lấy ở những quả đang còn xanh, vỏ quả mịn, có trọng lượng từ 0.3-1 kg

Casein – Merck, Đức.

là tốt nhất. Quả non quá cho ít nhựa, quả quá già hoặc quả to vừa cho nhựa ít, vừa

Albumin – Merck, Đức.

không sánh sệt, hoạt tính enzyme không cao. Quả có vỏ sần sùi, chia thùy cũng cho

Dung dịch Citrat Natri 1%: cân chính xác 1g Citrat Natri pha với nước cất

ít nhựa. Để thu enzyme có hoạt tính cao nhất, nên lấy nhựa ở quả đang độ 10 tuần

thành 100ml.

tuổi.

Dung dịch Na2HPO4 1/15M: cân chính xác 5.9690g Na2HPO4.12H2O hòa tan
trong nước cất và định mức cho đủ 250ml.

Thời gian lấy nhựa: sáng sớm, kết thúc vào giữa buổi sáng (giai đoạn có độ
ẩm không khí cao). Khi độ ẩm không khí thấp, dòng nhựa chảy chậm và đặc rất khó

Dung dịch KH2PO4 1/15M: cân chính xác 0.9072g KH2PO4 hòa tan trong

thu nhận.

nước cất và định mức lại cho đủ 100ml.

Mùa khô: nhựa ít, đặc, nồng độ protein cao

Dung dịch đệm Sorosen 1/15M, pH 7.6: trộn chung 177ml dung dịch
Na2HPO4 1/15M và 23ml dung dịch KH2PO4 1/15M.

Mùa mưa: nhựa nhiều, loãng, nồng độ protein thấp
Tiến hành

Dung dịch casein 1%: đun sôi cách thủy 1g casein trong dung dịch đệm

Nhựa đu đủ lấy ở quả xanh còn ở trên cây

Sorensen cho đến khi tan hoàn toàn rồi định mức lại cho đủ 100ml.

Dùng dao inox có đầu nhọn rạch vài đường dọc theo quả ở chỗ đường kính

Dung dịch TCA 5%: hòa tan 5g TCA trong nước cho đủ 100ml.

quả to nhất, các lát khía cách nhau 3-5cm (không rạch sâu quá 2cm, nếu không dịch

Dung dịch NaOH 0.5N: hòa tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500ml.

nước và tinh bột từ quả sẽ trộn lẫn vào nhựa và làm giảm chất lượng nhựa thu

Dung dịch HCl 0.2N: trộn 4.25ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 250ml.

được).

Dung dịch Tyrosin 20 mM/l: khuấy nghiền 1.8119 Tyrosin trong dung dịch
HCl 0.2N vừa đủ 500ml.

Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thủy tinh màu miệng rộng trong 4 – 6 phút,
sau khi lấy nhựa xong đậy nắp kín và bảo quản lạnh, giữ trong tối nhằm tránh không

Dung dịch Tyrosin chuẩn 1mM/l trong dung dịch HCl 0.2N: pha loãng 5ml
dung dịch Tyrosin 20mM/l trong dung dịch HCl 0.2N thành 100ml.

cho nhựa tiếp xúc lâu với không khí và để bảo đảm hoạt tính của papain có trong
nhựa.

Nhựa đu đủ lấy mẫu tại thị trấn Xuyên Mộc - tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu.

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


19

20

Khi lấy nhựa cần lau sạch trái nhằm tránh không cho chất bẩn hoặc côn trùng
lẫn vào.

Trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g celite và 150g cát sạch, nghiền kỹ trong
cối ở nhiệt độ phòng với 200-300ml dung dịch cysteine 0.04M (hòa tan 6.3g

Không nên trộn nhựa khô với nhựa tươi vì nó làm giảm chất lượng nhựa.

cysteine hydrochloride trong 1000ml dung dịch NaOH 0.054M, kiềm được sử dụng
để đưa pH dịch chiết tới 5.7). Khi dịch nhựa tạo thành thể huyền phù, gạn bỏ lớp
nổi ở trên. Quá trình nghiền và trích được lặp lại với 300ml dung dịch cysteine. Sau
đó rửa cối với dung dịch cysteine để điều chỉnh thể tích lên 1000ml. Dịch huyền
phù sau cùng được lọc lạnh (có thể hút nhẹ) trên giấy lọc Whatman số 1. Thời gian
lọc phụ thuộc vào nhựa khô được sử dụng và quá trình này có thể rất chậm. Nước
lọc có màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần 5.7. Các bước còn lại của quá trình
tinh sạch enzyme được tiến hành trong điều kiện lạnh.[25, 27, 28]
2.2.2.1 Loại bỏ các chất không tan ở pH 9.
Dịch chiết thu được ở trên được điều chỉnh lên pH 9 bằng cách thêm từ từ và
khuấy đều một lượng khoảng 110ml dung dịch NaOH 1M. Tủa xám tạo thành có

Hình 2.1 Cách lấy nhựa đu đủ
Quả có thể được rút nhựa trong suốt khoảng thời gian từ 4 – 7 ngày. Lần đầu
tiên có thể chỉ cần một rạch là đủ, ở những lần thu nhựa sau, rạch 2 – 3 đường giữa

thể được loại ra bằng lọc hoặc ly tâm ở 4000rpm trong 30 phút. Dịch trích ở giai
đoạn này phải trong do các tủa gây biến tính protein đã được loại bỏ.
2.2.2.2 Quá trình phân đoạn bằng amonium sulfate
Cho amonium sulfate vào dịch enzyme đến 40% độ bão hòa, sau 1-2 giờ, ly

những đường rạch trước đó.

