Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả mù u để ứng dụng trong kiểm nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

HÀ MINH HIỂN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT PHENOL
TỪ NHỰA VÀ VỎ QUẢ MÙ U ĐỂ ỨNG DỤNG
TRONG KIỂM NGHIỆM

Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC
Mã số: 62.73.15.01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

TP Hồ Chí Minh-Năm 2014


Công trình được hoàn thành tại:
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Người hướng dẫn khoa học:

1.

2.

PGS TS. NGUYỄN KHẮC QUỲNH CỨ
TS. NGUYỄN VĂN THỊ

Phản biện 1: GS.TSKH. Nguyễn Công Hào

3.

Viện Công nghệ Hóa học TP. Hồ Chí Minh
Phản biện 2: PGS.TS. Trịnh Văn Quỳ
Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

4.

Phản biện 3: PGS.TS. Phạm Đình Hùng
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh
5.
Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp
tại: ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Vào hồi

giờ

ngày

tháng

năm
6.

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện Khoa học Tổng hợp TP. Hồ Chí Minh

- Thư viện Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh

7.

DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ
ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
Hà Minh Hiển, Phạm Ngọc Dung, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Nguyễn Văn
Thị, Võ Thị Bạch Huệ (2009), “Phân lập một số hợp chất phenol từ nhựa
Mù u dư phẩm”, Tạp chí Dược học, số 395, tr. 33-36.
Ha Minh Hien, Tran Thi Thuy Tien, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Viet Kinh,
“Phenolic compound and other constituents determined from crude ethyl
acetate extract of fruit peels of Calophyllum inophyllum L.”, Analytica
Vietnam Conference Proceedings 3/2009, Ho Chi Minh City, Vietnam, pp.
228-232.
Minh Hien Ha, Van Thi Nguyen, Khac Quynh Cu Nguyen, Emily LC
Cheah, Paul WS Heng (2009), “Antimicrobial activity of Calophyllum
inophyllum crude extracts obtained by Pressurized Liquid Extraction”,
Asian Journal of Traditional Medicine, 4 (4), pp. 141-146.
Ha Minh Hien, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Khac Quynh Cu, Nguyen Van
Thi, Francoise NEPVEU, “Antimicrobial and antioxidant activities of
methanolic extract obtained from resin of Calophyllum inophyllum L. nut
oil”, Proceedings of the Sixth Indochina Conference on Pharmaceutical
Sciences 12/2009, Hue, Vietnam, pp. 64-68.
Hà Minh Hiển, Paul WS Heng, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Nguyễn Văn Thị,
Võ Thị Bạch Huệ (2011), “Nghiên cứu thiết lập chất đối chiếu
calophyllolid dùng trong kiểm nghiệm và nghiên cứu dược liệu Mù u
Calophyllum inophyllum L.” Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, số 3.2011, tr. 1519.
Ha Minh Hien, Paul WS Heng, Nguyen Van Thi, Nguyen Khac Quynh Cu,
Vo Thi Bach Hue (2011), “Development and Validation of a GC-MS
Method for Rapid Determination of Calophyllolide in Calophyllum

inophyllum L.: A Quality Control Approach”, Chinese Journal of Natural
Medicines, 9 (6), pp. 429-434.
Hà Minh Hiển, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Nguyễn Văn Thị, Võ Thị Bạch
Huệ, Bùi Thị Thu Thảo (2013), “Nghiên cứu xác định calophyllolid bằng
phương pháp HPLC-DAD ứng dụng trong kiểm nghiệm dung dịch thuốc từ
dược liệu có dầu Mù u”, Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, số 2.2013, tr. 14-18.


đầu dò PDA SPD-M20A; phần mềm xử lý dữ kiện LCsolution. Cột

1. Đặt vấn đề

Zorbax 250 mm × 4,6 mm, 5 μm, pha động acetonitril-dung dịch acid

Cây Mù u có tên khoa học là Calophyllum inophyllum L. Clusiaceae,

acetic 2% với chế độ rửa giải gradient: acetonitril 20-80%: dung

từ lâu đã được dùng các bộ phận như: hạt, dầu hạt, nhựa cây, rễ, lá đ ể

dịch acid acetic 2% 80-20% trong 30 phút. Tốc độ dòng 1 ml/phút và

chữa bệnh nhất là ghẻ, nấm tóc, bệnh ngoài da, nhiễm trùng xương,

o

nhiệt độ cột 40 C. Phát hiện tại bước sóng 270 nm. Thể tích tiêm

bỏng, thấp khớp….Tại Việt Nam, Mù u khai thác bằng cách đập quả

mẫu 10 µl”. Hàm lượng calophyllolid (kl/kl) trong chế phẩm “Dầu

bỏ vỏ, lấy hạt để ép dầu. Tinh chế dầu thô bằng cách tách loại nhựa

Mù u Inopilo” thu được là 0,47 ± 0,01% (g/100 g).

để thu được dầu Mù u dược dụng. Nhựa loại ra khi tinh chế dầu Mù u

KIẾN NGHỊ
-

-

-

và vỏ quả Mù u Việt nam chưa được nghiên cứu để sử dụng.

Tiếp tục áp dụng các phương pháp GC-MS, HPLC-DAD để xác

Dầu Mù u được dùng riêng hoặc phối hợp với các dược liệu khác

định calophyllolid, 4-hydroxyxanthon trong các thuốc từ dược

trong các chế phẩm được sử dụng rộng rãi để trị bỏng, viêm loét da,

liệu Mù u nhằm nâng cấp tiêu chuẩn cơ sở.

làm mau lành các vết thương…Đề tài: “Nghiên cứu xác định hợp

Khảo sát tác dụng sinh học của hợp chất N3 (hợp chất tự nhiên

chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u để ứng dụng trong kiểm

mới): kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư...

nghiệm” được thực hiện với các mục tiêu nghiên cứu sau:

Tiếp tục nghiên cứu độ ổn định của chất chuẩn đối chiếu

-

calophyllolid nhằm cải tiến qui trình chiết xuất, phân lập, tinh

mọc ở Việt Nam bằng một số kỹ thuật sắc ký và phổ nghiệm để chọn

chế đã xây dựng.

chất điểm chỉ dùng trong kiểm nghiệm nguyên liệu và chế phẩm từ

Bổ sung chất chuẩn đối chiếu calophyllolid vào Dược điển Việt

dược liệu Mù u.

Nam xuất bản lần thứ 5 và nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược

-

liệu có hoạt chất tương ứng như dầu Mù u thành tiêu chuẩn quốc

dùng cho định lượng trong số các hợp chất phenol phân lập được.

gia.

