Bộ câu hỏi Đề thi đáp án thi học sinh giỏi thành phố môn Sinh học lớp 12

Trường THPT chuyên Nguyễn Huệ
Bộ môn Sinh học

Bộ câu hỏi ôn thi học sinh giỏi
thành phố môn Sinh học.
(Lưu hành nội bộ)


CHỈ THỊ PHÂN TỬ
1. Đa dạng di truyền là gì?
Đa dạng di truyền ý nói đến sự biến động của những gene bên trong loài, đó là những biến dị có
thể thừa kế bên trong hoặc giữa những quần thể của các cá thể. Kết quả là tất cả những biến dị ở lại
bên trong chuỗi 4 base pairs mà bao gồm phân tử DNA và như vậy tạo thành code di truyền. Những
kiểu đa dạng di truyền khác cũng có thể được xác định ở tất cả các mức độ của cơ thể trong nhân,
bao gồm lượng DNA trên tế bào, số lượng chromosome và cấu trúc DNA.
Các thế hệ của biến dị di truyền mới xảy ra liên tục trong những cá thể thông qua những đột
biến nhiễm sắc thể và đột biến gene, mà trong các cá thể sinh sản hữu tính được nhân giống thông
qua sự tái tổ hợp. Biến dị di truyền cũng bị ảnh hưởng bởi sự chọn lọc. Kết quả của những hiện
tượng này là những thay đổi trong gene và allele mà liên quan đến sự tiến hoá quần thể. Những trạng
thái tương tự có thể xảy ra thông qua chọn lọc nhân tạo như là việc nuôi dưỡng rèn luyện.
2. Biến động di truyền là gì? Biến động di truyền được xác định như thế nào?
Biến động di truyền là những sự biến đổi ngẫu nhiên vô hướng về tần số allele và các kiểu gen
trong tất cả các quần thể, nhưng đặc biệt là ở các quần thể nhỏ và không cần có sự chọn lọc tự nhiên.
Biến động di truyền xảy ra thuần túy ngẫu nhiên, mang tính xác suất và tỷ lệ nghịch với kích
thước quần thể. Trong một quần thể lớn, thông thường biến động di truyền chỉ gây ra một sự thay đổi
ngẫu nhiên nhỏ. Nhưng trong các quần thể nhỏ, nó có thể gây ra những sự biến động lớn về tần số
allele qua các thế hệ khác nhau. Chính hiện tượng này là nguyên nhân tạo nên sự khác biệt đa dạng
về mặt di truyền ở các quần thể nhỏ và dần dần dẫn tới sự cách ly sinh sản trong quá trình tiến hóa
của loài. Và sự biến động di truyền có thể là nguyên nhân làm cho mức dị hợp tử thấp quan sát được
ở một số loài có nguy cơ bị diệt vong
Biến động di truyền được xác định như thế nào?

Để xác định được biến động di truyền trong quần thể, các thí nghiệm cần bố trí hợp lý về vị trí
và số lượng cá thể thu thập.
Phương pháp nghiên cứu có thể áp dụng là thăm dò mức độ biến động, đa hình mức độ DNA
như các kỹ thuật RAPDs (đánh giá tính đa hình của các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên),
RFLPs (đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzyme hạn chế), AFLP
(RFLP + PCR nhằm tăng độ nhạy truy tìm dấu vết biến đổi DNA), Microsatellite (kỹ thuật giúp phát
hiện các đột biến, biến đổi bên trong các đoạn DNA siêu vệ tinh). Hoặc áp dụng kỹ thuật isozymes
giúp phát hiện biến đổi trong các locus mã hóa cho 1 loại enzyme bất kỳ, tính toán thống kê, khoảng
cách di truyền, để thiết lập bản đồ di truyền, đánh giá biến động di truyền trong quần thể.


3. Các kiểu chỉ thị di truyền? Ưu điểm và nhược điểm chính của các kiểu chỉ thị này?
3.1. Những đặc điểm hình thái
Về mặt truyền thống, sự đa dạng bên trong hoặc giữa các quần thể được xác định bằng sự đánh
giá sự khác biệt về mặt hình thái. Sự đánh giá này có ưu điểm là có sẵn, không đòi hỏi những dụng
cụ phức tạp và là phương pháp xác định trực tiếp dựa vào kiểu hình. Tuy nhiên việc xác định hình
thái cần phải có các chuyên gia về loài, chúng lại ảnh hưởng bởi những thay đổi của các điều kiện
môi trường, và có thể biến động qua các giai đoạn khác nhau và số lượng của chúng cũng bị giơíi
hạn.
3.2. Chỉ thị sinh hoá (protein)
Để khắc phục những giới hạn của phương pháp phân tích hình thái, một số chỉ thị khác vừa mới
được phát triển dựa vào cả 2 mức độ, mức đọ protein (kiểu hình) và mức độ DNA (kiểu gene). Chỉ
thị protein thường được gọi là ‘chỉ thị” sinh hoá, và chúng thường được xếp sai vào nhóm của các
“chỉ thị phân tử”.
Chỉ thị protein (những protein dự trữ trong hạt và isozymes) được tạo ra thông qua quá trình
điện di, nhờ vào đặc tính di chuyển của protein và enzymes và được biểu lộ bằng thuốc nhuộm đặc
biệt đối với protein được phân tích.
Việc thăm dò sự đa hình, những khác biệt có thể thăm dò được ở chỉ thị đưa ra xảy ra bên trong
các cá thể, trong những chỉ thị prtein là một kỹ thuật mà chia sẽ một vài ưu điểm của việc sử dụng
chỉ thị hình thái. Tuy nhiên, chỉ thị protein là cũng bị giới hạn do bị ảnh hưởng bởi những điều kiện

môi trường và những thay đổi trong những giai đoạn phát triển khác nhau. Mặc dù vậy isozyme là
một phương pháp hổ trợ thô cho sự phận tích những biến động hình thái đơn giản.
3.3. Chỉ thị phân tử
Sự đa hình có thể được thăm dò bên trong DNA của nhân hoặc của các bào quan, mà được tìm
thấy có ở trong ti thể và lạp thể. Chỉ thị phân tử nói đến chính phân tử DNA và vì vậy mà được coi
như là một phương pháp đo lường các biến dị một cách khách quan. Chúng không phụ thuộc vào
những ảnh hưởng của môi trường, việc đánh giá có thể được thực hiện ở bất kỳ thời điểm nào trong
quá trình phát triển của thực vật và hơn tất cả đó là chũng có tiềm năng cho một sự tồn tại không giới
hạn về mặt số lượng, bao phủ toàn bộ bộ gen.
Ưu điểm
–Không phụ thuộc vào những ảnh hưởng của môi trường
–Khả năng không bị giới hạn về số lượng
–Đánh giá khách quan các biến dị


