NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM BỆNH MẠCH VÀNH BẰNG CẤY GHÉP TẾ BÀO GỐC TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Họ tên NCS: PHẠM LÊ BỬU TRÚC

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM BỆNH
MẠCH VÀNH BẰNG CẤY GHÉP TẾ BÀO GỐC
TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT

Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT

Cán bộ hướng dẫn : PGS. TS. PHẠM THÀNH HỔ

1


1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh mạch vành là một loại bệnh tim thường gặp nhất, nguyên nhân do động mạch vành
xơ vữa làm tim bị thiếu máu cục bộ, gây suy tim và đột quỵ có thể dẫn đến tử vong ở bệnh nhân.
Theo Tổ chức Y tế Thế giới, mỗi năm có khoảng 17 triệu người trên hành tinh chết vì bệnh tim
mạch, con số này được dự đoán sẽ tăng lên 25 triệu vào năm 2020. Tại Việt Nam, theo thống kê
của Viện Tim mạch Việt Nam, hàng năm có đến hàng triệu người bị bệnh mạch vành và khoảng
10% trong số bệnh nhân này tử vong do nhồi máu cơ tim. Hiện nay, có nhiều phương pháp điều
trị bệnh mạch vành như điều chỉnh lối sống, dùng thuốc, can thiệp động mạch vành qua da hay
mổ bắc cầu nối động mạch vành. Các phương pháp điều trị này gây xâm lấn và buộc bệnh nhân
phải sử dụng thuốc suốt đời. Với sự phát triển của khoa học hiện nay, đặc biệt là việc phát hiện
ra tế bào gốc, phương pháp mới sử dụng tế bào gốc để điều trị bệnh mạch vành được nghĩ đến và
đã có một số nghiên cứu ứng dụng tế bào trong điều trị bệnh mạch vành. Tuy nhiên, cho đến nay
vẫn chưa có kết quả nghiên cứu nào về việc sử dụng tế bào gốc trung mô/nội mô từ máu cuống

rốn điều trị bệnh mạch vành được công bố trên các Tạp chí Khoa học chuyên ngành, cũng như
chưa có nghiên cứu nào về việc đánh giá, theo dõi sự tồn tại của tế bào gốc khi ghép hay vai trò
của tế bào gốc trong cấy ghép. Do đó, việc tiến hành đề tài “Nghiên cứu điều trị thực nghiệm
bệnh mạch vành bằng cấy ghép tế bào gốc trên mô hình chuột” là phù hợp với xu thế Thế
giới cũng như định hướng của nước ta trong việc điều trị bệnh mạch vành.
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
- Chuẩn hóa được các kĩ thuật thu nhận tế bào gốc trung mô, tế bào gốc nội mô từ máu cuống rốn
người và biệt hóa thành công tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người thành tế bào giống tế
bào cơ tim
- Khảo sát và đánh giá được tác động của việc ghép tế bào giống cơ tim được biệt hóa từ tế bào
gốc trung mô, hay tế bào gốc nội mô từ máu cuống rốn người hoặc kết hợp 2 nguồn tế bào này
lên sự phục hồi bệnh mạch vành thực nghiệm
3. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU
3.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Các bệnh về động mạch nói chung đã được nghiên cứu nhiều trên mô hình động vật bao
gồm các bệnh suy tim, thiếu máu cục bộ cơ tim, tắt nghẽn động mạch vành, thiếu máu cục bộ
chi… Nhiều đối tượng tế bào được thử nghiệm điều trị bệnh tim mạch như tế bào gốc phôi, tế
bào gốc trung mô, tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc nội mô. Murohara phân lập các tế bào đơn
nhân từ máu cuống rốn và ngoại vi, chọn lọc tế bào CD34 +, sau đó cấy ghép các tế bào này vào
mô hình chuột thiếu máu chi. Kết quả cho thấy có đáp ứng hình thành mạch máu mới cũng như
sự biểu hiện tăng dòng chảy của máu và tăng mật độ mao mạch ở vùng cách xa vùng động mạch
đùi đã thắt. [20, 81, 108] Nghiên cứu tương tự của Botta hướng tới việc thu nhận các tế bào
CD34+/KDR được phân lập từ máu cuống rốn, sau đó tiêm vào cơ tim chuột NOD/SCID ngay
sau khi thắt động mạch vành trước. Kết quả cho thấy có sự cải thiện động học máu trong suốt
khoảng thời gian 5 tháng và có sự định vị của các nhân tế bào người được nhuộm miễn dịch
trong cơ tim của chuột. Tuy nhiên chưa xác định được liệu các tế bào cấy ghép có dung hợp hay
biệt hóa thành tế bào cơ tim hay không.[27]Việc ứng dụng tế bào gốc nội mô máu cuống rốn
người (CD34+/CD133+) lên mô hình chuột thiếu máu cục bộ ở chi chưa được công bố (theo kết
quả tìm kiếm trên Cơ sơ Dữ liệu Sinh học NCBI đến tháng 6/2009). Như vậy, các công bố sử
dụng 4 nguồn tế bào trên cho điều trị bệnh này đều cho thấy có dấu hiệu tốt trên mô hình chuột,

đặc biệt có sự xuất hiện, hình thành nhiều mạch máu mới. [101, 102, 103]

2


Ở người, việc thử nghiệm điều trị các bệnh động mạch ngoại biên được thử nghiệm với
nhiều kết quả rất khác nhau. Đến nay, có 2 nguồn tế bào được cho ghép sử dụng trên người:
nguyên bào cơ xương và tế bào gốc tủy xương hay tế bào gốc huy động từ máu ngoại vi. Bệnh
nhân đầu tiên ứng dụng liệu pháp này được tiêm tế bào trực tiếp vào màng ngoài tim. Trong thử
nghiệm này, Menasche và cộng sự đã tiêm các nguyên bào cơ xương tự thân vào cơ tim nhồi
máu không còn sống, không tạo mạch cho 10 bệnh nhân bị suy tim nhồi máu. Vào cuối tháng 11,
thử nghiệm cho thấy có sự cải thiện chức năng tim và có sự gia tăng sức sống của mô xơ ở tất cả
các bệnh nhân. Không có trường hợp tử vong ngay sau khi phẫu thuật, chỉ có một trường hợp
chết muộn xảy ra do đột quỵ sau hơn 1 năm cấy ghép. Điều đáng ghi nhận trong các thử nghiệm
này là sự cải thiện sức đập cơ tim đáng kể ở 4 bệnh nhân.[78,82] Nghiên cứu của Orlic và cộng
sự cũng cho kết quả tương tự về sự cải thiện chức năng tim sau 3 tháng tiêm tế bào vào 12 bệnh
nhân nhồi máu cơ tim. Trong 12 bệnh nhân này chỉ có 1 bệnh nhân không cho thấy sự cải thiện
chức năng của tim. [90] Tương tự, Ballard và cộng sự đã thử nghiệm tiêm các tế bào đơn nhân tự
thân từ tủy xương vào 5 năm bệnh nhân. Một năm sau khi tiêm, 3 trong 5 bệnh nhân cho thấy có
sự cải thiện sức bơm trong vùng tổn thương.[116] Trong một thí nghiệm khác, Strauer tiến hành
truyền các tế bào đơn nhân tủy xương tự thân cho 10 bệnh nhân, trong khi Assmus đánh giá việc
sử dụng các tế bào tiền thân thu từ tủy xương và máu ngoại vi ở 20 bệnh nhân. Tất cả các bệnh
nhân này được theo dõi trong 3-4 tháng sau khi truyền và được so sánh với các bệnh nhân làm
đối chứng. Kết quả cho thấy việc truyền tế bào làm kích thích vùng nhồi máu và cải thiện sức
tống máu của tim và sức co cục bộ và toàn bộ tim.[22, 29, 106] Sự thành công của các thử
nghiệm ban đầu đã kích thích Wollert và cộng sự tiến hành thử nghiệm để kiểm tra tính an toàn
và hiệu quả của liệu pháp tế bào trên bệnh nhân thiếu máu cơ tim. Sáu mươi bệnh nhân được
truyền các tế bào tủy xương tự thân vào mạch vành. Sau 6 tháng, không có tác động phụ nào
được báo cáo.[79, 120, 121] Sau đó, Cheng và cộng sự cũng tiến hành thử nghiệm tương tự trên
69 bệnh nhân và cũng cho thấy sau 3 tháng, các bệnh nhân nhận tế bào có sự cải thiện đáng kể về

sức bơm cơ tim. [83] Tuy việc sử dụng các nguồn tế bào tự thân như nguyên bào cơ xương, tế
bào gốc từ tủy xương, máu ngoại vi cho kết quả tốt nhưng liệu pháp này cũng gặp nhiều hạn chế
vì lượng tế bào gốc từ các nguồn này ít và giảm theo tuổi bệnh nhân. Do đó, nhiều nhà nghiên
cứu cho rằng máu cuống rốn là nguồn tế bào gốc hữu hiệu trong việc điều trị các bệnh này vì
chúng dồi dào, dễ thu nhận và luôn tươi mới. [127]
3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Theo cơ sở dữ liệu khoa học của Trung tâm Thông tin và Khoa học Công nghệ Quốc gia
(đến tháng 6/2009) vẫn chưa có bài báo hay công trình nghiên cứu nào công bố về các vấn đề
liên quan đến việc sử dụng tế bào gốc nội mô/trung mô trong điều trị nghẽn động mạch hay thử
nghiệm tác động tăng sinh mạch máu mới của tế bào gốc.
Một số phương pháp điều trị thiếu máu cục bộ được sử dụng trên người đã được khảo sát
như laser nội mạch (Nguyễn Trọng Lưu, 2005), sử dụng các kĩ thuật lấy huyết khối, giải phẫu
(Trần Công Quyền, 2006; Đoàn Quốc Hưng, 2006)…
Việc thu nhận và biệt hóa tế bào gốc được tiến hành bởi một số nhóm nghiên cứu ở
Phòng thí nghiệm Tế bào Gốc, Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM [10-12]
Các thử nghiệm ghép tế bào lâm sàng được thực hiện trên bệnh nhân bạch cầu mạn dòng
tủy, bệnh nhân thalasemia (Trần Văn Bé, 1995), bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho (Trần
Văn Bé, 2002), bệnh nhân khớp giả thân xương chày (Nguyễn Mạnh Khánh, 2007).