-

Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u

Nghiên cứu thiết lập 01 chất chuẩn đối chiếu để định tính và 01
Ứng dụng chất đối chiếu đã thiết lập để kiểm nghiệm nguyên liệu

và chế phẩm từ dược liệu Mù u.
2. Tính cấp thiết của đề tài
Tiêu chuẩn cơ sở của dầu Mù u cũng như các thuốc từ Mù u tuy đã
có nhưng chưa đáp ứng với các nguyên tắc, tiêu chuẩn thực hành tốt
sản xuất thuốc đối với cơ sở sản xuất thuốc từ dược liệu của tổ chức
Y tế thế giới (GMP-WHO) mà Bộ Y tế đã đưa ra lộ trình áp dụng kể
từ ngày 01/01/2014 vì không xác định thành phần hoạt chất hoặc chất


điểm chỉ do thiếu chất đối chiếu và phương pháp phân tích, kiểm

tiêu: tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ

nghiệm tin cậy. Các dược điển: Hoa kỳ 2012, Anh 2013, châu Âu

chính xác, độ đúng thực hiện tại Đại học Quốc gia Singapore (NUS).

7.0, Nhật 2006, Quốc tế 4, Trung quốc 2010 đều chưa thấy có chuyên

Điều kiện sắc ký: “Máy sắc ký khí GC-2010 ghép đầu dò phổ khối

luận về các bộ phận dùng cũng như thuốc từ dược liệu Mù u. Tiêu

GCMS-QP 2010 Shimadzu; bộ chích mẫu tự động AOC-20i; phần

chuẩn quốc gia của dầu Mù u theo dược điển Việt Nam 4 chưa có chỉ

mềm xử lý dữ kiện LabSolutions GCMSSolution phiên bản 2.5. Cột:

tiêu định tính, định lượng chất điểm chỉ.

DB-5MS 25 m x 0,22 mm ID, df = 5 µm. Chương trình nhiệt độ: 80

Việc nghiên cứu xác định các hợp chất phenol và ứng dụng trong

o

kiểm nghiệm này cũng nhằm mở ra triển vọng khai thác, tận thu bằng

không chia dòng; nhiệt độ đầu dò phổ khối: nguồn ion: 250 oC; giao

cách xác định giá trị của nhựa cũng như vỏ quả là những phần được

diện: 200 oC; ion hóa bằng bắn phá điện tử; tốc độ dòng khí mang:

xem là dư phẩm trong quá trình sản xuất dầu Mù u dược dụng.

1,43 ml/phút; khoảng phổ: 50-450 amu. Kiểu thu dữ liệu: SCAN và

3. Những đóng góp mới của luận án

SIM (ion đích: m/z 401; ion tham chiếu: m/z 83,55). Thể tích tiêm

Về mặt hóa học: Lần đầu tiên công bố việc phân lập được các hợp

mẫu 1 µl”. Hàm lượng calophyllolid (kl/kl) trong cao methanol chiết

chất phenol gồm có:

từ nhựa Mù u là 0,67 ± 0,01% (g/100 g).

Từ nhựa: hợp chất N1 (1,5-dihydroxyxanthon C13H8O4), N2 (4-

Từ phương pháp GC-MS đã thiết lập, tiếp tục xây dựng và thẩm định

hydroxyxanthon C13H8O3) thuộc nhóm xanthonoid và hợp chất N3:

phương pháp GC-MS để xác định calophyllolid trong vỏ quả Mù u.

inocalophyllin C (tên đề nghị) C37H48O6 là một hợp chất tự nhiên

Chuẩn bị mẫu thử bằng cách chiết lỏng dưới áp suất (PLE).

hoàn toàn mới (Xác định nhờ phổ MS, NMR và X-ray).

Điều kiện sắc ký chỉ thay đổi : Chương trình nhiệt độ: 80 oC-300

Từ vỏ quả: hợp chất V1 (calophyllolid C26H24O5) thuộc nhóm

o

neoflavononid.

quả Mù u là 0,0255 ± 0,0005% (g/100 g).

Về mặt thiết lập chất đối chiếu: Lần đầu tiên công bố nghiên cứu

Phương pháp HPLC-DAD

thiết lập 2 chất đối chiếu: 4-hydroxyxanthon dùng cho định tính;

Đã xây dựng phương pháp HPLC-DAD pha đảo và thẩm định theo

calophyllolid dùng cho định lượng .

ICH với các chỉ tiêu: tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, tính

Về mặt kiểm nghiệm thuốc: Lần đầu tiên công bố các phương pháp

tuyến tính, độ chính xác, độ đúng thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm

GC-MS và RP-HPLC-DAD xác định calophyllolid (từ nhựa Mù u,

thuốc thành phố Hồ Chí Minh để xác định calophyllolid trong dung

vỏ quả Mù u và chế phẩm chứa dầu Mù u).

dịch thuốc từ dược liệu có dầu Mù u với các điều kiện thực nghiệm

C-300 oC/9 phút (40 oC/phút); nhiệt độ buồng tiêm mẫu: 250 oC,

C/12 phút (40 oC/phút). Hàm lượng calophyllolid (kl/kl) trong vỏ

là: “Máy HPLC Shimadzu: bộ kiểm tra hệ thống CBM-20Alite; bơm
LC-20AD; bộ chích mẫu tự động SIL-20AC, buồng cột CTO-20AC;


- Trong vỏ quả Mù u:

4. Bố cục của luận án

 Từ 4 kg vỏ quả Mù u, đã chiết xuất bằng EtOAc thu được 20 g cao,

Luận án gồm: 113 trang, mở đầu 3 trang, tổng quan 22 trang, đối

từ đó phân lập được 26,0 mg hợp chất V 1 xác định là calophyllolid

tượng và phương pháp nghiên cứu 15 trang, kết quả nghiên cứu 55

(C26 H24O5).

trang, bàn luận 14 trang, kết luận và kiến nghị 4 trang. Luận án có 32

2. Thiết lập chất chuẩn đối chiếu

bảng, 23 hình, 11 sơ đồ, 3 đồ thị, 123 tài liệu tham khảo (12 tiếng

Đã xây dựng được bộ dữ liệu nhận dạng chất bao gồm: phổ UV-VIS,

Việt, 110 tiếng Anh và 1 tiếng Pháp), và 16 phụ lục.

phổ IR, phổ MS, phổ NMR, điểm chảy của các chất calophyllolid và

NỘI DUNG LUẬN ÁN

4-hydroxyxanthon.