Khi tiến hành các thao tác với nhựa tươi, tránh không cho nhựa tiếp xúc vào

tâm ở 4000rpm. Thu nhận tủa, bỏ dịch lỏng hoặc có thể giữ lại để lấy chymopapain.

da vì dễ gây bỏng. Đồng thời cũng không nên để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm

Tủa được rửa một lần với 400-500ml dung dịch amonium sulfate 40% độ bão hòa.

từ kim loại nặng như sắt, đồng, …để tránh làm biến màu và giảm hoạt tính enzyme.

2.2.2.3 Quá trình phân đoạn bằng NaCl

Lọ, dao, muỗng,… phải được làm bằng nhựa hoặc thép không rỉ.
Nhựa tươi không bền vì thế nên đông khô chân không ngay sau khi thu nhận,
nhựa đông khô được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu.
2.2.2 Phƣơng pháp thu nhận papain tinh khiết

[8, 18, 23, 28, 40, 42, 44]

Hòa tan tủa trong 600ml dung dịch cysteine 0.02M (pH 7-7.5), tủa papain tạo
thành khi thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau một giờ, ly tâm ở 4000rpm trong 40 phút để
thu tủa, bỏ dịch lỏng.
2.2.2.4 Kết tinh

Trong thành phần của nhựa đu đủ tươi ngoài enzyme papain, chymopapain

Tủa được tạo thành dịch huyền phù với 400ml dung dịch cysteine 0.002M ở

còn có một số loại enzyme, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo,… và các tạp

pH 6.5 và điều kiện nhiệt độ phòng. pH của dung dịch huyền phù được điều chỉnh

chất khác. Để có được quy trình tách và làm sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả

lại đến 6.5 sau khi cho protein vào. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể

thì phải có quy trình hòa tan nhựa đu đủ, mục đích là để loại bỏ các chất cặn, nhựa,

tạo thành, sau đó duy trì ở 4oC qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 4000rpm trong 1 giờ

tạp lớn.

để thu nhận tinh thể.

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


21

22

2.2.3 Xác định lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry[1, 4, 12, 36]

2.2.2.5 Tái kết tinh

Hòa tan tinh thể thu được ở giai đoạn kết tinh trong nước cất (tạo dung dịch

Nguyên tắc

có nồng độ protein khoảng 1%) ở nhiệt độ phòng. Sau đó cho vào từ từ (đồng thời

Hầu hết các protein đều có chứa tyrosin và tryptophan. Hàm lượng của

khuấy đều) dung dịch NaCl bão hòa (10ml/300ml dung dịch protein). Khi 75% thể

những acid amin này tùy thuộc vào loại protein. Vì vậy, những protein cùng loại với

tích dung dịch NaCl đã cho vào, papain bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng. Dịch

nhau có hàm lượng các acid amin này giống nhau.

huyền phù được giữ ở 4oC qua đêm, sau đó ly tâm thu tủa. Hoạt độ riêng của

Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có

enzyme có thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như trên.

màu. Cường độ màu của phức này tỉ lệ với hàm lượng tyrosin và tryptophan (cũng

2.2.2.6 Đông khô chân không.

là hàm lượng protein). Vì thế ta có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm

Tủa protein thu được đem đông khô chân không để loại bỏ nước. Protein sau
khi đông khô chân không được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu

lượng protein.
Hóa chất
Dung dịch A: cân 2g Na2CO3 hòa tan trong NaOH N/10 thành 100ml.

tiếp theo.
Qui trình thu nhận papain tinh khiết có thể được tóm tắt lại theo sơ đồ
2.2

Dung dịch B: cân 0.5g CuSO4.5H2O hòa tan trong Citrat Natri 1% tạo thành
100ml.
Dung dịch C (chỉ pha để dùng trong ngày): là hỗn hợp của hai dung dịch A
và B được pha theo tỷ lệ 49:1.
Dung dịch Albumin 0.1%: cân chính xác đến 4 chữ số khoảng 0.1g albumin
pha với nước cất thành 100ml.
Dựng đƣờng chuẩn
Ta thực hiện đường chuẩn với một loại protein tinh khiết có sẵn, thường là
albumin của bò đã đông khô. Tiến hành pha albumin có nồng độ khác nhau vào các
ống nghiệm được đánh số từ 0 đến 5 như bảng bên dưới.
Ống nghiệm số

0

1

2

Nồng độ protein mg/ml

0

50

100 150 200 250

Dung dịch albumin 0.1% (ml) 0
Nước cất (ml)

3

4

5

0.5 1.0

1.5

2.0

2.5

10 9.5 9.0

8.5

8.0

7.5

Hút 0.4ml dung dịch protein có nồng độ khác nhau từ các ống nghiệm vừa
pha ở trên theo thứ tự từ 1 đến 6 vào 6 ống nghiệm sạch khác. Thêm vào đó 2ml
dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó thêm vào
Hình 2.2 Sơ đồ thu nhận papain từ nhựa đu đủ đông khô

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml. Đem
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