Nhược điểm chính là cần những phương tiện kỹ thuật tương đối phức tạp
4. Tiêu chuẩn của một chỉ thị phân tử là gì?
- Đa hình cao: nó biến động bên trong các cá thể. Mức độ đa hình được thăm dò phụ thuộc vào
kỹ thuật dùng để đánh giá nó.
- Có thể lặp lại được: Có thể tạo ra chỉ thị này ở bất kỳ phòng thí nghiệm nào, có nghĩa là nó có
thể dùng để đánh giá trong nhiều phòng thí nghiệm khác nhau.
- Đồng ưu thế (đồng trội): Phụ thuộc vào kiểu áp dụng, kỹ thuật được chọn lọc phải có thể thăm
dò các dạng khác nhau của marker, phân biệt giữa đồng hợp tử, dị hợp tử (đồng kế thừa). Một cá thể
dị hợp cho thấy đồng thời kiểu gene kết hợp của hai bố mẹ đồng hợp tử.
- Được phân bố một cách đều đặn qua toàn bộ bộ gene. Sự bao phủ trên toàn bộ gene càng dày
đặc và càng rãi rác thì việc đánh giá sự đa hình càng tốt hơn.
- Sự biểu lộ rõ, nghĩa là có thể thăm dò sự khác biệt giữa các cá thể có quan hệ họ hàng gần gũi.
- Không phụ thuộc vào những ảnh hưởng môi trường. Tính chính xác của một kiểu gene của
một marker nên không phụ thuộc vào môi trường mà cơ thể đó sống hay giai đoạn phát triển của nó.
- Tính trung tính. Allele hiện diện ở vị trí marker là không phụ thuộc hay không có ảnh hưởng

bởi áp lực chọn lọc tác động lên cá thể. Đây chỉ là một giả thiết vì chưa có dữ liệu nào có sẵn để xác
minh hoạc phản kháng đặc tính này.
- Không đắt. Dễ, nhanh và rẽ trong việc thăm dò qua nhiều cá thể. Nếu có thể, những phương
tiên nên có khả năng sử dụng đa mục đích trong thí nghiệm.
5. Protein ? Enzyme?
1. Protein:

- Protein là hợp chất hữu cơ có ý nghĩa quan trọng bậc nhất trong cơ thể sống. Về mặt số lượng,
nó chiếm không dưới 50% trọng lượng khô của tế bào. Về thành phần cấu trúc, protein được tạo
thành chủ yếu từ các amino acid qua liên kết peptide. Cho đến nay người ta đã thu được nhiều
loại protein ở dạng sạch cao có thể kết tinh được và đã xác định được thành phần các nguyên tố
hoá học, thông thường trong cấu trúc của chúng gồm bốn nguyên tố chính là C H O N với tỷ lệ C
≈ 50%, H ≈ 7%, O ≈ 23% và N ≈ 16%.

- Protein tham gia mọi hoạt động sống trong cơ thể sinh vật, từ việc tham gia xây dưng tế bào,
mô, đến tham gia hoạt động xúc tác và nhiều chức năng khác
- Cùng với acid nucleic, protein là cơ sở vật chất của sự sống.
2. Enzyme:


Enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hoá học, là chất xúc tác
sinh học có ý nghĩa đặc biệt quan trọng
6. Cấu trúc của protein liên quan đến chức năng của chúng?
*Thành phần cấu trúc P:
Protein là một trong những đại phân tử sinh học của tế bào, chứa các nguyên tố chính như C, H,
O, N, S, P…
- Đơn vị cơ bản tạo nên Cấu trúc P là acid amin.
- Các a.a có c.thức TQ là (H2N-CH-COOH).
- Có khoảng 20 loại a.a, chúng liên kết với nhau = lk peptide.
- Lk peptide là sự kết hợp giữa nhóm amine của 1 a.a với nhóm cacboxyl của a.a

kế tiếp (H2N-CH(R)-COOH). Peptide là phức hợp gồm 2 ->c30a.a nếu dài hơn gọi là olypeptide
- Bản chất gốc R khác nhau sẽ tạo nên những nhóm P, a.a khác nhau. Căn cứ vào đó ta chia a.a
thành 4 nhóm.
+Nhóm kiềm, nhóm acid, nhóm trung tính kị nước ko mang điện tíc, nhóm trung tính ưa nước
mang tính phân cực.
- Nhóm NH2 và COOH: Là 2 nhóm rất q.trọng vì chúng phân li trong nước làm cho các acid
amin trở thành ion trái dấu NH3+ và COO-.
- Tất cả các chuỗi polypeptide đều có 2 amino acid ở 2 đầu tận cùng, 1 đính vào nhóm amin, còn
đầu kia đính nhóm COOH tự do và đc tổng hợp từ trái sang phải, bắt đầu từ acid amin chứa đầu
amin (N )và kết thúc là acid amin chứa đầu cacboxyl (C).
- Các P khác nhau có trình tự và thành phần các amino acid khác nhau, trình tự và thành phần các
acid amin quyết định tính chất và chất lượng Protein.
- Trong cơ thể, protein đảm nhận nhiều chức năng quan trọng như cấu trúc, vận chuyển, dự trữ,
xúc tác, điều hòa trao đổi chất, miễn dịch….
* Tính chất của P phụ thuộc vào: trình tự, số acid amin và số chuỗi polypeptide phản ánh mức độ
phức tạp và chức năng của P. Cấu trúc không gian do mức độ cuộn xoắn các chuỗi polypeptide.
* Cấu trúc P.
- Cấu trúc b1. Là trình tự sắp xếp của các a.a trong chuỗi polypeptidetừ 20 loại acid amin khác
nhau. Các a.a đều có 3 nhóm gốc giống nhau là amin(-NH2), cacboxyl (COOH) và hydro(-H) còn
gốc R thì khác nhau do đó quy định Tính chất khác biệt giữa các a.a.


->Cấu trúc b1 quy định tính đặc thù và cấu hình không gian của pt P. Nếu chuỗi polypeptide bị
mất, thêm or thay đổi trình tự dù chỉ 1 a.a cũng có thể dẫn đến sự thay đổi tính đặc thù và tính
chất của phân tử protein
- Cấu trúc b2: Là sự uốn các phần của từng chuỗi polypeptide thành Cấu trúc đều đặn trong
không gian theo kiểu dạng xoắn α hay phiến gấp nếp β. Lk H đóng vai trò tạo nên Cấu trúc b2.
-> Ảnh hg đến hoạt tính và chức năng của P. Là dạng trung gian chuyển tiếp để pt P hình thành
nên Cấu trúc b3 phức tạp hơn.
-Cấu trúc b3: Đc hình thành do các chuỗi polypeptide cuộn xoắn hay gấp khúc tạo nên pt có cấu

hình không gian 3 chiều, cấu hình không gian của P. Cấu trúc không gian đc tạo nên bởi các lk
yếu như lk ion, lk kỵ nc hoặc lk disulphite giữa 2 a.a chứa S
-> Cấu hình không gian quy định hoạt tính chức năng của P.
-Cấu trúc b4: đc hình thành do 2 or nhiều chuỗi polypeptide thành phần tg tác với nhau tạo nên
->Ảnh hưởng đến chức năng của P.
6. Nêu các yếu tố ảnh hưởng đến PCR? Nó ảnh hưởng như thế nào?
 Trình tự của primer:
Trình tự primer có khoảng 50% GC để tăng khả năng gắn mồi. Tránh GC ở đầu 3’ của primer
vì nó có thể làm tăng cơ hội tạo hiện tượng primer-dimers. Tránh chọn các vùng có trình tự tương
đồng để hạn chế primer gắn với nhau.
 Nhiệt độ của quá trình ủ:
Nhiệt độ ủ thích hợp là nhiệt độ mà ở đó 1/2 primer sẽ gắn với DNA khuôn mẫu. Số base của
primer càng ít thì nhiệt độ ủ càng thấp và ngược lại.
T¬a = 4(G+C) + 2(A+T) - 5oC
 Nồng độ Mg2+
Nồng độ Mg2+ có thể ảnh hưởng đến nhiệt độ biến tính của DNA khuôn mẫu, quá trình ủ của
primer, tính đặc hiệu của sản phẩm PCR, hoạt tính cả Taq pol và độ chính xác của kết quả.
 Các dNTPs
Dung dịch stock của các dNTP phải có pH 7, hàm lượng xác dNTP trong khoảng 20-200μM
cho kết quả ổn định, chính xác và đặc hiệu. Bốn loại dNTP được sử dụng cần có nồng độ tương
đương nhau để giảm thiểu tối đa hiện tượng sai biệt do kết hợp sai mã di truyền nào đó.