Chương 1: TỔNG QUAN

Đã xây dựng và thẩm định theo ICH quy trình xác định tạp chất hữu

Trình bày những vấn đề sau:

cơ đi kèm với calophyllolid trong quá trình chiết xuất bằng kỹ thuật

1.1. Sơ lược về cây Mù u.

HPLC-DAD với các chỉ tiêu: tính phù hợp của hệ thống, tính đặc

1.2. Sơ lược về hợp chất phenol.

hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác, giới hạn phát hiện.

1.3. Tình hình nghiên cứu về hợp chất phenol từ quả Mù u.

Lần đầu tiên đã thiết lập chất đối chiếu calophyllolid (chuẩn chính)

1.4. Một số phương pháp phân tích hợp chất phenol từ Mù u.

loại dùng cho định lượng theo hướng dẫn của WHO, ISO với tiêu

1.5. Một số khái niệm về chất chuẩn đối chiếu.

chuẩn chất lượng bao gồm các chỉ tiêu: cảm quan; định tính: UV-Vis,

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

IR, MS, NMR; điểm chảy; độ tinh khiết: tạp chất hữu cơ, tạp chất vô

2.1. Đối tượng nghiên cứu

cơ, tạp chất bay hơi; định lượng. Số lượng chất đối chiếu thiết lập

Các hợp chất phenol.

được tổng cộng 100 lọ 10 mg với hàm lượng 95,27% .

2.2. Nguyên vật liệu

Ngoài ra, còn thiết lập chất đối chiếu 4-hydroxyxanthon dùng cho



định tính với số lượng 9 lọ 5 m g với hàm lượng 93,91%.

màu xanh lá đậm, mùi đặc trưng do Khoa Dược-Đại học Y Dược TP.

3. Ứng dụng chất đối chiếu thiết lập để kiểm nghiệm

HCM cung cấp năm 2008.

calophyllolid từ nhựa, vỏ quả Mù u và chế phẩm từ Mù u



Phương pháp GC-MS

cấp năm 2008.

Đã xây dựng một phương pháp nhanh, phù hợp, chính xác và đặc



hiệu để xác định calophyllolid từ nhựa Mù u bằng kỹ thuật sắc ký khí

& sản xuất dược phẩm Bình Minh.

mao quản ghép khối phổ (GC-MS). Thẩm định theo ICH với các chỉ

Nhựa tách loại khi tinh chế dầu thô ép từ hạt Mù u: chất lỏng có

Vỏ quả Mù u do công ty Natural Pro thu tại tỉnh Bến tre cung
Chế phẩm dầu Mù u Inopilo của công ty TNHH thương mại


2.3. Phương pháp nghiên cứu

KẾT LUẬN

2.3.1. Nguyên liệu - Dung môi, hóa chất - Trang thiết bị

Đề tài “Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù

- Dung môi, hóa chất sử dụng loại kỹ thuật dùng cho chiết xuất, loại
phân tích và sắc ký (Merck và JT Baker) dùng cho các kỹ thuật TLC,

u để ứng dụng trong kiểm nghiệm” đã hoàn thành các nội dung
nghiên cứu để đạt được mục tiêu đề ra và đưa ra những kết luận sau:

UV-Vis, IR, GC-MS, LC-MS, ICP-MS, deteuri hóa (Merck) dùng

1. Xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u

cho kỹ thuật NMR,….

Bằng một số kỹ thuật sắc ký như: sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng chân

- Các chủng vi khuẩn đối chiếu do ATCC cung cấp; đĩa kháng sinh

không, sắc ký lỏng (phân tích và điều chế), sắc ký khí và một số kỹ

chuẩn của hãng Oxoid Ltd (Anh).

thuật phổ nghiệm như: phổ UV-Vis, phổ IR, phổ khối lượng, phổ

- Thiết bị chiết xuất và phân tích đặt tại Khoa Dược -Đại học Y Dược

NMR một và hai chiều, phổ nhiễu xạ tia X, đã chiết xuất, phân lập,

TP.HCM, Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam, Viện Kiểm

tinh chế và xác định cấu trúc một số hợp chất phenol như sau:

nghiệm thuốc TP.HCM, Khoa Hóa-Đại học Khoa học Tự nhiên,
Khoa Hóa và Khoa Dược-Đại học Quốc gia Singapore.

- Trong nhựa Mù u:
 Từ 3 kg nhựa Mù u, đã chiết xuất bằng n -hexan thu được 40 g cao,

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu

từ đó phân lập được 8,1 mg hợp chất N 1 xác định là 1,5-

2.3.2.1. Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả

dihydroxyxanthon (C13H8O4) và 105,0 mg hợp chất N 2 xác định là 4-

Chiết xuất hợp chất phenol từ nhựa Mù u

hydroxyxanthon (C13H8O3).
 Từ 4 kg nhựa Mù u, đã chiết xuất bằng hỗn hợp MeOH -nước (9:1)

Phương pháp dùng dung môi kém phân cực có thay đổi pH
Kiềm hóa bằng các dung dịch kiềm khác nhau như natri carbonat
(TT), natri hydroxyd (TT), amoniac (TT) đến các pH 7-8 và 8-9. Acid

thu được 50 g cao, từ đó phân lập được 135,0 mg hợp chất N 3 dề
nghị tên inocalophyllin C (C37H48O6) và 98,0 mg hợp chất N 4 xác

Phương pháp dùng dung môi phân cực không thay đổi pH

định là calophyllolid (C26 H24O5).
Hợp chất N 3 với tên khoa học: ethyl 3-((2R,3R)-4-hydroxy-2,3-

Khảo sát tỉ lệ methanol/nước phù hợp nhất và phương pháp loại dầu.

dimethyl-6-(5-methyl-2-(prop-1-en-2-yl)hex-4-enyl)-6-(3-

Khảo sát quy trình loại dầu dựa vào độ phân cực:

methylbut-2-enyl)-5,7-dioxo-3,5,6,7-tetrahydro-2H-chromen-8-

hóa dịch kiềm đến pH 3-4 rồi chiết bằng dung môi kém phân cực.

-

Chiết lỏng - lỏng dịch chiết MeOH/nước với ether dầu hỏa.

-

Làm giảm nồng độ dung môi có trong dịch chiết MeOH/nước.

yl)-3-phenylpropanoat là một hợp chất tự nhiên mới, chưa từng
công bố trong các nguồn dữ liệu tra cứu tại thư việ n Đại học Quốc

Chiết xuất hợp chất phenol từ vỏ quả Mù u

gia Singapore (NUS): ScienceDirect, Scopus, PubMed, SciFinder

Phương pháp chiết lỏng dưới áp suất (PLE)

(Chemical Abstracts), Patent Databases.