3


4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nội dung 1: Nghiên cứu tạo và đánh giá mô hình chuột bệnh mạch vành [122]
Mô hình chuột tắc nghẽn mạch vành được tạo bằng cách thắt động mạch vành cung cấp
máu nuôi tim (theo phương pháp 1).
Chuột sau khi gây mô hình được đánh giá dựa trên các tiêu chí (theo phương pháp 8):
(1) Sự thay đổi sinh lí tuần hoàn
o Sự tăng huyết áp và rối loạn hoạt động chức năng của tim
o Đo kích thước vùng nhồi máu và vùng hư hại

(2) Đánh giá sự thay đổi ở mức gen, protein và tế bào
o Thay đổi sự biểu hiện gen, xơ hóa và sự chết các tế bào cơ tim
o Hoạt hóa các nhân tố tự tiết và cận tiết bao gồm sự giải phóng các nhân tố tăng
trưởng và cytokine
Kết quả: Mô hình chuột tắc nghẽn mạch vành đạt yêu cầu cho nghiên cứu cấy ghép điều trị.
Nội dung 2: Nghiên cứu thu nhận và tăng sinh tế bào gốc nội mô và tế bào gốc trung mô từ
máu cuống rốn người
2.1. Nghiên cứu phân lập và tăng sinh tế bào gốc nội mô từ máu cuống rốn người (theo
phương pháp 4) [20, 123]
Tế bào gốc nội mô từ máu cuống rốn người được tiến hành thu nhận theo các phương pháp
của Xiao Wu và cộng sự (2007). Quần thể tế bào gốc nội mô có khả năng tái tạo mạch máu mới
được thu nhận dựa vào chọn lọc marker CD34+/CD133+.
Máu cuống rốn được được làm giàu tế bào có nhân bằng phương pháp li tâm trên gradient
Ficoll. Tế bào đơn nhân được làm giàu và nuôi cấy chọn lọc tế bào CD34+/CD133+ bằng cách
nuôi cấy trên môi trường chuyên biệt EGM-2. Sau đó, quần thể tế bào gốc nội mô được nuôi cấy
tăng sinh và thu nhận. Quần thể tế bào này được đánh giá 1ại sự biểu hiện marker
CD34+/CD133+ bằng kĩ thuật flow cytometry. Quần thể tế bào với 90% CD34+/CD133+ được
sử dụng cho cấy ghép ở Nội dung 3.
Kết quả: Quy trình thu nhận và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc nội mô và quần thể tế bào gốc nội
mô đạt độ tinh sạch từ 90% trở lên.
2.2. Nghiên cứu thu nhận và tăng sinh tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người
(theo phương pháp 3)
Tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người được tiến hành thu nhận theo các phương pháp
của Oscar và cộng sự (2004). Tế bào gốc trung mô được chọn lọc dựa trên các marker bề mặt,
khả năng tự làm mới và khả năng biệt hóa.
Máu cuống rốn được làm giàu tế bào có nhân bằng phương pháp li tâm trên gradient Ficoll,
quần thể tế bào đơn nhân được nuôi cấy trong môi trường IMDM dành cho tế bào bám dính.
Quần thể tế bào bám dính được đánh giá marker bề mặt: CD13, CD14, CD34, CD44, CD45,
CD73, CD90, CD105, CD106, CD117, CD166, HLA-DR, khả năng tự làm mới và khả năng biệt
hóa. Quần thể tế bào biểu hiện marker đặc trưng ở độ tinh sạch 90% trở lên sẽ được sử dụng cho

Nôi dung 4.
Kết quả: Quy trình thu nhận và nuôi cấy tế bào gốc trung mô. Dòng tế bào trung mô từ máu
cuống rốn người đạt độ tinh sạch từ 90% trở lên.

4


Nội dung 3: Đánh giá hiệu quả điều trị và vai trò của tế bào gốc nội mô trong cấy ghép điều
trị bệnh mạch vành trên mô hình chuột
3.1. Đánh giá hiệu quả điều trị của tế bào gốc nội mô
Tế bào gốc nội mô CD34+/CD133+ từ máu cuống rốn có khả năng hình mạch máu mới
trong mô hình chuột suy giảm miễn dịch. Tế bào gốc này vừa có khả năng biệt hóa thành tế bào
máu, vừa có khả năng hình thành tế bào nội mô mạch máu.
Để đánh giá hiệu quả điều trị, tế bào gốc nội mô được ghép theo các phác đồ (nghiệm thức)
khác nhau, được tiến hành theo phương pháp biến đổi từ phương pháp của Chen và cs [18]:
 Nghiệm thức 1: Ghép 1.000.000 tế bào/30 μl/con (chuột 25 g) vào vùng tim thiếu máu
 Nghiệm thức 2: Ghép 10.000.000 tế bào/30 μl/con (chuột 25 g) vào vùng tim thiếu máu
 Nghiệm thức đối chứng 1: tiêm PBS vào vùng tim thiếu máu
 Nghiệm thức đối chứng 2: chuột bị bệnh mạch vành
Việc ghép được tiến hành theo cách ghép tế bào vào vùng tim thiếu máu (phương pháp 7).
Hiệu quả ghép được đánh giá theo các tiêu chí sinh lí sinh hóa (phương pháp 8). Mỗi nghiệm
thức tiến hành trên 30 chuột mô hình. Hiệu quả điều trị giữa các nghiệm thức được so sánh để
chọn phác đồ tốt nhất trong các phác đồ khảo sát.
3.2. Đánh giá vai trò của tế bào gốc nội mô
Các tế bào trước khi ghép được đánh dấu với PKH26 hay Vybrant Dil để thuận lợi cho việc
khảo sát sự tồn tại và di cư của tế bào sau khi ghép (theo phương pháp 7).
3.2.1. Đánh giá ở mức độ sinh lí (theo nội dung 1)
3.2.1. Đánh giá ở mức độ tế bào và phân tử
Khảo sát sự tồn tại của tế bào ghép đã đánh dấu ở các thời điểm là: 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ,
3, 7, 15 và 30 ngày sau khi ghép tế bào dựa vào sự tồn tại của các tế bào mang dấu bằng kĩ thuật

hóa mô miễn dịch (theo phương pháp 6)
Các tế bào trong các mô khảo sát được phân lập theo kĩ thuật tách bằng hoạt hóa huỳnh
quang (FACS) hoặc kĩ thuật vi thao tác dựa vào sự phát quang của dấu lưu (theo phương pháp
9). Những tế bào này được kiểm tra để đánh giá sự biểu hiện của các gen quan trọng như VEGF
(Vascular endothelial growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), Ang-1 (angiopoietin-1),
eNOS (endothelial nitric oxide synthase), G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor), GMCSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, SDF-1 (stromal cell-derived factor 1),
IGF-1 (insulin-like growth factor-1), Statins (droxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase
inhibitors) và xác định sự biệt hóa của tế bào cho sự biểu hiện gen 2 marker CD34/CD133 (theo
phương pháp 5)bằng kĩ thuật RT-PCR. [96]
Nội dung 4: Đánh giá hiệu quả điều trị và vai trò của tế bào cơ tim được biệt hóa từ tế bào
gốc trung mô trong cấy ghép điều trị bệnh tim thiếu máu cục bộ
4.1. Đánh giá hiệu quả điều trị
Tế bào gốc trung mô máu cuống rốn được biệt hóa thành tế bào giống cơ tim bằng hóa chất
5-azacytidine (theo phương pháp 4) [24]. Tế bào giống cơ tim được ghép theo các phác đồ
(nghiệm thức) khác nhau :
 Nghiệm thức 3: Ghép 1.000.000 tế bào/30 μl/con (chuột 25 g) vào vùng tim thiếu máu
 Nghiệm thức 4: Ghép 10.000.000 tế bào/30 μl/con (chuột 25 g) vào vùng tim thiếu máu
 Nghiệm thức đối chứng 3: tiêm PBS vào vùng tim thiếu máu
 Nghiệm thức đối chứng 4: chuột bị bệnh mạch vành
Sau khi ghép, hiệu quả điều trị được đánh giá theo các tiêu chí sinh lý và sinh hóa (theo
phương pháp 8). Mỗi nghiệm thức tiến hành trên 30 chuột mô hình. Hiệu quả điều trị giữa các
nghiệm thức được so sánh để chọn phác đồ tốt nhất trong các phác đồ khảo sát.
5


4.2. Đánh giá vai trò của tế bào cơ tim được biệt hóa từ tế bào gốc trung mô [76]
Các tế bào trước khi ghép được đánh dấu với PKH26 hay Vybrant Dil để thuận lợi cho việc khảo
sát sự tồn tại và di cư của tế bào sau khi ghép (theo phương pháp 7).
4.2.1. Đánh giá ở mức độ sinh lí (theo nội dung 1)
4.2.1. Đánh giá ở mức độ tế bào và phân tử

Khảo sát sự tồn tại của tế bào ghép đã đánh dấu ở các thời điểm là: 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ,
3, 7, 15 và 30 ngày sau khi ghép tế bào dựa vào sự tồn tại của các tế bào mang dấu bằng kĩ thuật
hóa mô miễn dịch (theo phương pháp 6)
Các tế bào trong các mô khảo sát được phân lập theo kĩ thuật tách bằng hoạt hóa huỳnh
quang (FACS) hoặc kĩ thuật vi thao tác dựa vào sự phát quang của dấu lưu (theo phương pháp
9). Những tế bào này được kiểm tra để đánh giá sự biểu hiện của các gen quan trọng như VEGF
(Vascular endothelial growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), Ang-1 (angiopoietin-1),
eNOS (endothelial nitric oxide synthase), G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor), GMCSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, SDF-1 (stromal cell-derived factor 1),
IGF-1 (insulin-like growth factor-1), Statins (droxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase
inhibitors) và xác định sự biệt hóa của tế bào cho sự biểu hiện gen các marker CD44, CD73,
CD90, CD105, CD106 và HLA-DR (theo phương pháp 5) bằng kĩ thuật RT-PCR.[69,107,118,]
Bảng 1: trình tự primer
Tên Primer
Trình tự xuôi (forward primer)
Trình tự ngược ( reverse primer)
hVEGF
5′5′CTACCTCCACCATGCCAAG GCAGTAGCTGCGCTGATAG
T-3′
A-3′
hHGF
5′-TCCCCATCGCCATCCCC- 5′3′
CACCATGGCCTCGGCTGG3′
heNOS
5'5′GTGATGGCGAAGCGAGTG
GACACCACGTCATACTCAT
AAG-3′
CC3′
hG-CSF
TGCCCGGCCTTGGCACGCC TGGGGCTGCCCAGCAGCTG
ACCCATC