 Enzyme Taq pol
Nếu nồng độ E quá cao có thể xuất hiện các sản phẩm PCR không đặc hiệu và làm sai kết quả.
Nếu nồng độ quá thấp sẽ không đủ lượng E để xúc tác tạo sản phẩm mong muốn.
 Đệm ổn định hoạt động của Taq pol.
 Nồng độ các primer
Sử dụng nồng độ primer cao không cần thiết và thường tạo ra bất lợi vì quá thừa primer sẽ có
hiện tượng primer-dimers và hiện tượng gắn primer nhầm vị trí trên khuôn mẫu.

 Nồng độ DNA khuôn mẫu
Nếu các chất trong thành phần phản ứng có nồng độ cao trong khi DNA khuôn có nồng độ thấp
thì giai đoạn sàng lọc của PCR sẻ trở nên khó khăn vì tần suất DNA và primer gặp nhau giảm rõ rệt.
 Tỷ lệ giữa primer và DNA khuôn
Nếu tỉ lệ quá cao sẽ gây hiện tượng primer-dimers, nếu tỷ lệ này quá thấp thì sản phẩm k nhiều.
 Khởi động nóng PCR
Làm tăng khả năng bắt cặp của primer và DNA khuôn, giúp thu đc sp sạch hơn.
7. Cơ sở của phản ứng chuỗi polymerase (PCR)?
PCR (polymerase chain reaction) là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh
học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến
vô cùng quan trọng tương đương với việc khám phá ra các enzyme hạn chế và kỹ thuật Southern
blot.
PCR dựa trên cơ sở phản ứng kéo dài primer nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại in
vitro các nucleic acid đặc trưng. PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần các
đoạn DNA có chiều dài từ 200-3000 bp. Đoạn DNA được khuếch đại (DNA đích) được nhận diện
nhờ cặp primer đặc trưng (oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide.
8. Các kiểu DNA?
- Tổ chức trình tự DNA: DNA của các sinh vật nhân thật có thể được chia thành những kiểu
khác nhau và những nhóm khác nhau:
–Gene code protein phiên bản đơn
–Sự hiện diện DNA trong đa phiên bản
+Những trình tự với những chức năng được biết:
–Coding


–Non-coding
+Những trình tự với chức năng không được biết:
–Lặp lại (tản mạn hay theo thứ tự)
–Transposons (gene nhảy)
–DNA spacer (vùng đệm)

Nhiều đoạn lặp lại được tìm thấy trong DNA spacer. Chúng bao gồm cùng một trình tự được
tìm thấy ở nhiều vị trí, đặc biệt là ở centromere và ở telomere. Những lặp lại thay đổi về kích cỡ, số
lượng và sự phân bố trên toàn bộ gene, làm cho chúng có thể được dùng làm những chỉ thị phân tử.

- Các loại DNA:
Xét về cấu trúc:
B-DNA
 Cuộn xoắn tạo thành NST
 Xoắn phải đối song song, 10 cặp base mỗi vòng xoắn; mã hóa cho các protein trong tế
bào; tiến hành sao chép, phiên mã dịch mã, trong đó sao chép là bước đầu tiên và cần
thiết cho quá trình phân bào.

A-DNA
 Cũng là chuỗi xoắn phải nhưng có nhiều cặp base trong 1 vòng xoắn hơn B-DNA (11).
 Ít được tìm thấy, hầu như chỉ được tổng hợp trong phòng thí nghiệm
Z-DNA
 Xoắn trái, hình dạng zíc-zắc
 Có 12 cặp base mỗi vòng xoắn nên mang nhiều gen hơn
 Đóng vai trò trong quá trình phiên mã RNA, tạo mRNA từ chuỗi DNA


cDNA
cDNA (complementary or clonal DNA) là dạng DNA dùng tạo nên thư viện thông tin di truyền
Là một sợ DNA bổ sung với mạch DNA gốc, ứng dụng trong các thí nghiệm kiểm tra tính đặc
hiệu thuốc….
Xét về vị trí:
DNA nhân:
Là DNA cuộn xoắn tạo nên các sợi NST, mang thông tin di truyền của tế bào, có thể chứa các
đoạn mã hóa hoặc không mã hóa. Trải qua quá trình phiên mã và dịch mã tạo thành các protein trong
tế bào.

DNA bào quan (Cytoplasmatic DNA)
–Chloroplast DNA (cpDNA)
–Mitochondrial DNA (mtDNA)
Một lượng nhỏ DNA được tìm thấy trong cytoplasm bên ngoài nhân- trong lạp thể (chloroplast
DNA ký hiệu là cpDNA) và ti thể (mitochondrial DNA kí hiệu là mtDNA). Lạp thể và ti thể có sợi
sắc thể riêng của nó cùng với một vài phiên bản. Những gene này cũng qui định cho sự dịch mã và
sao mã riêng các cấu thành của các bào quan, và đóng vai trò chuyên biệt cao trong biểu hiện kiểu
hình của cơ thể.
Điểm đặc trưng của cytoplasmatic DNA:
–Tính kế thừa. DNA bào quan là thường (nhưng không luôn luôn) di truyền thông qua mẹ, một
mẫu hình của sự thừa kế qua mẹ.
–Sự khác biệt trong tốc độ tiến hoá (trật tự của gene thông qua trình tự các nucleotide)
–Tích luỹ chậm các đột biến.
Nguyên nhân tại sao sự tích luỹ các đột biến là chậm là chưa được giải thích rõ ràng, nhưng có
lẽ đó là kết qủa của sự hiện diện của cả việc sửa chữa có hiệu quả cao các thiệt hại trên DNA hay cả
một hệ thống tái tạo DNA lỗi tự do.
9. Những nét chính của DNA tế bào chất (cytoplasmic DNA)?
Tế bào chất không chỉ là môi trường hoạt động của hệ gen trong nhân mà trong đó còn có
những bào quan cũng chứa những gen gọi là gen ngoài nhân hay gen ngoài nhiễm sắc thể.
Gen ngoài nhiễm sắc thể có trong lạp thể, ti thể, các plasmit ở vi khuẩn là những bào quan có
khả năng tự nhân đôi. Bản chất của gen ngoài nhân cũng là DNA.