GC-MS dùng cột thủy tinh với pha tĩnh OV 1 hoặc OV 17 3% tẩm

Dung môi chiết là n-hexan (TT) và methanol (TT); áp suất 1500 psi;

trên Gas Chrom Q. Tuy nhiên, tác giả đã không mô tả điều kiện sắc

nhiệt độ 120 oC; thời gian chiết: 15 phút; chu kỳ chiết: 1; thể tích rửa:

ký cũng như nguồn gốc chất đối chiếu calophyllolid đã sử dụng.

60%; thời gian làm sạch hệ thống bằng nitrogen: 90 giây.

Phương pháp sắc ký khí mao quản ghép khối phổ (GC-MS) đề xuất

Phương pháp chiết soxhlet

của chúng tôi tuy là phương pháp ngoại chuẩn do không tìm được nội

Dung môi chiết là methanol (TT); thời gian chiết: 8 giờ.

chuẩn đồng vị hoặc chất có cấu trúc tương tự với calophyllolid

Phương pháp ngấm kiệt

nhưng độ tin cậy chấp nhận được do sử dụng bộ tiêm mẫu tự động và

Vỏ quả Mù u xay thành bột, được ngấm kiệt ngược dòng với cồn

quy trình chuẩn bị mẫu không phức tạp. Kết quả là lần đầu tiên đã

96% thu được dịch chiết cồn. Cô cách thủy dịch chiết này đến cắn sệt

công bố trên tạp chí quốc tế phương pháp GC-MS xác định nhanh

như sirô. Thêm nước vào cắn này với tỷ lệ thích hợp rồi chiết với

calophyllolid. Phương pháp này sau đó làm cơ sở để xác định

ethyl acetat. Cô dịch chiết ethyl acetat dưới áp suất giảm ở 40 oC.

calophyllolid có trong vỏ quả Mù u.

Thử tác dụng kháng khuẩn

4.4.2. Phương pháp HPLC-DAD

Dùng phương pháp khuếch tán trên thạch, tiêu chuẩn của CLSI theo

Khi xác định calophyllolid trong chế phẩm có chứa dầu Mù u, do

khuyến cáo của FDA. Kháng sinh chuẩn và vi khuẩn thử nghiệm:

mẫu thử sau khi xử lý có nước nên không áp dụng phương pháp GC-

carbenicilin 100 µg cho Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027;

MS. Nghiên cứu của Frederic và cộng sự năm 2008 đã xác định các

methicilin 5 µg cho Staphylococcus aureus ATCC 6538 P;

coumarin kể cả calophyllolid trong cao lá Mù u bằng kỹ thuật HPLC-

streptomycin 10 µg đối với Mycobacterium smegmatis ATCC 14468.

o

DAD pha thuận dùng cột silica lỗ sốp 120 A , hạt 5 µm, kích thước

Phân lập

250 mm x 4,6 mm. Chương trình dung môi: i-propanol-i-octan từ 1-

Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng chân không (với silica gel 0,040-

20% (tt/tt) trong 25 phút, từ 20/80 (tt/tt) trong 25 phút, sau đó cân

0,063 mm) để tách các hợp chất phenol tinh khiết.

bằng trong 15 phút. Tuy nhiên, sắc ký đồ cho thấy calophyllolid kém

Tinh chế

phân giải và phương pháp chưa được thẩm định. Chưa thấy công bố

Sử dụng phương pháp kết ti nh lại trong dung môi thích hợp và

phương pháp HPLC-DAD pha đảo xác định calophyllolid với độ tin

phương pháp sắc ký lỏng điều chế.

cậy cao do sử dụng chất đối chiếu đã thiết lập. Với nghiên cứu của

Xác định cấu trúc hóa học

chúng tôi, các chỉ tiêu thẩm định đều đạt yêu cầu.

Xác định cấu trúc bằng cách đánh giá phối hợp kết quả các phổ: UVVis, IR, MS (EI-MS, HRESI-TOFMS), NMR (1H-NMR, 13C-NMR,
DEPT, HSQC, HMBC), X-ray.


2.3.2.2. Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu

thế và danh pháp. Ngoài ra, còn tìm thấy hợp chất acid

Chiết xuất, phân lập, tinh chế

brasiliensophyllic C từ Calophyllum brasiliense Cambess Clusiaceae

Chất đối chiếu phân lập từ các cao hợp chất phenol toàn phần chiết từ

có cấu tạo tương tự N 3 ngoại trừ nhóm chức acid thay vì ester và

nhựa Mù u. Sử dụng các kỹ thuật sắc ký lỏng chân không, kết tinh

mạch nhánh có thêm một carbon.

lại, sắc ký lỏng điều chế để đạt độ tinh khiết cao nhất.

4.3. Thiết lập chất chuẩn đối chiếu

Định tính

Chưa thấy có nhà sản xuất hay phân phối chất chuẩn đối chiếu như

Đối chiếu các phổ UV-Vis; phổ IR; phổ MS; phổ NMR của các chất

ChromaDex, Sigma Aldrich, USP, Cerilliant hoặc hai Viện kiểm

nghiên cứu với các phổ từ tài liệu tham khảo .

nghiệm thuốc trung ương và TP.HCM cung cấp calophyllolid và 4-

Đánh giá chất điều chế làm chất đối chiếu

hydroxyxanthon. Hiện chưa có các quy định về độ tinh khiết của chất

Điểm chảy: phương pháp 1 theo DĐVN IV.

đối chiếu là hợp chất tự nhiên phân lập từ dược liệu. Do

Tạp chất vô cơ: phương pháp ICP-MS theo DĐTQ 2010.

calophyllolid là chất có các hoạt tính như: ức chế elastas (IC 50 = 8,4

Tạp chất bay hơi: phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng TGA

µM); kháng viêm (LD50 = 2,5 g/kg); độc tính tế bào ( IC50 = 3,5

theo USP.

µg/ml), kháng khuẩn và là thành phần chính của nhiều bộ phận dùng

Tạp chất hữu cơ: phương pháp HPLC-DAD. Thẩm định phương

từ Mù u ở Việt nam và trên thế giới nên đáp ứng với tiêu chuẩn lựa

pháp: theo hướng dẫn của ICH ban hành vào tháng 11 năm 2005.

chọn làm chất điểm chỉ. Theo tổng kết của FHH (Forum for the

Đánh giá đồng nhất lô trong quá trình đóng gói chất đối chiếu

Harmonization of Herbal Medicine) năm 2005, Dược điển Hàn quốc

Lấy mẫu: Sử dụng cách lấy mẫu ngẫu nhiên theo phần mềm Excel,

8 quy định độ tinh khiết phải trên 95%. Đây là cơ sở để xây dựng

số lọ được lấy để kiểm tra là g = N +1 lọ, N là số lọ đóng được.

mức chất lượng cho chỉ tiêu định lượng calophyllolid làm chất chuẩn

Xác định độ tinh khiết: Áp dụng phương pháp xác định tạp chất hữu

đối chiếu.

cơ HPLC-DAD đã xây dựng và thẩm định theo ICH.

