Khóa luận Quy trình chẩn đoán viêm gan C bằng kỹ thuật PCR Elisa và Real Time PCR

LỜI MỞ ĐẦU
Hiện nay, người ta ước tính có khoảng hơn phân nửa dân số trên thế giới
đã từng bị nhiễm một hoặc nhiều siêu vi gây viêm gan từ siêu vi A đến siêu vi G.
Nhiễm siêu vi A và E chỉ gây ra bệnh lý cấp tính và diễn tiến bệnh thường tự
giới hạn, ít để lại hậu quả nghiêm trọng. Ngược lại, viêm gan siêu vi B, C và D
có thể dẫn đến những nhiễm trùng dai dẳng mãn tính với nguy cơ tiến triển sang
xơ gan, ung thư gan và đưa đến tử vong. Hơn nữa, tỉ lệ mắc bệnh viêm gan siêu
vi B và C nhanh chóng gia tăng ở nhiều quốc gia đã làm cho bệnh này trở thành
một vấn đề đáng được quan tâm cho sức khoẻ cộng đồng.
Siêu vi viêm gan C là một trong những bệnh nguy hiểm rất đáng lo ngại
hiện nay, bởi số lượng người nhiễm bệnh, cũng như các kiểu biến chứng gây
nguy hiểm đến sức khỏe con người như xơ gan, ung thư thư gan… Ở Việt Nam,
bệnh này mới xuất hiện gần đây nên chúng ta chưa hiểu rõ được nguyên nhân
gây ra bệnh và cũng chưa biết cách phòng ngừa nhiều nên chúng ta sẽ dễ dàng
mắc phải. Viêm gan siêu vi C xâm nhập vào cơ thể nhờ virus HCV (Hepatitis C
Virus), được Houghton phát hiện vào năm 1989. Từ đó, nhờ vào những thử
nghiệm tìm anti-HCV, tỉ lệ người bị nhiễm viên gan sau truyền máu đã giảm đi
đáng kể. Trong suốt thập niên 90 của thế kỷ 20, các nhà khoa học đã đạt được
nhiều thành tựu mới trong lãnh vực nghiên cứu cấu trúc phân tử của siêu vi và
đặc biệt là trong điều trị. Hiện này những phương thức trị liệu siêu vi C mặc dù
chưa phải là hoàn hảo nhưng càng ngày càng có những thuốc mới hơn và hiệu
quả cao hơn được đưa vào thử nghiệm lâm sàng. Khả năng thường xuyên biến
đổi cấu trúc di truyền của siêu vi C đã trở thành một thách thức lớn cho việc chế
tạo thuốc chủng ngừa trong tương lai. Cho nên, nếu ta phát hiện bệnh viêm gan
siêu vi C này càng sớm càng tốt thì ta sẽ biết được nhiễm genotype C nào, để tìm
ra loại thuốc điều trị tốt.
Để phát hiện ra dòng virus này thì nhiều nhà khoa hoc đã nghiên cứu ra
nhiều phương pháp phát hiện virus HCV dựa vào các ứng dụng của sinh học

1

phân tử như : phương pháp ELISA kết hợp với phương pháp PCR, phương pháp
lai phân tử (Hybrid Capture, bDNA )...và gần đây nhất là phương phát RealTime PCR là phương pháp được sử dụng nhiều nhất hiện nay vì phương pháp
này, thao tác dễ thực hiện, ít gây sai sót, cho kết quả trong thời gian ngắn, và
định tính một cách chính xác, độ nhạy cao hơn kỹ thuật bDNA và phương pháp
xác định bệnh nhân có bị nhiễm viêm gan lại hay không, vì các phương pháp
khác chỉ xác định được bệnh nhân có bị nhiễm cấp tính hay mãn tính do không
phân biệt chắc chắn được tình trạng đang nhiễm hay đã lành (hết mầm bệnh
trong cơ thể, không còn nguy cơ lây lan), ví dụ : phương pháp PCR ELISA, sau
khi điều trị bệnh đã hết, có nghĩa là kháng nguyên lạ đã không còn, nhưng kháng
thể vẫn còn tồn tại trong cơ thể một thời gian dài, có khi đến nhiều năm…
Do đó, việc chẩn đoán viêm gan C là một trong những nhu cầu cần thiết
đối với con người. Cho nên, em chọn đề tài này để tìm hiểu quy trình chẩn đoán
bệnh viên gan siêu vi C bằng phương pháp Real-Time PCR và phương pháp
PCR ELISA là hai phương pháp thông dụng nhất hiện nay.

