THIẾT LẬP QUI TRÌNH PHÁT HIỆN VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KIỀU THỊ DIỄM TRANG

THIẾT LẬP QUI TRÌNH PHÁT HIỆN VIBRIO
PARAHAEMOLYTICUS TRONG THỰC PHẨM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN
REACTION) VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Tp Hồ Chí Minh - Năm 2005



LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn chân thành, tôi xin cảm ơn:
Quý Thầy, Cô Khoa Sinh Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh đã cung
cấp cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt khóa học.
Thầy Trần Linh Thước đã luôn hướng dẫn tận tình và tạo những điều kiện thuận
lợi cho tôi hoàn thành luận văn.
Thầy Nguyễn Tiến Dũng đã luôn quan tâm và theo sát chỉ bảo trong suốt quá
trình tôi làm luận văn.
Các em Huệ, Na và các em ở Phòng Công Nghệ Gen và ở Trung tâm Khoa học
và Công nghệ Sinh học Trường Đại học Khoa học tự nhiên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực nghiệm.
Nhân đây tôi cũng xin chân thành cảm ơn sở Giáo dục và Đào tạo tỉnh Đồng
Tháp, Ban Giám hiệu Trường Phổ thông Trung học thị xã Sa Đéc đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt khóa học.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2005
Kiều Thị Diễm Trang

iii


BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
AOAC: Association of Official Analytical Chemists (Hiệp hội các nhà hóa học
phân tích nhà nước)
bp: Base pair (cặp base)
CDC: Center for Disease Control (Trung tâm Kiểm soát dịch bệnh)
CFU: Colony forming unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)
Da: Dalton (đơn vị khối lượng protein) DNA: Deoxyribonucleic acid (AND)
dNTP: 2' - Deoxynucleoside - 5' - triphosphate (nucleotide dùng để tổng hợp
DNA)
ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent Assay (thử nghiệm hấp phụ miễn dịch
gắn enzyme)
FAO: Food and Agriculture Organization (Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp)
FDA: Food and Drug Administration (Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm)
ISO: International Standards Organization (Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế)
kb:Kilo base (1.000 base)
kDa: Kilo Dalton (1.000 da)
Mb: Mega base (1.000.000 base)
MPN: Most Probable Number (số có xác suất cao nhất, số tối khả)
NĐTP: ngộ độc thực phẩm
NordVal: Nordic System for Validation of Alternative Biological Method (Hệ
thống đánh giá phương pháp sinh học thay thế Nordic)
PCR: Polymerase chain reaction (Phản ứng chuồi tổng hợp bằng polymerase)
TAE: Tris acetic acid - Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) Taq: Thermus
aquaticus TE: Tris-EDTA

TDH: Thermostable direct hemolysin (hemolysin trực tiếp bền nhiệt)

iv


TL: Thermolabile hemolysin (hemolysin kém bền nhiệt)
TRH: Thermostable Related hemolysin (hemolysin liên quan đến TDH)
UV: Ultraviolet (tia tử ngoại)
V. parahaemolyticus: Vibrio parahaemolyticus

v


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... iii
T
0

T
0

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................................iv
T
0

T
0

MỤC LỤC ...........................................................................................................vi
T

0

T
0

ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1
T
0

T
0

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3
T
0

T
0

1.1.Ngộ độc thực phẩm ............................................................................................ 3
T
0

T
0

1.1.1.Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật và đặc điểm .......................................... 3
T
0

T
0

1.1.2.Thực trạng NĐTP trên thế giới và Việt Nam ............................................. 4
T
0

T
0

1.1.3.Một số vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm thường gặp ........................ 6
T
0

T
0

1.2.Đặc điểm sinh học và bệnh học của Vibrio parahaemolyticus ...................... 9
T
0

T
0

1.2.1.Đặc điểm hình thái và tăng trưởng ............................................................. 9
T
0

T
0

1.2.2.Đặc điểm sinh hóa và miễn dịch ............................................................... 10
T
0

T
0

1.2.3.Đặc điểm bệnh học..................................................................................... 12
T
0

T
0

1.2.3.1.Bệnh và cơ chế gây bệnh .................................................................... 12
T
0

T
0

1.2.3.2.Gen mã hóa độc tố .............................................................................. 13
T
0

T
0

1.2.3.4.An toàn về V. parahaemolyticus trong thực phẩm ........................... 15

T
0

T
0

1.3.Phương pháp phát hiện V. parahaemolyticus trong thực phẩm ................. 15
T
0

T
0

1.3.1.Phương pháp nuôi cấy truyền thống ........................................................ 15
T
0

T
0

1.3.2.Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ............. 16
T
0

T
0

1.3.3.Phương pháp lai phân tử (Hybridization) ................................................ 17
T
0

T
0

1.3.4.Phương pháp PCR ..................................................................................... 18
T
0

T
0

1.3.4.1.Nguyên tắc .......................................................................................... 18
T
0

T
0

1.3.4.2.Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR ....................................... 19
T
0

T
0

vi


1.3.4.3.Một số ưu điểm và nhược điểm của phương pháp PCR trong phát
T

0

hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm ................................................... 21
T
0

1.3.4.4.Một số nghiên cứu ứng dụng phương pháp PCR để phát hiện V.
T
0

parahaemolyticus trong thực phẩm ............................................................... 21
T
0

1.4.Xác nhận hiệu lực phương pháp sinh học ...................................................... 22
T
0

T
0

1.4.1.Định nghĩa các khái niệm ......................................................................... 22
T
0

T
0

1.4.2.Các bước xác nhận hiệu lực...................................................................... 23
T

0

T
0

1.4.3.Các thông số kỹ thuật trong xác nhận hiệu lực phương pháp định tính vi
T
0

sinh vật................................................................................................................. 23
T
0

1.4.4.Ý nghĩa của việc xác nhận hiệu lực .......................................................... 25
T
0

T
0

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................... 26
T
0

T
0

2.1.Vật liệu .............................................................................................................. 26
T
0

T
0

2.1.1.Thiết bị và dụng cụ .................................................................................... 26
T
0

T
0

2.1.2.Hóa chất và môi trường ............................................................................. 26
T
0

T
0

2.1.3.Vật liệu thí nghiệm..................................................................................... 27
T
0

T
0

2.2.Phương pháp ..................................................................................................... 28
T
0

T

0

2.2.1.Thu và xử lý mẫu ....................................................................................... 28
T
0

T
0

2.2.2.Đồng nhất mẫu và tăng sinh ..................................................................... 28
T
0