4.4. Các phương pháp ghép nối sắc ký-phổ nghiệm ứng dụng xác

Đánh giá độ đồng nhất giữa các lọ: Đánh giá bằng kỹ thuật thống kê

định calophyllolid trong nhựa, vỏ quả và chế phẩm từ Mù u

ANOVA một yếu tố. Các lọ là đồng nhất khi Ftn < Ftc (P = 0,05).

4.4.1. Phương pháp GC-MS

Đánh giá chất chuẩn đối chiếu thông qua liên phòng thí nghiệm

Khi thử hòa tan cao methanol trong hỗn hợp MeCN -nước với các tỷ

Tiến hành xác định độ tinh khiết tại ba phòng thí nghiệm độc lập đạt

lệ khác nhau thấy có hiện tượng mẫu bị đục làm ảnh hưởng đến quá

tiêu chuẩn GLP hoặc ISO/IEC17025.

trình phân tách và phát hiện nếu sử dụng phương pháp LC -MS hoặc

Xác định giá trị ấn định và độ không đảm bảo đo

HPLC-DAD. Năm 1972, Games DE đã công bố bài báo về định danh
các hợp chất 4-phenyl coumarin trong Calophyllum inophyllum bằng

nhựa và vỏ quả Mù u . Thật vậy, năm 2003, Shen và cộng sự đã xác

Xác định giá trị ấn định và độ không đảm bảo đo theo các phương

định được từ hạt Calophyllum inophyllum ở Đài loan: 4 dẫn suất

pháp thống kê dùng cho chương trình thử nghiệm thành thạo so sánh

pyranocoumarin và calophyllolid. Sau đó vào năm 2004, Yimdjo và

lien phòng thí nghiệm ISO 13528.

cộng sự công bố phân lập được calophyllolid và các coumarin khác

Định lượng

như calaustralin, inophyllum C, E từ hạt Mù u ở Cameroon. Gần đây

Hàm lượng % tính trên nguyên trạng: 100 – (% tạp chất hữu cơ) – (%

nhất là công trình năm 2009 của Leu và cộng sự cũng chưa thấy phân

tạp chất bay hơi) – (% tạp chất vô cơ) (theo hướng dẫn của WHO).

lập được 1,5-dihydroxyxanthon và 4-hydroxyxanthon trong nhựa Mù

2.3.2.3. Ứng dụng chất đối chiếu đã thiết lập để kiểm nghiệm

u tách loại khi tinh chế dầu ép từ hạt Mù u mọc ở Polynesia thuộc

nguyên liệu (nhựa, vỏ quả) và chế phẩm từ Mù u.

Pháp..

Phương pháp GC-MS

Kết quả xác định hàm lượng calophyllolid từ cao nhựa tách loại chiết

Khảo sát chọn nhiệt độ buồng cột: thay đổi nhiệt độ đầu và tốc độ

với MeOH bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng: 0,68 ± 0,01 (g/100g)

gia nhiệt, chọn điều kiện thời gian lưu ngắn và pic phân giải tốt.

và từ vỏ quả chiết với MeOH bằng phương pháp PLE: 0,0255 ±

Xác định các mảnh ion đặc trưng: xác định các mảnh ion phù hợp

0,0005 (g/100g) so với hàm lượng calophyllolid 0,47 ± 0,01 (g/100g)

với cấu trúc hợp chất.

trong chế phẩm Dầu Mù u Inopilo (chỉ định trị bỏng, u nhọt, viêm

Thẩm định quy trình

loét da, làm mau lành vết thương) cùng với tác dụng kháng S. aureus

- Tính phù hợp của hệ thống

và M. smegmatis đã sơ bộ cho thấy nhựa loại bỏ khi tinh chế dầu và

Yêu cầu: hệ số đối xứng của pic  2; hệ số tương quan (r) của đường

vỏ quả Mù u là đối tượng tiềm năng trong sử dụng làm thuốc.

chuẩn > 0,995; độ lệch cường độ tương đối các mảnh ion đặc trưng

4.2. Kết quả xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u

(%) của pic chất đối chiếu và pic mẫu thử ± 20%.

Từ nhựa 4 kg nhựa Mù u, đã chiết xuất được 50 g cao methanol và

- Tính đặc hiệu: Kiểm tra độ tinh khiết của pic trong mẫu thử bằng

phân lập được 135 mg hợp chất N 3 bằng phương pháp sắc ký lỏng

phần mềm AMDIS 2.69 (NIST).

chân không. Đây là một hợp chất tự nhiên hoàn toàn mới. Tham khảo

- Tính tuyến tính: r > 0,995.

tài liệu về chi Calophyllum cũng như các hợp chất đã công bố từ các

- Độ chính xác:

nguồn: ScienceDirect, Scopus, PubMed, SciFinder (Chemical



Độ lặp lại: %RSD ≤ 3,0

Abstracts), Patent Databases tại thư viện Đại học Quốc gia Singapore



Độ chính xác trung gian: Kết quả giữa các ngày khác

(NUS) cho thấy: chỉ có hợp chất inocalophyllin A dimethylat có phân
tử lượng tương đương nhưng khác biệt về cấu tạo bao gồm: loại
ester, vị trí dioxo, vị trí C-4, 1-3-diketon enol, vị trí C-5, vị trí nhóm

biệt không có ý nghĩa thống kê: test F (P = 0,05)
- Độ đúng: tỷ lệ phục hồi 98% - 102%; %RSD ≤ 2,0.


Phương pháp HPLC-DAD

3.3.2.2. Khảo sát chọn quy trình chuẩn bị mẫu thử

Khảo sát chọn chương tr ình dung môi: thay đổi tỷ lệ pha động và

Chọn nhiệt độ làm ấm: 60 oC; hàm lượng methanol (TT): 90%; thời

pH, chọn điều kiện để pic đạt độ phân giải tối thiểu 1,5.

gian làm ấm: 10 phút; thời gian siêu âm: 15 phút.