CCCATA.
hGM-CSF
5'-CATCTAGA
5'-ATGCGGCCGC
AAGGAGGGCCACCATG TG- TGTCGAGC TAGCGAATTC3'
3'
hSDF-1
5'5'TTCAGGAGTACCTGGAGAA ACTGAACCTGACCGTACAC
A-3'
CTAACACTGGT-3'
hIGF-1
5’5’CCTCCTCGCATCTCTTCTAC TGCTGGAGCCATACCCTGT
CTGC-3’
G-3’
hCD44
5’5’CTCCGGACACCATGGACAA CTCTTCTTATGCTATAACCT
GT-3’
G-3’
hCD73
5_-ATTGCA AAG TGG TTC
5_-ACA CTT GGC CAG
AAA GTC A-3
TAAAAT AGG G-3
hCD105 (endoglin)
5′3′6


hHLA-DR
h GAPDH

GCTGGATGAGCCGGGAGCT
CCCTGCTG-3′;
5’_GACAAAGCCAACCTGG
AAATCA-3’
5′AGGGCTGCTTTTAACTCTG
GT-3′

CACAGGCTGAAGGTCACA
ATGGACTG-3′
5’_GGACGTTGGGCTCTCTC
AGTT-3’
5′CCCCACTTGATTTTGGAGG
GA-3

Nội dung 5: Nghiên cứu điều trị phối hợp bệnh mạch vành
Bênh mạch vành kéo dài sẽ dẫn đến hệ quả tất yếu là suy tim kéo dài. Việc đưa ra được một
phác đồ điều trị bệnh mạch vành kết hợp hồi phục các chức năng của tim nhằm làm chậm tiến
trình suy tim là một việc hết sức ý nghĩa trong nghiên cứu và điều trị. Trên cơ sở đó, nội dung
nghiên cứu này nhằm phối hợp 2 loại tế bào gốc nội mô và tế bào cơ tim được biệt hóa từ tế bào
gốc trung mô trong điều trị bệnh mạch vành. Tế bào gốc có khả năng kích thích quá trình tăng
sinh mạch máu mới, tiết các chất kích thích mạch và tim, tế bào cơ tim vai trò hỗ trợ kích thích
lên tế bào tim và tăng sinh mạch.
Việc ghép phối hợp 2 dạng tế bào này được tiến hành theo 1 phác đồ duy nhất.
 Nghiệm thức 5: Ghép 1 liều duy nhất (chứa 2 loại tế bào với phác đồ tốt nhất được đánh
giá ở Nội dung 3 và 4)
 Nghiệm thức đối chứng 5: tiêm PBS vào vị trí tương ứng với lô thí nghiệm
 Nghiệm thức đối chứng 6: chuột bị bệnh mạch vành
Sau khi ghép, hiệu quả điều trị được đánh giá theo các tiêu chí sinh lý và sinh hóa. Mỗi
nghiệm thức tiến hành trên 30 chuột mô hình.
5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Cách tiếp cận
- Dựa vào nhu cầu của xã hội
- Học hỏi, tham khảo ý kiến của các chuyên gia đầu ngành
- Tham khảo các tài liệu trong và ngoài nước có liên quan đến đề tài
Phương pháp nghiên cứu
1. Phương pháp 1: tạo mô hình chuột bệnh mạch vành (quy trình 1, 14, 15, 16, 17)
2. Phương pháp 2: phân lập, tăng sinh tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người (quy
trình 2, 3, 4, 5, 6, 10 và 11)
3. Phương pháp 3: phân lập, tăng sinh tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người (quy
trình 2, 5, 6, 7, 8)
4. Phương pháp 4: biệt hóa tế bào gốc (quy trình 9,10,11)
5. Phương pháp 5: đánh giá sự biểu hiện gen ở mức phiên mã (quy trình 10, 11)
6. Phương pháp 6: hóa mô/hóa mô miễn dịch (quy trình 15)
7. Phương pháp 7: cấy ghép tế bào (quy trình 12, 13)
8. Phương pháp 8: đánh giá các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa (quy trình 10,11,12, 16, 17)
9. Phương pháp 9: thu nhận tế bào lưu dấu sau khi ghép (quy trình 18,19)
Quy trình 1 : Phẫu thuật tạo mô hình chuột tắc nghẽn động mạch vành [92, 128]
- Đặt ống thở : chuột được gây mê bằng ketamine
- Làm sạch lông vùng ngực (từ cổ đến qua giữa ngực)
- Chuột được đặt nằm ngửa và nằm trên tấm làm ấm toàn cơ thể

7


Sử dụng dây chằng vắt ngang qua miệng chuột ở vùng răng hàm hình chữ S nhằm giữ
cho phần cổ và ngực thẳng. Dùng kẹp cong kéo lưỡi chuột qua một bên và nhẹ nhàng
luồng ống thở oxy vào vỏ trong khí quản, sử dụng ống dẫn PE 90. Ống thông vào vùng
vỏ trong khí quản được nối với máy phụ thở ở nhịp là 125-150 nhịp/phút, thể tích 10,3ml
- Sát trùng vùng phẫu thuật bằng betadine 70% ethanol (lặp lại 3 lần)
- Để tránh sự lây nhiễm, sử dụng tấm phẫu thuật che phủ các phần còn lại của chuột, chỉ

phơi vùng phẫu thuật dưới đèn soi của kính hiển vi soi nổi
- Tạo vết mổ từ gần chóp lồng ngực đến xương sườn thứ 2, sử dụng banh vết mổ để giữ vết
mổ
- Kẹp đầu cong 400 được sử dụng để mở vùng giáp và tách mô mỡ đến vùng mạch vành
- Sử dụng chỉ lụa 0,6 và kim cong gauge 271/2 để thắt mạch, tạo hai vết thắt hờ tại hai vị trí
gần nhau trên mạch
- Lấy cái banh vết mổ ra, đồng thời thắt nhíp thở ra tại ổng thở 2 lần nhằm bơm căng lồng
ngực.
- Khâu vết mổ vùng cơ với chỉ prolene 6,0
- Khâu vùng da mổ với chỉ prolene 6,0
- Sau khi khâu vết thương, giảm đau cho chuột bằng buprenorphine (0,1 mg/kg) vào vùng
bụng. Nếu quan sát thấy có sự mất nước, bổ sung bằng nước mối sinh lý bằng cách tiêm
vào vùng bụng
- Sự phục hồi trình trạng gây mê được giảm dần bằng cách cho chuột nằm sấp và nhẹ
nhàng rút ống thở ra khi thấy có sự thở bình thường tự nhiên được phục hồi
- Chuột được đặt nằm ngửa trở lại và đặt vào buồng nhiệt
Quy trình 2: Thu nhận tế bào đơn nhân bằng Ficoll từ máu cuống rốn [48]
- Pha loãng máu cuống rốn với PBSA với tỉ lệ 1:1
- Hút 5 ml Ficoll-Hypaque vào ống li tâm 15 ml
- Nhẹ nhàng đặt 10 ml hỗn hợp PBSA và máu cuống rốn lên trên lớp Ficoll-Hypaque
(1,077 g/ml)
- Li tâm ở 450 g trong 20-30 phút ở nhiệt độ phòng
- Sau khi li tâm, xuất hiện một lớp tế bào đơn nhân nằm tại lớp giữa, ngay trên lớp mặt của
Ficoll-Hypaque
- Sử dụng pipette Pasteur chuyển lớp giữa chứa tế bào đơn nhân vào ống li tâm mới
- Rửa tế bào với PBSA và li tâm ở tốc độ 200 g trong 10 phút
- Đổ bỏ dịch nổi, tái huyền phù cặn tế bào trong PBSA và lặp lại quy trình rửa
- Cuối cùng, tái huyền phù tế bào trong một thể tích môi trường
Quy trình 3: Nuôi cấy chọn lọc và tăng sinh tế bào bám dính [109]
- Tế bào đơn nhân được nuôi trong môi trường IMDM, với 2 mM L-glutamine, bổ sung

với 20% FBS, 1% Antibiotic-antimycotic 100X ở mật độ 106 tế bào/cm2 , 370 C, 5% CO 2
trong tủ ấm
- Thay môi trường mỗi 7 ngày đến khi tế bào có hình dạng như nguyên bào sợi và đạt mật
độ khoảng 60-70%
- Tiến hành cấy chuyền tế bào, nuôi tế bào ở bình mới với mật độ 105 tế bào/bình nuôi
Quy trình 4: Biệt hóa tế bào bám dính [95]
Biệt hóa thành tế bào xương:
- Tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung Dexamethazone: 50 μM,
Acid ascorbic: 50 μM, β- glycerophosphate: 10 mM, 10% FBS và 1 % antibiotic
-

8


Môi trường biệt hóa được thay 2 lần trong một tuần và tiến hành nuôi cấy trong 2
tuần
- Sau đó, các tế bào biệt hóa được cố định bằng methanol trong 10 phút ở nhiệt độ
phòng và nhuộm với Alizarin red trong 5 phút ở nhiệt độ phòng
Biệt hóa thành tế bào mỡ:
- Tế bào được cảm ứng bằng môi trường cảm ứng biệt hóa mỡ DMEM bổ sung
Dexamethazone: 10 μM, Insulin: 10 μg/ ml, Indomethacine: 200 μM, Isobutylmetylxanthane: 0.5 mM, 10 % FBS
- Môi trường biệt hóa được thay 2 lần trong một tuần. Thời gian tiến hành cảm ứng biệt
hóa là 1 tuần
- Các tế bào này được cố định bằng methanol trong 45 phút ở nhiệt độ phòng và tiến
hành nhuộm với thuốc nhuộm Oil Red
Quy trình 5: Xác định marker bề mặt của tế bào gốc trung mô bằng kĩ thuật flow
cytometry [93]
- Các tế bào gốc trung mô ứng viên sau 3 lần cấy chuyền được xác định sự biểu hiện các
marker bề mặt CD13, CD14, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD117, CD105,
CD106, CD166, HLA-DR

- Các tế bào sau khi phát triển phủ kín chừng 70% bề mặt bình nuôi được xử lí với
trypsin/EDTA 0,25% và thu nhận tế bào đơn
- Cứ mỗi 106 tế bào được sử dụng để nhuộm với kháng thể trong 30 phút, trong tối, ở 40 C.
- Sau đó, tế bào được rửa 2 lần bằng FACSflow để loại bỏ kháng thể thừa và tái huyền phù
tế bào trong 500 µl FACSflow
- Mẫu được phân tích bằng máy FacsCalibur (BD Bioscience). Tất cả các dữ liệu được
phân tích bằng phần mềm CellQuest Pro ở 30.000 tế bào
Quy trình 6: Xác định khả năng tự làm mới của tế bào gốc trung mô bằng kĩ thuật
colony assay
- 100 tế bào được nuôi trong đĩa nuôi cấy tế bào 35 mm trong 7 ngày
- Sau đó, đĩa nuôi được tiến hành nhuộm với thuốc nhuộm Crytal violet trong 10 phút với
methanol
- Các colony được đếm
- Thử nghiệm này được lặp lại 3 lần
Quy trình 7: Nuôi cấy chọn lọc và tăng sinh tế bào tiền thân nội mô [88, 94]
- Tế bào đơn nhân được nuôi trong môi trường EBM, bổ sung với 10% FBS, 1%
Antibiotic- mycobiotic 100X, mật độ 106 tế bào/cm2, 370 C, 5% CO 2 trong tủ ấm
- Sau 2 ngày, quần thể tế bào không bám nổi lên được thu nhận, li tâm 3000 vòng/phút
trong 5 phút để thu cặn tế bào
- Cặn tế bào được tái huyền phù và được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường tăng trưởng
cEGM-2 (EGM-2 được bổ sung với Bulletkit nhân tố tăng trưởng toàn bộ, 10% FBS, 1%
penicillin (10.000 U/ml), streptomycin (10000 ug/ml), am photericin (25 ug/ml), với chế
độ thay môi trường ½ trong 4 ngày
-

Quy trình 8: Xác định marker bề mặt của tế bào gốc nội mô bằng kĩ thuật flow
cytometry [85, 114, 115]
- Các tế bào tiền thân nội mô ứng viên sau 3 lần cấy chuyền được xác định sự biểu hiện các
marker bề mặt CD34, CD133