23

24

đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 750nm. Sau đó vẽ đường chuẩn biểu diễn sự

Dung dịch hóa chất

Ống nghiệm

biến thiên của mật độ quang (OD) theo nồng độ albumin chuẩn (mg/ml).
Xác định hàm lƣợng protein có trong mẫu:
Hút 0.4ml dung dịch protein cần xác định hàm lượng cho vào một ống
nghiệm sạch và đã được sấy khô. Thêm vào đó 2ml dung dịch C. Lắc đều và để yên

1

2

Dung dịch casein 1% (ml)

5

5

Dung dịch TCA 5% (ml)

0

10

Dung dịch enzyme mẫu (ml) 1

ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó, thêm vào 0.2ml thuốc thử Folin, lắc đều
trong 5 – 10 phút, thêm nước cất vào cho đủ 5ml. Đem đo mật độ quang (OD) ở
bước sóng 750nm. Dựa vào đường chuẩn để ngoại suy ra hàm lượng protein có
trong mẫu nghiên cứu.

1
o

Lắc đều và giữ ở 35.5 C
Dung dịch TCA 5% (ml)

10

0

Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên dưới
Lấy 4 ống nghiệm mới, sạch, chia thành hai lô, mỗi lô hai ống để lấy trung

2.2.4 Xác định hoạt tính protein theo phƣơng pháp Anson[1, 4]

bình đánh dấu A và B. Cho vào ống A 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 1 và ống B 5ml

Nguyên tắc

dịch lọc từ ống nghiệm 2.

Casein bị phân giải trong môi trường kiềm dưới tác dụng của protease tạo

Thêm vào mỗi ống 10ml dung dịch NaOH 0.5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc

thành sản phẩm là các đoạn peptid ngắn hòa tan trong tricloroacetic acid (TCA), xác

mạnh, sau 10 phút, đo OD ở bước sóng 660nm hoặc 720nm. Dựa vào đồ thị chuẩn

định tyrosin và tryptophan hòa tan bởi thuốc thử Folin.

để suy ra được M Tyrosin.

Dựng đƣờng chuẩn Tyrosin

2.2.5 Xác định đạm tổng số theo phƣơng pháp Kjeldahl[1, 4]

Dung dịch hóa chất

Ống nghiệm

Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml)

1

2

3

2.2.5.1 Nguyên tắc:
4

5

6

Chất đạm khi đem vô cơ hóa sẽ chuyển thành dạng ammonium sulfat, khi

Lượng Tyrosin tương ứng (M) 0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

cho tác dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng thích ra amoniac theo

Dung dịch HCl 0.2N (ml)

0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

phương trình như sau:

Dung dịch NaOH 0.5N (ml)

5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0

Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 720nm

(NH4)2SO4 + NaOH ---> 2NH3 + H2O + Na2SO4
Lượng amoniac phóng thích ra sẽ được hơi nước lôi cuốn bằng một dụng cụ

Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TT). Vẽ

là máy Parnas – Wargner và được dẫn đến một bình tam giác có chứa một lượng

đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và độ hấp thu quang ở

thừa H2SO4. Từ đây, cho phép chúng ta xác định được lượng amoniac phóng thích

bước sóng 720nm.

ra, có nghĩa là xác định hàm lượng đạm trong mẫu nguyên liệu.
2NH3 + H2O + H2SO4 ---> (NH4)2SO4 + H2O

Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và OD.

2.2.5.2 Cách tính:

Xác định lƣợng Tyrosin trong dung dịch nghiên cứu

N = 1.4*V (mg/ml)

Cân chính xác 0.1g mẫu protein hòa tan trong 100ml nước cất, tạo thành
Trong đó:

dung dịch protein có nồng độ 0.001g/ml.

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


25

26

N: Số gam đạm tổng số có trong 1 lít nguyên liệu loãng hay 1kg nguyên liệu

Hút 10ml dung dịch nguyên liệu đã pha loãng từ 5 đến 20 lần (trong đề tài
này chúng tôi tiến hành pha loãng mẫu 10 lần) thêm vào đó 10ml dung dịch formol

rắn.
V = V0 – V

½ đã trung hòa và vài giọt phenolphtalein 3%, lắc đều để phản ứng xảy ra hoàn

V0: thể tích NaOH N/100 mẫu thử không.

toàn, sau đó định phân bằng NaOH x N/10 cho đến khi dung dịch chuyển màu
hồng.

V: thể tích NaOH N/100 mẫu thử thật.
2.2.6 Phƣơng pháp xác định đạm formol (phƣơng pháp Sorensen)

[1, 4]

cất) lấy trị số trung bình.

2.2.6.1 Nguyên tắc
Trong phân tử acid amin, peptid, protein có một đầu chức là nhóm –COOH
như là một acid còn đầu kia là nhóm –NH2 được xem như là một base, còn các amin
tự do cũng như amoniac khi hòa tan thường ở dưới dạng amonium NH4+ kết hợp với

2.2.6.3 Cách tính
Số gam đạm formol có trong 1 lít nguyên liệu = 1.4*V (g/lít)
Trong đó:
V = V – V0

một anion thường là clorur, sulfat, phosphat…
Như vậy khi ta cho tác dụng các phân tử “phi protein” này với formol,
formol sẽ tác dụng lên nhóm -NH2 để tạo thành phức chất methylen (mono, tri hoặc

V0: thể tích NaOH N/10 mẫu thử không.