2


CHƯƠNG1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI C
1.1 Lịch sử phát hiện bệnh [7]
Bệnh viêm gan siêu vi C do Hepatitis C Virus (HCV) gây ra. Đây là một
bệnh nguy hiểm, thường dẫn đến các biến chứng như xơ gan và ung thư gan
nguyên phát với tỉ lệ cao. Hiện nay, số người nhiễm HCV trên thế giới ước tính
khoảng 170 triệu người (số liệu năm 2000).

) Quá trình phát hiện bệnh viêm gan siêu vi C:
Năm 1975, Prince và cộng sự nhận định rằng có một chứng bệnh viêm
gan siêu vi sau truyền máu không do HBV và có thời kỳ ủ bệnh dài hơn thời ủ
bệnh do HAV. Sau đó, các tác giả khác chứng minh về mặt huyết thanh học rằng

bệnh viêm gan siêu vi loại này không có liên quan gì đến bệnh viêm gan siêu vi
A và từ lúc này danh từ “bệnh viêm gan siêu vi không A không B” ra đời.
Vào tháng 5 năm 1989, có một phát hiện mới về viêm gan siêu vi không A
không B được công bố. Bằng phương pháp ly tâm siêu tốc huyết tương thu từ
những con tinh tinh bị bệnh viêm gan siêu vi, Choo và cộng sự đã tách chiết
nucleic acid của virus, tổng hợp cDNA từ RNA tách chiết, chèn vào genome (bộ
gene) của λgt11 và xâm nhiễm E. coli. Trong số hàng triệu dòng thu được có một
dòng có phản ứng đặc hiệu với kháng thể có trong huyết thanh người bị bệnh
viêm gan siêu vi không A không B sau truyền máu. Cuối cùng, họ xác định rằng
bệnh viêm gan siêu vi không A không B do một loại siêu vi mới gây ra, đó là
siêu vi C (HCV).
1.2. Đặc điểm của virus gây bệnh viêm gan siêu vi C: [1, tr. 8-12], [20]
1.2.1 Đặc điểm sinh học của virus HCV
HCV là virus thuộc họ Flaviviridae. Đây là một loại virus RNA, có vỏ
lipid, đường kính khoảng 55-65 nm. Trọng lượng phân tử khoảng 4.106 daltons.
Bộ gen (genome) của siêu vi là một chuỗi đơn RNA có cực tính (+), nằm bên

3


trong phần nucleocapsid hình đa diện. Ở ngoài cùng là lớp vỏ lipid chứa các
protein E1 và E2 tạo thành các phức hợp dimer ( Hính1.1).
Điểm đặc biệt ở virus này là chưa có một nghiên cứu nào có thể xác định
cấu trúc chính xác của virus. Cho đến nay, các nhà khoa học chỉ thiết lập nên
một mô hình mang tính chất mô phỏng cấu trúc của virus này. Nguyên nhân của
việc này là do HCV không thể gây nhiễm nhân tạo trên các dòng tế bào hiện có
trên các phòng thí nghiệm trên thế giới (không phân lập được virus mà chỉ tách
được gen di truyền ( acid nhân ) trong huyết tương người bị nhiễm HCV RNA).
Đây chính là một trong những trở ngại lớn trong việc tìm hiểu cặn kẽ về virus
này.