9


Các tế bào sau khi phát triển phủ kín chừng 70% bề mặt bình nuôi được xử lí với
trypsin/EDTA 0,25% và thu nhận tế bào đơn
- Cứ mỗi 106 tế bào được sử dụng để nhuộm với kháng thể trong 30 phút, trong điều kiện
tối, 40 C
- Sau đó, tế bào được rửa 2 lần bằng FACSflow để loại bỏ kháng thể thừa và tái huyền phù
tế bào trong 500 µl FACSflow
- Mẫu được phân tích bằng máy FacsCalibur (BD Bioscience). Tất cả các dữ liệu được
phân tích bằng phần mềm CellQuest Pro ở 30.000 tế bào
- Tế bào gốc nội mô phải dương tính với cả 2 marker CD34+/CD133+
Quy trình 9: Biệt hóa thành tế bào giống cơ tim [68]
- Tế bào sau 3 lần cấy chuyền được tiền cảm ứng biệt hóa ở mật độ 50.000 tế bào/cm2 bằng
môi trường cảm ứng biệt hóa bổ sung 10 μM 5-azacytidine
- Các tế bào được cảm ứng trong 24 giờ. Sau đó, chúng được thay bằng môi trường không
bổ sung tác nhân cảm ứng biệt hóa nuôi trong 7 ngày và tiến hành tái cảm ứng tế bào
trong 24 giờ
- Sau 2 lần cảm ứng, tế bào được nuôi trong môi trường nuôi, đến ngày 35 thu nhận tế bào
để phân tích biểu hiện gen
Quy trình 10: Tách RNA tổng số [74, 79]
Quy trình tách RNA tổng số được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sigma
- Thu toàn bộ huyền phù tế bào cho vào eppendorf 1,5 ml, Ly tâm thu cặn
- Hòa lẫn với 0,25 ml nước có xử lý DEPC
- Cho 0,75 ml Trizol vào (5-10 x 106 tế bào cho mỗi 0,75 ml Trizol)
- Ly tâm 12,000 g 10 phút ở 4o C. Thu phần dịch nổi
- Lắc trong15s, để ở nhiệt độ phòng 5 phút
- Thêm 0,2 ml chloroform. Lắc trong 15 giây thấy một huyền phù màu hồng để nhiệt độ
phòng trong 10 phút . Sự phân tách bắt đầu xảy ra (xảy ra nhanh hơn nếu để trong đá)
 Kết tủa RNA

- Chuyển pha nước vào một tube sạch, thêm 0,5 ml isopropanol mỗi 0,75 ml Trizol sử
dụng. Để mẫu ở nhiệt độ phòng 5-10 phút
- Ly tâm 12.000 g trong 8 phút ở 4-250 C. RNA tủa sẽ hình thành cặn ở bên và đáy ống
 Rửa RNA
- Loại bỏ dịch nổi và rửa cặn RNA bằng 1ml 75% ethanol. Vortex và ly tâm ở 7.500 g
trong 5 phút ở 4-250 C. Nêu cặn RNA trôi nổi hay chất đống ở bên thì rửa bằng ethanol
75%
- Mẫu có thể trữ lạnh trong ethanol ở 4o C trong 1 tuần và 1 năm ở -20o C
 Hòa tan RNA
- Làm khô nhanh cặn RNA trong 5-10 phút để khô tự nhiên hay bằng chân không. Không
để khô hoàn toàn vì như vậy sẽ rất khó hoà tan
- Hoà tan bằng nước DEPC để nóng 55-60o C trong 10-15 phút rồi cho vào đá 5 phút
 Định lượng RNA
- Nhuộm ethidium bromide RNA trên agarose cho thấy hai vạch ưu thế của RNA ribosome
nhỏ 2kb và lớn 5kb, RNA phân tử nhỏ 0,1- 0,3kb và mảnh RNA phân tử lớn 7-15 kb
Quy trình 11: RT-PCR
Nghiên cứu này sử dụng bộ kit RT-PCR one tube Acess Quick của Promega. Trong bộ kit này,
RNA tổng số sau khi thu nhận, định lượng được sử dụng đi chạy RT-PCR. Kit này vừa thực hiện
phản ứng chuyển RNA thành cDNA và sau đó khuếch đại theo chu trình PCR bình thường.
-

10


Hỗn hợp phản ứng RT – PCR
- Phản ứng RT-PCR được tiến hành theo hướng dẫn của bộ kit Acess Quick của Promega
- Hỗn hợp phản ứng như sau:
- Phản ứng 50 μl:
- Master Mix: 25 μl (chứa dNTP, oligo T primer, hexamer random primer, Taq
polymerase, và PCR buffer)

- Primer xuôi 1,5 μl (100 pmol)
- Primer ngược: 1,5 μl (100 pmol)
- RNA template: 2 μl
- Nước: 20 μl
- AMV: 1 μl
Chu trình RT-PCR:
- 450 C trong 45 phút ( phản ứng phiên mã ngược)
- 940 C trong 2 phút
- 680 C trong 5 phút
- 40 C trong 5 phút
Quy trình 12: Đánh dấu tế bào với PKH26 hay Vybrant Dil [103]
- Tế bào tiền cảm ứng với 5 azacytidine/tế bào nội mô được đánh dấu bằng kĩ thuật đánh
dấu trên màng tế bào với một chất phát huỳnh quang đỏ PKH26 (Kit MINI26 cell linker)
hay Vybrant Dil trước khi tiến hành cấy ghép
- Tế bào được tiền xử lý bằng dung dịch Diluent C, sau đó tiến hành nhuộm với
PKH26/Vybrant Dil ở 25o C trong 5 phút. Sau đó tế bào được rửa lại bằng FBS 1 lần và
môi trường 3 lần
- Các tế bào đã được đánh dấu được kiểm tra bằng kính hiển vi huỳnh quang xác định mật
độ trước khi tiến hành cấy ghép trên mô hình chuột suy tim
Quy trình 13: Ghép tế bào vào vùng tim thiếu máu [22, 26, 27]
- Sử dụng phác đồ cyclosporine A 3 mg/kg/ngày tiêm vào tĩnh mạch đuôi 1 tuần trước khi
ghép và phác đồ 3 mg/kg cách 2 ngày 1 lần trong suốt thời gian khảo sát
- Tế bào đã đánh dấu được huyền phù trong PBS ở thể tích tiêm là 30 µl/lần tiêm với mật
độ cần thiết /lần tiêm/con
- Phương pháp ghép: ghép tế bào trực tiếp vào vùng bệnh lý
Quy trình 14: Sự tăng huyết áp và rối loạn hoạt động chức năng của tim [67, 82]
- Điện tâm đồ được đo ở vùng ngực trước khi tiến hành cảm ứng bằng thuốc và mỗi tháng
sau khi xử lý thuốc
- Chuột được gây mê với 1,5% isofluorane cho tới khi nhịp tim ổn định ở 400-500
nhịp/phút

- Sử dụng hệ thống vi siêu âm độ phân giải cao (Vevo770, VisualSonics Inc, Toronto,
Canada, 40 MHz probe) để quan sát hình ảnh tim
Quy trình 15: Đo kích thước vùng nhồi máu và vùng hư hại [83, 110, 126]
- Chuột được tiêm 100 U heparin theo đường bụng. 20 phút sau tiêm thêm sodium
pentobarbitone (300 mg/kg) theo đường tĩnh mạch. Khi chuột đã hoàn toàn bị mê, phẫu
thuật mở ngực
- Quá trình phẫu thuật được thực biện bằng cách rạch qua màng và tới trục giữa của 2 bên
xương sườn. trong suốt quá trình này, chuột được cung cấp oxy qua ống thở. Đặt chỉ ở
ngay dưới động mạch chủ. Thắt động mạch chủ trước lại. Đặt ống thông theo vào động
mạch và thắt lại cho chắc. Sau đó thu nhận quả tim
11


Thêm 20 ml đệm heparine theo đường ống thông để rửa và loại máu trong tim. Tiếp tục
thêm 5 ml 1% triphenyltetrazolium chloride (TTC) trong dung dịch đệm phosphate
(Na2PO4 45,1 mM, NaH2PO4 3,3 mM, pH 7,8) theo đường ống thông. Đặt quả tim trong
ống Falcon 50 ml chứa sẵn 5 ml TTC, ủ ở 370C. Sau 10 phút lấy tim ra
- Mối thắt LAD được làm ướt lại nhờ phần ống thông PE-10. Để giới hạn vùng hư hại, 5
ml dung dịch 1% Evan Blue trong 0,9% muối được sử dụng để làm đầy thông qua ống
thông trong khoảng 1-2 phút. Trong suốt quá trình làm ướt, muối được rửa khắp mặt
trong của tim để cản bề mặt nhuộm. Tim sau đó được đặt ngập trong 1 ml muối đệm
trước khi loại bỏ ống thông. Sau khi làm khô điểm, cân tim và đông lạnh ở -800 C để cắt
- Việc giải đông tim được tiến hành bằng cách cắt thành các miếng 100 Am sau khi cố
định trong 2,5% gluteraldehyde và nhận chìm trong dung dịch 5% agarose. Sau đó cố
định trong 10% formaldehyde trong 1 giờ và rửa lại với PBS
- TTC được nhỏ xuống để đánh dấu vùng nhồi máu. Quan sát sự có mặt của thuốc nhuộm
TTC trong vùng không nhồi máu dưới đèn UV
Quy trình 16: Đánh giá quá trình apoptosis các tế bào cơ tim [29, 36]
Quá trình apoptosis của tế bào cơ tim được đánh giá bằng bộ kit annexin V-FitC apoptosis
detection của nhà sản xuất Sigma.

- Tế bào cơ tim được thu nhận và tách thành tế bào đơn sử dụng trypsin/EDTA 0,25%
- Rửa tế bào 2 lần với PBS
- Tái huyền phù tế bào trong 1X dung dịch đệm ở mật độ 1 x 106 tế bào/ml
- Thêm 500 μl huyền phù tế bào vào ống test
- thêm 5 μl annexin C-FITC và 10 l propidium iodide vào mỗi huyền phù tế bào
- ủ ống ở nhiệt độ phòng trong đúng 10 phút, tránh ánh sáng
- Xác định sự phát huỳnh quang của tế bào được đánh giá trực tiếp bằng hệ thống flow
cytometer. Các tế bào ở trạng thái apoptosis chỉ bắt màu với annexin V-FITC. Các tế bào
sống sẽ không nhuộm với cả annexin và V-FITC lẫn propidium iodide. Các tế bào
necrosis sẽ nhuộm màu cả 2
Quy trình 17: Đánh giá sự hoạt hóa các nhân tố tự tiết và cận tiết bao gồm sự giải
phóng các nhân tố tăng trưởng và cytokine bằng kĩ thuật ELISA [33, 34, 39, 87]
- Đĩa 96 giếng được phủ bằng kháng nguyên nồng độ 40 μg/mL đã được pha loãng 1/100
trong dung dịch đệm phủ đĩa với thể tích 100 μL/giếng và được ủ qua đêm ở nhiệt độ
phòng. Đĩa được rửa 3 lần bằng dung dịch rửa
- Tiếp đó, khóa đĩa bằng dung dịch đệm khóa đĩa với thể tích 150 μL/giếng và ủ đĩa 1 giờ ở
nhiệt độ phòng
- Tiếp tục rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch rửa. Huyết thanh chuột nhắt trắng được pha loãng
từ 1/100, 1/200 ... 1/6400 và cho vào các giếng, mỗi giếng 100 μL
- Đĩa được ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng trước khi được rửa 3 lần bằng dung dịch rửa
- Sau đó, dung dịch cộng hợp (kháng thể kháng IgG chuột có gắn men peroxidase) đã được
pha loãng 1/5000 trong dung dịch đệm PBS tiếp tục được bổ sung vào các giếng với thể
tích 100 μL/giếng
- Ủ đĩa trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng trước khi rửa đĩa 5 lần bằng dung dịch rửa. Tiếp đó,
cơ chất TMB được bổ sung vào đĩa với thể tích 100 μL/giếng trong tối
- Sau 10 phút, ngừng phản ứng bằng dung dịch H2 SO 4 1M với thể tích 50 μL/ giếng trước
khi tiến hành đo màu bằng máy quang phổ trắc quang ở bước sóng 450 nm
Quy trình 18: Tách tế bào lưu dấu bằng kĩ thuật FACS [61, 72]
- Vùng mô cơ tim của chuột sau khi ghép ở các mốc thời gian sẽ được thu nhận, phân tách
-