T
0

2.2.3.Xác định mẫu âm tính ............................................................................... 28
T
0

T
0

2.2.4.Phương pháp pha loãng vi sinh vật .......................................................... 29
T
0

T
0

2.2.5.Định lượng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ....................................... 29
T
0

T
0

2.2.6.Phương pháp gây nhiễm vi khuẩn lên mẫu thực phẩm........................... 30
T
0

T
0

2.2.7.Phương pháp nuôi cấy V. parahaemolyticus............................................ 30
T
0

T
0

2.2.8.Thử nghiệm Oxidase.................................................................................. 31
T
0

T
0

2.2.9.Thử nghiệm KIA ........................................................................................ 32
T

0

T
0

vii


2.2.10.Thử nghiệm Lysine Dercarboxylase (LDC) ........................................... 33
T
0

T
0

2.2.11.Thử khả năng chịu mặn .......................................................................... 34
T
0

T
0

2.2.12.Thử nghiệm ONPG .................................................................................. 35
T
0

T
0

2.2.13.Khảo sát điều kiện ly trích khuôn DNA từ dịch tăng sinh mẫu thực

T
0

phẩm bằng xử lý nhiệt ........................................................................................ 36
T
0

2.2.14.Điều kiện tiến hành phản ứng PCR ....................................................... 37
T
0

T
0

2.2.15.Điện di phân tích ...................................................................................... 38
T
0

T
0

2.2.16.Kiểm chứng tính chuyên biệt của cặp mồi TL ....................................... 38
T
0

T
0

2.2.17.Kiểm chứng điều kiện tối ưu của phản ứng ........................................... 38
T

0

T
0

2.2.18.Khảo sát thời gian tăng sinh tối thiểu phát hiện V.parahaemolyticus
T
0

trong mẫu thủy sản ............................................................................................. 39
T
0

2.2.19.Kiểm chứng độ nhạy của phản ứng PCR ............................................... 39
T
0

T
0

2.2.20.Xác định giới hạn phát hiện V. parahaemolyticus trong mẫu thực tế .. 39
T
0

T
0

2.2.21.Xác định các thông số kỹ thuật của phản ứng PCR .............................. 40
T
0

T
0

2.2.22.Đánh giá độ lặp lại của phương pháp thay thế ...................................... 41
T
0

T
0

2.2.23.Đánh giá độ ổn định của phương pháp thay thế .................................... 41
T
0

T
0

2.2.23.Ứng dụng qui trình phát hiện V. parahaemolyticus bằng phương pháp
T
0

PCR vào thực tế................................................................................................... 42
T
0

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN............................................................ 43
T
0

T
0

3.1.Phân lập chủng V. parahaemolyticus từ mẫu thủy sản ................................ 43
T
0

T
0

3.2.Xây dựng qui trình phát hiện V. parahaemolyticus trong thực phẩm bằng
T
0

phương pháp PCR .................................................................................................. 44
T
0

3.2.1.Thời gian xử lý nhiệt trích khuôn DNA ................................................... 44
T
0

T
0

3.2.2.Khả năng khuếch đại của cặp mồi TL ...................................................... 45
T
0

T

0

3.2.3.Độ chuyên biệt của cặp mồi TL phát hiện V. parahaemolyticus trong
T
0

thực phẩm ............................................................................................................ 46
T
0

viii


2.2.4.Điều kiện tối ưu của phản ứng PCR......................................................... 47
T
0

T
0

3.2.5.Thời gian tăng sinh tối thiếu phát hiện V.parahaemolyticus trong mẫu
T
0

thủy sản ............................................................................................................... 50
T
0

3.2.6.Độ nhạy của phản ứng PCR ..................................................................... 51
T

0

T
0

3.2.7.Qui trình phát hiện V. parahaemolyticus trong thực phẩm bằng phản
T
0

ứng PCR .............................................................................................................. 52
T
0

3.3.Xác nhận hiệu lực phương pháp PCR phát hiện V. parahaemolyticus trong
T
0

thực phẩm ............................................................................................................... 54
T
0

3.3.1.Giời hạn phát hiện V. parahaemolyticus trong thực phẩm bằng phản
T
0

ứng PCR .............................................................................................................. 54
T
0

3.3.2.Xác định các thông số kỹ thuật của qui trình PCR .................................. 56

T
0

T
0

3.3.3.Đánh giá độ lặp lại ..................................................................................... 58
T
0

T
0

3.3.4.Đánh giá độ ổn định .................................................................................. 59
T
0

T
0

3.4.Ứng dụng qui trình PCR phát hiện V. parahaemolyticus trên các mẫu thực
T
0

tế ............................................................................................................................... 63
T
0

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................. 66
T

0

T
0

4.1. Kết luận ............................................................................................................ 66
T
0

T
0

4.2.Đề nghị ............................................................................................................... 67
T
0

T
0

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 68
T
0

T
0

PHỤ LỤC ........................................................................................................... 70
T
0

T
0

ix


Thiết lập qui trình…

Kiều Thị Diễm Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ
Không phải ngẫu nhiên mà hàng năm cứ vào khoảng giữa tháng tư nước ta lại
rầm rộ ra quân với phong trào "Tháng hành động vì vệ sinh an toàn thực phẩm". Chủ
đề của phong trào này ương năm 2005 là "Sản xuất, kinh doanh và sử dụng thực phẩm
theo pháp lệnh vệ sinh an toàn thực phẩm" [15]. Những năm gần đây nhiều vụ ngộ
độc thực phẩm (NĐTP) tại các bếp ăn tập thể, nhà hàng, khách sạn... đã xảy ra; số vụ
ngộ độc có xu hướng ngày càng tăng do ý thức về vệ sinh an toàn thực phẩm của
người dân chưa cao. NĐTP không những gây tổn thất rất lổn về kinh tế mà còn có khả
năng ảnh hưởng nghiêm trọng cho sức khỏe trước mắt và lâu dài.
NĐTP không chỉ là vấn đề đáng lo ngại ở các nước nghèo kém phát ừiển, các
nước đang phát triển mà ở cả những nước phát triển. Theo Tổ chức Y tế thế giới
(WHO), hàng năm số ca ngộ độc thực phẩm ở Mỹ là 175 ca/1000 dân, ở Anh và New
Zealand là 190 ca/1000 dân, ở úc là 220 ca/1000 dân, ở Việt Nam trung bình có
khoảng 7000 ca/năm... Tổn thất gây ra bởi một vụ NĐTP cấp tính ở một số nước phát
triển là 1.679 đô úc (úc), 1.531 đô Mỹ (Hoa Kỳ), 789 bảng (Anh), 1.100 đô Canada
(Canada) [13].
Có nhiều nguyên nhân gây NĐTP, nhưng nguyên nhân do vi sinh vật là chiếm tỉ
lệ cao nhất. Trong số các vi sinh vật gây bệnh thì Vibrio parahaemolyticus (V.
parahaemolyticus), Salmonella spp, Shigella spp được xem là mối đe dọa, gánh nặng
bệnh tật đến sức khỏe của người Việt Nam [17]. V. parahaemolyticus là loài vi khuẩn

ưa mặn, xuất hiện nhiều trong các loài thủy hải sản ở vùng nước ấm ven bờ biển.
Nước ta có hệ thống sông rạch chằng chịt và bờ biển dài 3.260 km, có nguồn lợi thủy
hải sản vô cùng to lớn, không chỉ đáp ứng nhu cầu tiêu thụ nội địa mà còn tạo nguồn
hàng xuất khẩu có thế mạnh trên thị trường quốc tế. Do đó việc kiểm tra giám sát sự
hiện diện của V. parahaemolyticus trong thực phẩm thủy hải sản là vô cùng quan
trọng.
Việc phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm thường được thực hiện bằng phương
pháp nuôi cấy truyền thống. Phương pháp này tốn rất nhiều thời gian, công sức lao
động... nên làm ứ động hàng hóa, ngăn cản lưu thông, tăng chi phí sản xuất... Vì vậy,
việc tìm ra một phương pháp mới, nhanh, nhạy và chính xác để phát hiện các vi sinh
1


Thiết lập qui trình…

Kiều Thị Diễm Trang

vật gây bệnh trong thực phẩm là một nhu cầu rất bức thiết.
Trong những năm gần đây, dựa trên những thành tựu nổi bật của sinh học phân
tử, nhiều phương pháp mới đã được đề nghị có ưu điểm là nhanh, nhạy, chính xác,
thao tác đơn giản, khắc phục được một số nhược điểm của phương pháp nuôi cấy
truyền thống. Một trong những phương pháp đó là phương pháp PCR (Polymerase
chain reaction, phản ứng tổng hợp chuỗi bằng polymerase), đã được phát triển rộng rãi
và được áp dụng thử nghiệm trên thế giới. Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh
học và Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử thuộc Trường Đại học Khoa
học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh đã và đang triển khai việc nghiên
cứu thiết lập qui trình phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm như
Staphylococuss aureus, Shigella spp., Salmonella spp., E. coli Clostridium
perfringens, C. botulinum, Vibrio cholerae... bằng phương pháp PCR. Để góp phần
làm đồng bộ các quy trình phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm bằng phương pháp

PCR, chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm đối tượng là vi khuẩn V. parahaemolyticus
hiện diện trong thực phẩm có nguồn gốc từ thủy hải sản. Nội dung của luận văn bao
gồm hoàn thiện qui trình phát hiện V. parahaemolyticus trong thực phẩm bằng
phương pháp PCR, áp dụng qui trình này trên một số loại thực phẩm nhằm đánh giá
hiệu lực của qui trình tạo cơ sở để góp phần đưa qui trình này được áp dụng vào thực
tế.

2


Thiết lập qui trình…

Kiều Thị Diễm Trang

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Ngộ độc thực phẩm
1.1.1.Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật và đặc điểm
Ngộ độc thực phẩm (NĐTP) là thuật ngữ chỉ triệu chứng bệnh lý ở người gây ra
do thực phẩm. Có hai nguyên nhân gây ra ngộ độc thực phẩm:
- Ngộ độc do hóa chất: là trường hợp người bị ngộ độc ăn phải những thức ăn có
chứa chất độc. Các chất độc này có thể có nguồn gốc từ nguyên liệu thực phẩm chứa
dư lượng thuốc trừ sâu, phân hóa học, từ phụ gia không đạt chất lượng hoặc bị cấm sử
dụng, do nhiễm kim loại hay chất độc trong quá trình chế biến và bảo quản thực
phẩm...
- Ngộ độc do vi sinh vật: là trường hợp người bị ngộ độc ăn phải những thức ăn
có chứa vi sinh vật gây bệnh còn sống hoặc có chứa độc tố của vi sinh vật. Nhiều loài
vi sinh vật có thể gây ngộ độc thực phẩm như vi khuẩn, virut, nấm men, nấm mốc và
kí sinh trùng. Nguy cơ bị NĐTP do vi sinh vật thường cao hơn 100.000 lần so với ngộ
độc bằng hóa chất [14]. Độc tố vi sinh vật được chia thành hai loại: ngoại độc tố và

nội độc tố.
+ Ngoại độc tố (exotoxin) là những protein được tổng hợp trong tế bào vi sinh
vật sống và được tiết ra ngoài môi trường. Loại độc tố này rất độc và gây ra những rối
loạn điển hình, dễ bị phân hủy bởi nhiệt và có tính kháng nguyên mạnh.
+ Nội độc tố (endotoxin) là thành phần màng ngoài của tế bào vi khuẩn gram (-),
chỉ được thải ra môi trường khi tế bào vi sinh vật bị chết hay bị phân hủy. Endotoxin
là phức hợp của glucid, lipid, protein có tác dụng gây độc và những rối loạn chung.
Loại độc tố này bền nhiệt chỉ bị phá hủy khi đun sôi ở 100°c trong 30 phút, và có tính
kháng nguyên yếu.
Mặc dù nguy cơ thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật là rất lớn nhưng không phải
thực phẩm bị nhiễm khuẩn nào cũng có thể gây bệnh. Để gây bệnh, mật độ vi khuẩn
hiện diện trong thực phẩm phải đủ lớn, gọi là liều gây bệnh. Liều gây bệnh của một vi
3


Thiết lập qui trình…

Kiều Thị Diễm Trang

khuẩn phụ thuộc vào độc lực của vi khuẩn và tính mẫn cảm của mỗi người. Các vi
khuẩn cùng loài nhưng khác chủng có thể khác nhau xa về độc lực, điều kiện tăng
trưởng và gây bệnh. Con người khác nhau về tuổi tác, tình trạng dinh dưỡng, sức
khỏe, sức đề kháng, đang trong giai đoạn uống kháng sinh, pH của dịch dạ dày... sẽ có
mức độ mẫn cảm khác nhau đối với cùng một vi sinh vật gây bệnh.
Có hai dạng ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật là nhiễm trùng và nhiễm độc. Vi
khuẩn gây ra hai dạng này khác nhau ở cách thức gây bệnh.
- NĐTP do nhiễm trùng: xảy ra khi người bệnh ăn phải thực phẩm bị nhiễm vi
sinh vật có khả năng sinh độc tố trong quá trình phát triển ở hệ tiêu hóa hoặc bị nhiễm
các vi khuẩn gây bệnh có khả năng xâm nhập và nhân lên trong tế bào biểu mô ruột.
Các vi khuẩn này thường phải có thời gian để phát triển trong ruột nên thời gian ủ

bệnh từ khi ăn phải thức ăn bị nhiễm khuẩn cho đến khi biểu hiện triệu chứng ngộ độc
thường sau một vài ngày.
- NĐTP do nhiễm độc: là dạng xảy ra phổ biến và có thời gian ủ bệnh rất ngắn
gây ra bởi độc tố của vi khuẩn hiện diện trong thực phẩm. Độc tố này được sinh ra
trong quá trình phát triển của vi khuẩn trong thực phẩm hoặc phóng thích khỏi tế bào
khi vi khuẩn bị chết. Độc tố này thường rất bền với nhiệt độ, có khả năng gây NĐTP
trong vòng 30 phút đến 2 giờ, đôi khi 8 giờ, sau khi ăn [14].
Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật thường có các đặc điểm là phát sinh đột ngột,
thời gian ủ bệnh ngắn; nhiều người bị mắc bệnh cùng một lúc do ăn phải một loại thực
phẩm nhiễm khuẩn, thường gặp ở bếp ăn tập thể, bếp ăn công cộng; bệnh có liên quan
đến việc vi phạm các qui định về vệ sinh trong chế biến, bảo quản, phân phối và sử
dụng thực phẩm. về mặt dịch tể học, bệnh chỉ giới hạn trong một địa phương nhất
định và kết thúc nhanh sau khi chấm dứt tiêu thụ loại thức ăn đó. Ngoài ra bệnh có qui
mô khác nhau, phụ thuộc vào số lượng và hình thức phân phối loại thức ăn nhiễm
khuẩn [7].
1.1.2.Thực trạng NĐTP trên thế giới và Việt Nam
Ngày 25/01/2000 Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã báo động về tình hình gia
tăng của các bệnh do thực phẩm. Theo WHO, hàng năm có tới 30% dân số ở các nước
4


Thiết lập qui trình…

Kiều Thị Diễm Trang

phát triển bị bệnh do thực phẩm. Con số này ở các nước đang phát triển thì cao hơn
nhiều [12].
Phần lớn các bệnh do thực phẩm có nguyên nhân là vi sinh vật và kí sinh trùng.
Người ta đã xác định ít nhất 16 loài vi khuẩn, 4 loài virus, 4 loài đơn bào và 13 loài
giun sán gây bệnh được truyền qua thực phẩm.

Sự đa dạng về chủng loại bệnh do thực phẩm làm cho không một quốc gia nào
trên thế giới có thể cung cấp số liệu một cách chính xác về các trường hợp và sự lưu
hành của bệnh do thực phẩm. Các chương trình giám sát cũng chỉ thu thập được
những số liệu ít ỏi, không đầy đủ. Chẳng hạn, hàng năm ở Hoa Kỳ ước tính có khoảng
6-33 triệu ca bị bệnh do thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật trong đó 9.000 ca tử vong.
Thế nhưng ở một nước mà trình độ quản lý an toàn thực phẩm còn thấp như Việt Nam
thì mỗi năm chỉ có 7.000 ca bệnh được báo cáo; số liệu này chắc chắn khác xa con số
thực tế. Hiện nay người ta cho rằng số liệu các ca bệnh do thực phẩm được báo cáo
chỉ phản ánh dưới 10% số ca thực tế ở các nước phát triển và dưới 1% ở các nước
đang phát triển [12].
Theo số liệu đã công bố, riêng các chủng vi khuẩn Salmonella đã làm cho
khoảng 40.000 - 60.000 người Mỹ, 8.000 - 12.000 người Nhật, 6.000 - 8.000 người
Úc mắc bệnh mỗi năm. Ở Nhật mỗi năm có hàng chục ngàn người bị NĐTP. Năm
2000 tại Nhật có 14.000 người bị ngộ độc do uống sữa tươi đóng hộp bị nhiễm
Staphylococcus aureus. Ở úc mỗi năm có khoảng 4,2 triệu ca NĐTP cấp tính, trung
bình mỗi ngày xảy ra 11.500 ca, gây tổn thất 2,6 tỷ đô la Úc [13]. Tại Hoa Kỳ, ước
tính có khoảng 6,5 - 81 triệu lượt bệnh mỗi năm [19]. Số liệu thống kê tình hình
NĐTP tại Việt Nam những năm gần đây của Bộ Y tế được trình bày trong Bảng 1.

5


Thiết lập qui trình…

Kiều Thị Diễm Trang

Trên thực tế, chắc chắn số vụ NĐTP, số người bị ngộ độc và tử vong cao hơn rất
nhiều. Theo khảo sát của Viện Chiến lược và Chính sách y tế tại Hà Nội, Đà Nẵng,
Quảng Ninh và TP. Hồ Chí Minh, số ca bệnh cấp tính do thực phẩm chiếm 10% tổng
số ca nhập viện [8], [18].

1.1.3.Một số vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm thường gặp
Bacillus cereus là trực khuẩn tạo nội bào tử phân bố rộng rãi trong tự nhiên, hiện
diện trong các loại thực phẩm như ngũ cốc, rau, sữa, thịt quay hoặc rán. Triệu chứng
gây bệnh thường là đau bụng, tiêu chảy, buồn nôn hoặc nôn mửa sau khi ăn từ 1- 5
giờ. Thời gian ủ bệnh từ 8 – 10 giờ và kéo dài 12 - 24 giờ.
Clostridium botulium là vi khuẩn kị khí thường gặp trong đất, phân động vật,
ruột cá tôm. C. botulium tạo ngoại độc tố có độc tính rất mạnh, gây tổn thương hệ thần
kinh trung ương và hành tủy, rối loạn lời nói, mất tiếng, liệt dạ dày, táo bón... Triệu
chứng bệnh xuất hiện sau thời gian ủ bệnh là 12-36 giờ, nhưng có thể kéo dài đến 8
ngày, tỉ lệ tử vong là 30%.
C. peryringens là vi khuẩn kị khí gây 5% các vụ NĐTP. Đồ hộp, thức ăn nấu
chín là môi trường thích hợp cho vi sinh vật này phát triển vì sự nấu chín làm giảm
lượng ôxi. Triệu chứng của bệnh là đau bụng, tiêu chảy, không sốt và ít khi ói mửa.
Bệnh rất nhẹ và xảy ra sau thời gian ủ bệnh 8-24 giờ và kéo dài 12 đến 18 giờ.
Campylobacter là vi khuẩn vi hiếu khí, gây đau bụng hoặc co rút, buồn nôn, tiêu
chảy, mệt mỏi khó chịu, đau đầu và sốt. Bệnh có thể kéo dài từ 1 - 4 ngày. Ngộ độc
6


Thiết lập qui trình…

Kiều Thị Diễm Trang

Campylobacter có thể do các loại thực phẩm như sữa tươi, nước chưa khử trùng hoặc
đun sôi, thịt gia cầm nấu chưa chín.
E. coli là vi khuẩn gram (-) hiện diện rộng rãi trong môi trường. Một số chủng có
khả năng gây bệnh đa dạng, phổ biến nhất là tiêu chảy, hoặc gây nhiễm khuẩn đường
tiểu, nhiễm khuẩn máu, gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh. E. coli hiện diện trong hầu
hết các loại thực phẩm tươi sống và không hợp vệ sinh.
Listeria monocytogenes có thể hiện diện trong thịt, cá, rau, sữa và nước bề mặt.

Triệu chứng gây bệnh xuất hiện đầu tiên từ đường tiêu hóa với những biểu hiện như
tiêu chảy, sốt nhẹ. Trường hợp nặng có thể bị nhiễm trùng máu. Vi khuẩn tác động lên
hệ thần kinh trung ương, tim, mắt và có thể vào bào thai trong bụng mẹ gây sẩy thai,
đẻ non hoặc nhiễm trùng thai nhi [19].
Một số chủng Salmonella có khả năng gây bệnh. Triệu chứng gây bệnh bắt đầu
có 6 - 8 giờ sau khi ăn hay uống thức ăn, nước uống bị nhiễm Salmonella như buồn
nôn, nôn mửa, đau quặn bụng, tiêu chảy, đau cơ, nhức đầu, sốt và ớn lạnh. Triệu
chứng chung nhất là tiêu chảy. Thời gian sốt và tiêu chảy dao động từ 2 - 7 ngày, sau
đó bệnh nhân tự hồi phục.
Các chủng Shigella gây bệnh vào cơ thể qua đường tiêu hóa. Vi khuẩn tấn công
lớp biểu mô niêm mạc ruột già, tạo những áp xe nhỏ li ti, gây hoại tử ung loét và xuất
huyết. Triệu chứng bệnh là đau bụng dữ dội, tiêu chảy nhiều lần, phân nhầy nhớt và có
máu.
Tụ cầu Staphylococcus aureus gây ngộ độc rất nhanh sau khi ăn khoảng 30 phút
đến 4 giờ. Triệu chứng bệnh đặc hiệu là tiết nước bọt nhiều, nôn mửa, tiêu chảy, quặn
đau cả bụng, nhức đầu, không sốt. Tuy triệu chứng dữ dội nhưng ít khi gây nguy hiểm
cho tính mạng.
Vibrio cholerae là loài vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên, gây dịch tả. Dịch bệnh
dễ phát sinh nơi nước bẩn và thực phẩm bị nhiễm trùng. Thời gian ủ bệnh là 24 - 48
giờ. Các triệu chứng lâm sàng bắt đầu xuất hiện và thay đổi từ tiêu chảy nhẹ đến tiêu
chảy ồ ạt, có thể gây tử vong (tỉ lệ hơn 60%) nếu không điều tri khẩn cấp và thích hợp.
Vibrio parahaemolyticus thường gặp ở nhuyễn thể và giáp xác trong nước biển
7


Thiết lập qui trình…

Kiều Thị Diễm Trang

lẫn nước ngọt. Các triệu chứng bệnh là đau bụng, tiêu chảy, buồn nôn, ớn lạnh, đau

đầu xuất hiện 12 giờ sau khi ăn những loại thực phẩm (đặc biệt là hải sản) chứa một
lượng lớn vi khuẩn sống.
Yersinia enterocolitica có thể hiện diện trong nhiều loại thức ăn khác nhau, đặc
biệt là thực phẩm đông lạnh. Triệu chứng bệnh là viêm đường ruột [16].
Ngoài các vi khuẩn nêu trên, NĐTP do vi sinh vật còn được gây ra bởi virut và
độc tố vi nấm.
Virut tồn tại ở thể không hoạt động khi ở bên ngoài tế bào, không thể tự nhân lên
trong nước hay trong thực phẩm. Virut nhiễm vào thực phẩm trong quá trình chế biến,
từ nước bị ô nhiễm [10]. Sự lan truyền virut qua người thông qua đường miệng đã
được biết đến từ năm 1950. Dịch cúm ở Hồng Kông (1998 - 1999) là do thịt gà có
nhiễm virut cúm (Influenza virus). Lassa virus gây xuất huyết mao mạch, dẫn đến sốc
và có thể chết. Virut này được truyền từ không khí, nước uống, nhất là thức ăn vào
người. Các virut đường ruột như Echo, Coxsackie, Poliovirus sống kí sinh ở đường
tiêu hóa nhưng có thể gây bệnh ở nhiều cơ quan khác nhau như hệ thần kinh (viêm
não, màng não), viêm cơ tim, cơ... Rhotavirus được lây lan bằng đường tiêu hóa gây
tiêu chảy, sốt, đau bụng, nôn và có thể dẫn đến mất nước. Bệnh viêm gan siêu vi A
(Hepatitis A virus) là một bệnh nhiễm trùng đường ruột điển hình, thường do nhiễm
phân, do thức ăn bị nhiễm virut. Cuối năm 2003 đầu năm 2004, nhiều quốc gia ở Châu
Á như Việt Nam, Thái Lan, Indonesia, Lào, Campuchia và ở các nước khác như Mỹ,
Canada... đã đối diện với đại dịch cúm gia cầm do Avian influenzae virus A týp
H5N1, H7N3, H7N7, H9N2 gây ra. Dịch cúm gia cầm do týp H5N1 đang là nguy cơ
đe dọa tính mạng cho người dân Việt Nam cũng như các nước Đông Nam Á [1].
Các chất độc của nấm mốc gọi chung là độc tố nấm mốc (mycotoxin) có độc tính
cực mạnh có khả năng gây ung thư cho người và động vật. Độc tố AAatoxin của
Aspergillus flavus, A. parasiticus được tạo ra trong đậu phông, bắp, hạt hướng dương
bị ẩm thấp. Độc tố này gây ung thư gan, ung thư tế bào biểu bì nang phổi.
Strerigmatostin do A. versicolor tạo ra có độc tính gần giống AAatoxin, thường hiện
diện nhiều ở phomai. Ergatamine rất độc đối với hệ tuần hoàn đã được tìm thấy ở giữa
thế kỉ XIX do nấm Claviceps purpurea tạo ra.
8

Thiết lập qui trình…

Kiều Thị Diễm Trang

Thực phẩm chứa nhiều chất dinh dưỡng nên là môi trường thuận lợi cho vi sinh
vật phát triển. Các vi khuẩn gây bệnh nêu trên phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nên khi
thực phẩm được chế biến trong điều kiện kém vệ sinh sẽ dễ bị nhiễm vi sinh vật gây
bệnh mặc dù về mặt cảm quan thực phẩm vẫn bình thường. Rối loạn tiêu hóa là triệu
chứng chung nhất trong đa số các vụ NĐTP, trong đó bệnh tiêu chảy do Salmonella,
Shigella và V. parahaemolyticus hiện được xem là mối đe dọa, gánh nặng bệnh tật cho
sức khỏe của người Việt Nam. Đây là một trong những bệnh dịch có nguy cơ nhiều
người mắc do sử dụng thực phẩm không đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm [17].

1.2.Đặc điểm sinh học và bệnh học của Vibrio parahaemolyticus
1.2.1.Đặc điểm hình thái và tăng trưởng
Vibrio parahaemolyticus là vi khuẩn gram (-), không sinh bào tử, có dạng hình
que, trụ, cong hoặc thẳng, kích thước 0,5 - 0,8 µm x 1,4 - 2,4µm, tồn tại ở dạng đơn
độc, đôi khi có dạng s hoặc dạng xoắn ốc. Loài này di chuyển bởi một hoặc vài tiêm
mao ở một cực [26].

9


Thiết lập qui trình…

Kiều Thị Diễm Trang

Đây là loài vi khuẩn ưa mặn, sinh trưởng ở nồng độ NaCl từ 0,5 - 10%. Nồng độ

NaCl 3% là tối ưu cho V. parahaemolyticus phát triển. Loài vi khuẩn này có thể sinh
trưởng ở nhiệt độ từ 5 - 43°c, tối ưu là 37°c. Ở điều kiện thuận lợi, thời gian thế hệ của
vi khuẩn là 9 - 10 phút. Mặc dù pH tối ưu là từ 7,8 - 8,6, nhưng loài này cũng có thể
sinh trưởng được ở pH từ 4,8 - li. Đặc biệt sự sinh trưởng bị ức chế khi có sự hiện diện
của 0,1% acetic acid (pH = 5,1). V. parahaemolyticus là vi khuẩn hiếu khí tùy ý có thể
sinh trưởng ở điều kiện có hoặc không có O 2 [28].
R

R

Trong môi trường lỏng TSB (Tryptic Soy Broth) 2% NaCl, vi khuẩn mọc nhanh,
tạo nhiều sinh khối. Khi được nuôi cấy trong điều kiện có ôxi (lắc) vi khuẩn làm đục
môi trường chỉ trong 4 giờ. Trên môi trường chọn lọc rắn TCBS (Thiosulfate Ciữate
Bite Salts sucrose), khuẩn lạc V. parahaemolyticus có màu xanh, bóng, nhô cao,
đường kính khoảng 3-4 mm, tâm có màu đậm hơn, không làm axit hóa môi trường
bên dưới khuẩn lạc, đây là đặc điểm để phân biệt với khuẩn lạc của V. cholerae [10].
V. parahaemolyticus hiện diện phổ biến trong nước biển và có thể tồn tại trong
thực phẩm thủy hải sản. ở điều kiện đông lạnh vi khuẩn này có thể sống sót. Tuy
nhiên số lượng có thể giảm từ lo - 100 lần. Đặc biệt loài này có thể tồn tại ở -18°c
trong 7 tuần. Do vậy thực phẩm đông lạnh cũng không loại trừ được nguy cơ nhiễm
và gây bệnh bởi V. parahaemolyticus. Đây là đặc điểm cần lưu ý khi bảo quản thực
phẩm nhất là thực phẩm đông lạnh [27].
Nhiệt độ bên trong thực phẩm đạt 65°c sẽ gây bất hoạt vi khuẩn. Dùng phương
pháp khử trùng Pasteur trong 10 phút ở 50°c đối với hàu cũng có thể gây bất hoạt V.
parahaemolyticus.
Vi khuẩn rất nhạy cảm với điều kiện thiếu nước. Nước ngọt cũng gây bất hoạt
cho vi khuẩn này. Ngoài ra V. parahaemolyticus còn có thể bị ức chế bởi 50 ppm
butylated hydroxyanisole, 0,1% sorbic acid hoặc bằng tia xạ (liều xạ 3KGy sẽ loại trừ
vi khuẩn này ở tôm đông lạnh).
1.2.2.Đặc điểm sinh hóa và miễn dịch

V. parahaemolyticus có phản ứng Oxidase (+), phát triển được trong canh
trypton ở 24°c, có phản ứng O-Nitrophenyl-D-Galactopyranoside (ONPG) (-),
10


Thiết lập qui trình…

Kiều Thị Diễm Trang

Arginine Dihydrolase (ADH) (-), Lysine Decarboxylase (LDC) (+), có khả năng khử
nitrate thành nitrite nhưtig không lên men được đường sucrose, sử dụng được một số
nguồn cacbonhydrate khác nhau để lên men nhưng không sinh hơi. Vi khuẩn không
tăng trưởng được trong môi trường không có muối, tăng trưởng được ương các môi
trường có 3%, 6% muối; ở các nồng độ 8%, 10% muôi sự tăng ứưởng yếu hoặc không
rõ.
Một đặc tính sinh hóa quan trọng của V. parahaemolyticus là phản ứng KP
(Kanagawa phenomenon). Đây là phản ứng làm tan huyết trên môi trường thạch máu
(Wagatsuma) của chủng V. parahaemolyticus nhờ vào sự hiện diện của gen tdh tạo
độc tố hemolysin bền nhiệt tdh (Thermostable direct hemolysin) [4]. Hầu hết các các
dòng V. parahaemolyticus cho phản ứng KP(+) là những dòng gây bệnh. Tuy nhiên
nhiều dòng V. parahaemolyticus cho phản ứng KP(-) cũng có thể gây bệnh do tạo
được độc tố TRH (Thermostable direct hemolysin-related hemolysin).
Kháng nguyên của V. parahaemolyticus được chia thành 3 loại: kháng nguyên
O, kháng nguyên K và kháng nguyên H.
- Kháng nguyên o là kháng nguyên màng tế bào bền với nhiệt, được chia thành
12 nhóm.
- Kháng nguyên K là kháng nguyên vỏ chịu nhiệt kém được chia thành 71 kiểu.
Sự phối hợp của các kháng nguyên trên cho phép xây dựng sơ đồ kháng nguyên
của V. parahaemolyticus được tóm tắt trong Bảng 2.

11


Thiết lập qui trình…

Kiều Thị Diễm Trang

- Kháng nguyên H là kháng nguyên tiêm mao, không quan trọng như hai loại
kháng nguyên trên.
Vào năm 2001, từ số liệu điều tra tổng quát về những trường hợp nhiễm vi
khuẩn V. parahaemolyticus trong vòng 5 năm, người ta đã xác định được 3 týp huyết
thanh có khả năng gây ra dịch là O3:K6, 04:K68, 0O:K25 [1]. Chủng O3:K6 được
phát hiện lần đầu tiên vào năm 1996 ở Bangladesh. Sau đó chủng này gây những đợt
dịch ngộ độc tại nhiều nước ở Châu Á, như ở Đài Loan trong các năm 1996- 1999
[20].
1.2.3.Đặc điểm bệnh học
1.2.3.1.Bệnh và cơ chế gây bệnh
Khi vào bụng, V. parahaemolyticus gây ra bệnh tiêu chảy với các triệu chứng
như đau thắt vùng bụng, buồn nôn, nôn, sốt và ớn lạnh. Thường những triệu chứng
này xuất hiện trong vòng 24 giờ sau khi nhiễm. Bệnh thường kéo dài từ Ì đến 7 ngày,
đôi khi dài hơn, trung bình khoảng 2,5 ngày. Có thể sử dụng một số kháng sinh thích
hợp để làm giảm triệu chứng. Bệnh thường tự khỏi, nhưng 7% trường hợp phải nhập
viện [29].
V. parahaemolyticus kháng được axit cao trong dạ dày để xuống ruột non là nhờ
các yếu tố giúp vi khuẩn đáp ứng thích nghi. Các yếu tố này là các protein màng ngoài
OMP (Outer membrane protein). Trong thực nghiệm in vitro khi bị gây sốc bằng pH
thấp, có 20 loại protein được tăng cường tổng hợp và 26 loại protein khác bị ức chế
[25].
Vượt qua rào cản pH ở dạ dày, vi khuẩn di chuyển xuống ruột non. Tại đây các
chủng V. parahaemolyticus KP(+) tiết ra độc tố TDH, các chủng V. parahaemolyticus

KP(-) tiết ra độc tố TRH. Các độc tố này có cấu tạo và cơ chế gây bệnh tương tự như
độc tố tả cholerae ở V. cholerae. Độc tố TDH và TRH được tạo thành từ 6 tiểu đơn vị
gồm 5 tiểu đơn vị B có vai trò gắn vào ganglioside GM-1 ở biểu mô ruột non và Ì tiểu
đơn vị A có vai trò hoạt hóa adenyl cyclase làm tăng tổng hợp AMP vòng (cAMP).
cAMP tác động lên niêm mạc ruột làm tăng tiết lon cr vào trong lòng ruột. Hậu quả là
NaCl được tích lũy cao ở bên trong lòng ruột nên nước bị kéo vào trong lòng ruột một
12


Thiết lập qui trình…

Kiều Thị Diễm Trang

cách thụ động, gây nên tiêu chảy. Tiêu chảy làm mất đi một lượng lớn nước cùng với
lon K+ và bicarbonate [1].
1.2.3.2.Gen mã hóa độc tố
TDH và TRH được mã hóa bởi hai gen gây bệnh tương ứng là tdh (Thermostable
direct hemolysin gene) và trh (Thermostable direct hemolysin -related hemolysin
gene). Gen tdh chỉ hiện diện trên các chủng V. parahaemolyticus có phản ứng KP(+)
và gen trh chỉ hiện diện ở các chủng có phản ứng KP(-). Hai gen tdh và trh có sự
tương đồng trình tự đến 69%.
Ngoài ra ở V. parahaemolyticus còn có gen tlh (thermolabile hemolysin gene)
mã hoa cho hemolysin không bền nhiệt TLH. Gen tlh đã được chứng minh là hiện
diện ở tất cả các dòng V. parahaemolyticus và được xem là chỉ thị chuyên biệt cho
loài V. parahaemolyticus.
Protein TDH chứa 165 axit amin, là một nhân tố gây bệnh chính của V.
parahaemolyticus. Trọng lượng phân tử của TDH trưởng thành là 18.496 Da và của
tiền TDH là 21.140 Da. TDH được cấu thành từ hai tiểu đơn vị được mã hóa từ cùng
một gen. Tiền TDH chứa một đoạn peptide tín hiệu gồm 24 axit amin với đầu N là
phenylalanine. Peptide tín hiệu được loại bỏ để tạo ra protein TDH trưởng thành. TDH

có tác dụng hấp thu lon từ hồng cầu, làm cho tế bào hồng cầu bị tan. Thụ thể của TDH
trên màng tế bào hồng cầu là gliosides GT1 và GDia.
TRH gồm 189 axit amin, trọng lượng phân tử 23 KDa chứa 2 axit amin là
systein hình thành cầu nối disulfide bên trong phân tử. TRH là tác nhân gây độc mạnh
lên tế bào và tim mạch. TRH có đáp ứng miễn dịch tương tự TDH, nhưng có hoạt tính
làm tan hồng cầu khác nhau.
1.2.3.3.Tình hình NĐTP do V. parahaemolyticus
Các ca ngộ độc do V. parahaemolyticus phổ biến ở Châu Á và Mỹ nhưng lại ít
gặp ở Châu Âu. Người bị nhiễm do tiêu thụ phải những thức ăn sống, do nấu ăn không
chín, cá bị nhiễm bẩn, các loài động vật hai mảnh, đặc biệt là loài hàu.
Ở Châu Á, V. parahaemolyticus là nguyên nhân phổ biến nhất cho thức ăn bị
nhiễm, có đến 70% bản báo cáo về thức ăn bị nhiễm ở thập niên 60, phần lớn xảy ra ở
13


Thiết lập qui trình…

Kiều Thị Diễm Trang

Nhật Bản, nơi có sở thích ăn cá sống. Ở Nhật Bản, các vụ NĐTP do V.
parahaemolyticus có xu hướng tăng: 102 vụ xuất hiện năm 1996, 160 vụ năm 1997 và
234 vụ năm 1998. Hầu hết các vụ xảy ra nhỏ, ít hơn 50 người, 6% vụ được phát hiện
gồm 50 - 449 người. V. parahaemolyticus là tác nhân thường xuyên gây ra các vụ
nhiễm thực phẩm qui mô nhỏ ở Nhật.
ở Đài Loan, trong những năm 1986 - 1995, có 197 ca NĐTP là do V.
parahaemolyticus và hơn 200 ca được báo cáo vào năm 1997.
Ở Mỹ các trường hợp nhiêm V. parahaemolyticus gan chặt với việc sử dụng hàu
sống. Năm 1997 có 209 người bị nhiễm và năm 1998 có 416 người bị bệnh tiêu chảy
do thói quen ăn hàu sống sau khi thu hoạch [21].
Ở Pháp, các vụ nhiễm V. parahaemolyticus cũng được báo cáo. Năm 1997, 44

người bị tiêu chảy sau khi dùng tôm nhập từ Châu Á. Trong số 5 mẫu được xét
nghiệm có 3 mẫu dương tính V. parahaemolyticus.
Ở Việt Nam tại tỉnh Khánh Hòa từ tháng 1-1997 đến tháng 11-1999 xảy ra các
trường hợp tiêu chảy: 31 trường hợp/1000 trẻ em dưới 6 tuổi, 61/1000 người từ 6 đến
65 tuổi và 13/1000 người trên 65 tuổi. Trong đó tỉ lệ nhiễm V. parahaemolyticus
tương ứng là 15%, 18%, 9%. số ca nhập viện là 42% đối với trẻ em và 28% đối với
người trưởng thành, không có trường hợp tử vong [24]. Bảng 3 ghi lại một số vụ
NĐTP do V. parahaemolyticus ở một số nước khác.

14


Thiết lập qui trình…

Kiều Thị Diễm Trang

1.2.3.4.An toàn về V. parahaemolyticus trong thực phẩm
Độc tố của V. parahaemolyticus không bền với nhiệt, do đó chỉ cần nấu chín
thức ăn thì có thể loại trừ được mối nguy hiểm này. Nhiệt độ nấu và thời gian nấu đối
với một số loại thực phẩm như sau [27], [28]:

1.3.Phương pháp phát hiện V. parahaemolyticus trong thực phẩm
1.3.1.Phương pháp nuôi cấy truyền thống
Phương pháp nuôi cấy truyền thống đã được xây dựng và phát triển từ những
năm 80 của thế kỷ XIX dựa trên cơ sở những công trình nghiên cứu của Pasteur và
Robert Koch. Mặc dù chưa có một cơ quan nào đánh giá về phương pháp nuôi cấy
nhưng do có quá trình lịch sử phát triển và ứng dụng lâu dài nên phương pháp này
được các cơ quan có thẩm quyền công nhận ở cấp quốc gia cũng như quốc tế. Do vậy,
mặc dù có nhiều nhược điểm như: tốn kém, mất nhiều thời gian, chậm thu kết quả,
mất nhiều công sức lao động... nhưng phương pháp này vẫn được áp dụng rộng rãi ở

nhiều nước trên thế giới và vẫn được xem là phương pháp tiêu chuẩn để đánh giá các
phương pháp thay thế khác.
Phương pháp nuôi cấy dùng để phát hiện V. parahaemolyticus được dựa trên các
15


Thiết lập qui trình…

Kiều Thị Diễm Trang

đặc điểm về sự hình thành khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy chọn lọc và các đặc
điểm sinh hóa. Quy trình dùng để phát hiện V. parahaemolyticus trong thực phẩm
bằng phương pháp nuôi cấy chỉ cho kết quả sau 4 ngày kể từ ngày phân tích mẫu và
được thực hiện qua các bước sau:
- Tăng sinh chọn lọc: nhằm làm tăng số lượng V. parahaemolyticus có trong mẫu
đồng thời ức chế sự tăng trưởng của các vi sinh vật khác.
- Phân lập: nhằm tách V. parahaemolyticus ra khỏi các vi sinh vật khác có trong
mẫu.
- Thử nghiệm sinh hóa: nhằm khẳng định các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi
trường phân lập bằng các thử nghiệm sinh hóa như: Lysine Decarboxylase (LDC), ONitrophenyl- D-Galactopyranoside (ONPG), oxidase, lactose, Arginine Dihydrolase
(ADH), Kliger Iron Agar (KIA), khả năng chịu mặn NaCl 0%, 3%, 6%, 8%, 10%.
Nếu các chủng vi sinh vật nghi ngờ có biểu hiện sinh hóa phù hợp thì được kết luận là
mẫu dương tính V. parahaemolyticus.
- Thử nghiệm kháng huyết thanh: để xác định kiểu huyết thanh, các chủng V.
parahaemolyticus được thử nghiệm ngừng kết với các huyết thanh O và K [10].
1.3.2.Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Để khắc phục những nhược điểm của phương pháp truyền thống, nhiều phương
pháp nhanh và tự động đã được phát triển và thương mại hóa dựa trên sự phát triển
mạnh mẽ của kỹ thuật sinh học hiện đại, trên nguyên tắc của phản ứng miễn dịch và
dựa trên phân tử DNA. Các phương pháp này được gọi chung là các phương pháp

không truyền thống và đều có ưu điểm là cho kết quả nhanh, chính xác, thao tác đơn
giản và có thể tự động hóa.
Trong số các phương pháp phân tích miễn dịch, phương pháp hấp phụ miễn dịch
nhờ enzym ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) hay EIA (Enzyme
immunosorbent assay) được quan tâm nhiều do có tính đơn giản và hiệu quả cao.
Nguyên tắc của kỹ thuật ELISA là sử dụng kháng thể phủ bên ngoài những đĩa giếng
(microplate) để giữ lại tế bào vi khuẩn trong mẫu thông qua sự gắn giữa kháng thể và
kháng nguyên mục tiêu trên bề mặt tế bào. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện
16