Lượng DNA trong tế bào chất ít hơn nhiều so với lượng DNA trong nhân, hàm lượng không ổn
định, phụ thuộc vào trạng thái hoạt động sinh lý của tế bào.DNA ngoài NST có cấu trúc xoắn kép,
trần, dạng vòng. Ví dụ, DNA của lạp thể ở tế bào thực vật có dạng vòng giống DNA của một số vi
khuẩn và virut. DNA plasmit ở vi khuẩn là những phân tử nhỏ dạng vòng, chứa các gen kháng thuốc,
bền vững với các ion kim loại...và có vai trò quan trọng trong kĩ thuật di truyền.
Bộ mã di truyền cũng có nhiều điểm khác với bộ mã di truyền trong nhân, gen ngoài NST cũng
có khả năng tự nhân đôi, nhưng sự nhân đôi không thật sự chính xác như gen nhân.

Các đặc điểm cơ bản của di truyền tế bào chất
- Lai thuận lai nghịch kết quả biểu hiện kiểu hình ở đời con thay đổi.
- Di truyền qua tế bào chất vai trò chủ yếu thuộc về tế bào chất của tế bào sinh dục cái.
- Các tính trạng di truyền qua tế bào chất được truyền theo dòng mẹ (nhưng không nhất thiết
mọi đặc điểm di truyền theo mẹ đều liên quan tới các gen trong tế bào chất vì còn những nguyên
nhân khác).
- Các tính trạng di truyền qua tế bào chất không tuân theo các định luật của thuyết di truyền qua
nhiễm sắc thể vì khi phân bào thì tế bào chất không được chia đều cho 2 tế bào con một cách chính
xác như các nhiễm sắc thể.
- Tóm lại, trong sự di truyền, nhân có vai trò chính nhưng tế bào chất cũng có vai trò nhất định.
Trong tế bào có 2 hệ thống di truyền: di truyền qua nhiễm sắc thể và di truyền ngoài nhiễm sắc thể
tác động qua lại lẫn nhau đảm bảo cho sự tồn tại sinh trưởng, phát triển của cơ thể.
10. Enzyme cắt hạn chế là gì?
Trong tự nhiên, các enzyme hạn chế hiện diện trong hầu hết các tế bào vi khuẩn để ngăn cản
DNA ngoại lai tiếp quản bộ máy tổng hợp protein của tế bào. DNA của chính chúng sẽ được bảo vệ
khỏi tác dụng của enzyme hạn chế do sự có mặt của các enzyme nội bào có thể methyl hóa
(methylation) các nucleotide đặc biệt, vì thế các nucleotide này không nhận biết bởi các enzyme hạn
chế. Enzyme hạn chế có khả năng nhận biết những đoạn DNA có trình tự nucleotide xác định, bám
vào đoạn DNA đó và cắt cả hai sợi của DNA vào giữa nucleotide đối xứng nhau tại điểm cắt.
Các enzyme hạn chế có ba loại (type): I, II và III. Các enzyme được dùng phổ biến hiện nay
thuộc type II, có cơ chế tác động đơn giản nhất. Đây là các nuclease cắt ở một vị trí đặc hiệu nằm bên
trong sợi DNA (chứ không phân hủy DNA từ hai đầu), nên được gọi là endonuclease. Tên gọi đầy đủ
của chúng là các restriction endonuclease type II, hay được gọi đơn giản là enzyme hạn chế
(restriction enzyme, RE).Mỗi enzyme cắt hạn chế cắt phân tử DNA thành những đoạn xác định bằng
cách hoạt động tại các trình tự đặc trưng. Các enzyme hạn chế cắt các phân tử DNA sợi đôi theo hai
cách khác nhau:
+Cắt trên một đường thẳng đối xứng để tạo ra các phân tử đầu bằng.


+Cắt trên những vị trí nằm đối xứng quanh một đường thẳng đối xứng để tạo ra những phân tử

đầu so le (đầu kết dính).
Bởi vì các đặc tính của chúng mà tất cả những kiểu enzyme này trở thành cốt yếu cho kỹ thuật
DNA tái tổ hợp. Enzyme hạn chế có bán sẵn trên thị trường và thường được cung cấp với thông tin
11. Thế nào là đa hình trong chuỗi DNA?
Vô số những khác biệt lớn và nhỏ trong chuỗi nucleotide giữa các cá thể được gọi là đa hình
DNA. Hai loại cơ bản khác nhau của tính đa hình đã được khai thác rộng rãi cho DNA gồm: lặp đi
lặp lại song song và đa hình độ dài đoạn hạn chế.

Nhiều sự kiện có thể gia tăng các biến dị trong chuỗi DNA. Những biến dị như thế thường
được mô tả như những thể đa hình. Sự đa hình có thể hiểu như những khác biệt trong kiểu genenhư được chứng tỏ trong sự đa dạng của đặc điểm của band khi được thăm dò với một qui trình
thích hợp,-và có thể đa dạng kiểu hình.
Một số trường hợp có thể tạo ra sự đa hình:
- Đột biến điểm (point mutations): Đột biến điểm xảy ra khi một base trong chuỗi DNA
được thay thế bởi một base khác. Chiều dài của chuỗi DNA là không thay đổi.
- Chèn đoạn hoặc mất đoạn (insertions & deletions): Chèn đoạn hoặc mất đoạn là sự thêm
vào hoặc biến mất một vài base trong trình tự DNA. Độ dài của phân tử DNA vì thế mà thay đổi.
- Sắp xếp lại (rearrangements): Sự thay đổi trong trình tự DNA có thể xảy ra thông qua sự
sắp xếp lại vì thế các đoạn bị đảo lộn. Trong trường hợp như thế, độ dài phân tử có thể thay đổi
hoặc không. Sự thay đổi như thế có thể xem như là một sự đa hình.
12. Phân biệt allozyme và isozyme?
Isoenzym là những dạng khác nhau của một enzyme có cùng hoạt tính cơ chất đặc hiệu nhưng
lại khác nhau về phương diện di truyền tức là khác nhau về cấu trúc bậc một và do các locus gene
khác nhau mã hóa trình tự. Còn allozyme lại là các dạng khác nhau của một isoenzym do chỉ một
locus gene xác định
13. Những bước tiến hành chính của kỹ thuật izozyme?
Gồm 4 bước:


xử lý nguyên liệu:
 nghiền nát mẫu bằng chày

 lọc lấy dịch chiết


 load mẫu vào gel


điện di trên gel tinh bột hay acrylamine:
 thêm dung dịch đệm
 gắn dòng điện vào hệ thống, chạy trong 1h



nhuộm mô hóa học:
 cắt lớp gel theo cùng chiều và chuyển lên các khay nhuộm
 nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm tùy mỗi loại enzyme
 phân tích kết quả điện di

14. Những điểm chính cần quan tâm để dịch mã mẫu hình các band.
Những vấn đề chính là:
- Cấu trúc bậc 4 của enzymes (kể cả monomeric, dimeric…)
- Cây nghiên cứu là đồng hợp tử hay dị hợp tử ở tại mỗi locus của gene
- Số loci của gene
- Số allele trên một locus
- Có bao nhiêu gene được di truyền lại?
+ Allozymes được điều khiển bởi những allele đồng trội có nghĩa là đồng hợp tử, có thể được
phân biệt với dị hợp tử
+ Đối với các enzyme monomeric (bao gồm 1 polypeptide đơn), những cây đồng hợp tử đối với
1 locus sẽ cho 1 band, trong khi cá thể dị hợp tử sẽ tạo ra 2 bands.
+ Đối với các enzyme dimeric (bao gồm 2 polypeptide), cây đồng hợp tử đối với 1 locus sẽ cho
ra 1 band, trong khi cây dị hợp sẽ cho 3 bands do sự liên kết ngẫu nhiên giữa các polypeptides.