Mật độ các hạt tử của virus HCV trong huyết thanh rất thay đổi, từ 1,03
đến 1,72g/ml. Sở dĩ có sự thay đổi này là do các virion lưu hành trong máu dưới
nhiều dạng khác nhau : hoặc là ở dạng tự do có tính lây nhiễm rất cao nhưng chỉ
hiện diên ở mật độ tương đối thấp ( khoảng 1,03 ) hoặc là ở dạng kết hợp với các
đại phân tử đặc biệt là các lipoprotein hoặc hiện diện trong các phức hợp miễn
dịch nhưng mật độ lại cao (khoảng 1,10). Thực nghiệm trên khỉ chimpanzee cho
thấy tính lây nhiễm của HCV tự do cao hơn rõ rệt so với dạng kết hợp với các
đại phân tử. Một điểm quan trọng nữa là virus này có khả năng biến thể nhanh và
tạo thành rất nhiều type và sub-type kháng thuốc.
Chính vì khả năng biến thể quá nhanh này mà cho đến nay vẫn chưa có
một loại vaccine nào có hiệu quả đối với HCV.

4


Hình 1.1: Cấu trúc HCV

1.2.2 Cấu trúc genome virus HCV
Genome của virus HVC là một cuỗi RNA có cực tính dương, được chia
làm 3 phần. Bộ gene của virus có kích thước khoảng 9400 nucleotide (Hình 1.2).

Hinh 1.2. Cấu trúc genome virus

n Đầu 5’ không mã hoá (5’UTR-untranslated region hay 5’NCR = noncoding region ) gồm 341 - 344 nucleotid. Đây là vùng tương đối ít bị biến đổi
nhất giữa các phân týp (subtype) khác nhau. Do đó, người ta sử dụng vùng này
như là một chất mồi (primer) để phát hiện RNA của virus HCV bằng phương
pháp PCR. Chức năng của vùng này là tham gia vào việc điều hoà quá trình nhân

5

đôi của siêu vi. Tại đây, có một số cấu trúc uốn lượn (stem-loop structure ) gồm
27 nucleotid, giữ vai trò ức chế quá trình giải mã (translation ) theo cơ chế điều
hoà âm tính (negative regulation ). Vùng này còn là vị trí gắn kết với ribosome,
được gọi là IRES (internal ribosome entry site ), để khởi phát quá trình giải mã
cho việc tổng hợp chuỗi polyprotein tiền chất của siêu vi.
o Vùng được mã hoá giữa 2 đầu 5’ và 3’. Vùng này chỉ có một khung
đọc mở duy nhất (open reading frame) gồm 9.379 - 9481 nucleotid, được giải mã
để tổng hợp một polyprotein tiền chất (precursor) của siêu vi gồm khoảng 3000
acid amin. Sau đó, polyprotein này sẽ được các enzyme protease của siêu vi và
các enzyme peptidase tín hiệu của tế bào (host signal peptidases), phân cắt thành
các protein cấu trúc và protein không cấu trúc.
- Protein cấu trúc : được tạo ra từ các gen C, E1 và E2
*Protein capsid = protein C : mã hoá protein lõi, tạo nên phần nucleotid-capsid
bao bọc bên ngoài chuỗi genom RNA của siêu vi .
* Protein E1 và E2 (envelope): mã hoá protein vỏ, là hai glycoprotein của lớp vỏ,
liên kết với nhau thành phức hợp dimer.
- Protein không cấu trúc
* Protein NS2 là một enzyme Matallopproteinase, phân cắt polyprotein tiền chất
tại chỗ nối NS2/NS3.
* Protein NS3 (proteas/helicase ) các enzyme thuỷ giải và cắt đứt liên kết hydro.
* Protein NS4 : (Gồm NS4 A VÀ NS 4B ) : NS4 A cần thiết cho hoạt tính của
men protease NS3, NS4 B một protein liên kết với màng tế bào.
* Protein NS5 (polymerase ) gồm NS5A và NS5B và NS5B là dùng để tổng hợp
chuổi RNA từ khuôn mẫu là RNA.
p Đầu 3’ không mã hoá (3’UTR hay 3’ NCR ) bao gồm 3 vùng : vùng
đầu tiên có chiều dài thay đổi từ 28Æ 42 nucleotid, tiếp theo là vùng poly (U)
hoặc poly (A) để báo hiệu kết thúc quá trình giải mã. Tận cùng là một đoạn X
gồm 98 nucleotid.

