KỸ THUẬT sắc ký cột hở pha thường powerpoint

MỘT SỐ VẤN ĐỀ TRONG KỸ THUẬT SẮC KÝ
CỘT HỞ PHA THƯỜNG

TN 395

1


Nội dung

I. Lựa chọn chất hấp thu và dung môi khởi đầu giải ly
II. Quá trình nạp cột
III.Quá trình giải ly
IV.Chọn hệ dung môi giải ly

2


Lựa chọn chất hấp thu và dung môi khởi đầu giải ly

1. Chọn chất hấp thu
-.Tùy vào tính phân cực của chất cần phân tích

3


*

Đối với hợp chất rất phân cực, nên sử dụng sắc ký trao đổ ion hoặt sắc ký l ọc gel.

4

*

Với các hợp chất phân cực bình thường thì sử dụng sắc ký hấp thu

5


Lựa chọn chất hấp thu và dung môi khởi đầu giải ly

2. Chọn dung môi
ể dò tìm hệ dung môi phù hợp, với các bước:
-.DùngBướsắcc1:kýHòalớptanmỏmngẫuđtrong
trong dung môi phù hợp.

- Bước 2: Chấm bản mỏng.
- Bhợướp.c 3: Mỗi bản mỏng khai triển với 1 loại dung môi, sau đó hiện hình các vết. Từ kết quả đó tìm hỗn hợp dung môi phù
- BướcVớ4:i mẫu là kết quả của phản ứng tổng hợp hữu cơ, lựa chọn hệ dung môi đẩy hợp chất cần quan tâm lên với Rf = 0,2-0,3
thô cây cỏ, dung môi giải ly đầu tiên đ ẩy v ết ít phân cực nhất lên v ới Rf = 0,5. Dung môi ch ấm d ứt s ắc ký là dung môi đ ẩy
- Vvếớti cao
phân cực nhất lên Rf = 0,2

6


*

Bản mỏng silica gel GF254 (MERCK)Dung môi khai triển 
A. Sắc ký đồ dưới ánh sáng tử ngoại 254nm

B. Sắc ký đồ dưới ánh sáng tử ngoại 366nm
C. Sắc ký đồ dưới ánh sáng thường. Hiện màu bằng Vanilin/ H 2SO4
7


*

Lưu ý:
- Pha tĩnh của SKLM và SKC phải giống nhau.
- Dung môi giải ly cột là hệ dung môi đã chọn trong phần thực nghiệm nêu trên
nhưng phải điều chỉnh sao cho có tính kém phân cực một ít.

8


Quá trình nạp cột

1. Tính toán các tỉ lệ
-.Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách tốt thì trọng lượng chất hấp thu phải lớn hơn 25 - 50 lần trọng
lượng của mẫu.

-.Các hợp chất khó tách cần dùng lượng nhiều hơn (100-200 lần)

9


Nạp chất hấp thu vào cột

10

Nạp cột sệt

- Cố định cột trên giá, chặn phần đầu ra của cột bằng một miếng bông.
- Cho chất hấp thu vào becher có sẵn dung môi (loại bắt đầu giải ly) đều đặn từng lượng nhỏ, khuấy đều. Lượng
dung môi phải vừa đủ không được quá sệt cũng không được quá lỏng.

- Rót hỗn hợp sệt vào cột qua một phễu, mở khóa dưới cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher, dung môi
này được sử dụng lại để rót trả lên đầu cột.

- Tiếp tục rót cho hết lượng chất sệt. Vừa rót hỗn hợp sệt vừa gõ nhẹ thành cột.
- Sau khi nạp hết chất hấp thu cho dung môi chảy ra và rót trả lại đầu cột vài lần để chất hấp thu trong cột có
dạng đồng nhất.

11


Nạp cột sệt

• Lưu ý:
- Không được để khô cột, nghĩa là luôn phải có dung môi phủ trên đầu cột.
- Sau khi nạp xong, mặt thoáng chất hấp thu ở đầu cột phải nằm ngang.
- Đối với sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel (sử dụng loại chất hấp thu có thể trương nở) trước khi rót vào cột
cần ngâm trong dung môi vừa đủ khoảng một đêm.

12


Nạp cột khô

- Cố định cột thẳng đứng.
- Cho dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 cột.
- Cho từng lượng nhỏ chất hấp thu dạng bột khô vào trong cột vừa cho vừa gõ nhẹ thành cột.
- Khi chiều cao chất hấp thu vào khoảng 2cm thì mở khóa dưới cho dung môi chảy ra.
- Sau khi nạp xong, cho dung môi chạy qua chất hấp thu vài lần để chất hấp thu có dạng đồng nhất.

13


Nạp mẫu chất phân tích

1. Nạp mẫu chất dạng dung dịch
-.Dung dịch mẫu có nồng độ càng đậm đặc càng tốt, vì như thế lớp dung dịch này nằm thành một lớp mỏng trên
đầu cột.