Khảo sát chọn quy trình chuẩn bị mẫu thử: thiết kế thí nghiệm để

3.3.2.3. Thẩm định quy trình

chọn điều kiện chuẩn bị mẫu dựa vào nhiệt độ làm ấm mẫu, hàm

Thẩm định quy trình theo các chỉ tiêu:

lượng dung môi, thời gian làm ấ m và thời gian siêu âm.

- Tính phù hợp của hệ thống

Thẩm định quy trình

Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống cho thấy sau 6 lần sắc ký

- Tính phù hợp của hệ thống

các thông số đều nằm trong giới hạn cho phép.

Yêu cầu: hệ số đối xứng của pic 0,8  As  1,5; %RSD diện tích pic

- Tính đặc hiệu: quy trình có tính đặc hiệu.

 2,0; số đĩa lý thuyết ≥ 2000.

- Tính tuyến tính: kết quả khảo sát tính tuyến tính cho thấy có sự

- Tính đặc hiệu: Sắc ký đồ pha động và dung môi pha mẫu không

tương quan tuyến tính giữa nồng độ calophyllolid đối chiếu cũng như

xuất hiện tín hiệu trùng với thời gian lưu của chất cần phân tích trong

calophyllolid trong mẫu và diện tích pic tương ứng với hệ số tương

mẫu thử và mẫu đối chiếu. Độ tinh khiết của pic chất cần phân tích

quan r > 0,995.

trong sắc ký đồ mẫu thử: > 0,99. Độ phân giải giữa pic chất cần phân

- Độ chính xác và độ đúng

và các pic liền kề trong sắc ký đồ mẫu thử: ≥ 1,5.

Kết quả thống kê cho thấy các quy trình có tỷ lệ hồi phục nằm trong

- Tính tuyến tính: r > 0,995.

giới hạn cho phép của tỷ lệ hồi phục lý thuyết 98% - 102%; %RSD:

- Độ chính xác:

< 2,0 và %RSD < 2 đối với độ lặp lại; %RSD < 3 đối với độ chính



Độ lặp lại: %RSD ≤ 3,0

xác trung gian.



Độ chính xác trung gian: Kết quả giữa các ngày khác

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
4.1. Xác định hợp chất phenol và thử tính kháng khuẩn các cao
chiết từ nhựa và vỏ quả Mù u

biệt không có ý nghĩa thống kê: test F (P = 0,05)
- Độ đúng: tỷ lệ phục hồi 98% - 102%; %RSD ≤ 2,0.
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu của chúng tôi đã dùng phương pháp chiết xuất từ nhựa

3.1. Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa, vỏ quả Mù u

Mù u Việt nam bằng n-hexan có thay đổi pH để phân lập được các

3.1.1. Chiết xuất các hợp chất phenol từ nhựa Mù u

hợp chất xanthon kể trên. Đặc biệt, bằng phương pháp chiết với

3.1.1.1. Phương pháp dùng dung môi kém phân cực, thay đổi pH

MeOH, đã phân lập được một hợp chất tự nhiên mới chưa từng được
ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Chưa thấy có tác giả nào
công bố xác định 1,5-dihydroxyxanthon và 4-hydroxyxanthon từ

3.3.1.2. Thẩm định quy trình
Thẩm định quy trình theo các chỉ tiêu:
- Tính phù hợp của hệ thống
Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống cho thấy sau 6 lần sắc ký
các thông số đều nằm trong giới hạn cho phép.
- Tính đặc hiệu: các quy trình có tính đặc hiệu.
- Tính tuyến tính: kết quả khảo sát tính tuyến tính cho thấy có sự
tương quan tuyến tính giữa nồng độ calophyllolid đối chiếu cũng như
calophyllolid trong mẫu và diện tích pic tương ứng với hệ số tương
Sơ đồ chiết xuất các hợp chất phenol từ nhựa Mù u bằng n -hexan

quan r > 0,995.

3.1.1.2. Phương pháp dùng dung môi phân cực không thay đổi pH

- Độ chính xác và độ đúng
Kết quả thống kê cho thấy các quy trình có tỷ lệ hồi phục nằm trong
giới hạn cho phép của tỷ lệ hồi phục lý thuyết 98% - 102%; %RSD:
< 2,0 và %RSD < 2 đối với độ lặp lại; %RSD < 3 đối với độ chính
xác trung gian.
3.3.2. Xác định calophyllolid trong chế phẩm có dầu Mù u
3.3.2.1. Khảo sát chọn chương trình dung môi
Cột Zorbax 250 mm × 4,6 mm, 5 μm. Tốc độ dòng: 1 ml/phút. Thể
tích tiêm mẫu: 10 μl. Nhiệt độ cột: 40 oC. Bước sóng phát hiện 270
nm. Pha động: acetonitril-dung dịch acid acetic 2% với chương trình
dung môi như sau:

Sơ đồ chiết xuất các hợp chất phenol từ nhựa Mù u bằng MeOH-nước

Thời gian (phút)
0
30
35
40

Acetonitril (%)
20
80
20
20

Dung dịch acid acetic 2% (%)
80
20
80
80

3.1.2. Chiết xuất các hợp chất phenol từ vỏ quả Mù u
3.1.2.1. Phương pháp chiết lỏng dưới áp suất (PLE)
Từ 5 g bột vỏ quả bằng n-hexan (TT) và methanol (TT) đã chiết được
lần lượt 0,05 g chất chiết sánh như dầu, màu vàng, hiệu suất 0,96%
và 0,5 g chất chiết dầu nhầy, màu nâu đậm , hiệu suất 9,98%.


Phổ NMR

3.1.2.2. Phương pháp chiết soxhlet

13

lần lượt 0, 02 g chất chiết rắn, màu vàng (hiệu suất 0,95%) và 0,08 g

139,9; 144,2; 151,7; 152,0; 155,0; 155,8; 159,4; 194,3.

3.1.2.3. Phương pháp ngấm kiệt
Từ 4 kg bột vỏ quả bằng ethyl acetat đã chiết được 20 g cao ethyl
acetat, hiệu suất 0,5%. Cao này được dùng cho phân lập kế tiếp.
3.1.3. Thử tác dụng kháng khuẩn các cao chiết từ nhựa và vỏ quả
Bảng 3.2. Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn của cao nhựa và vỏ quả

Điểm chảy
Tạp chất hữu cơ

154-156 oC.

Tạp chất bay hơi
Tạp chất vô cơ

Không quá 1,0 %.