12


thành tế bào đơn bằng trypsin/EDTA. Quần thể tế bào đơn được nhận diện sự tồn tại của
tế bào lưu dấu bằng kĩ thuật flow cytometry
- Quần thể tế bào lưu dấu nếu tồn tại với lượng 5% quần thể có thể được tách ra khỏi quần
thể bằng hệ thống tách tube catcher based cell sorter gắn trên máy flow cytometter
Quy trình 19: Tách tế bào lưu dấu bằng vi thao tác
- Sau khi nhận diện sự tồn tại của tế bào lưu dấu trong quần thể tế bào tim, nếu quần thể tế
bào tồn tại ít hơn 5% sẽ được thu nhận bằng kĩ thuật vi thao tác
- Sử dụng hệ thống vi thao tác cho tế bào lơ lửng của Eppendorf cùng với kính hiển vi
huỳnh quang có thể thu nhận tế bào quan tâm. Dưới bước sóng thích hợp, tế bào lưu dấu
sẽ phát huỳnh quang. Dùng hệ thống hút áp lực của Eppendorf để hút tế bào quan tâm.
Các tế bào này sẽ được phân tích theo kiểu phân tích tế bào đơn
6. KẾT QUẢ DỰ KIẾN ĐẠT ĐƯỢC
TT
Tên sản phẩm
1 Quy trình phân lập và tăng
sinh tế bào gốc trung mô từ
máu cuống rốn người

Yêu cầu khoa học cần đạt
Tế bào thu nhận từ quy trình đạt một số chỉ tiêu
sau:
- Tế bào thu nhận được biểu hiện các marker:
CD13. CD44. CD73. CD105. CD106. CD166
và không biểu hiện: CD34. CD45. CD14.
HLA-DR. Quần thể tế bào được đánh giá biểu
hiện bằng kĩ thuật flow cytometry: tế bào cho

là dương tính với marker nếu có ít nhất 50%
quần thể biểu hiện. Tế bào được cho là âm tính
nếu có ít hơn 5% biểu hiện
- Tế bào có khả năng biệt hóa thành tế bào mỡ,
xương
- Các tế bào có khả năng hình thành các tập
đoàn khi nuôi cấy ở mật độ thấp

2

Quy trình phân lập và tăng
sinh tế bào tiền thân nội mô
từ máu cuống rốn người

Tế bào sau khi thu nhận đạt các chỉ tiêu sau:
- Có kiểu hình miễn dịch CD34+/CD133+
trên 90% quần thể được phân tích bằng
flow cytometry
- Các tế bào có khả năng hình thành các tập
đoàn khi nuôi cấy ở mật độ thấp

3

Quy trình biệt hóa tế bào
gốc trung mô từ máu cuống
rốn người thành tế bào

Tế bào sau khi biệt hóa đạt các chỉ tiêu sau:
- Biểu hiện các gen liên quan đến kiểu hình
cơ tim như: cardiac actin, cardiac myosin,

cardiac troponin được phát hiện bằng kĩ
thuật RT-PCR hay realtime RT-PCR
- Số lượng tế bào biểu hiện dương tính với
các marker liên quan đến cơ tim chiếm
65% quần thể tế bào sau khi biệt hóa được
13


đánh giá bằng kĩ thuật flowcytometry
4

Quy trình cấy ghép tế bào
điều trị bệnh mạch vành
thực nghiệm

5

Bảng phân tích kết quả hiệu
quả của các phác đồ điều trị

6

Báo cáo phân tích vai trò
của tế bào cấy ghép trong
điều trị bệnh mạch vành
thực nghiệm
Bài báo được đăng trên các
tạp chí, hội nghị trong và
ngoài nước

7

Quy trình rõ ràng, cụ thể từng bước (có video kèm
theo)
Chuột được điều trị bằng liệu pháp này có hiệu
quả hồi phục các chỉ tiêu:
- Số chuột sống sót sau khi điều trị so với
chuột đối chứng sau 30 ngày là 60%
- Số chuột sống sót sau khi điều trị so với
chuột đối chứng sau 15 ngày là 90%
- Vùng tim thiếu máu giảm ít nhất 50%
- Huyết áp, nhịp tim về ngưỡng bình thường
ở 60% chuột sau 30 ngày điều trị
- Xuất hiện mạch máu mới ở vùng tim thiếu
máu cục bộ
 Bảng phân tích kết quả phải phân tích ít nhất
trên 5 phác đồ điều trị cùng với các nghiệm
thức đối chứng
 Tất cả các số liệu phải được phân tích, xử lí
thống kê với độ tin cậy ít nhất là 95%
 Bảng phân tích kết quả phải kèm theo với kết
quả thô và nhật kí cho từng chuột khảo sát
 Tất cả các số liệu phải được phân tích, xử lí
thống kê với độ tin cậy ít nhất là 95%
 Bảng phân tích kết quả phải kèm theo với kết
quả thô
 Chấp nhận đăng

7. TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI
- Mô hình động vật : Có khá nhiều mô hình động vật bệnh lý về động mạch đã được

nghiên cứu và xây dựng như mô hình bệnh suy tim, thiếu máu cục bộ cơ tim, tắc nghẽn
động mạch vành, thiếu máu cục bộ chi bằng nhiều phương pháp khác nhau như hóa học,
vật lý… Trên cơ sở nền tảng căn bản này, nhóm nghiên cứu tiến hành nghiên cứu và xây
dựng mô hình động vật suy tim và bệnh động mạch vành bằng phương pháp phẫu thuật
và hóa chất. Đây là những phương pháp cơ bản đạt hiệu quả cao trong việc tạo mô hình
bệnh lý trên động vật.
- Nguồn tế bào gốc: nghiên cứu này sử dụng nguồn tế bào gốc từ máu cuống rốn. Tế bào
gốc từ máu cuống rốn dồi dào, việc thu nhận không gây xâm lấn cơ thể là thuận lợi cơ
bản của nguồn tế bào gốc này. Hơn nữa, với xu hướng bảo quản tế bào gốc từ máu cuống
rốn ngày càng phổ biến trên thế giới và ở nước ta, việc khai thác ứng dụng, sử dụng
nguồn tế bào gốc từ máu cuống rốn là hướng đi phù hợp với xu hướng thế giới và nhu
cầu của xã hội.

14


-

-

Liệu pháp : nghiên cứu này sử dụng 2 nguồn tế bào gốc chính có trong máu cuống rốn
người : tế bào gốc trung mô và nội mô. Sử dụng phối hợp 2 chiến lược điều trị nguyên
nhân và triệu chứng hy vọng sẽ có kết quả tốt hơn các liệu pháp hiện nay. Tế bào gốc nội
mô với khả năng hình thành mạch máu mới là đối tượng cần sử dụng cho điều trị tình
trạng tắt nghẽn mạch vành (điều trị nguyên nhân gây bệnh thiếu máu tim cục bộ), tế bào
gốc trung mô với khả năng biệt hóa thành tế bào cơ tim là đối tượng cần sử dụng cho tình
trạng suy tim do tế bào cơ tim bị hoại tử (điều trị triệu chứng).
Phương pháp nghiên cứu : đề tài sử dụng phương pháp nghiên cứu hiện đại, phối hợp
đánh giá tác động gián tiếp thông qua các biểu hiện sinh lý, trực tiếp thông qua các biểu
hiện mô học, tế bào học, sự biểu hiện gen. Nghiên cứu còn sử dụng các kĩ thuật đánh dấu

theo dõi sự tồn tại, di cư, kĩ thuật phân tích tế bào đơn, thu nhận tế bào đơn… và nhiều kĩ
thuật tiên tiến hiện nay trong nghiên cứu tế bào gốc.

8. ĐỊA ĐIỂM DỰ KIẾN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
Nơi được chọn để thực hiện đề tài là PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc, Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên Tp.HCM.
Điện thoại: 08 38397719
Website: www.ptntebaogoc.com. www.vinastemcelllab.com
Địa chỉ: 227. Nguyễn Văn Cừ. P.4 Quận 05 Tp HCM
Lý do lựa chọn cơ sở đào tạo này vì trường Đại học Khoa học Tự nhiên là một trong những
trường đại học hàng đầu Việt Nam, có nhiều ưu thế trong lĩnh vực Sinh học. Thêm vào đó, PTN
Tế bào Gốc của trường được trang bị đầy đủ các trang thiết bị nghiên cứu hiện đại đáp ứng được
các yêu cầu thực hiện nghiên cứu của đề tài.
9. DỰ KIẾN VIỆC LÀM VÀ NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
Sau khi tốt nghiệp, người dự tuyển dự kiến sẽ tiếp tục công tác tại PTN Tế bào Gốc, tham gia
thực hiện các dự án nghiên cứu trong lĩnh vực chuyên môn, giảng dạy và viết giáo trình.
Khi nghiên cứu này được hoàn thành, các kết quả nghiên cứu sẽ được xem xét, đánh giá để tiến
đến việc liên kết, hợp tác với các bệnh viện trong thử nghiệm lâm sàng trên người.
10. KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG VÀ PHƯƠNG THỨC CHUYỂN GIAO KẾT QUẢ NGHIÊN
CỨU
10.1. Khả năng về thị trường
Bệnh tim mạch đặc biệt bệnh mạch vành ngày càng tăng ở các nước phát triển. Nhu cầu sử dụng
các liệu pháp trị liệu của người dân ngày càng nhiều.
Nếu như trên thế giới, các bệnh lý tim mạch và đột quỵ là kẻ giết người nguy hiểm nhất, cướp đi
mạng sống của 17,5 triệu người/năm thì tại Việt Nam, theo số liệu thống kê của Viện tim mạch
Việt Nam, tỉ lệ mắc các bệnh lý tim mạch và đột quỵ ngày càng tăng và đang ở mức đáng báo
động. Chẳng hạn ở khu vực miền Bắc, nếu như năm 1960 chỉ có 2% người trên 25 tuổi bị bệnh
cao huyết áp thì năm 2003, tỉ lệ này đã tăng lên 8 lần. Đặc biệt riêng khu vực nội thành Hà Nội,
tỉ lệ người trên 25 tuổi bị cao huyết áp lên tới 23,3%, nghĩa là trong số 100 người trên 25 tuổi
sống ở nội thành Hà Nội thì có tới 23 người bị cao huyết áp.

10.2. Khả năng về ứng dụng các kết quả nghiên cứu vào sản xuất kinh doanh
Nghiên cứu này là nghiên cứu điều trị thực nghiệm. Kết quả nghiên cứu là tiền đề khoa học quan
trọng cho việc triển khai thử nghiệm trên người.
Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp một liệu pháp ứng viên mới cho việc điều trị bệnh mạch vành
trên người.