+ Những enzymes multimeric cũng tồn tại, nơi mà những polypeptides được đặc trưng bởi
những loci khác nhau. Những thông tin về cấu trúc enzyme (isozymic heteromers) có thể làm phức
tạp thêm mẫu hình của các band.
+ Những sự phức tạp này và tầm quan trọng của việc dịch đúng mẫu hình các bands càng làm
cho việc phân tích di truyền có kết quả đúng như mong đợi.
15. Ưu điểm và nhược điểm của chỉ thị di truyền izozyme trong nghiên cứu đa dạng.
Ưu điểm:
- Là phương pháp thô và có thể lặp lại được
- Đồng trội nên thích hợp cho việc đánh giá trên một khoảng rộng để đo di truyền quần thể và
cho việc lập bản đồ gene


- Có khoảng 90 enzymes được dùng đối với thực vật với vị trí isozymes được lập bản đồ trong
nhiều trường hợp
Nhược điểm:
- Có tương đối ít các phép phân tích là có sẵn để thăm dò enzymes. Giới hạn chính của phân
tích isozymes là có ít marker được cung cấp vì số lượng phép phân tích sinh hoá có sẵn để thăm dò
chúng là quá nhỏ. Kết quả là tỉ lệ phần trăm những thông tin đưa ra là không đủ cho những nghiên
cứu đa dạng di truyền
- Phân tích dựa vào kiểu hình. Vì vậy có thể bị ảnh hưởng bới điều kiện môi trường do đó sẽ có
những biểu hiện làm sai lệch kết quả. Bởi vì những biểu hiện khác nhau của gene có thể xảy ra ở
những giai đoạn phát triển khác nhau, hoặc trong những mô khác nhau, cùng một nguyên liệu phải
được dùng cho tất cả các thí nghiệm.
16. Những nét chính của kỹ thuật RADP?
Bước 1: Tách chiết DNA:
DNA được tách chiết có chất lượng tốt (tương đối sạch và không bị gãy nhiều). Thông thường
quy trình ly trích DNA ở thực vật gồm 3 giai đoạn:
• Giai đoạn 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân.
Tế bào lá được nghiền với dịch trích EB (extraction buffer) để phá vỡ màng tế bào, giải phóng
các thành phần có trong tế bào ra ngoài môi trường dịch trích.

• Giai đoạn 2: Làm biến tính protein, loại bỏ protein và các thành phần hữu cơ khác
(polysaccharides, polyphenols, lipids,…).
• Giai đoạn 3: Tủa DNA bằng isopropanol hay ethanol 100 %, thường tủa bằng isopropanol
lạnh trước, sau đó tiếp tục tủa bằng ethanol 100 % kết hợp với muối.
Một số vấn đề có thể gặp phải khi tách chiết DNA:
 DNA bị phân hủy hoặc bị gãy.
 Có RNA trong mẫu DNA.
 Có polysaccharide trong mẫu DNA. •
 Có polyphenol trong mẫu DNA.
Bước 2:Thực hiện phản ứng PCR:
Phản ứng PCR được thực hiện với các primer ngắn, thiết lập điều kiện phản ứng nghiêm ngặt
để hạn chế tạo ra những sản phẩm không chính xác.
 Hỗn hợp các chất cho phản ứng PCR


 Primer (10 base) được bán sẵn ở nhiều công ty
 MgCl2 (thêm) để gia tăng số lượng bands được khuyếch đại trong một phản ứng. Tuy nhiên
cần phải tính toán để tìm ra nồng độ thích hợp, tránh việc khuyếch đại những đoạn gene không đặc
hiệu
 Chu kỳ gắn kết primer được thực hiện ở nhiệt độ thấp (32 - 40°C)
Bước 3: Điện di phát hiện:
Kết quả PCR – RAPD được điện di trên gel agarose.
Bước 4: Dùng kết quả điện di mã hoá và chạy trên chương trình NTSYS để phân tích đa dạng
di truyền giữa các chủng giống
Kết quả : Có được bảng hệ số đồng dạng di truyền và sơ đồ cây thông từ đó có thể biết được
mức độ gần gũi giữa các loài
 Những nét chính
 Dùng một primer ngẫu nhiên ngắn (10 bases)
 Khuyếch đại một đoạn DNA chưa biết.
 Các bước trong phòng thí nghiệm

 Phân lập DNA
 Phản ứng PCR với 1 primer
 Tách các phân đoạn DNA bằng điện di trên gel
 Quan sát các phân đoạn bằng nhuộm ethidium bromide.
17. Nguyên nhân sự đa hình phân tử DNA mà có thể thăm dò bởi kỹ thuật RADP?
 Sự đa hình DNA trong các cá thể có thể là do:


Lỗi trong quá trình ghép đôi ở các điểm gắn mồi



Sự xuất hiện điểm primer mới



Độ dài đoạn khuyếch đại giữa các điểm primer

18. Tiêu chuẩn để chọn lựa band RADP để phân tích đa dạng di truyền?
 Do bản chất của các chỉ thị RAPD, chỉ có sự hiện diện hay vắng mặt các bands riêng biệt có
thể được đánh giá. Tiêu chuẩn để chọn lựa các bands:
 Khả năng lặp lại (reproducibility): cần để lặp lại các thí nghiệm
 Độ dày
 Kích cỡ
 Sự chia cách có thể quan sát được trong một quần thể lập bản đồ


19. Thuận tiện và bất tiện của kỹ thuật RADP?
Ưu điểm của RADP
 Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước

trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản. Chất lượng DNA khuôn không cần
độ tinh sạch cao. Thời gian thực hiện nhanh. Khả năng nhân bản cao.
 Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp nhưng kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết
hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có
độ tin cậy cao
Nhược điểm
 RADP markers là trội. Sự khuyếch đại có thể xảy ra ở cùng 1 locus hay không. Có
nghĩa là cá thể đồng hợp và dị hợp không thể phân biệt
 Thiếu những thông tin về các sản phẩm khuyếch đại
 Khó để có thể lặp lại (kết quả phụ thuôc vào chất lượng DNA, thành phần & điều
kiện của phản ứng PCR)
 Vấn đề của việc đồng di chuyển (2 phân đoạn khác nhau nhưng có cùng độ dài, cùng
trọng lượng phân tử)
 Sự hình thành các band trong kỹ thuật RAPD phụ thuộc vào:


Số lương và chất lượng của DNA hệ gen tách chiết.