6


1.2.3 Cách thức tồn tại và khả năng gây bệnh
Đầu tiên, HCV gắn vào một receptor (thụ thể) chưa được xác định trên bề
mặt tế bào gan nhờ hai glycoprotein bề mặt của nó là E1 và E2. HCV xâm nhập
vào bên trong tế bào gan sau một quá trình hòa màng (membrane fusion). RNA
mạch (+) của HCV được dịch mã thành protein nhờ hệ thống dịch mã của tế bào
chủ. Protein tiền thể tạo ra sẽ được phân cắt bởi enzyme tín hiệu (signalase) để
tạo ra các protein cấu trúc (C, E1, E2) và các protein không cấu trúc (NS1-NS5).
Sau khi HCV đã tạo ra reverse transcriptase của nó thì enzyme này bắt đầu phiên
mã ngược để tạo ra mạch RNA mạch (-) bổ sung với mạch (+) đã có. Chính
mạch RNA (-) này là khuôn để tạo ra RNA genome của HCV((+) ssRNA). (Hình
1.3 )

Hình 1.3 Chu kỳ sống của HCV

7


Sau đó, capsomer được tạo ra từ các protein thành phần như C, E1, E2 sẽ
kết hợp với RNA genome của HCV ((+)ssRNA) để tạo thành dạng nucleocapsid.
Nucleocapsid này tiến đến tương tác với màng tế bào để thoát ra ngoài, trở thành
dạng virus hoàn chỉnh và đi xâm nhiễm một tế bào khác.
1.3.Triệu chứng lâm sàng: [7], [21]
1.3.1- Giai đoạn cấp tính:
Bệnh nhân nhiễm HCV ở giai đoạn cấp tính thường không có biểu hiện
bệnh lý hoặc chỉ có những biểu hiện bệnh nhẹ (rất khó quan sát bằng mắt
thường). Khoảng 60-70% các bệnh nhân nhiễm không thể hiện triệu chứng, 2030% có thể có biểu hiện vàng da, 10% các bệnh nhân thể hiện một số triệu chứng
không đặc hiệu như: mệt mỏi, đau bụng…

Triệu chứng biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân ở giai đoạn cấp tính HCV
tương tự như các bệnh nhân nhiễm các virus gan gây bệnh ở gan khác. Do vậy,
việc xét nghiệm các bệnh nhân này bằng các thử nghiệm miễn dịch là điều cần
thiết để xác định bệnh nhân nhiễm loại virus Hepatitis nào. Tuy nhiên, các thử
nghiệm miễn dịch này chỉ có kết quả tốt (80%) sau 15 tuần kể từ khi có những
biểu hiện bệnh lý. Tỉ lệ trên tăng dần theo thời gian và tối đa là sau 9 tháng hầu
như 100% các bệnh nhân nhiễm HCV đều có thể phát hiện virus bằng kỹ thuật
miễn dịch.
Do nhược điểm về thời gian mà các kỹ thuật miễn dịch tỏ ra không có
hiệu quả trong việc phát hiện sớm virus. Tuy nhiên, do các kỹ thuật phát hiện
HCV bằng sinh học phân tử còn quá mắc tiền do vậy kỹ thuật miễn dịch vẫn
được sử dụng phổ biến hiện nay tại các quốc gia đang phát triển.
1.3.2-Giai đoạn mãn tính:
Sau giai đoạn nhiễm cấp tính khoảng 15-25% bệnh nhân sẽ tự loại bỏ tất
cả các virus HCV và cơ thể trở lại bình thường như khi chưa nhiễm virus. Tuy
nhiên, khoảng hơn 75% các bệnh nhân nhiễm HCV sẽ chuyển sang giai đoan
mãn tính.