15


10.3. Phương thức chuyển giao
Kết quả nghiên cứu được chuyển giao cho các cơ sở nghiên cứu, cơ sở điều trị ở dạng quy trình
công nghệ và đào tạo kĩ thuật.
10.4. Phạm vi và địa chỉ (dự kiến) ứng dụng các kết quả của Đề tài
Kết quả nghiên cứu là tiền để cho các cơ sở nghiên cứu tiến hành các nghiên cứu sâu hơn, các cơ
sở ứng dụng thử nghiệm trên người. Các cơ sở như: Các Trường Đại học, các Viện nghiên cứu,
Bệnh viện và cơ sở y tế đều có thể ứng dụng kết quả nghiên cứu này.
11. TÁC ĐỘNG VÀ LỢI ÍCH MANG LẠI CỦA KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
11.1. Đối với lĩnh vực KH&CN có liên quan
Công nghệ sinh học Người và Động vật là một lĩnh vực còn non trẻ ở Việt Nam, nghiên cứu này
sẽ tạo điều kiện để chúng ta có thể hòa nhập với xu hướng nghiên cứu của các nước bạn. Nghiên
cứu này không chỉ đòi hỏi về chuyên môn mà còn cả về mặt kĩ thuật công nghệ. Tại Việt Nam,
đây là hướng nghiên cứu mới và đầy tiềm năng. Trên thế giới, nghiên cứu này mang tính tiếp cận
và sáng tạo. Kết quả nghiên cứu hy vọng mang nhiều tính mới ở cả trong và ngoài nước.
11.2. Đối với tổ chức chủ trì và các cơ sở ứng dụng kết quả nghiên cứu
Đối với tổ chức chủ trì: việc tiếp cận nghiên cứu dạng này góp phần đào tạo về mặt kĩ thuật
chuyên môn cho các cán bộ.
Đối với cơ sở ứng dụng: sẽ có thêm một phương pháp điều trị mới và có thể tiếp cận với công
nghệ tế bào ứng dụng trong y học phục hồi.
11.3. Đối với kinh tế - xã hội và môi trường
Nghiên cứu sẽ hứa hẹn một phương pháp điều trị mới hiệu quả cho người bệnh. Người bệnh sẽ

được giảm nguy cơ bị tai biến dẫn đến mất một số chức năng vận động và trở thành gánh nặng
cho gia đình và xã hội. Ngoài ra, cách thức trị liệu đơn giản của phương pháp này ít gây xâm lấn
cho người bệnh, đồng thời bệnh nhân cũng không phải tốn quá nhiều chi phí cho các cuộc đại
phẫu thuật để chữa bệnh như hiện nay. Như vậy, nghiên cứu này góp phần mang lại nhiều lợi ích
cho bệnh nhân, gia đình và xã hội.
12. TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Đoàn Chính Chung, Phạm Văn Phúc, Phan Kim Ngọc. Cảm ứng biệt hóa tế bào gốc
trung mô máu cuống rốn người thành tế bào cơ tim bằng 5-azacytidine. Hội nghị Miễn
dịch học, Hà Nội, 2010
2. Lê Thế Trung. Tế bào gốc-những triển vọng trong công nghệ tái tạo mô. TC Thông tin y
dược. - 2005 . - no. 4 . - tr. 2-4 . -ISSN 0868-3891
3. Lê Văn Đông, Phạm Mạnh Hùng. Công nghệ tế bào gốc và tạo clôn. TC Thông tin y
dược. - 2006 . - no. 8 . - tr. 4-11 . -ISSN 0868-3891
4. Mai Mạnh Tuấn, Chu Quốc Trường, Trần Thanh Loan, Bùi Thị Nga, Nguyễn Thông,
Phan Toàn Thắng. Kết quả bước đầu sử dụng tế bào gốc trung mô dây rốn trong điều trị
vết thương. TC Nghiên cứu y dược học cổ truyền Việt Nam. - 2007 . - no. 18 . - tr. 2733
5. Nguỵ Hữu Tâm. Cuộc cách mạng trong nghiên cứu tế bào gốc . TC Thông tin & Phát
triển. - 2008 . - no. 5 . - tr. 21-22 . -ISSN 1859-2678
6. Nguyễn Mạnh Khánh, Nguyễn Thị Thu Hà, Nguyễn Tiến Bình, Lý Tuấn Khải, Trương
Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Thanh Bình, Ngô Văn Toàn. Ghép tế bào gốc tuỷ xương tự
thân điều trị khớp giả thân xương chày. TC Nghiên cứu y học. - 2007 . - no. 104 . - tr. 48 . -ISSN 0868-202X
7. Nguyễn Mạnh Khánh, Nguyễn Tiến Bình, Nguyễn THị Thu Hà. Tế bào gốc và khả năng
16


ứng dụng trong điều trị . TC Y học Việt Nam. - 2007 . - no. 7 . - tr. 1-6 . -ISSN 06863174
8. Nguyễn Thị Thu Hà. Tế bào gốc và khả năng sử dụng tế bào gốc trong điều trị . TC Y
học Việt Nam. 2004 no. 14 tr. 3-20 . -ISSN 0686-3174
9. Nguyễn Trung Chính. Một số kinh nghiệm ban đầu về điều trị huy động tế bào gốc tạo

máu ngoại vi tại bệnh viện trung ương quân đội 108 . Nội khoa. - 2008 . - no. 2 . - tr. 2028 . -ISSN 1859-1884
10. Phạm Văn Phúc, Đặng Hoàng Lâm, Trương Hải Nhung, Phan Kim Ngọc (2008). Thu
nhận tế bào gốc đa tiềm năng từ máu cuống rốn người. Tạp chí Y dược học Quân sự,
33(2): 119-125.
11. Phạm Văn Phúc, Nguyễn Đăng Khoa, Trần Bảo Kiếm, Phan Kim Ngọc (2008). Nghiên
cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người thành tế bào giống thần kinh,
cơ tim và tiết insulin bằng dịch chiết. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6(4): 415-421.
12. Phạm Văn Phúc, Nguyễn Thanh Tâm, Vương Thị Hồng Nhung, Dương Thị Bạch Tuyết,
Phan Kim Ngọc (2009). Khảo sát tác động của tốc độ làm lạnh và nồng độ huyết thanh
lên tỉ lệ sống và tính gốc của tế bào gốc trung mô sau khi đông lạnh. Tạp chí Phát triển
Khoa học và Công nghệ: 12(9): 12-23.
13. Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trần Lê Bảo Hà (2007). Thu nhận và biệt hóa tế bào
gốc trung mô từ máu cuống rốn người. Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 10
(12): 5-10.
14. Trần Thị Mỹ Dung, Đỗ Trung Phấn, Nguyễn Quang Tùng, Phạm Quang Vinh, Nguyễn
Anh Trí. Kết quả nghiên cứu quy trình giảm khối lượng hồng cầu máu cuống rốn sử dụng
cho bảo quản dài ngày tế bào gốc tạo máo. TC Nghiên cứu y học. - 2007 . - no. 104 . tr. 1-3 . -ISSN 0868-202X
15. Trần Thị Mỹ Dung, Nguyễn Quang Tùng, Đỗ Trung Phấn. Nghiên cứu xây dựng quy
trình thu gom tế bào gốc tạo máu từ máu cuống rốn đạt hiệu quả cao . TC Nghiên cứu y
học. - 2007 . - no. 3 . - tr. 69-72 . -ISSN 0868-202X
Tài liệu tiếng Anh
16. A. Zampetaki, J. P. Kirton, and Q. Xu. Vascular repair by endothelial progenitor cells.
Cardiovasc Res 2008; 78(3): 413 - 421.
17. Essential role of endothelial nitric oxide synthase for mobilization of stem and progenitor
cells. Nature Med 2003; 9: 1370–1376
18. Alexander KP, Chen AY, Roe MT, et al. Excess dosing of antiplatelet and antithrombin
agents in the treatment of non-ST-segment elevation acute coronary syndromes. JAMA.
2005; 294:3108–3116.
19. Anversa P, Leri A, Kajstura J. Cardiac regeneration. J Am Coll Cardiol 2006; 47:1769–
1776.

20. Asahara T, Murohara T, Sullivan A et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells
for angiogenesis. Science 1997; 275: 964–967
21. Asahara T. Cell therapy and gene therapy using endothelial progenitor cells for vascular
regeneration. Handb Exp Pharmacol 2007; 181-194.
22. Assmus B, Honold J, Schachinger V, et al. Transcoronary transplantation of progenitor
cells after myocardial infarction. N Engl J Med. 2006; 355:1222–1230
23. Badorff C, Brandes RP, Popp R et al. Transdifferentiation of blood-derived human adult
endothelial progenitor cells into functionally active cardiomyocytes. Circulation 107:
1024–1032
17


24. Bartosz Balana1, Cecilia Nicoletti, Ihor Zahanich1, Eva M Graf , Torsten Christ, Sabine
Boxberger,Ursula Ravens. “5-Azacytidine induces changes in electrophysiological
properties of human mesenchymal stem cells”. Cell Research 2006;16: 949-960.
25. Beltrami AP, Barlucchi L, Torella D et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and
support myocardial regeneration. Cell 2003; 114: 763–776
26. Beyrlea, Klaus-Michael Debatinb, Johannes Waltenbergera , Christian Beltingerb.
Endothelial progenitor cell culture and differentiation in vitro: a methodological
comparison using human umbilical cord blood. Cardiovascular Research 2003; 58:
478–486
27. Botta R, Gao E, Stassi G, Bonci D, Pelosi E, Zwas D, et al. Heart infarct in NOD–SCID
mice: therapeutic vasculogenesis by transplantation of human CD34+ cells and low dose
CD34+KDR+ cells. FASEB J 2004;18(12): 1392–4.
28. Bradley EH, Herrin J, Wang Y, et al. Strategies for reducing the door-to-balloon time in
acute myocardial infarction. N Engl J Med. 2006; 355:2308–2320.
29. Britten MB, Abolmaali ND, Assmus B et al. Infarct remodeling after intracoronary
progenitor cell treatment in patients with acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI).
Mechanistic insights from serial contrast-enhanced magnetic resonance imaging.
Circulation 2003.