V: thể tích NaOH N/10 mẫu thử thật.
2.2.7 Xác định đạm amoniac[1, 4]

hexamethylen).
H
HOOC

Thực hiện ba sự thử thật và ba sự thử không (thay dung dịch đạm bằng nước

C

2.2.7.1 Nguyên tắc

H
NH2

+ HCHO

HOOC

C

N

CH2 + H2O

Trong nguyên liệu chứa đạm thường có một loại đạm nằm dưới dạng “vô cơ”
(muối amonium hay những amin dễ bay hơi). Đây là dạng đạm tạo thành do sự

R

RNH4+Cl- + HCHO

R

R

N

CH2 + H2O + HCl

Sản phẩm của phản ứng là hợp chất methylen và một chức –COOH tự do
(trong trường hợp acid amin) hoặc HCl (trong trường hợp amin tự do hoặc
amoniac). Nên ta có thể định phân bằng NaOH, từ đây cho phép ta xác định một
cách gián tiếp được lượng –NH2.

phân hủy của protein (bị lên men thối hoặc quá trình khử carboxyl của acid amin),
vì thế nếu đứng về khía cạnh dinh dưỡng thì loại đạm này không cần cho cơ thể,
nếu có sự hiện diện của nó với hàm lượng cao thì nguyên liệu được đánh giá là “mất
phẩm chất’.
Những loại đạm này thường có tính kiềm yếu, vì vậy khi cho tác dụng với
MgO thì những loại đạm này sẽ bị đuổi ra khỏi dung dịch, nên chúng sẽ được lôi

Khi hàm lượng đạm formol không tăng theo thời gian có nghĩa là phản ứng
thủy phân đã kết thúc

cuốn theo hơi nước qua một bình đựng lượng thừa acid. Sau đó đem định phân
lượng acid dư, cho phép chúng ta xác định được loại đạm này.

2.2.6.2 Tiến hành

2(NH4)+ + Mg(OH)2 ---> 2NH3 + 2H2O + Mg2+

Trung hòa formol ½: lấy 50ml formol ½, thêm vào đó vài giọt

2NH3 + H2SO4 ----> (NH4)2SO4

phenolphtalein 3%, cho NaOH N/10 từng giọt cho đến khi dung dịch chuyển màu
hồng nhạt, ta được formol ½ đã trung hòa.

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


27

28

2.2.7.2 Tiến hành

erlen 100ml, thêm vào 50ml dung dịch đệm phosphate 0.1M. Bánh dầu đậu phộng

Lấy 50ml dung dịch nguyên liệu đã pha loãng 20 lần (hoặc cân chính xác

được trộn với dung dịch đệm phosphate để đạt được pH mong muốn, hỗn hợp sau

một lượng m gam nguyên liệu đã nghiền nhuyễn cho đồng nhất) cho vào trong bình

đó được gia nhiệt và khuấy từ liên tục. Khi phản ứng đạt đến nhiệt độ cần khảo sát,

cầu 500ml, thêm vào đó 150ml nước cất và vài giọt phenolphtalein, tiếp tục thêm

cho enzyme vào với tỉ lệ thích hợp, phản ứng được tiến hành trong 26 giờ. Sau mỗi

vào bình cầu 5g MgO, dung dịch phải có màu hồng nhạt, đậy nút ngay để tránh

2 giờ phản ứng, lấy 0.1 gam dịch thủy phân từ erlen trên, thêm nước sôi để ngừng

amoniac bay ra, lắc đều, đun sôi và hơi nước được chưng cất sang một bình tam

phản ứng, định mức thành 100ml dung dịch, đem lọc. Hút 10ml dịch lọc đem xác

giác có chứa sẵn 10ml H2SO4 N/10 và vài giọt thuốc thử Tashiro, đầu nhọn của ống

định hàm lượng đạm formol theo phương pháp Sorensen, phần dung dịch còn lại

sinh hàn nhúng chìm trong dung dịch H2SO4 N/10. Chưng cất trong 15-20 phút kể

trong bình định mức dùng để xác định lượng protein theo phương pháp Lowry.

từ khi dung dịch trong bình cầu sôi. Sau 15-20 phút chất đạm amoniac sẽ được hấp

2.2.8.3 Hiệu suất thủy phân[39]

thụ vào dung dịch H2SO4. Lấy bình tam giác ra (rửa đầu ống sinh hàn trước khi lấy

Papain có tính chất của endopeptidase thủy phân protein trong bánh dầu đậu
phộng chủ yếu thành peptide theo phản ứng sau:

ra).
Định phân lượng acid dư bằng NaOH có chuẩn độ là x N/10 từ màu xanh tím
sang màu xanh xám, nếu dư NaOH thì chuyển thành màu xanh ve chai. Thực hiện

R1

H

R3

N

C

C

N

C

C

H

O

H

H

O

ba lần thử thật và ba lần thử không.