8


Hình 1.4. Các giai đoạn phát triển bệnh

Trong giai đoạn nhiễm mãn tính bệnh nhân thường không có bất kỳ một
biểu hiện bệnh lý nào. Giai đoạn này có thể kéo dài từ 20-30 năm hoặc có thể
kéo dài hơn trước khi bệnh nhân chuyển thành ung thư gan. Vì thế người bệnh
thường không được chẩn đoán và điều trị kịp thời. Nhiều trường hợp bệnh chỉ
được phát hiện khi đã có biến chứng nghiêm trọng như : xơ gan với biểu hiện
báng bụng (ổ bụng có nước), giãn mạch máu đường tiêu hóa, có thể vỡ gây chảy
máu ồ ạt và tử vong. Một biến chứng nữa là ung thư tế bào gan. Khi đã xơ, gan

khó hồi phục lại, cho dù tình trạng viêm có thuyên giảm. Vì vậy, các thầy thuốc
khuyên nên điều trị sớm nhằm ngăn ngừa hoặc làm chậm tiến triển sang giai
đoạn xơ gan.
1.4. Chẩn đoán
Chẩn đoán viêm gan do siêu vi C, ngoài các xét nghiệm đánh giá chức
năng gan, siêu âm gan ( nhằm nghiên cứu cấu trúc của gan và các bộ phận xung
quanh, tìm dấu hiệu xơ gan hoặc biểu hiện bất thường), sinh thiết gan ( Xét
nghiệm này cho phép các chuyên gia quan sát tế bào gan dưới kính hiển vi, xác
định mức độ viêm nhiễm, chẩn đoán giai đoạn bệnh, đánh giá hiệu quả điều
trị.)....thì các xét nghiệm tìm HCV giữ một vai trò rất quan trọng .
Anti-HCV: có thể tìm thấy ở 70% trường hợp khi bắt đầu có triệu chứng
và khoảng 90% trong vòng 3 tháng sau. Tuy nhiên, nhiều người bị viêm gan C

9


nhưng không có triệu chứng. Anti-HCV không xác định được là đang nhiễm cấp
tính, đã lành bệnh (đào thải hết virus) hay chuyển sang giai đoạn mãn tính.
HCV RNA : phát hiện trực tiếp siêu vi trong máu, một bằng chứng của
nhiễm HCV và virus đang tăng sinh, đồng thời định danh dưới nhóm để lựa chọn
phác đồ hợp lý. Có thể phát hiện HCV-RNA trong vòng 1 đến 2 tuần sau khi
nhiễm virus. Xét nghiệm này còn được sử dụng để tiên lượng đáp ứng tốt với
điều trị.
1.5. Dịch tễ học:
Từ khi Choo Q.L phát hiện siêu vi gan viêm gan C năm 1989 đến nay,
nhiều nghiên cứu dịch tễ học nhiễm siêu vi C đã được tiến hành để đánh giá tình
trạng nhiễm siêu vi C trong cộng đồng, các đường lây nhiễm và diễn tiến các
trường hợp bị lây nhiễm.
1.5.1 . Tình trạng nhiễm bệnh viêm gan siêu vi C: [1], [22]
Tình hình trên thế giới:

Số người bị nhiễm viêm gan siêu vi C trên thế giới là khoảng 170 triệu
người, trong đó khu vực Đông Nam Á chiếm tỷ lệ cao với khoảng 32,3 triệu
(xem hình 1.5). Con số này cũng đã gia tăng trong những năm gần đây. Virus
viêm gan siêu vi C được xem như là kẻ giết người thầm lặng vì bệnh nhân khi
mắc phải virus này có thể không có các triệu chứng gì trong khoảng hơn 10 năm
trước khi phát triển thành viêm gan mãn tính và ung thư gan. Khoảng 40-50%
các trường hợp ghép gan ở Hoa kỳ là do nhiễm virus viêm gan C. Có 6 chủng
virus viêm gan C được xác định (HCV1-6) và tùy thuộc vào chủng virus nhiễm
mà các đáp ứng trị liệu cũng khác nhau.