30. Catalin Toma, Mark F. Pittenger, Kevin S. Cahill, BS Barry J. Byrne, Paul D. Kessler.
“Human Mesenchymal Stem Cells Differentiate to a Cardiomyocyte Phenotype in the
Adult Murine Heart”. Circulation 2002; 105: 93-98.
31. Chen, Heather A. Himburg and Nelson J. Chao John P. Chute, Garrett G. Muramoto,
Alice B. Salter, Sarah K. Meadows, Dennis W. Rickman, Benny. Transplantation of
vascular endothelial cells mediates the hematopoietic recovery and survival of lethally
irradiated mice. Blood journal 2007; 109: 2365-2372.
32. Cheng Fanjun, Zou Ping, Yang Handong, Yu Zhengtong, Zhong Zhaodong.
“Induced Differentiation of Human Cord Blood Mesenchymal Stem/Pro- genitor
Cells into Cardiomyocyte-like Cells In Vitro”. Journal of Huazhong University of
Science and Technology 2003; 23:154-157.
33. Christoph Kalka, Haruchika Masuda, Tomono Takahashi, Wiltrud M. Kalka-Moll, Marcy
Silver, Marianne Kearney,Tong Li, Jeffrey M. Isner, and Takayuki Asahara.
Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic
neovascularization. PNAS 2000; 97(7): 3422–3427
34. David A. Ingram, Laura E. Mead, Hiromi Tanaka, Virginia Meade, Amy Fenoglio, Kelly
Mortell, KarenPollok, Michael J. Ferkowicz, David Gilley and Mervin C. Yoder (2004).
“Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human
peripheral and umbilical cord blood”. Blood. 2004; 104: 2752-2760.
35. David B. Weinreb, Juan Gilberto S. Aguinaldo,Jonathan E. Feig, Edward A. Fisher2 and
Zahi A. Fayad. Review Article: Non-invasive MRI of mouse models of atherosclerosis.
NMR Biomed. 2007; 20: 256–264
36. Davies MJ, Thomas AC. Plaque fissuring: the cause of acute myocardial infarction,
sudden ischemic death, and crescendo angina. Br Heart J. 1985; 53:363–373.
37. Dörthe Schmidt MD, Christian Breymann MD, Alberto Weber MD, Christina I. Guenter
MD, Stefan Neuenschwander PhD, Gregor Zund MD, Marko Turina MD and Simon P.
Hoerstrup MD. Umbilical Cord Blood Derived Endothelial Progenitor Cells for Tissue
Engineering of Vascular Grafts. The Annals of Thoracic Surgery 2004; 78(6) 2094-2098.
18

38. Duan HX, Cheng LM, Wang J, Hu LS, Lu GX. Angiogenic potential difference between
two types of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood. Cell Biol Int
2006; 30: 1018-1027.
39. Edelberg JM, Tang L, Hattori K, Lyden D, Rafii S. Young adult bone marrow-derived
endothelial precursor cells restore aging-impaired cardiac angiogenic function. Circ Res
2002; 90: E89–E93
40. Erices A, Conget P, Minguell JJ. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord
blood. Br J Haematol 2000; 109:235-242.
41. Erik B. Friedrich, Katrin Walenta, John Scharlau, Georg Nickenig and Nikos Werner
CD34–/CD133+/VEGFR-2+ Endothelial Progenitor Cell Subpopulation With Potent
Vasoregenerative Capacities Circ. Res 2006; 98;E20-E25
42. Fan Chun-Ling, LI Yan, Gao Ping-Jin, LIU Jian-Jun, Zhang Xue-Jun2 , ZHU Ding-Liang3
Differentiation of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood CD 34 +
cells in vitro . Fan CL et al / Acta Pharmacol Sin 2003; 24 (3): 212-218.
43. Federico Vozzi, Jan-Michael Heinrich, Augustinus Bader, Arti D. Ahluwalia. Tissue
Connected Culture of Murine Hepatocytes and Human Umbilical Vein Endothelial Cells
in a Multicompartmental Bioreactor. Engineering Part A. 2009; 15(6): 1291-1299.
44. Fuchs S, Satler LF, Kornowski R et al. Catheter-based autologous bone marrow
myocardial injection in no-option patients with advanced coronary artery disease: a
feasibility study. J Am Coll Cardiol 2003; 41: 1721–1724
45. Gavira et al., A comparison between percutaneous and surgical transplantation of
autologous skeletal myoblasts in a swine model of chronic myocardial infarction,
Cardiovascular Research 2006; 71:744–753
46. Gretel monreal, Mark A. Gerhardt, Atsushi Kambara, a. Reza Abrishamchian, John A.
Bauer, and Andrew H. Goldstein. Methods Selective Microembolization of the
Circumflex Coronary Artery in an Ovine Model: Dilated, Ischemic Cardiomyopathy and
Left Ventricular Dysfunction, Journal of Cardiac Failure 2004; Vol. 10 No. 2
47. Hirschi KK, Goodell MA. Hematopoietic, vascular and cardiac fates of bone marrowderived stem cells. Gene Ther 2002; 9: 648–652
48. Hu CH, Wu GF, Wang XQ, Yang YH, Du ZM, He XH, et al. Transplanted human

umbilical cord blood mononuclear cells improve left ventricular function through
angiogenesis in myocardial infarction. Chin Med J 2006; 119: 1499-1506.
49. Hua-Xin Duan, La-Mei Cheng, Jian-Wang, Liang-Shan Hu and Guang-Xiu Lu
Angiogenic potential difference between two types of endothelial progenitor cells from
human umbilical cord blood. Cell Biology International 2006;30(12):1018-1027
50. Hristov M, Erl W, Weber PC. Endothelial progenitor cells: mobilization, differentiation,
and homing. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003; 23:1185-9.
51. Iwaguro H, Yamaguchi J, Kalka C, et al. Endothelial progenitor cellvascular endothelial
growth factor gene transfer for vascular regeneration.Circulation 2002;105:732–738.
Jackson KA, Majka SM, Wang H et al. Regeneration of ischemic cardiac muscle and
vascular endothelium by adult stem cells. J Clin Invest 2001; 107: 1395–1402
52. Janssens S, Dubois C, Bogaert J, et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell
transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind,
randomized controlled trial. Lancet. 2006;367:113–121.
53. Jeffrey M. Isner and Takayuki Asahara Tepper, Edwin Gravereaux, Ann Pieczek, Hideki
Iwaguro, Shin-Ichiro Hayashi, Christoph Kalka, Haruchika Masuda, Tomono Takahashi,
19


54.
55.

56.
57.

58.

59.

60.

61.

62.
63.

64.

65.

66.
67.

Rebecca Gordon, Oren. Endothelial Progenitor Cells in Human Subjects Vascular
Endothelial Growth Factor 165 Gene Transfer Augments Circulating. Circ. Res. 2000;
86:1198-1202.
Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells
derived from adult marrow. Nature 2002; 418: 41–49
Jolicoeur EM, Granger CB, Fakunding JL, et al. Bringing cardiovascular cell-based
therapy to clinical application: perspectives based on a National Heart, Lung, and Blood
Institute Cell Therapy Working Group meeting. Am Heart J 2007;153:732–742.
Johan Denollet et al. Personality, Emotional Distress and Coronary Heart Disease.
European Journal of Personality 1997; 11:343±357
Jorn Tongers and Douglas W. Losordo Frontiers in Nephrology: The Evolving
Therapeutic Applications of Endothelial Progenitor Cells. J Am Soc Nephrol 2007; 18:
2843–285
Juliane Eggermann, StefanieKliche, GergelyJarmy, KarinHoffmann, UlrikeMayr-Beyrle,
Klaus-Michael
Debatin,
JohannesWaltenberger,

ChristianBeltinger,
Endothelial
progenitor cell culture and differentiation in vitro: a methodological comparison using
human umbilical cordblood, Cardiovascular Research 2003; 58:478–486
K. Chu, K.-H. Jung, S.-T. Lee, H.-K. Park, D.-I. Sinn, J.-M. Kim, D.-H. Kim, J.-H. Kim,
S.-J. Kim, E.-C. Song, et al. Circulating Endothelial Progenitor Cells as a New Marker of
Endothelial Dysfunction or Repair in Acute Stroke * Supplemental Methods. Stroke
2008; 39(5): 1441 - 1447.
Kalka C, Masuda H, Takahashi T et al. Transplantation of ex vivo expanded endothelial
progenitor cells for therapeutic neovascularization. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97:
3422–3427
Kamihata H, Matsubara H, Nishiue T et al. Implantation of bone marrow mononuclear
cells into ischemic myocardium enhances collateral perfusion and regional function via
side supply of angioblasts, angiogenic ligands, and cytokines. Circulation 2001; 104:
1046–1052
Kawamoto A, Gwon HC, Iwaguro H et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded
endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation 2001; 103: 634–637
Kawamoto A, Gwon HC, Iwaguro H, Yamaguchi JI, Uchida S, Masuda H, et al.
Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial
ischemia. Circulation 2001; 103: 634-637.
Keeley EC, Boura JA, Grines CL. Primary angioplasty versus intravenous thrombolytic
therapy for acute myocardial infarction: a quantitative review of 23 randomised trials.
Lancet 2003; 361:13–20.
Kehat I, Kenyagin-Karsenti D, Snir M et al. Human embryonic stem cells can
differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J
Clin Invest 2001;108: 407–414
Kenichi yamahara, Potential use of endothelial progenitor cells for regeneration of the
vasculature, Therapeutic Advances in Cardiovascular Disease 2009; 3:17-27
Kocher AA, Schuster MD, Szabolcs MJ et al. Neovascularization of ischemic
myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte

apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function. Nature Med 2001; 7: 430–
436

20


68. Kristine G. Gaustad, Andrew C. Boquest, Brent E. Anderson, A. Martin Gerdes,and
Philippe Collas. “Differentiation of human adipose tissue stem cellsusing extracts of rat
cardiomyocytes”. Biochemical and Biophysical Research Communications 2004;
314:420–427.
69. Kupatt C, Horstkotte J, Vlastos GA, Pfosser A, Lebherz C, Semisch M, et al. Embryonic
endothelial progenitor cells expressing a broad range of proangiogenic and remodeling
factors enhance vascularization and tissue recovery in acute and chronic ischemia. Faseb
J 2005; 19: 1576-1578.
70. Liu C, Sun Z, Du X, Chen X, Feng J, Jia B. Implantation of endothelial progenitor cells
into laser-induced channels in rat ischemia hindlimb augments neovascularization. Ann
Vasc Surg 2005; 19: 241-247
71. Lin H, Iammattoni MD, Modblum JR, Bolling SF. Experimental heterotopic heart
transplantation without ischemia or reperfusion. Heart Transplant. 1990;9:720 –723.
72. Lunde K, Solheim S, Aakhus S, et al. Intracoronary injection of mononuclear bone
marrow cells in acute myocardial infarction. N Engl J Med. 2006;355:1199–1209
73. Ma N, Stamm C, Kaminski A, Li W, Kleine HD, Muller-Hilke B, et al. Human cord
blood cells induce angiogenesis following myocardial infarction in NOD/scid-mice.
Cardiovasc Res 2005; 66: 45-54.
74. Manoukian SV, Feit F, Mehran R, et al. Impact of major bleeding on 30-day mortality
and clinical outcomes in patients with acute coronary syndromes: an analysis from the
ACUITYTrial. J Am Coll Cardiol 2007; 49:1362–1368.
75. Medvinsky A, Smith A. Stem cells: fusion brings down barriers. Nature 2003; 422: 823–
825
76. Mehdi Kadivar , Shohreh Khatami , Yousef Mortazavi , Mohammad Ali, Shokrgozar,