R4
R2 + HOH

R1

H

R3

N

C

C

H

O

R4
OH + H2N

C

CO

H

2.2.7.3 Cách tính
Số gam đạm NH3 có trong 1 lít nguyên liệu = (1.4*V)/2.5
V = (Vt – V0) là lượng NaOH tương đương với lượng đạm phóng thích đã
được hấp thụ trong H2SO4.
2.2.8 Phƣơng pháp chung tiến hành phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng
với xúc tác papain thô.[15, 27]
2.2.8.1 Phƣơng pháp loại béo:

Ngoài ra, papain còn có tính chất của exopeptidase thủy phân các peptide
thành các acid amin theo phản ứng sau:
R2
H2N

R4

R3

C

C

N

C

C

H

O

H

H

O

R1 + HOH

H2N

C

C

H

O

OH

+ H2N

C

CO

H

Hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân (%) được tính dựa trên tỉ lệ hàm

Sử dụng dung môi eter dầu hỏa: cho dung môi vào bánh dầu đậu phộng đã
xay nhuyễn với tỷ lệ khối lượng dung môi trên cơ chất là 3:2. Khuấy đều trong 3
giờ ở 70oC, sau đó lọc bỏ dung môi (tiến hành 3 lần). Sau đó cho nước vào với tỷ lệ
trên sản phẩm là 2:1, khuấy đều, đem lọc. Thực hiện sự rửa này 7 lần. Sản phẩm thu

lượng acid amin hòa tan trong nước của dung dịch sau phản ứng so với hàm lượng
protein ban đầu được xác định thông qua hàm lượng nitơ tổng.
Hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân H(%) được tính theo công thức
như sau:

được đem sấy khô ta được bánh dầu đậu phộng đã loại béo.

H

2.2.8.2 Phƣơng pháp thực hiện phản ứng[5, 30, 31, 37]
Phản ứng thủy phân được thực hiện tại tỉ lệ của bánh dầu đậu phộng với
dung dịch đệm phosphate là 1:10. Cân 5g bánh dầu đậu phộng đã loại béo cho vào
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

R3

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

G
*100
P

Trong đó:
H: hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân (%).

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

R1

R2


29

30

G: hàm lượng acid amin tan của dung dịch sau thủy phân xác định theo
phương pháp Lowry.
P: hàm lượng protein ban đầu trong bánh dầu đậu phộng xác định theo

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KHẢO SÁT LƢỢNG NHỰA Ở QUẢ ĐU ĐỦ
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát lượng nhựa ở ba loại quả (quả non, quả già

phương pháp Kjeldahl.

xanh, quả gần chín) ở trên cùng một loài và cùng một phương pháp làm khô. Kết
quả được trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1. Hàm lƣợng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau.
Loại quả

Khối lượng

Khối lượng nhựa

quả (g)

lấy (g)

Tỉ lệ nhựa
thô trên
quả (%)

Quả non (dưới 40 ngày tuổi)

120

0.2576

0.21

Quả già xanh (50-100 ngày tuổi)

580

1.5153

0.26

Quả gần chín (100-120 ngày tuổi)

1700

3.0292

0.18

Nhận xét: lượng papain thô thu được ở quả già xanh cao hơn so với quả non
và quả gần chín đồng thời chiếm hàm lượng khá cao. Qua kết quả này, chúng tôi
nhận thấy thời gian thích hợp để thu nhận nhựa thô là khi quả đu đủ được 50 – 100
ngày tuổi.
3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SƠ CHẾ NHỰA TƢƠI
Nhựa tươi được làm khô ngay, ở nhiệt độ nhỏ hơn 50 oC bằng các phương
pháp khác nhau. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2. Các phƣơng pháp làm khô nhựa đu đủ
Phương pháp làm khô

Hình thức cảm quan

Phơi nắng 1-2 nắng

Vón cục,vàng nâu

Sấy nóng, có quạt gió 24 giờ

Vón cục, vàng nhạt

Đông khô chân không 8 giờ

Vẩy mỏng, óng ánh và trắng sáng

Nhận xét:
Chất lượng papain thô thu được từ các phương pháp xử lý khác nhau rất khác
nhau. Hình thức cảm quan phản ánh rõ chất lượng của sản phẩm: màu càng thẫm
chất lượng càng kém.

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


31

32

Tuy có nhiều phương pháp khác nhau để làm khô nhựa tươi nhưng phương

1 – thang protein chuẩn

pháp đông khô chân không là phương pháp hiệu quả nhất và ít ảnh hưởng đến chất

2 – nhựa đu đủ non đông khô sơ chế bằng etanol

lượng nhựa. Do đó, toàn bộ nhựa tươi được đông khô chân không để loại nước và

Nhận xét: quá trình sơ chế bằng dung môi còn lẫn khá nhiều protein tạp, do

nhựa sau đông khô được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu tiếp

đó chúng tôi tiến hành qui trình tinh chế với các phân đoạn khác nhau để tinh sạch

theo.

protein. Đồng thời, chúng ta cũng dễ dàng nhận thấy rằng trong vạch điện di của
Từ 100ml dung dịch nhựa tươi, chúng tôi tiến hành đông khô trong 8 giờ và

nhựa đu đủ non không có xuất hiện enzyme papain do đó chúng tôi tiến hành lấy

thu được 5 gam chế phẩm đông khô.

nhựa trên trái trưởng thành để thu nhận papain. Điều này hoàn toàn phù hợp với các