Các band khác nhau của enzyme DNA pol



Các máy PCR khác nhau

20. Những bước chính trong thăm dò biến động bằng chỉ thị RFLP?
Kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzim
giới hạn . Khi ủ DNA với enzim giới hạn ở dung dịch đệm thích hợp ( pH, nhiệt độ..) sẽ tạo ra
những phân đoạn DNA với kích thước khác nhau

 Nguyên tắc chung:
- Dựa trên độ đặc hiệu của các enzim cắt giới hạn đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA
bộ gen. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau
 Enzim cắt giới hạn
Các loại
Loại I: khi enzym nhận biết trình tự nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA cách đó 1000-5000 nu và
giải phóng độ vài chục nu.
Loại II: enzym nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó.


Loại III: enzym nhận biết trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó 20 nu.
Một số quy tắc khi thực hiện phản ứng cắt bằng RE
- Nồng độ NaCl của dung dịch đệm, nếu phải sử dụng nhiều RE có nồng độ NaCl của dung dịch
đệm khác nhau thì nên cắt với RE có nồng độ NaCl thấp trước rồi đến RE cần NaCl nồng độ cao
hơn.
- RE được bảo quản trong dung dịch đệm có 50% glycerol ở -200C, nên thêm vào phản ứng sau
cùng, thời gian để bên ngoài càng ngắn càng tốt.
 Quy trình thực hiện RFLP
1. Tách chiết và tinh sạch DNA:
- Điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của enzim nội bào (DNAase, RNAase).
- Quá trình thực hiện gồm 3 bước
Phá màng tế bào  Loại protein  Tủa DNA
 B1: Phá màng tế bào
Tế bào bị phá vỡ bằng biện pháp cơ học và các chất tẩy mạnh để giải phóng DNA ra môi trường
và phân ly các protein liên kết với DNA.
 B2: Loại Protein
Để thu được DNA tinh sạch ta cần
Tách chiết một hoặc vài lần với các tác nhân tách chiết hổn hợp dung dịch phenol- chloroform để
loại bỏ các chất tạp nhiễm như protein
 B3. Tủa DNA

Có 2 kiểu tủa chính
- Tủa bằng ethanol: được thực hiện ở nồng độ muối cao, nồng độ ethanol cao Nhiệt độ thấp thúc
đẩy sự tủa.
- Sự tủa DNA cho phép thu nhận acid nucleic tinh sạch nằm trong một thể tích dung dịch lớn,
dưới dạng cặn tủa.
- Bảo quản và khi cần có thể hòa lại trong nước ở nồng độ xác định
2. RE cắt các mẫu DNA cần phân tích
3. Điện di trên gel agarose :
- Tách các đoạn DNA theo kích thước


4. Chuyển DNA đã phân tách lên màng lai
5. Lai DNA:
DNA probe:
Mẫu dò RFLP là một đoạn DNA được đánh dấu lai với 1 hoặc nhiều trình tự của mẫu DNA được
phân giải sau khi chúng được phân tách bởi điện di trên gel và chuyển lên màng lai.
Các DNA trong nhân (DNA hệ gen, cDNA), DNA tế bào chất là tiêu biểu, được sử dụng như các
mẫu dò RFLP.
Các đánh dấu mẫu dò thường dùng là : đồng vị phóng xạ 32P ,biotin, streptavidin, a
bioluminescent.

Các loại đa hình được phát hiện bằng RFLP:
RFLPs: Các nguyên nhân tạo ra đa hình
A = Kiểu gốc (ban đầu)
B = có đoạn chèn
C = mất đoạn
D = xuất hiện điểm cắt hạn chế mới nằm trong trình tự đoạn probe (mẫu lai)
E = mất điểm cắt hạn chế
F = xuất hiện điểm cắt hạn chế mới nằm ngoài trình tự đoạn probe
21. Các nguồn đầu dò khác nhau?

- DNA nhân: có thể lấy từ thư viện gene (có một thư viện của các đầu dò cho những phân tích
RFLP) hay cDNA (complementary DNA-thư viện DNA bổ sung).
- DNA cytoplasmic: Sự đặc trưng loài của nhiều đầu dò ở các vị trí đơn đòi hỏi phải xây dựng
một thư viện khi nghiên cứu loài mới. Tuy nhiên đầu dò từ những chi gần gũi cũng có thể được sử
dụng
- Trình tự có tính lặp lại hay kiểu minisatelite: đây là các nhóm cơ bản của 10 đến 60bp sắp
xếp theo thứ tự từ đầu đến cuối. Các trình tự lặp lại này biến động cao giữa các cá thể về cả số lượng
của các trình tự lặp lại.
Một đầu dò chọn lọc có thể dùng để thăm dò những phân đoạn hạn chế mà hiện diện tại nhiều
vị trí. Mẫu hình các phân đoạn hạn chế mang minisatelite trên film (được gọi là DNA- fingerprint)
cho phép phân biệt rõ sự khác biệt giữa những cá thể khác nhau.


22. Ảnh hưởng của các sự kiện đột biến khác nhau đến thăm dò mẫu hình band RFLP?
Một đột biến tạo ra một điểm cắt mới bên trong vùng target ngay chính điểm đầu dò nhận biết
trên chuỗi A. Kết quả là đầu dò đồng thời lai 2 phân đoạn được tạo ra bởi enzyme. Trên chuỗi B
không có đột biến xảy ra, chỉ có một phân đoạn là được lai với đầu dò. Trong quá trình điện di, 2
phân đoạn từ A di chuyển xa hơn so với phân đoạn từ B.

Đột biến tạo ra một điểm cắt mới ở giữa vùng flanking (bên) của các điểm cắt hạn chế tạo ra
một phân đoạn nhỏ. Vì điểm cắt mới này không ở trong vùng nhận biết của đầu dò nên chỉ một đoạn
được lai trên A và một đoạn được lai trên B.

Một đột biến chèn đoạn ở vùng flanking của các điểm cắt, tạo một phân đoạn cắt lớn hơn hơn.

Một đột biến mất đoạn xảy ra ở giữa vùng flanking của các điểm cắt hạn chế tạo ra đoạn cắt hạn
chế nhỏ hơn


Một trong những điểm của vùng flanking là bị thay đổi hoặc mất thông qua sự đột biến hay mất

đoạn

23. Ưu điểm và nhước điểm của kỹ thuật RFLP?
Những ưu điểm của RFLP:
+

Phương pháp có khả năng trao đổi tốt giữa các phòng thí nghiệm

+

Sự đồng ưu thế được di truyền lại vì vậy có thể đánh giá dị hợp tử

+

Không đòi hỏi thông tin về các trình tự

+

Bởi vì dựa vào sự đồng dạng của các trình tự nên có thể dùng được cho những nghiên cứu
sự phát sinh loài giữa các loài có liên quan.