Mohammad, Taghikhani, Masoud Soleimani. “In vitro cardiomyogenic potential of
human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells ”. Biochemical and Biophysical
Research Communications 2005; 340: 639–647
77. Melo LG, Gnecchi M, Pachori AS, Kong D, Wang K, Liu X, et al. Endothelium-targeted
gene and cell-based therapies for cardiovascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol
2004; 24: 1761-1774.
78. Menasche P. Skeletal muscle satellite cell transplantation. Cardiovasc Res 2003 58:351–
357
79. Meyer GP, Wollert KC, Lotz J, et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after
myocardial infarction: eighteen months’ follow-up data from the randomized, controlled
BOOST (Bone marrow transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial.
Circulation 2006;113:1287–1294.
80. Michael j.b. Kutryk and duncan j. Stewart, angiogenesis of the heart. Microscopy
Research And Technique 2003; 60:138–158
81. Murohara T. Therapeutic vasculogenesis using human cord blood-derived endothelial
progenitors. Trends Cardiovasc Med 2001; 11: 303-307.
82. Murry C.E., Field L.J., Menasche P. Cell-based cardiac repair: reflections at the 10-year
point. Circulation 2005. 112:3174–3183
83. N.-M. Heida, J.-P. Muller, I.-F. Cheng, M. Leifheit-Nestler, V. Faustin, J. Riggert, G.
Hasenfuss, S. Konstantinides, and K. Schafer. Effects of obesity and weight loss on the
functional properties of early outgrowth endothelial progenitor cells. J. Am. Coll. Cardiol
2010; 55(4): 357 - 367.
21


84. Nabel EG. Gene therapy for cardiovascular disease. Circulation. 1995; 91:541–548
85. Nakagawa, Masabumi Shibuya, Hiroyuki Yoshikawa and Osamu Ohneda Masumi
Nagano, Toshiharu Yamashita, Hiromi Hamada, Kinuko Ohneda, Ken-ichi Kimura,
Tomoki. Identification of functional endothelial progenitor cells suitable for the treatment
of ischemic tissue using human umbilical cord blood blood. Journal 2007; 110: 151-160

86. Nallamothu BK, Bates ER. Percutaneous coronary intervention versus fibrinolytic
therapy in acute myocardial infarction: is timing (almost) everything? Am J Cardiol
2003; 92:824–826.
87. Neumann FJ, Kastrati A, Pogatsa-Murray G, et al. Evaluation of prolonged
antithrombotic pretreatment (‘‘cooling-off’’ strategy) before intervention in patients with
unstable coronary syndromes: a randomized controlled trial. JAMA 2003; 290: 1593–
1599.
88. Nieda M, Nicol A, Denning-Kendall P, Sweetenham J, Bradley B, Hows J. Endothelial
cell precursors are normal components of human umbilical cord blood. Br J Haematol
1997; 98: 775-777.
89. Oh H, Bradfute SB, Gallardo TD et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium:
homing, differentiation, and fusion after infarction. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100
90. Orlic D, Kajstura J, Chimenti S et al. Bone marrow cells regenerate infarcted
myocardium. Nature 2001; 410: 701–705
91. Perin EC, Dohmann HF, Borojevic R et al. Transendocardial, autologous bone marrow
cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation 2003; 107:
2294–2302
92. Pitchai Balakumar, Amrit Pal Singh, Manjeet Singh, Rodent models of heart failure,
Journal of Pharmacological and Toxicological Methods (2007) 56: 1–10
93. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC et al. Multilineage potential of adult human
mesenchymal stem cells. Science 1999; 284: 143–147
94. Pollok, Michael J. Ferkowicz, David Gilley and Mervin C. Yoder David A. Ingram,
Laura E. Mead, Hiromi Tanaka, Virginia Meade, Amy Fenoglio, Kelly Mortell, Karen.
Human peripheral and umbilical cord blood Identification of a novel hierarchy of
endothelial progenitor cells using blood. journal 2004;104: 2752-2760
95. Polychronis Antonitsis, Elisavet Ioannidou-Papagiannaki, Aikaterini Kaidoglou , Christos
Papakonstantinoua. “In vitro cardiomyogenic differentiation of adult human bone marrow
mesenchymal stem cells. The role of 5-azacytidine”. Interactive CardioVascular and
Thoracic Surgery 2007; 6: 593–597.
96. Quaini F, Urbanek K, Beltrami AP, et al. Chimerism of the transplanted heart. N Engl J

Med. 2002; 346:5–15.
97. Quirici N, Soligo D, Caneva L, Servida F, Bossolasco P, Deliliers York, USA, for initial
support in establishing the culture of GL. Differentiation and expansion of endothelial
cells from human non-adherent cells. The generous gift of the antibody bone marrow
CD133(1) cells. Br J Haematol 2001;115:186–194.
98. Rosenzweig A. Cardiac cell therapy – mixed results from mixed cells. N Engl J Med
2006; 355:1274–1277.
99. Schachinger V, Erbs S, Elsasser A, et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor
cells in acute myocardial infarction. N Engl J Med 2006; 355:1210–1221.
100. Schachinger V, Erbs S, Elsasser A, et al., for the REPAIR-AMI Investigators. Improved
clinical outcome after intracoronary administration of bone-marrow-derived progenitor
22


101.
102.

103.

104.

105.
106.

107.

108.

109.

110.

111.

112.

113.

114.

cells in acute myocardial infarction: final 1-year results of the REPAIR-AMI trial. Eur
Heart J 2006; 27:2775–2783
Shi Q, Rafii S, Wu MH et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial
cells. Blood 1998; 92: 362–367
Siminiak T., Kalawski R., Fiszer D., Jerzykowska O., Rzezniczak J., Rozwadowska N., et
al. Autologous skeletal myoblast transplantation for the treatment of postinfarction
myocardial injury: phase I clinical study with 12 months of follow-up. Am Heart J 2004;
148:531–537
Simon G. Fisher, Michael S. Marber. An in vivo model of ischaemia–reperfusion injury
and ischaemic preconditioning in the mouse heart, Journal of Pharmacological and
Toxicological Methods 2002; 48: 161-169
Smits P.C., van Geuns R.J., Poldermans D., Bountioukos M., Onderwater E.E., Lee C.H.,
et al. Catheter-based intramyocardial injection of autologous skeletal myoblasts as a
primary treatment of ischemic heart failure: clinical experience with six-month followup. J Am Coll Cardiol 2003; 42:2063–2069
Stamm C, Westphal B, Kleine HD et al. Autologous bone-marrow stem-cell
transplantation for myocardial regeneration. Lancet 2003; 361: 45–46
Strauer BE, Brehm M, Zeus T et al. Repair of infarcted myocardium by autologous
intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circulation
2002; 106: 1913–1918
T. J. Povsic and P. J. Goldschmidt-Clermont. Review: Endothelial progenitor cells:

markers of vascular reparative capacity. Therapeutic Advances in Cardiovascular
Disease 2008; 2(3): 199 - 213.
Tateishi-Yuyama E, Matsubara H, Murohara T et al. Therapeutic angiogenesis for
patients with limb ischaemia by autologous transplanation of bone marrow cells: a pilot
study and a randomized controlled trial. Lancet 2002; 360: 427–435
Tingzhong Wang, Zhengyun Xu, Wenhui Jiang, Aiqun Ma.“Cell-to-cell contact induces
mesenchymal stem cell to differentiate into cardiomyocyte and smooth muscle cell ”.
International Journal of Cardiology 2006;109: 74 – 81.
Thum T, Bauersachs J, Poole-Wilson PA, Volk HD, Anker SD. The dying stem cell
hypothesis: immune modulation as a novel mechanism for progenitor cell therapy in
cardiac muscle. J Am Coll Cardiol. 2005; 46:1799–1802.
Toma C, Pittenger MF, Cahill KS, Byrne BJ, Kessler PD. Human mesenchymal stem
cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation
2002; 105: 93–98
Tse HF, Kwong YL, Chan JK, Lo G, Ho CL, Lau CP. Angiogenesis in ischaemic
myocardium by intramyocardial autologous bone marrow mononuclear cell implantation.
Lancet 2003; 361: 47–49
Urao N, Okigaki M, Yamada H, Aadachi Y, Matsuno K, Matsui A, et al.
Erythropoietinmobilized endothelial progenitors enhance reendothelialization via Aktendothelial nitric oxide synthase activation and prevent neointimal hyperplasia. Circ Res
2006; 98: 1405-1413.
Urbich C, Heeschen C, Aicher A, Dernbach E, Zeiher AM, Dimmeler S. Relevance of
monocytic features for neovascularization capacity of circulating endothelial progenitor
cells. Circulation 2003; 108: 2511–1516

23


115. Ursula M. Gehling, Su¨leyman Ergu¨n, Udo Schumacher, Christoph Wagener, Klaus
Pantel, Marcus Otte, Gunter Schuch, Philippe Schafhausen, Thorsten Mende, Nerbil
Kilic, Katrin Kluge, Birgit Scha¨ fer, Dieter K. Hossfeld, and Walter Fiedler. In vitro

differentiation of endothelial cells from AC133-positive progenitor cells. Blood 2005;
Volume 95, Number 10
116. V. L.T. Ballard and J. M. Edelberg. Stem Cells and the Regeneration of the Aging
Cardiovascular System. Circ. Res 2007; 100(8): 1116 – 1127
117. V. Planat-Bénard, C. Menard, M. André, M. Puceat, A. Perez J.-M. Garcia-Verdugo, L.
Pénicaud, L. Casteilla. “Spontaneous Cardiomyocyte Differentiation From Adipose
Tissue Stroma Cells ”. Circulation Research (2003). 94: 223-229.
118. Vasa M, Fichtlscherer S, Adler K, et al. Increase in circulating endothelial progenitor
cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation.
2001;103:2885–2890.
119. White HD. Non-ST elevation acute coronary syndromes unstable angina and non-ST
elevation myocardial infarction. In: Textbook of Cardiovascular Medicine, 2nd ed. Edited
by Topol EJ. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2006.pp. 352–384.
120. Wollert KC, Meyer GP, Lotz J et al. Randomized controlled clinical trial of intracoronary
autologous bone marrow cell transfer post myocardial infarction. Circulation 2003; 108:
2723
121. Wollert KC, Meyer GP, Lotz J, et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer
after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet.
2004; 364:141–148.
122. Wuqiang zhu, weinian shou, r. Mark payne, randall caldwell, and loren j. Field. A mouse
model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction, pediatric research
(2008),vol. 64, no. 5
123. Xiao Wu, Lensch, Wylie-Sears et al. , Hemogenic Endothelial Progenitors from Cord
Blood, Stem Cells 2007;25:2770 –2776
124. Yamamoto K, Takahashi T, Asahara T, Ohura N, Sokabe T, Kamiya A, et al.
Proliferation, differentiation, and tube formation by endothelial progenitor cells in
response to shear stress. J Appl Physiol 2003; 95: 2081-2088.
125. Yang C, Zhang ZH, Li ZJ, Yang RC, Qian GQ, Han ZC. Enhancement of
neovascularization with cord blood CD133+ cell-derived endothelial progenitor cell
transplantation. Thromb Haemost 2004; 91: 1202-1212.

126. Yoshioka T, Ageyama N, Shibata H, Yasu T, Misawa Y, Takeuchi K, et al. Repair of
infarcted myocardium mediated by transplanted bone marrow-derived CD34+ stem cells
in a nonhuman primate model. Stem Cells 2005; 23: 355-364.
127. Zhao Y, Glesne D, Huberman E. A human peripheral blood monocyte-derived subset acts
as pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 2426–2431
128. Zijiang Yang 1, Moritz Wyler von Ballmoos 1, Nicolas Diehm, Iris Baumgartner,
Christoph Kalka, Stefano Di Santo. Call for a reference model of chronic hind limb
ischemia to investigatetherapeutic angiogenesis.Vascular Pharmacology 2009; 51:268–
274

24