3.3 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THU NHẬN PAPAIN TỪ NHỰA KHÔ

nghiên cứu trước đây về enzyme trong nhựa đu đủ: enzyme papain chỉ hình thành

Nhựa tươi sau khi đã đông khô chân không, chúng tôi tiến hành sơ chế bằng
dung môi hữu cơ được làm lạnh để loại bỏ các tạp chất. Sản phẩm sau quá trình sơ
chế được chạy điện di để phân tích sơ bộ thành phần protein. Kết quả chạy điện di

của sản phẩm sau giai đoạn sơ chế được trình bày trong hình 3.1a:

trong giai đoạn trưởng thành của trái.
Tinh chế:
Tiến hành tinh chế papain từ nhựa đông khô theo phương pháp đã trình bày
trong phần thực nghiệm, từ 90 gam nhựa khô ban đầu chúng tôi thu được 1g papain.
Kết quả điện di được trình bày trong hình 3.1b:

Hình 3.1a. Điện di đồ của nhựa khô ở trái non sơ chế bằng dung
môi etanol
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

Hình 3.1 b. Điện di đồ của chế phẩm Merk và papain tinh chế từ
nhựa đu đủ đông khô.
1- Thang protein chuẩn
2- Chế phẩm Merck
3 - papain
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


33

34

3.4 PHƢƠNG PHÁP LOWRY XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG PROTEIN

M

Kết quả đo mật độ quang ∆OD ở bước sóng 750nm của các ống nghiệm có

với x: là nồng độ protein trong dung dịch đã pha loãng (mg/ml).

nồng độ albumin từ 50 – 250mg/ml được trình bày trong bảng 3.3 (phụ lục 1)

n: hệ số pha loãng

Bảng 3.3. Mật độ quang của albumin ở bƣớc sóng 750nm
Mẫu

x * 0.001* n
(mg/g)
m

m: khối lượng nguyên liệu lấy phân tích (g)
01

02

03

04

05

Nồng độ Albumin
50

100
150
200
250
(mg/ml)
Độ hấp thu quang OD
0.0432
0.0648
0.1192
0.135
0.1942
(AU)
Từ kết quả trên, vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang ∆OD
(AU) theo nồng độ protein chuẩn (mg/ml) theo hình 3.2 với phương trình đường
chuẩn là y = 0.0007x – 0.0004

3.5 PHƢƠNG PHÁP ANSON XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE
Kết quả đo mật độ quang ∆OD ở bước sóng 720nm của các ống nghiệm có
lượng tyrosin tương ứng từ 0.2 – 1.0M được trình bày trong bảng 3.4 (phụ lục 2)
Bảng 3.4. Mật độ quang của tyrosin ở bƣớc sóng 720nm
Mẫu

02

03

04

05

06

Lượng tyrosin tương ứng (M)

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Độ hấp thu quang OD(AU)

0.1059 0.1812 0.3138

0.3464

0.4688

Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TT). Vẽ
đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và biến thiên độ hấp thu
quang ở bước sóng 720nm như hình 3.3 với phương trình đường chuẩn là y =
0.4454x + 0.016.
Đường chuẩn Anson
0.5

Hình 3.2. Đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang

vào nồng độ albumin.

Mật độ quang (AU)

0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
y = 0.4454x + 0.016

0.15
0.1
0.05

Cách tính

0

Từ phương trình đường chuẩn so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Lượng Tyrosin (mM )

mẫu protein. Từ đó suy ra nồng độ của protein trong nguyên liệu là x (mg/ml)
Hàm lượng protein M (có trong 1g nguyên liệu được tính theo công thức):

Hình 3.3. Đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang
vào nồng độ tyrosin.

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


35

36

để tính lượng protein trong nguyên liệu là M (mg/g).

Cách tính

Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong

Bảng 3.5. Lƣợng protein thu đƣợc ở các phân đoạn tinh chế khác

điều kiện chuẩn (35.5oC, pH 7.6 …) thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản

nhau.

phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở

Các phân đoạn

∆OD

M (mg/g)

bước sóng 660nm tương ứng với 1M Tyrosin trong đường chuẩn.

Phân đoạn pH 5.7

0.173

247.71

3

Phân đoạn pH 9.0

0.139

199.14

4

Phân đoạn tủa với ammonium sulfat

0.129

184.86

5

Phân đoạn bằng NaCl

0.125

179.14

6

Hđ P: hoạt tính protein (UI)

Phân đoạn kết tinh

0.123

174.86

7

V: tổng thể tích hỗn hợp trong ống nghiệm 1 hoặc 2 (ml).

Phân đoạn tái kết tinh

0.113

162.00

8

Hñ P = Tyrosin*V*L(UI)
t*m*v
với

v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml).

Phụ lục

300

m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g)
L: độ pha loãng mẫu enzyme.
M Tyrosin: lượng M Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn.
3.6 KHẢO SÁT LƢỢNG ENZYME THU ĐƢỢC SAU CÁC GIAI ĐOẠN
TINH CHẾ.