-.Công thức: V=0,4xD2
-.Mở khóa cho dung môi chảy xuống vừa sát mặt thoáng chất hấp thu.
-.Đóng khóa lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu cột bằng pipette.
-.Mở khóa cho dung môi chảy ra, chất phân tích thấm vào chất hấp thu, không để chất hấp thu ở đầu cột khô.

14


Nạp mẫu chất phân tích

1. Nạp mẫu chất dạng dung dịch
-.Dùng pipette cho một lượng nhỏ dung môi mới lên đầu cột, dùng lượng dung môi này rửa sạch thành ống do chất
phân tích dính lên. Lại mở khóa cho dung môi chảy ra.

-.Lặp lại như thế cho đến khi cho dung môi vào đầu cột, dung môi trong suốt.

-.Cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly.

15


Nạp mẫu chất phân tích

2. Nạp mẫu chất dạng bột khô
-.Trong bình cầu dùng để cô quay, mẫu chất (x g) được hòa tan trong dung môi như ethyl acetate hoặc
methanol (50x g), cho thêm vào silica gel cỡ hạt lớn (10x g). H ỗn hợp được cô quay trong chân không đ ến khi
có bột silica gel khô, mẫu cần phân tích đã được tẩm lên bề mặt của silica gel khô.

-.Cho lớp silica gel này lên đầu cột (cột đã được nạp chất hấp thu) dùng một ít dung môi thấm ướt phần silica
gel.

-.Cho dung môi vào đầy cột bắt đầu quá trình giải ly.

16


Quá trình giải ly

1.

Giải ly nhờ trọng lực

Các hạt gel nạp cột phải có kích thước > 60µm

2. Sử dụng lực đẩy (trong sắc ký chớp nhoáng)
-.Sử dụng áp lực để đẩy dung môi đi qua pha tĩnh.

-.Có thể sử dụng những hạt gel có kích thước 40-63 µm.
-.Cột phải có lớp bao lưới bên ngoài tránh nổ vỡ do áp suất cao.

17


Biotage Isolera Automated Flash Chromatography System

18


Quá trình giải ly

3. Sử dụng lực hút (trong sắc ký nhanh – cột khô)
bơm hút chân không ở đầu ra của cột
-.SViửệdcụlấngy máy
dung môi có phần bất tiện. Tuy vậy, k ỹ thuật
-.
này an toàn hơn.

19


Quá trình giải ly

• Các kỹ thuật sắc ký khác nhau là việc sử dụng kích thước khác nhau của hạt gel làm pha tĩnh và việc sử
dụng áp lực để giải ly dung môi ra khỏi cột.

- Cột – áp suất thấp: cột thủy tinh, dùng hạt kích cỡ 40-200 µm.
- Cột – áp suất trung bình: cột bằng thủy tinh dày, dùng hạt kích cỡ 25-40 µm, thực hiện ở áp suất 5-40 bar

(75-600 psi).

- Cột HPLC: cột bằng thép không rỉ, dùng hạt kích cỡ 3-10 µm, thực hiện ở áp suất cao (500-3000 psi)

20


Quá trình giải ly

4.

Vận tốc giải ly

Thông thường trong đa số sắc ký cột, vận tốc giải ly là khoảng 5 -50 giọt/phút hoặc 1-2 cm/phút.

•.Vận tốc dung môi giải ly không được quá nhanh (sẽ không kịp cân bằng với chất hấp thu), cũng không được quá
chậm hoặc bị cho ngừng lại một thời gian vì lúc đó các dãy chất tan sẽ khuếch tán hoặc trãi dài theo m ọi h ướng
làm xấu quá trình tách.

21


Dung môi giải ly

- Dung môi đảm bảo tinh khiết
- Tránh sử dụng một vài dung môi cho silica gel nhất là cho alumin dạng acid hoặc base hoặc dạng hoạt tính
mạnh (pyridin, methanol, nước, acid acetic => hòa tan và giải ly luôn cả chất hấp thu silica gel).

- Độ phân cực của một số đơn dung môi: (tăng dần theo thứ tự)
Hexan < cyclohexan < diclorometan < isopropanol < propanol < cloroform < etyl acetat < aceton < metanol <

etanol < acetonitril
(Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập h ợp ch ất h ữu c ơ, 193)

22


Giải ly sử dụng dung môi đơn nồng độ

Chỉ sử dụng đơn dung môi hoặc hỗn hợp dung môi nhưng trong hỗn hợp tỉ lệ giữa các thành ph ần không thay đ ổi
để giải ly cho đến khi việc tách chất hoàn tất.

23


Giải ly có nồng độ tăng theo kiểu bậc thang

- Trong quá trình sắc ký cần thay đổi nhiều loại dung môi khác nhau, có lực mạnh tăng dần để có thể đuổi hết
nhưng cấu tử khác nhau ra khỏi cột.

- Tăng tính phân cực cho dung môi nhất thiết phải tăng chậm, thêm từ từ. VD: pha bezen vào hexan với các tỉ lệ
1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 50% và 100% bezen.

- Nếu tăng tính phân cực nhanh, đột ngột sẽ làm gãy cột.

24


Giải ly với nồng độ tăng dần tuyến tính

25