Định lượng

Không ít hơn 95,0%.

phận
Nhựa
Vỏ quả

S. aureus

Ps. aeruginosa

M. smegmatis

ATCC 6538 P

ATCC 9027

ATCC 14468

Methicillin 5 µg

Carbenicillin 100 µg

Streptomycin 10 µg

Phương

3.3.1. Xác định calophyllolid trong nhựa và vỏ quả Mù u
3.3.1.1. Khảo sát nhiệt độ cột và xác định mảnh ion đặc trưng
Bảng 3.16. Khảo sát chương trình nhiệt độ cột
Nhiệt độ buồng cột

Tốc độ gia nhiệt
o

pháp chiết
n-Hexan

Dung môi

41,0

Âm tính

36,0

Methanol

Dung môi

45,3

-

48,4

Methanol

PLE

58,1

-

47,0

EtOAc

Ngấm kiệt

58,0

-

47,0

n-Hexan

PLE

53,8

-

37,5

Methanol

Soxhlet

50,0

-

45,5

60-300 C/9 phút

( C/phút)

(phút)

15

21,98 ± 0,01

Mảnh ion đặc trưng (m/z)
[M]+ 416, [M-CH3]+ 401,

20

18,5 ± 0,006

[M]+ 416, [M-CH3]+ 401,
[C5H7O]+ 83, [C4H7]+ 55

25

16,43 ± 0,01

[M]+ 416, [M-CH3]+ 401,
[C5H7O]+ 83, [C4H7]+ 55

30

15,06 ± 0,012

[M]+ 416, [M-CH3]+ 401,

[C5H7O]+ 83, [C4H7]+ 55

S. aureus và M. smegmatis, không có tác dụng trên Ps. aeruginosa.
3.1.4. Phân lập các hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u
3.1.4.1. Phân lập các hợp chất phenol từ nhựa
Từ 40 g cao n -hexan đã phân lập được: hợp chất N1 = 8,1 mg; hợp

Thời gian lưu

[C5H7O]+ 83, [C4H7]+ 55
o

Các cao chiết từ nhựa và vỏ quả Mù u có tác dụng kháng khuẩn trên

chất N2 = 105,0 mg.

Không quá 20 ppm.

liệu (nhựa, vỏ quả Mù u) và chế phẩm từ dầu Mù u.

mẫu thử (100 g/đĩa)/mẫu chuẩn % (n =2)

Cao

Không ít hơn 96,0% tính theo chế phẩm nguyên trạng.

3.3. Ứng dụng chất đối chiếu đã thiết lập để kiểm nghiệm nguyên

Đường kính vòng kháng khuẩn

Bộ

C-NMR (CD3Cl3, 75 MHz): 10,7; 15,2; 26,8 x 2; 63,0; 77,4; 105,6;

110,7; 114,2; 115,0; 115,9; 127,2 x 2; 127,5 x 2; 127,7; 129,0; 139,5;

chất chiết sánh như dầu, màu vàng sậm (hiệu suất 4,05%).

Đĩa kháng sinh chuẩn

H-NMR (CD3Cl3, 300 MHz): 7,26 m x 2; 7,40 m x 2; 0,97 s x 2; 1,9 d

(6,3); 2,01 s; 5,48 d (9,9); 6,02 s; 6,45 d (9,6), 6,57 q (6,0).

Từ 2 g bột vỏ quả bằng n-hexan (TT) và methanol (TT) đã chiết được

Chủng vi sinh vật thử nghiệm

1

40

13,2 ± 0,01

[M]+ 416, [M-CH3]+ 401,
[C5H7O]+ 83, [C4H7]+ 55

o

80-300 C/9 phút

40

12,83 ± 0,006

[M]+ 416, [M-CH3]+ 401,
[C5H7O]+ 83, [C4H7]+ 55

Kết quả: Chọn chương trình nhiệt độ: 80 -300 oC/9 phút, tăng 40 oC/phút.


3.2. Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu (ĐC)
Chiết xuất, phân lập và tinh chế để thu được hợp chất đủ tinh khiết
làm chất chuẩn đối chiếu. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng với mức
chất lượng, chỉ tiêu , phương pháp thử theo hướng dẫn của WHO và
ISO.
Bảng 3.3. Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng của 4-hydroxyxanthon (ĐC)
Sơ đồ phân lập N1, N2 bằng sắc ký lỏng chân không
Chỉ tiêu
Tính chất
Định tính
Phổ UV -Vis
Phổ IR
Phổ khối lượng
Phổ NMR

Mức chất lượng
Tinh thể hình kim, không màu , dễ tan trong aceton, methanol

Từ 50 g cao methanol đã phân lập được: hợp chất N3 = 135,0 mg;

hợp chất N4 = 98,0 mg.

Phải có các cực đại hấp thu ở 231, 248, 278 và 348 nm.
Phải có các đỉnh có số sóng: 3197, 1652, 1589, 1292, 754, 729 cm -1.
Phải có các pic có m/z 212 [M]+ (pic căn bản), 184, 155, 128, 102, 63
1

H-NMR (CD3OD, 500 MHz): 7,73 dd (8,0; 2,0); 7,25 t (8,0); và 7,31

dd (8,0; 1,5); 7,68 dd (8,5; 0,5); 7,83 dt (8,5; 1,5); 7,44 dt (7,5; 1,0); và
8,26 dd (8,0; 2,0)
13

C-NMR (CD3OD, 125 MHz): 179,2; 157,4; 147,9; 147,1; 136,4;

127,3; 125,3; 125,1; 123,6; 122,5; 121,5; 119,4; 117,1
Điểm chảy
Tạp chất hữu cơ

228-230 oC.

Tạp chất bay hơi
Định lượng

Không quá 1,0 %.

Không ít hơn 94,0% tính theo chế phẩm nguyên trạng.
Không ít hơn 90,0%.

Sơ đồ phân lập N 3, N4 bằng sắc ký lỏng chân không

3.1.4.2. Phân lập các hợp chất phenol từ vỏ quả
Từ 20 g cao EtOAc đã phân lập được: hợp chất V1 = 26,0 mg.

Bảng 3.4. Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng của calophyllolid (ĐC)
Chỉ tiêu

Mức chất lượng

Tính chất
Định tính

Tinh thể không màu, dễ tan trong aceton, benzen, ether ethylic, alcol

Phổ UV-Vis
Phổ IR

Phải có các cực đại hấp thu ở 235, 270 và 295 nm.
Phải có các đỉnh có số sóng: 1726, 1662, 1579, 1133, 759, 702 cm -1.