Lượng protein (mg/g)

t: thời gian thủy phân (phút)
250

247.71
199.14

184.86

200

179.14

174.86

NaCl

Kết tinh

162.00

150
100
50

Trong quá trình tinh chế enzyme chúng tôi tiến hành khảo sát lượng protein
thu được sau mỗi phân đoạn bằng cách lấy ra 0,1g dung dịch enzyme, sau đó định

0
pH 5.7

mức thành100ml bằng nước cất để xác định hàm lượng protein theo phương pháp

chuẩn xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry là y = 0.0007x –
0.0004 ta suy ra được nồng độ protein trong dung dịch đã pha loãng là x. Sau đó, áp
dụng công thức
M

(NH4)2SO4

Tái kết tinh

Các giai đoạn tinh chế

Lowry. Kết quả được trình bày trong bảng 3.5 với cách tính như sau:
Thế giá trị mật độ quang ∆OD ở mỗi phân đoạn vào phương trình đường

pH 9

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên lƣợng protein sau mỗi giai
đoạn tinh chế.
Nhận xét:
Từ bảng số liệu và biểu đồ trên ta nhận thấy rằng, trong quá trình tinh chế
enzyme bằng phương pháp tủa muối thì hàm lượng protein trong mẫu giảm dần.

x * 0.001* n
(mg/g)
m

Điều này có thể được giải thích như sau: lượng protein ban đầu cao là do trong nhựa

với x: là nồng độ protein trong dung dịch đã pha loãng (mg/ml).

khô chưa tinh chế ngoài papain còn có nhiều protein khác, sau mỗi giai đoạn tinh

n: hệ số pha loãng

chế thì protein tạp được loại bỏ dần làm cho hàm lượng protein cũng giảm theo.

m: khối lượng nguyên liệu lấy phân tích (g)
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


37

38

3.7 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA ENZYME SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH

Hđ P: hoạt tính protein (UI)

CHẾ

V: tổng thể tích hỗn hợp trong ống nghiệm 1 hoặc 2 (ml).
Trong quá trình tinh chế enzyme ngoài việc khảo sát lượng protein thu được

v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml).

sau mỗi phân đoạn, chúng tôi cũng tiến hành đồng thời việc khảo sát hoạt tính

t: thời gian thủy phân (phút)

protein ở mỗi giai đoạn tinh chế với cách thực hiện như sau:

m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g)

Cân 0.1g mẫu protein ở mỗi giai đoạn tinh chế định mức thành 100ml dung
dịch bằng nước cất. Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch protein đã pha loãng

M Tyrosin: lượng M Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn.
Bảng 3.6. Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế

và các dung dịch khác như sau
Dung dịch hóa chất

L: độ pha loãng mẫu enzyme.

Ống nghiệm

Tỉ lệ hoạt

1

2

Dung dịch casein 1% (ml)

5

5

Dung dịch TCA 5% (ml)

0

10

Dung dịch enzyme mẫu (ml) 1

1
o

Lắc đều và giữ ở 35.5 C
Dung dịch TCA 5% (ml)

10

0

Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên dưới

Các phân đoạn

∆OD1

∆OD2

P(UI/ml)

Nhựa khô ban đầu

0.308

0.012

70.353

Phân đoạn pH 5.7

0.264

0.063

66.46

94.47

10

Phân đoạn pH 9.0

0.150

0.035

57.39

81.57

11

49.30

70.08

12

từ ống nghiệm 1 và ống B 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 2.
Thêm vào mỗi ống 10ml dung dịch NaOH 0.5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc
mạnh, sau 10 phút, đo ∆OD1 và ∆OD2 ở bước sóng 720nm từ đó dựa vào đồ thị

giai đoạn

Phụ lục

tinh chế (%)

Phân đoạn tủa với ammonium

Lấy 2 ống nghiệm mới, sạch đánh dấu A và B. Cho vào ống A 5ml dịch lọc

tính sau mỗi

sulfat

0.372

0.185

9

Phân đoạn bằng NaCl

0.240

0.074

45.60

64.81

13

Phân đoạn kết tinh

0.115

0.055

36.36

51.68

14

Phân đoạn tái kết tinh

0.097

0.062

36.78

55.34

15

chuẩn để suy ra được M Tyrosin.
Hoạt tính protein được xác định theo phương pháp Anson. Kết quả được
trình bày trong bảng 3.6 với cách tính như sau:
Thế giá trị y = (∆OD1 - ∆OD2) vào phương trình đường chuẩn xác định hoạt
tính theo Anson y = 0.4454x + 0.016 ta suy ra được x chính là lượng tyrosin. Từ giá
trị của x ta tính được hoạt tính protease theo công thức:

Hñ P = Tyrosin*V*L(UI)
t*m*v
với
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


39

40

Bảng 3.7. Hàm lƣợng protein của các chế phẩm theo thời gian

90

∆OD

Hoạt tính protease (UI)

80
70

Ngày

66.46

Hàm lượng protein (mg/g)

M0

M1

M2

M3

M0

M1

M2

M3

1

0.155

0.112

0.115

0.110

222.00

160.57

164.86

157.71

2

0.136

0.141

0.101

0.109

199.14

202.00

144.86

156.29

3

0.142

0.124

0.162

0.131

203.43

177.71

232.00

187.71

10

4

0.135

0.116

0.133

0.122

193.43

166.29

190.57

174.86

0

5

0.125

0.106

0.133

0.116

179.14

147.71

190.57

169.14

57.39

60

49.30

50

Series1

45.60
36.36

40

36.78

30
20

pH 5.7

pH 9

(NH4)2SO4

NaCl

Kết tinh

Tái kết tinh

Các giai đoạn tinh chế

bằng phương pháp tủa muối thì hoạt tính protein trong mẫu giảm dần. Nguyên nhân
có thể là do ban đầu nhựa khô ngoài chứa enzyme papain ra còn chứa những
enzyme khác có chức năng bảo vệ papain nên hoạt tính cao, sau khi qua những giai
đoạn tinh chế tiếp theo đã loại bỏ hầu hết những protein tạp chỉ còn lại papain tinh