+

Phù hợp tốt cho việc xây dựng bản đồ di truyền

+

Có thể phân biệt – có thể ở mức độ loài hoặc quần thể, hoặc cá thể

+

Đơn giản

Nhược điểm:
+

Đòi hỏi một lượng lớn DNA

+

Không thể tự động hoá được

+

Mức độ đa hình thấp ở một vài loài

+

Chỉ một vài vị trí là được thăm dò trong một thí nghiệm

+

Cần phải có một thư viện probe phù hợp và sẵn có nguồn đầu dò phong phú trong phòng
thí nghiệm

+

Tốn nhiều thời gian, đặc biệt là với những đầu dò mang phiên bản đơn

+

Đắt

+

Khá phụ thuộc vào kỹ thuật

24. Các bước tiến hành của kỹ thuật AFLP?
Kỹ thuật này bao gồm bốn bước chính:
1. DNA được phân giải bởi hai enzyme cắt hạn chế khác nhau:


Phân tử DNA được phân giải với 2 loại enzyme cắt hạn chế khác nhau: một loại cắt
thường xuyên (enzyme hạn chế 4 base) và một loại cắt thỉnh thoảng (enzyme hạn chế 6 base).
Có nhiều loại enzyme/primer kết nối có thể được dùng, tuy nhiên, Msel và EcoRI là được dùng
nhiều nhất trong hệ gene nhiều AT trong khi chúng cho ít phân đoạn hơn trong hệ gene giàu
GC. Ở bước này cho sản phẩm tạo ra các đoạn chứa vị trí cắt hạn chế ở 2 đầu là: MseI-MseI;
MseI-EcoRI; EcoRI-EcoRI
2. Nối adapter (là 1 oligonucleotide) vào 2 đầu tận cùng của đoạn DNA đã được cắt hạn
chế.
Adapter phải chứa trình tự nucleotide bổ sung với đầu lồi hạn chế của đoạn cắt DNA
3. Tiến hành PCR chọn lọc sơ cấp (pre-selective PCR):
Primer cho phản ứng này gồm 3 phần: phần bổ sung với trình tự adapter; phần bổ sung
trình tự cắt hạn chế và phần chọn lọc mở rộng là 1 nucleotide (A-T-G-C).
Sau phản ứng thứ nhất chọn lọc được 1 tập hợp các đoạn DNA có số lượng được giảm đi
rất nhiều do chỉ những đoạn DNA chứa nu bổ sung với nu mở rộng trên primer là được khuếch
đại, và các đoạn DNA có 2 đầu hạn chế giống nhau sẽ bị loại bỏ do tự bắt cặp tạo vòng.
Sản phẩm này sẽ được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR thứ cấp
4. Tiến hành PCR chọn lọc thứ cấp .
Những sản phẩm khuyếch đại tiền chọn lọc sẽ được dùng cho một phản ứng PCR khác,

một lần nữa một tập hợp con của các phân đoạn lại được chọn
Primer của phản ứng PCR lần 2 khác với lần 1 là ở đầu 3’ được gắn phần nu mở rộng 2-3
nucleotide và chỉ primer của đầu cắt bởi EcoRI được đánh dấu huỳnh quang và do đó chỉ đoạn
nào chứa trình tự hạn chế của EcoRI mới được phát hiện trên máy đọc huỳnh quang.
Việc sử dụng 3 nu chọn lọc sẽ hạn chế sự bắt cặp sai và do đó chỉ nhân lên các đoạn
chuyên biệt.
5. Thăm dò sự đa hình có thể thực hiện được với các đồng vị phóng xạ, nhuộm huỳnh
quang hay nhuộm bạc
25. Những vấn đề cần quan tâm khi dịch mã mẫu hình các band AFLP.
 Cơ sở phân tử của đa hình AFLP thường được tạo ra ở mức độ nucleotide. Kỹ thuật AFLP
thăm dò sự đa hình xuất hiện từ các thay đổi (hình dáng hay kích cỡ) trong những điểm cắt hạn
chế hoặc cạnh những điểm cắt này, được gây ra do thiếu hoặc không bổ sung các nu. mở rộng ở
đầu 3’ và làm ngăn cản sự khuyếch đại.


 Có thể được sử dụng những enzyme cắt hạn chế khác nhau,
 Thay đổi các loại nucleotide chọn lọc và tiền chọn lọc sẽ gia tăng tìm kiếm các đa hình có
ích.
 Càng nhiều nucleotide chọn lọc thì càng ít đa hình được thăm dò.
 Những bands thường được ghi cả khi hiện diện hay không. Những bands dị hợp khác với
đồng hợp có thể được thăm dò dựa vào độ dày các dấu hiệu, mặc dù điều này đòi hỏi sự tinh tế
của người làm thí nghiệm.
26. Nguyên tắc cơ bản của phép điện di theo thang nồng độ biến tính.
 Điện di theo thang nồng độ biến tính là một phương pháp phân tích dấu hiệu ở mức độ phân tử
bằng cách tách dần các sản phẩm của phản ứng PCR.
 Sản phẩm DNA được đưa vào điện di qua gel polyacrylamide dưới những điều kiện biến tính
gia tăng dần.
 Thang nồng độ ổn định được thiết lập vuông góc với hướng điện di.
 Chất gây biến tính thường dùng là: urea hay formamide (một amide hình thành từ acid formic)
.

 Dựa vào đặc tính tái biến tính của chuỗi DNA, sự biến tính DNA xảy ra qua quá trình điện di
o Phân tử DNA đầu tiên di chuyển theo chuỗi đôi, sau đó do thành phần của gel thay đổi,
DNA “duỗi ra” (bị biến tính) và tách thành những chuỗi đơn
o Sự thay đổi trong cấu trúc dẫn đến khả năng khác biệt dễ nhận thấy khi di chuyển qua
gel
o Phân tử DNA thay đổi hình dạng của chúng và ngừng di chuyển
o Những khác biệt trong trình tự DNA sẽ được xác định dựa vào sự khác biệt ở các nồng
độ biến tính khác nhau (điểm tan).
o Hay nói cách khác điểm tan của DNA phụ thuộc vào trình tự của DNA trong vùng tan
dẫn đến một mẫu hình các bands khác nhau.
 Cho phép thăm dò những đa hình DNA rất nhỏ hay những đột biến hoặc có thể áp dụng đối
với những đoạn DNA dài hàng trăm bp mà không cần biết trước về sự đa hình của đoạn DNA
nghiên cứu


27. Nguyên tắc cơ bản của microarray.


Microarray là một bộ các đoạn trình tự có gắn nhãn xác định (ESTs) được tạo ra từ thư

viện cDNA của các loci đã biết. Những ESTs là được đặt lên một tấm kính có kích cỡ xác định,
(ở đây là 8x12 array). Trong thực tế, vi mạng có thể chứa tới hàng ngàn ESTs.


Vi mạng là sự sắp xếp những đốm nhỏ DNA (spots of DNA) gắn vào những tấm gương

hay màng nylon


Nguyên tắc cơ sở của chip là sự cặp đôi các base hay sự lai giữa những đầu dò ngắn và

trình tự DNA bổ sung


Mỗi điểm trên chip đại diện cho một chuỗi mã hóa khác nhau từ gen khác nhau, được

làm bằng một mẫu dò DNA có thể ghép nối với cDNA đã được tạo ra.
Nguyên lý của kỹ thuật cDNA microarray


mRNA transcriptomes được chuẩn bị từ mô của cơ thể đối chứng và từ mô thí nghiệm



cDNA được chuẩn bị và gắn nhãn với hai loại thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau.



