Chuong VI Bảo quản và nhân giống vi sinh vật

Chương 6: Bảo quản và nhân
giống vi sinh vật


1. Bảo quản vi sinh vật
Phương pháp cấy chuyền định kỳ
Phương pháp bảo quản ở nhiệt độ thấp
Phương pháp đông khô
Các phương pháp bảo quản khác



Mục đích – Nguyên tắc bảo quản giống VSV


Giống là gì?



Mục đích bảo quản giống vi sinh vật: bảo tồn hoạt tính của vi sinh vật theo
thời gian



Nguyên tắc:



Giữ giống dưới dạng tế bào sinh dưỡng
Giữ giống dưới dạng bào tử

Phương pháp cấy chuyền định kỳ





Ứng dụng: vi khuẩn, nấm men, nấm
mốc…
Sử dụng môi trường đặc
Điều kiện bảo quản: nhiệt độ thấp (46 oC), nơi tối
Thời gian giữa 2 lần cấy chuyền: 3 –
6 tháng


Phương pháp cấy chuyền định kỳ


Ưu điểm:






Đơn giản, dễ làm, rẻ tiền
Phổ biến, ứng dụng cho nhiều loại vi sinh vật khác nhau
Quá trình hoạt hóa đơn giản

Nhược điểm:







Chỉ thích hợp cho phòng thí nghiệm, qui mô sản xuất nhỏ
Thời gian bảo quản giống ngắn
Nếu cấy chuyền thường xuyên: VSV sẽ bị mất hoạt tính
Dễ bị lây nhiễm các VSV khác trong môi trường xung quanh
Bộ sưu tập giống lớn:


Phương pháp cấy chuyền định kỳ




Có thể kết hợp sử dụng dầu
khoáng để kéo dài thời gian giữa
2 lần cấy chuyền (6 – 12 tháng)
Tác dụng lớp dầu khoáng:






Hạn chế sự trao đổi chất của
VSV

Tránh nhiễm khuẩn
Giảm thời gian khô hóa môi
trường

Nhược điểm:



Kỹ thuật gieo cấy phức tạp
Khi muốn sử dụng VSV : kỹ
thuật phức tạp

1 cm
30o


Phương pháp cấy chuyền định kỳ




Có thể kết hợp sử dụng dầu
khoáng để kéo dài thời gian giữa
2 lần cấy chuyền (6 – 12 tháng)
Tác dụng lớp dầu khoáng:






Hạn chế sự trao đổi chất của VSV
Tránh nhiễm khuẩn
Giảm thời gian khô hóa môi
trường

Nhược điểm:



Kỹ thuật gieo cấy phức tạp
Khi muốn sử dụng VSV : kỹ thuật
phức tạp


Phương pháp cấy chuyền định kỳ


Bảo quản VSV trong nước cất:


Phương pháp bảo quản ở nhiệt độ thấp






Ứng dụng: một số vi khuẩn, virus…
Sử dụng nhiệt độ: -20  40oC, -80oC hoặc -196oC

Quy trình: nuôi vi sinh vật trên các môi trường tổng hợp
giàu dinh dưỡng  cho vào các ampoule  hạ nhiệt độ về
giá trị đã chọn  bảo quản.
Chất bảo vệ (protector): phổ biến là glycerol, saccharide,
dimethylsulfocid,…
 Cơ chế bảo vệ:

Ví dụ: bổ sung Tween 20 (sodium oleate) – 0,1% vào môi
trường nuôi Lactobacillus bulgaricus


Phương pháp bảo quản ở nhiệt độ thấp


Ưu điểm:






Nhược điểm:




Rất khó bị nhiễm VSV từ môi trường ngoài
Cả tế bào dinh dưỡng cũng được bảo quản bằng phương
pháp này
Thời gian bảo quản lâu nhưng không làm thay đổi hoạt tính

của VSV
Rất tốn kém, đắt tiền

Chú ý:



Trước khi sử dụng: cần làm tan giá môi trường và hoạt hóa
VSV
Yếu tố quan trọng: tốc độ giảm nhiệt độ trong quá trình lạnh
đông và tốc độ tăng nhiệt độ trong quá trình tan giá.


Phương pháp đông khô



Ứng dụng: vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, tảo, virus…
Quy trình:








Hạ nhiệt độ mẫu chứa sinh khối VSV để nước chuyển từ
trạng thái lỏng sang trạng thái rắn,
Tạo áp lực chân không và nâng nhiệt độ để nước chuyển từ

trạng thái rắn sang trạng thái hơi.

Độ ẩm sau khi sấy thăng hoa: 2 – 6%
Điều kiện bảo quản: T = 4 – 6 oC, môi trường khí trơ hoặc
chân không cho kết quả rất tốt.
Trước khi sử dụng: cần hoạt hóa VSV




Ưu điểm:






Áp dụng nhiều nhất, tốt nhất (vì ít làm thay đổi hoạt tính của
VSV
Có thể bảo quản ở nhiệt độ thường
Vận chuyển nhẹ nhàng, gọn nhẹ, ít bị nhiễm

Nhược điểm:



Đắt tiền
Cần trang thiết bị hiện đại (máy sấy thăng hoa)

Các phương pháp bảo quản khác


Phương pháp bảo quản vi sinh vật trong đất, cát, trên hạt ngũ cốc…


Sấy khô bằng không khí: bảo quản một số vi khuẩn, virus.
Đây thường là những loại gây bệnh  bảo quản trực tiếp
trên vật chủ
•





Ví dụ:

Bảo quản trong môi trường silicagel: chỉ bảo quản được bào
tử, không bảo quản tế bào dinh dưỡng.
Bảo quản trong đất:


Chú ý


Để an toàn, thường phối hợp 2 phương pháp bảo quản
cùng 1 lúc:








Vi khuẩn, tảo lam: cấy chuyền
Protozoa: bảo quản ở nhiệt độ thấp với sự có mặt của các chất
chống đông
Vi khuẩn:
• cấy chuyền
• Nitơ lỏng, đông khô
Virut:
• virus thực vật: Sấy khô đơn giản trong không khí
• Virus động vật: bảo quản cùng mô động vật  đông khô
Nấm men, nấm mốc:
• cấy chuyền và bảo quản dưới dầu
• Cấp đông, đông khô


Nhân giống vi sinh vật


Nguyên tắc


Sử dụng canh trường vi sinh vật thuần khiết



Chọn môi trường lỏng/rắn có thành phần tối ưu cho sự sinh sản của giống vi

sinh vật



Chọn các điều kiện nuôi tối ưu cho sự sinh sản của giống



Tăng dần thể tích các canh trường sau mỗi giai đoạn nhân giống


Cách thực hiện


2 giai đoạn:


Nhân giống ở phòng thí nghiệm:
•
•
•



Điều kiện vô trùng
Thể tích canh trường giống tăng lên đến 10L
Sử dụng ống nghiệm, tủ ấm, erlenmeyer, thiết bị lắc
điều nhiệt, bình nuôi cấy thủy tinh có thể khuấy trộn
và điều nhiệt

Nhân giống ở phân xưởng:
•
•

Điều kiện vô trùng hoặc bán vô trùng
Sử dụng thiết bị nhân giống có cánh khuấy và bộ
phận sục khí vô trùng.


Các điều kiện nuôi


Nhiệt độ



pH



Sự khuấy trộn



Cung cấp oxy



Độ ẩm



Thời gian


Kiểm tra chất lượng giống




Hiệu suất thu hồi sinh khối
Tỉ lệ tế bào chết
Hoạt tính giống