Phổ khối lượng

Phải có các pic có m/z 416 [M]+, 401 (pic căn bản), 83, 55

Sơ đồ phân lập V 1 bằng sắ c ký lỏng chân không


3.1.5. Xác định cấu trúc các hợp chất phenol phân lập được
Các hằng số vật lý và dữ liệu phổ của N1, N2 tóm tắt trong bảng sau:

13

C-NMR

(CDCl3, 125 MHz): 12,4; 14,1; 17,8; 18,1; 19,3; 25,5; 25,6; 35,2; 35,6;

(C, ppm)

36,8; 40,9; 41,7; 44,6; 60,1; 77,2; 109,7; 113,7; 115,2; 115,6; 117,1;

N1 (1,5-dihydroxyxanthon)

N2 (4-hydroxyxanthon)

122,4; 125,6; 127,7; 128,1; 132,2; 143,6; 147,4; 163,1; 187,3; 187,4;

Mô tả

Bột màu vàng, vô định hình

Tinh thể hình kim, không màu

195,7; 200,3.

Điểm chảy

245-247 oC

228-230 oC

UV (MeOH)

248, 315, 370 nm, 235 nm (sh)

231, 248, 348 nm

IR (KBr, cm-1)

3421, 1647, 1577, 1279, 792, 724

3197, 1652, 1589, 1292, 754, 729

EI-MS m/z

228 (100), 212 (1,37), 200 (11,12),

(rel. int.,%)
1

171 (11,46), 115 (23,3), 92 (13,75)

H-NMR

(CD3OD và DMSO-d6, 500 MHz):

(H, ppm; J, Hz)

4'

2'

(CD3OD, 500 MHz): 7,73 dd (8,0;

2

3'''
2'''

7

8'''
O

4a
3

9'''

4

5'''
4'''

6
5

11 8a
O

O

1"
1'''

8

O

6'''

7'''

2"

O

1'
9

12
10

128 (21,91), 102 (9,05), 63 (11,19)

4''
3"

6'

13

212 (100), 184 (22,76), 155 (7,28),

5''

5'

3'

10'''

7,72 t (8,0); 6,82 dd (8,0; 1,0); 7,12

2,0); 7,25 t (8,0); 7,31 dd (8,0; 1,5);

dd (7,5; 0,5); 7,36 dd (7,5; 2,0); 7,30

7,68 dd (8,5; 0,5); 7,83 dt (8,5; 1,5);

t (7,5); 7,74 dd (8,0; 1,5)

7,44 dt (7,5; 1,0); 8,26 dd (8,0; 2,0)

C-NMR

(CD3OD và DMSO-d6, 125 MHz):

(CD3OD, 125 MHz): 179,2; 157,4;

Công thức cấu tạo của N 3

Cấu trúc của N3 (nhiễu xạ tia X)
Các hằng số vật lý và dữ liệu phổ của N4 và V1 tóm tắt trong bảng

(C, ppm)

183,8; 162,9; 157,5; 147,7; 147,0;

147,9; 147,1; 136,4; 127,3; 125,3;

sau:

138,2; 125,3; 122,6; 122,2; 116,5;

125,1; 123,6; 122,5; 121,5; 119,4;

111,2; 109,7; 108,4.

117,1

13

IR (KBr, cm )

1726, 1663, 1580, 1133, 757, 698

1728, 1663, 1580, 1133, 757, 698

98,2-100,5 C

EI-MS m/z

416 (15,42), 401 (100), 83 (5,62),

416 (11,65), 401 (100), 83 (1,94),

239, 311 nm

(rel. int.,%)

55 (30,60)

55 (6,95)

1

(CD3Cl3, 300 MHz): 7,26 m x 2;

(CD3Cl3, 500 MHz): 7,19 m x 2;

7,40 m x 2; 0,97 s x 2; 1,9 d (6,3);

7,33 m x 2; 0,90 s x 2; 1,83 d

2,01 s; 5,48 d (9,9); 6,02 s; 6,45 d

(7,0); 1,94 s; 5,40 d (10,0); 5,95 s;

(9,6), 6,57 q (6,0)

6,38 d (10,0), 6,49 m

C-NMR

(CD3Cl3, 75 MHz): 10,7; 15,2; 26,8

(CD3OD, 125 MHz): 10,7; 15,1;

(C, ppm)

x 2; 63,0; 77,4; 105,6; 110,7; 114,2;

26,9; 27,8; 62,9; 77,4; 105,6;

(tính toán: 588,3401)

115,0; 115,9; 127,2 x 2; 127,5 x 2;

110,7; 114,3; 115,1; 116,0; 127,3

(CDCl3, 500 MHz): 16,5 s; 7,37 d (7,5) x 2; 7,22 t (7,5) x 2; 7,11 t (7,5);

127,7; 129,0; 139,5; 139,9; 144,2;

x 2; 127,5 x 2; 127,8; 129,2;

4,36 s; 4,92 m; 4,95 m; 3,21 dd (11,0; 7,0); 3,32 dd (10,5; 7,0); 1,75 s;

151,7; 152,0; 155,0; 155,8; 159,4;

139,6; 140,0; 143,9; 151,8; 152,0;

1,65 s; 1,5 s; 1,48 s; ,25 d (6,0); 1,3 d (6,0); 1,29 t (3,5); 4,1 q (4,5)

194,3.

154,9; 155,9; 159,4; 194,2.

IR (KBr, cm )

3440, 2926, 2855, 1732, 1603, 1447, 1376, 1257, 1031

EI-MS m/z

588 (7,45); 573 (1,77); 519 (10,81); 485 (1,58); 465 (2,65); 452 (11,92);

(rel. int.,%)

-1

H-NMR

(H, ppm; J, Hz)

419 (4,49); 411 (7,77); 397 (100); 379 (1,51); 363 (14,88); 323 (14,06);
105 (32,88); 97 (13,43); 69 (70,31); 55 (37,42); 45 (6,43)

[M]
1

+

H-NMR

(H, ppm; J, Hz)

588,3400

o

UV (EtOH)

289 (7,51); 267 (9,63); 235 (7,75); 177 (14,47); 135 (37,54); 121 (8,65);
HRMS (ESI-TOF)

Tinh thể hình phiến, không màu
235, 270, 295, 325 nm (sh)

o

-1

V1 (calophyllolid)

Tinh thể hình lăng trụ, không màu
235, 270, 295, 325 nm (sh)

Tinh thể hình phiến, không màu

UV (MeOH)

N4 (calophyllolid)

155,5 oC

N3 (Tên đề nghị: Inocalophyllin C)
Điểm chảy

Mô tả
Điểm chảy

155 C

Các hằng số vật lý và dữ liệu phổ của N3 tóm tắt trong bảng sau:
Mô tả

OH

13