Thư viện của DNA thí nghiệm và đối chứng sẽ được lai với microarray



Sự kích thích dòng laser đối ngẫu sẽ kích hoạt thuốc nhuộm bổ sung, sự phát huỳnh

quang sẽ tỉ lệ với mức độ lai vừa mới xảy ra


Sự biểu hiện của các gene tương ứng sẽ được đo theo tỉ lệ của hai biểu hiện huỳnh

quang: “up-regulation” (dò theo chiều đi lên) tương ứng với đối chứng sẽ được thấy như màu

đỏ, “down-regulation” (dò theo chiều xuống) tương ứng với mẫu thí nghiệm được thấy như
màu xanh (green), và constitutive expression (biểu hiện thành lập, tỉ lệ 1:1 so với đối chứng)
được thấy như màu đen trung tính


Cường độ của màu sắc thấy được sẽ tỉ lệ với chênh lệch của các biểu hiện

28. Ưu điểm và nhược điểm của các kỹ thuật mới trong phân tích đa dạng di truyền.
Những kỷ thuật mới bao gồm : DNA sequencing, ESTs, microarrays, DArT, SNPs
1. DNA sequencing
Là sự kết hợp của PCR phương pháp phân tích trình tự của Sanger. Sử dụng máy đọc trình tự
tự động, vẫn có điện di, tuy nhiên phản ứng không cần chia ra các subsamples
Ưu điểm:
- Cho kết quả chính xác
- Số lượng thông tin thu được rất lớn.


- Chỉ cần sử dụng 1 tube thí nghiệm
- Do phương pháp này phân tích toàn bộ DNA trong thí nghiệm nên có thể phát hiện được đột
biến
Nhược điểm:
- Chi phí cao
- Đòi hỏi kỹ thuật khắt khe
2. ESTs: Đoạn trình tự có gắn nhãn xác định (Expressed sequence tags)
- Đó là những đoạn trình tự DNA ngắn, thường dài từ 200 đến 500 nu
- Chúng có thể được dùng để xác định phiên bản gen, là công cụ để khám phá gen và xác định
trình tự gen
- Được tạo ra bằng việc xác định trình tự của một hoặc 2 đầu một gen xác định từ thư viện gen
- Phương pháp này có hiệu quả cực kỳ cao trong việc tìm ra gen mới
Thuận lợi

- Những trình tự này có thể tổng hợp rất nhanh chóng và không đắt
- Chỉ cần phân tích 1 trình tự để tổng hợp 1 cDNA
- Không cần phải kiểm tra lại vì lỗi không phát sinh khi ứng dụng EST để tổng hợp trình tự
- là marker di truyền rất tốt
- đồng trội
- Là nguồn trình tự để lấy những primer SSRs
Khó khăn
- Việc phân lập mRNA là khó
- Introns, mà có thể chứa những thông tin quan trọng, không ở trong cDNA tái bản
3. Microarrays
Microarray là một bộ các đoạn trình tự xác định (ESTs) được tạo ra từ thư viện cDNA của các
loci đã biết.
Thuận lợi:
- Kỹ thuật cao
- Có thể thăm dò toàn bộ genome
- Cho phép khám phá mối liên quan giữa kiểu hình và kiểu gene


Bất lợi:
- Dữ liệu trình tự phải có sẵn
- Đắt
- Phụ thuộc vào kỹ thuật cao
- Lượng và kiểu dữ liệu được tạo ra đòi hỏi những phương tiện và chuyên gia máy tính trình
độ cao
- Nhanh chóng thu thập dữ liệu và phân tích.
- Phát hiện một cơ sở thay đổi cũng như thêm vào hoặc xóa bỏ.
- Phát hiện sự khác biệt trong methyl hóa DNA, tùy thuộc vào loại enzyme được sử dụng để
tạo ra các mảnh vỡ.
4. Diversity array technology (DArT) : kỹ thuật mạng đa dạng
Là một phương pháp mới để khám phá và cho phép đánh dấu điểm di truyền đa hình

Ưu điểm
- Độc lập với trình tự DNA
- Phạm vi di truyền phân tích được xác định bởi người sử dụng và dễ dàng mở rộng
Nhược điểm
- Phức tạp, nhưng dữ liệu đưa ra ít
5. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) : đa hình các nucleotide đơn
Một kiểu chỉ thị mới nay đã được làm sẵn thông qua kỹ thuật xác định trình tự là SNPs
Sự đa hình là sự thay thế các base đơn độc giữa các trình tự tương đồng
SNPs là thường xảy ra hơn bất kỳ kiểu đa hình nào
SNPs có thể được xác định nhờ vào vi mạng gen hay máy DHPLC
Ưu điểm:
- Sản phẩm PCR có thể rất nhỏ:
+ Marker làm việc được với các mẫu DNA đã bị cắt ra rất ngắn.
- Phổ biến hơn trong bộ gene
- Có thể đa hình hàng trăm hoặc hàng nghìn trên một chip
- Xử lý mẫu hoàn toàn tự động
- Không có sản phẩm lặp
Nhược điểm:


- Ít allele
+ Mỗi marker ít thông tin
- Phải có nhiều kiểu di truyền hơn SNP để có được cùng một mức độ thông tin của mẫu DNA
- Hỗn hợp giải thích (Mixture interpretation) là khó khăn hơn
- Sự đa hình không thật sự làm việc
- Hiện nay sử dụng mẫu DNA nhiều hơn STRs

29. Nguyên tắc cơ bản của việc phân tích đối ngẫu, sắc ký lỏng cao áp.
1. Phân tích đối ngẫu (Heteroduplex Analysis)
- 2 sản phẩm khuyếch đại PCR được trộn với nhau với một lượng tương đương, biến tính ở

95°C và sau đó làm lạnh
- Trong suốt quá trình làm lạnh, những chuỗi đơn được gắn lại để hình thành những DNA đối
ngẫu
- Những ghép đôi không tương xứng trong đối ngẫu sẽ làm cho nó có một cấu trúc 3 chiều khác
biệt, với sự chuyển động bị giảm mà tỉ lệ với mức độ đa dạng của chuỗi trình tự
2. Sắc ký lỏng cao áp (DHPLC)
- DHPLC: Denaturing high performance liquid chromatography
- Là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tính sử dụng HPLC ngược pha phân tách SNP
(Single nucleotide polymorphisms).
- Được sử dụng để xác định đột biến và đa hình dựa trên phát hiện các kiểu heteroduplex giữa
nucleotide không khớp trong sợi đôi DNA khuếch đại PCR
- Các sợi DNA được biến tính bằng cách nung nóng và sau đó được hồi tính (reanneal).
- Nhiệt độ nóng chảy của các phân đoạn DNA hồi tính xác định độ dài của thời gian chúng
được giữ lại trong cột.
- Các sản phẩm hồi tính được đưa vào máy DHPLC.
30. Các kiểu biến động DNA mà có thể thăm dò được bằng chỉ thị sequencing, EST và SNP.
 DNA sequencing cho phép thăm dò các biến động ở mức độ nucleotide
 ESTs là công cụ có hiệu lực để thăm dò sự đa hình trong những vùng coding; Phương pháp
này có hiệu quả cực kỳ cao trong việc tìm ra gene mới. Chúng có thể được dùng để xác định
phiên bản gene, là công cụ để khám phá gene và xác định trình tự gene