Chuong VI Bảo quản và nhân giống vi sinh vật

Chương 6: Bảo quản và nhân
giống vi sinh vật


1. Bảo quản vi sinh vật
Phương pháp cấy chuyền định kỳ
Phương pháp bảo quản ở nhiệt độ thấp
Phương pháp đông khô
Các phương pháp bảo quản khác



Mục đích – Nguyên tắc bảo quản giống VSV





Giống là gì?
Mục đích bảo quản giống vi sinh vật:

Nguyên tắc:
 Giữ giống dưới dạng tế bào sinh dưỡng
 Giữ giống dưới dạng bào tử


Phương pháp cấy chuyền định kỳ





Ứng dụng: vi khuẩn, nấm men, nấm
mốc…
Sử dụng môi trường đặc
Điều kiện bảo quản: nhiệt độ thấp (46 oC), nơi tối
Thời gian giữa 2 lần cấy chuyền: 3 –
6 tháng


Phương pháp cấy chuyền định kỳ




Ưu điểm:
 Đơn giản, dễ làm
 Phổ biến, ứng dụng cho nhiều loại vi sinh vật khác
nhau
 Quá trình hoạt hóa đơn giản
Nhược điểm:
 Chỉ thích hợp cho phòng thí nghiệm, qui mô sản xuất
nhỏ
 Thời gian bảo quản giống ngắn
 Nếu cấy chuyền thường xuyên: VSV sẽ bị mất hoạt
tính
 Bộ sưu tập giống lớn:


Phương pháp cấy chuyền định kỳ




Có thể kết hợp sử dụng
dầu khoáng để kéo dài
thời gian giữa 2 lần cấy
chuyền (6 – 12 tháng)
Tác dụng lớp dầu khoáng:





Tránh nhiễm khuẩn
Giảm thời gian khô hóa
môi trường

Nhược điểm:



Kỹ thuật gieo cấy phức
tạp
Khi muốn sử dụng VSV :
kỹ thuật phức tạp

1 cm
30o

Phương pháp cấy chuyền định kỳ




Có thể kết hợp sử dụng
dầu khoáng để kéo dài
thời gian giữa 2 lần cấy
chuyền (6 – 12 tháng)
Tác dụng lớp dầu khoáng:





Tránh nhiễm khuẩn
Giảm thời gian khô hóa
môi trường

Nhược điểm:



Kỹ thuật gieo cấy phức
tạp
Khi muốn sử dụng VSV :
kỹ thuật phức tạp


Phương pháp cấy chuyền định kỳ



Bảo quản VSV trong nước cất:


Phương pháp bảo quản ở nhiệt độ thấp






Ứng dụng: một số vi khuẩn, virus…
Sử dụng nhiệt độ: -20  40oC, -80oC hoặc -196oC
Quy trình: nuôi vi sinh vật trên các môi trường tổng hợp
giàu dinh dưỡng  cho vào các ampoule  hạ nhiệt độ về
giá trị đã chọn  bảo quản.
Chất bảo vệ (protector): phổ biến là glycerol, saccharide,
dimethylsulfocid,…
 Cơ chế bảo vệ:

Ví dụ: bổ sung Tween 20 (sodium oleate) – 0,1% vào môi
trường nuôi Lactobacillus bulgaricus


Phương pháp bảo quản ở nhiệt độ thấp


Ưu điểm:








Nhược điểm:





Rất khó bị nhiễm VSV từ môi trường ngoài
Cả tế bào dinh dưỡng cũng được bảo quản bằng phương pháp
này
Thời gian bảo quản lâu nhưng không làm thay đổi hoạt tính của
VSV
Rất tốn kém, đắt tiền

Trước khi sử dụng: cần làm tan giá môi trường và hoạt
hóa VSV
Yếu tố quan trọng: tốc độ giảm nhiệt độ trong quá trình
lạnh đông và tốc độ tăng nhiệt độ trong quá trình tan giá.


Phương pháp đông khô



Ứng dụng: vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, tảo, virus…

Quy trình:










Hạ nhiệt độ mẫu chứa sinh khối VSV để nước chuyển từ trạng
thái lỏng sang trạng thái rắn,
Tạo áp lực chân không và nâng nhiệt độ để nước chuyển từ trạng
thái rắn sang trạng thái hơi.

Độ ẩm sau khi sấy thăng hoa: 2 – 6%
Điều kiện bảo quản: T = 4 – 6oC, môi trường khí trơ hoặc
chân không cho kết quả rất tốt.
Trước khi sử dụng: cần hoạt hóa VSV
Ưu điểm:
Nhược điểm:


Các phương pháp bảo quản khác


Phương pháp bảo quản vi sinh vật trong đất, cát, trên hạt
ngũ cốc…
 Sấy khô bằng không khí: bảo quản một số vi khuẩn,

virus. Đây thường làn những loại gây bệnh  bảo
quản trực tiếp trên vật chủ
• Ví dụ:
 Bảo quản trong môi trường silicagel: chỉ bảo quản
được bào tử, không bảo quản tế bào dinh dưỡng.
 Bảo quản trong đất:


Chú ý


Để an toàn, thường phối hợp 2 phương pháp bảo quản
cùng 1 lúc:








Vi khuẩn, tảo lam: cấy chuyền
Protozoa: bảo quản ở nhiệt độ thấp với sự có mặt của các chất
chống đông
Vi khuẩn:
• cấy chuyền
• Nitơ lỏng, đông khô
Virut:
• virus thực vật: Sấy khô đơn giản trong không khí
• Virus động vật: bảo quản cùng mô động vật  đông khô

Nấm men, nấm mốc:
• cấy chuyền và bảo quản dưới dầu
• Cấp đông, đông khô


2. Nhân giống vi sinh vật


Nguyên tắc





Sử dụng canh trường vi sinh vật thuần khiết
Chọn môi trường lỏng/rắn có thành phần tối ưu cho sự
sinh sản của giống vi sinh vật
Chọn các điều kiện nuôi tối ưu cho sự sinh sản của giống
Tăng dần thể tích các canh trường sau mỗi giai đoạn nhân
giống


Cách thực hiện


2 giai đoạn:
 Nhân giống ở phòng thí nghiệm:
• Điều kiện vô trùng
• Thể tích canh trường giống tăng lên đến 10L
• Sử dụng ống nghiệm, tủ ấm, erlenmeyer, thiết bị lắc

điều nhiệt, bình nuôi cấy thủy tinh có thể khuấy trộn
và điều nhiệt
 Nhân giống ở phân xưởng:
• Điều kiện vô trùng hoặc bán vô trùng
• Sử dụng thiết bị nhân giống có cánh khuấy và bộ
phận sục khí vô trùng.


Các điều kiện nuôi







Nhiệt độ
pH
Sự khuấy trộn
Cung cấp oxy
Độ ẩm
Thời gian


Kiểm tra chất lượng giống




Hiệu suất thu hồi sinh khối

Tỉ lệ tế bào chết
Hoạt tính giống