250

Lượng protein (mg/g)

Hình 3.5. Sự biến thiên hoạt tính của protein sau các giai đoạn
tinh chế.
Qua bảng số liệu và đồ thị, ta nhận thấy rằng trong quá trình tinh chế enzyme

220
190

M0
M1

160

M2
M3

130

khiết nên dẫn đến hoạt tính protein cũng giảm theo. Sau phân đoạn kết tinh, sản
100

phẩm đem đi kết tinh lại thì độ tinh sạch của sản phẩm cao hơn dẫn đến hoạt tính

1

2

protein tăng lên đôi chút.

3

4

5

Ngày khảo sát

3.8 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI LƢỢNG PROTEIN TRONG CÁC CHẾ

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lƣợng protein theo

PHẨM PROTEASE THU ĐƢỢC THEO THỜI GIAN
Nhằm đánh giá tính ổn định của mỗi chế phẩm, chúng tôi tiến hành khảo sát
sự biến đổi hàm lượng protein của mỗi chế phẩm theo thời gian.

thời gian
Trong đó:
M0: mẫu nhựa đu đủ tươi được đem đông khô

Cân chính xác 0.10 gam các chế phẩm thu được bằng các phương pháp khác
nhau sau khi đã đông khô, cho vào bình định mức 100ml. Thêm nước cất đến vạch
định mức, sau đó lắc đều đến khi chế phẩm tan hoàn toàn. Các chế phẩm này được

M1: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa với ammonium sulfate sau
khi đông khô.
M2: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng ethanol sau khi đông

bảo quản ở 4oC để dùng dần. Hút 0,4ml dung dịch protein đã pha ở trên để tiến hành
xác định lượng protein cho mỗi lần thí nghiệm Thời gian tiến hành thí nghiệm là 5

khô.

ngày. Kết quả được trình bày trong bảng 3.7 (phụ lục 16 -19):
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


41

42

M3: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng dung môi aceton sau
Bảng 3.8. Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian

khi đông khô.
Nhận xét:

∆OD

Qua biểu đồ trên chúng ta thấy rằng hàm lượng protein của các chế phẩm

Ngày

P(UI/ml)

M0

M1

M2

M3

M0

M1

M2

M3

hầu như không thay đổi nhiều theo thời gian chúng tôi khảo sát. Chế phẩm M0 có

1

0.296

0.212

0.144

0.116

70.353

49.286

32.187

25.146

hàm lượng protein cao nhất còn M1 có hàm lượng protein nhỏ nhất. Như vậy

2

0.197

0.158

0.192

0.124

65.081

51.010

63.224

38.797

phương pháp kết tủa bằng muối đã loại bỏ hầu hết các protein tạp có trong mẫu

3

0.125

0.107

0.081

0.080

54.728

45.766

32.690

32.187

nghiên cứu, còn lại chủ yếu là papain nên có hàm lượng protein nhỏ nhất trong các

4

0.265

0.071

0.064

0.087

44.702

9.879

8.621

12.753

phương pháp. Phương pháp đông khô giữ lại hầu hết những protein trong chế phẩm

5

0.059
0.044
0.033
0.264
26.749
4.634
Kết quả này được biểu diễn bằng đồ thị như hình 3.7

3.018

1.832

M0 vì quá trình đông khô giúp cố định mẫu nên có hàm lượng protein cao nhất. Còn
hai phương pháp còn lại dùng dung môi để tủa enzyme đã loại bỏ một số protein có

80

trong chế phẩm nhưng không thể loại bỏ hoàn toàn các protein khác nên có hàm

70

3.9 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI HOẠT TÍNH CỦA CÁC CHẾ PHẨM THEO
THỜI GIAN.
Nhằm đánh giá tính ổn định của chế phẩm, chúng tôi đã tiến hành khảo sát
sự biến đổi hoạt tính của chế phẩm theo thời gian.

Hoạt tính (UI/ml)

lượng protein trung bình nằm giữa chế phẩm M0 và M1.

60
50

M0

40

M1

30

M2

20

M3

Cân 0.1 gam các chế phẩm thu được bằng các phương pháp khác nhau sau

10

khi đã đông khô, cho vào bình định mức 100ml. Thêm nước cất đến vạch định mức,

0
1

sau đó lắc đều đến khi chế phẩm tan hoàn toàn. Chế phẩm được bảo quản ở 4oC để

2

3

4

5

Thời gian (ngày)

dùng dần, thời gian tiến hành thí nghiệm là 5 ngày.
Hút 1ml dung dịch trong bình định mức tiến hành xác định hoạt tính protease
theo phương pháp Anson. Thí nghiệm được lặp lại mỗi ngày và kết quả được thể

Hình 3.7. Sự biến đổi hoạt tính của các chế phẩm theo thời gian
Trong đó:
M0: mẫu nhựa đu đủ tươi được đem đông khô

hiện trong bảng 3.8:

M1: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa với ammonium sulfate sau
khi đông khô.
M2: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng ethanol sau khi đông
khô.
M3: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng dung môi aceton sau
khi đông khô.

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM