XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG METRONIDAZOL TRONG HUYẾT TƯƠNG CHÓ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG METRONIDAZOL TRONG
HUYẾT TƯƠNG CHÓ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Bùi Thị Thanh Châm*, Nguyễn Thu Quỳnh, Nguyễn Khắc Tùng, Đoàn Thanh Hiếu
Trường Đại học Y- Dược – ĐHTN
TÓM TẮT
Metronidazol là một dẫn chất nitroimidazol được sử dụng từ lâu trong điều trị các
bệnh do vi khuẩn kị khí, động vật nguyên sinh như amip, Giardia. Mục đích của nghiên
cứu nhằm thẩm định nồng độ metronidazol trong huyết tương chó bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với chuẩn nội carbamazepin ở bước sóng 320nm. Sau
khi kết tủa protein trong huyết tương bằng acetonitril, metronidazol và chuẩn nội được
tiến hành định lượng với điều kiện sắc ký: cột RESTEK untra C18 (5àm 250ì4,6mm)
nhit 25C, pha ng acetonitril : đệm K2HPO4 pH 4,5 tỷ lệ 30:70 (v/v), tốc độ dịng
1,0 ml/phút. Phương pháp phân tích có giới hạn định lượng dưới là 0,02 μg/ml, RSD <
20%. Khoảng tuyến tính 0,2 - 40 µg/ml. Độ chính xác 4,22 – 11,65%. Độ đúng 100,68 –
106,49%. Phương pháp này có thể được sử dụng trong đánh giá sinh khả dụng
metronidazol giải phóng tại đại tràng.
Từ khóa: Định lượng, Metronidazol, huyết tương chó, sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC)
ĐẶT VẤN ĐỀ
Metronidazol là một dẫn chất 5 - nitro - imidazol, có phổ hoạt tính rộng trên động vật
nguyên sinh như amip, Giardia và vi khuẩn kị khí. Thuốc có tác dụng rất mạnh trong
điều trị nhiễm động vật nguyên sinh như Entamoeba histolytica, Giardia lamblia và
Trichomonas vaginalis [1]. Với mục đích tăng cường tác dụng điều trị đồng thời làm
giảm tác dụng không mong muốn của metronidazol, chúng tôi nghiên cứu bào chế viên
metronidazol giải phóng tại đại tràng. Để đánh giá mức độ giải phóng, hấp thu của thuốc
tại đích cần định lượng được nồng độ của thuốc trong huyết tương sau khi uống. Vì vậy,
chúng tơi tiến hành nghiên cứu này với mục tiêu xây dưng phương pháp định lượng
metronidazol trong huyết tương chó bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, đồng thời thẩm
định lại phương pháp, làm cơ sở để đánh giá sinh khả dụng của chế phẩm so với dạng
bào chế thông thường.

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nội dung nghiên cứu
(I)Lấy máu tĩnh mạch cổ chó, ly tâm lấy huyết tương.
(II) Pha dung dịch gốc metronidazol (MTZ) và carbamazepin (CAR) rồi pha loãng thành
các nồng độ khác nhau bằng huyết tương trắng.
(III) Ly tâm, loại tủa, lọc qua màng lọc và định lượng bằng phương pháp HPLC
(IV) Xử lý, phân tích, đánh giá kết quả
Phương pháp nghiên cứu
(I) Súc vật thí nghiệm là chó đực, trọng lượng 10- 12 kg, lấy máu tĩnh mạch cổ, đem ly
tâm 3000 vòng/ phút, thu lấy phần dung dịch trong được huyết tương trắng.
(II) Dung dịch gốc: 1mg MTZ và 0,2 mg CAR pha trong acetonitril (ACN), sau đó pha
lỗng thành các nồng độ khác nhau bằng huyết tương trắng


(III) Ly tâm, loại tủa, lọc qua màng lọc 0,45 µm rồi tiến hành định lượng bằng phương
pháp HPLC với cỏc iu kin:
- Ct RESTEK untra C18 5àm 250ì4,6mm
- Nhit độ phân tích: nhiệt độ phịng
- Detector UV: 320 nm
- Thể tích tiêm: 20µl
- Pha động: acetonitrile, đệm phosphat pH 4,5 thêm 0,1% TEA tỷ lệ 30: 70
- Tốc độ dịng 1ml/phút
- Thể tích tiêm: 20µl
- Chất chuẩn metronidazol do Viện kiểm nghiệm cung cấp
- Chuẩn nội: carbamazepin do Viện kiểm nghiệm cung cấp
- Các hóa chất sử dụng đạt tiêu chuẩn dành cho HPLC.

Hình 1. Sắc ký đồ mẫu thử
Thẩm định quy trình định lượng: Theo hướng dẫn của FDA (2001) (độ đặc hiệu,
giới hạn định lượng dưới, độ tuyến tính, tỷ lệ thu hồi, độ ổn định) [3].

(iiii) Xử lý, phân tích, đánh giá kết quả dựa trên thời gian lưu t R, diện tích và chiều cao
các pic thu được trên sắc ký đồ.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Khảo sát và lựa chọn thơng số q trình sắc ký:
Sau q trình khảo sát với điều kiện sẵn có của phịng thí nghiệm, lựa chọn được
điều kiện sắc ký có khả năng tách riêng được pic của MTZ khỏi các thành phần tạp có
trong mẫu huyết tương như sau:


- Ct sc ký: ct RESTEK untra C18, 250ì4,6mm, 5àm
- Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phịng
- Pha động: acetonitrile, đệm phosphat pH 4,5 thêm 0,1% TEA tỷ lệ 30: 70
- Bước sóng phát hiện: 320 nm
- Tốc độ dịng 1ml/phút
- Thể tích tiêm: 20µl
- Chuẩn nội: carbamazepin
2. Thẩm định phương pháp
2.1. Tính đặc hiệu của phương pháp
Phân tích các mẫu trắng và mẫu chuẩn có nồng độ MTZ, CAR là 40µg/ml.
Kết quả phân tích cho thấy: trên sắc đồ mẫu chuẩn xuất hiện pic của MTZ với
thời gian lưu 2,59 phút và pic của CAR với thời gian lưu 4,79 phút (Hình 1); Sắc ký đồ
mẫu trắng khơng có pic tại các vị trí này (Hình 2)

Hình 2.Sác ký đồ mẫu trắng
Điều kiện sắc ký như trên là tối ưu cho sự phân tách MTZ ra khỏi các pic của
huyết tương.


2.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Phân tích các mẫu chuẩn metronidazol trong huyết tương có nồng độ từ 0,2 đến

40 µg/ml từ đáp ứng pic của MTZ và chuẩn nội CAR tại các nồng độ tương ứng, xây
dựng phương trình hồi qui giữa tỷ lệ đáp ứng pic của MTZ/CAR và nồng độ MTZ có
trong mẫu. Đường chuẩn phải có hệ số tương quan > 0,98 và ít nhất 75% số điểm của
đường chuẩn, bao gồm cả mẫu có nồng độ thấp nhất và mẫu có nồng độ cao nhất phải có
độ đúng nằm trong khoảng từ 85% đến 115% theo qui định. Riêng điểm thấp nhất của
đường chuẩn cho phép sai số không quá 20% [2].
Kết quả thu được trình bày ở Bảng 1 và Hình 3.
Bảng 1. Kết quả đánh giá độ tuyến tính của phương pháp định lượng MTZ trong
huyết tương
Nồng độ
A(mAU,s)
C xác định từ đường chuẩn
(µg/ml)
Nồng độ
So với giá trị
MTZ
CAR
MTZ/CAR
(µg/ml)
thực (%)
0,2
469565,15 6345475
0,074
0,076
100,5
0,5
561299,082 6035474
0,093
0,092
97,4

1
686902,2
5724185
0,120
0,118
99,9
5
1898781
5491888
0,346
0,331
105,6
10
3286035
5512413
0,596
0,597
103,6
20
5971858
5424720
1,101
1,129
105,6
40
12984899
5892683
2,204
2,193
85,5

Hình 3. Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic
MTZ/CAR và nồng độ MTZ trong huyết tương


Nhận xét: Đường chuẩn với giá trị R2= 0,9997 > 0,98 và tất cả các điểm trên
đường chuẩn đều có độ đúng nằm trong khoảng từ 85% đến 115%. Điều này cho thấy,
trong khoảng nồng độ đó khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ MTZ trong
huyết tương với tỷ lệ diện tích pic chuẩn/chuẩn nội thu được. Khoảng tuyến tính này
phù hợp để định lượng MTZ trong huyết tương. Khoảng tuyến tính này xác định được từ
0,2 - 40 µg/ml.
2.3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
Xác định đáp ứng pic của mẫu chuẩn, mẫu trắng. Tính nồng độ MTZ trong mẫu
chuẩn từ tỷ lệ diện tích pic của MTZ/CAR và đường chuẩn; từ đó xác định độ đúng
bằng cách so sánh với giá trị thực có trong mẫu.
Bảng 2. Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
Diện tích pic (mAU.s)
STT
Mẫu chuẩn
Mẫu trắng
MTZ
CAR
Rt=2.600-2.607
Rt=4.807-4.820
1
469565 6345475
2
456424 6342088
3
445412 6355157

4
468782 6279421
5
490389 6035474
6
515836 5711308
474401
SD
25263
RSD (%)
5.33
Kết quả ở Bảng 2 cho thấy, tại khoảng thời gian 2,6 phút đáp ứng của mẫu huyết
tương trắng bằng 0, đáp ứng của mẫu chuẩn lớn hơn đáp ứng của mẫu huyết tương trắng
> 5 lần, và độ lặp lại sau 6 lần phân tích cho RSD = 5,33 (< 20%). Như vậy, mẫu chuẩn
chứa MTZ có nồng độ 0,2µg/ml đáp ứng u cầu là giới hạn định lượng dưới và phương
pháp phân tích đã đủ độ nhạy để định lượng MTZ trong huyết tương.
2.4. Xác định độ đúng, độ chính xác của phương pháp
Kết quả ở Bảng 3 cho thấy phương pháp có độ đúng đạt yêu cầu (100,68 – 106,49%) độ
lệch nằm trong giới hạn cho phép (± 15%) là độ lặp lại với các giá trị RSD (4,22 –
11,65%). Phương pháp phân tích MTZ trong huyết tương chó đáp ứng u cầu về độ
đúng, độ chính xác của phương pháp phân tích trong dịch sinh học.
Bảng 3. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp
Diện tích pic (mAU,s)
Mẫu STT
Độ đúng
Thống kê
MTZ
CAR
MTZ/CAR
1

644566
5847292
0,110
113,6
2
591547
5881877
0,101
89,4
LQC
= 105,63%


SD = 11,09
RSD (%) = 10,50
3
645089
5841104
0,110
114,1
4
601189
5765239
0,104
98,7
5
615613
5611084
0,110
112,3

MQC
1
1852680 6279421
0,295
108,1
= 106,49%
SD = 4,50
2
1574681 5711308
0,276
99,1
RSD (%) = 4,22
3
1618956 5559215
0,291
106,4
4
1561909 5183772
0,301
111,1
5
1514788 5146702
0,294
107,8
HQC
1
8830543 6171174
1,431
85,6
= 100,68%

SD = 11,73
2
9071125 5935162
1,528
91,7
RSD (%) = 11,65
3
10949270 6359211
1,722
103,8
4
11128461 6187296
1,799
108,6
5
10800629 5746747
1,879
113,7
2.5. Xác định độ tìm lại của phương pháp
Tỷ lệ thu hồi:
Xác định tỷ lệ thu hồi của chất chuẩn và nội chuẩn bằng cách so sánh diện tích
pic của MTZ và CAR từ mẫu huyết tương với diện tích pic của chúng trong mẫu pha
động có chứa cùng nồng độ. Kết quả thu được ở Bảng 4.
Bảng 4. Kết quả xác định độ tìm lại của phương pháp
Diện tích pic
% tìm lại
STT
Huyết tương
Pha động
SpicMTZ Spic CAR SpicMTZ Spic CAR MTZ

CAR
1
644566
5847292
756591
6560315
85.2
89.1
LQC
2
591547
5881877
883560
6729560
67.0
87.4
3
645089
5841104
914632
6455114
70.5
90.5
4
601189
5765239
795602
6840062
75.6
84.3

5
615613
5611084
661079
7052193
93.1
79.6
Diện tích pic
% tìm lại
STT
MQC
Huyết tương
Pha động
SpicMTZ Spic CAR SpicMTZ Spic CAR MTZ
CAR
1
1852680 6279421 1995783 6960315
92.8
90.2
2
1574681 5711308 2073565 7729560
75.9
73.9
3
1618956 5559215 1904670 7685114
85.0
72.3


HQC

4
5
STT

1
2
3
4
5

1561909
1514788

5183772 1785662 6840062
5146702 1972599 7052193
Diện tích pic
Huyết tương
Pha động
SpicMTZ Spic CAR SpicMTZ Spic CAR
8830543 6171174 8547203 5729856
9071125 5935162 9505830 5692052
10949270 6359211 9969369 6894456
11128461 6187296 13940145 6972108
10800629 5746747 9920384 7120748

87.5
75.8
76.8
73.0

% tìm lại
MTZ
103.3
95.4
109.8
79.8
108.9

CAR
107.7
104.3
92.2
88.7
80.7

KẾT LUẬN
Đã xây dựng được phương pháp định lượng metronidazole trong huyết tương chó
với cột sắc ký RESTEK untra C18 5μm 250x4,6mm ở bước sóng 320nm, pha động
acetonitril: đệm phosphat pH 4,5 (30:70), tốc độ dịng 1ml/phút có thể áp dụng để
nghiên cứu, đánh giá sinh khả dụng của viên metronidazol giải phóng tại đại tràng.
Phương pháp đã được thẩm định các chỉ tiêu theo hướng dẫn về thẩm định
phương pháp phân tích dịch sinh học: tính đặc hiệu với MTZ, giới hạn định lượng dưới,
khoảng tuyến tính để định lượng MTZ trong dịch sinh học là 0,2 - 40 µg/ml. độ chính
xác đạt yêu cầu phân tích dùng trong phân tích dịch sinh học.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Bộ Y tế (2002), Dược thư quốc gia Việt Nam
[2] Trần Thị Vân Anh và cộng sự (2014), Định lượng metformin trong huyết tương chó
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, Tạp chí Y - Dược học quân sự số 8-2014
[3] FDA, US, Department of Health and Human Service, Center for drug evaluation and
research (2001) Guidance for industry, bioanalytical method validation.

ABSTRACT
DERTEMINATION OF METRONIDAZOLE IN DOG PLASMA BY HIGH
PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
Bui Thi Thanh Cham*, Nguyen Thu Quynh, Nguyen Khac Tung, Đoan
Thanh Hieu
Thainguyen University of Medicine and Pharmacy
Metronidazole [2-methyl-5-nitroimidazole-1-ethanol] is a nitroimidazol
derivative, which is used in the long term therapy for trichomoniasis, amoebiasis and
giardiasis. The aim of this study is to validate the analytical method of metronidazole in
dog plasma by high pressure liquid chromatography (HPLC) with detector UV (at
320nm) using carbamazepine as an intenal standard. After precipating protein in plasma
by acetonitrile, metronidazole and intenal standard were eluted from RESTEK untra
C18 column (5àm 250ì4,6mm) at 25⁰C with a mobile phase consisting of acetonitrile
and pH 4,5 K2HPO4 (30:70 v/v), at a flow rate of 1.0 ml/min. 0,1% TEA was added to
the mobile phase to help for the elution.The lower limit of quantitation was 0,02 μg/ml


with a relative standard deviation of less than 20%. A linear range of 0,2 - 40 µg/ml was
established. This HPLC method was validated with the precision of 2,70 – 6,35%,
respectively. The accuracy was 100,68 – 106,49% respectively. This validated method is
sensitive and repetable enough to be used in bioavailability studies in dogs.
Keywords: Dertermination, metronidazol, dog plasma, high performance liquid
chromatography (HPLC)