10


Hình 1.5. Tình hình nhiễm bệnh viêm gan siêu vi C trên thế giới năm 2002 (đơn vị
tính: triệu người)

Hình 1.6. Bản đồ phân bố tỷ lệ nhiễm HCV

Tình hình trong nước:
Hiện nay, ở Việt Nam tỷ lệ nhiễm HCV chiếm từ 1-5% dân số.
1.5.2. Con đường lây bệnh và các biện pháp đề phòng và điều trị bệnh
viên gan siêu vi C [1], [21]
1.5.2.1 Con đường lây bệnh
HCV lây lan bằng sự tiếp xúc trực tiếp qua máu. Đường truyền bệnh bao
gồm việc dùng chung các vật dụng ma túy như kim chích, kim dùng để xâm
mình, xỏ da và châm cứu cũng có thể truyền HCV. Dùng chung các vật dụng cá

11

nhân như dao cạo, bàn cải đánh răng, đồ cắt móng tay, tuy ít nguy cơ nhưng vẫn
có thể làm lây nhiễm bệnh.
Một số ít có thể bị lây nhiễm HCV do sự quan hệ tình dục không an toàn.
Các nhân viên y tế cũng có nguy cơ nhiễm bệnh vì những tai nạn việc làm
như bị kim đâm hoặc trong những trường hợp không thể tránh được có thể tiếp
xúc trực tiếp với máu của người mang bệnh.
Những người mẹ bị HCV có thể truyền bệnh cho con vào lúc trước hoặc
sau khi sinh. Sự lây truyền này tùy thuộc vào mức độ HCV có trong máu của
người mẹ.
1.5.2.2. Các biện pháp phòng ngừa :
Cho đến nay vẫn chưa có thuốc chủng ngừa siêu vi viêm gan C. Ngay cả
những hy vọng về một loại thuốc chủng ngừa cho căn bệnh này trong tương lai
cũng chưa thấy hé mở. Vì 3 lý do sau:
+ Thứ nhất: siêu vi C có khả năng biến hóa,nhưng đã nói ở phần
1.2.1 cấu tạo HCV, chúng có khả năng thay đổi các đặc tính di truyền bằng cách
thay thế những cấu trúc trên nhiễm sắc thể của mình. Điều này chẳng những gây
khó khăn cho hệ thống miễn nhiễm trong việc phát hiện và đối phó với chúng,
mà còn là nguyên nhân khiến cho việc tìm ra thuốc chủng ngừa bệnh này trở nên
cực kỳ khó khăn.
+ Thứ hai : do siêu vi C không “hoạt động” với bất cứ loài động vật
nào khác ngoài con người và một loài tinh tinh (chimpanzee). Vì thế, việc nghiên
cứu thử nghiệm rất khó khăn.
+ Cuối cùng: Khả năng sao chép của siêu vi C trong điều kiện
phòng thí nghiệm rất yếu ớt.
Vì thế, việc phòng ngừa bệnh viêm gan siêu vi C hiện nay chủ yếu là tập
trung vào các biện pháp ngăn chặn từ đầu.
Như đã biết, siêu vi viêm gan C lây lan chủ yếu qua sự tiếp xúc trực tiếp
với máu của người có bệnh, nên các biện pháp tiệt trùng và chăm sóc thích hợp

12

đối với các vết thương ngoài da như băng bó mọi vết cắt, vết thương sẽ giảm
thiểu đáng kể nguy cơ nhiễm bệnh.
Tuyệt đối không dùng chung kim chích, các dụng cụ chích ma túy, vật
dụng cá nhân hoặc bất cứ thứ gì có thể dính máu. Phải sát trùng đúng cách
những dụng cụ dùng để xâm mình, xỏ da và châm cứu.
1.5.1.3 Điều trị:
Loại dược phẩm thường dùng để chống lại viêm gan C là interferon, một
thuốc ức chế sự nhân lên của virus. Các thuốc interferon dùng để điều trị viêm
gan gồm: interferon alfa-2b (Intron A), interferon alfa-2a (Roferon-A) và
interferon alfacon-1 (Infegen). Nhưng interferon chỉ có tác dụng ở khoảng 20%
số trường hợp.
Hiện nay, tiêm interferon thường được phối hợp với uống ribavirin-một
thuốc kháng sinh virus phổ rộng. Điều trị thường mất sáu tháng đến một năm và
thành công ở khoảng 40% số người bị HCV.
Gần đây, một thuốc khác, interferon pegyl hóa (PEG) có hiệu quả gấp hai
lần interferon thông thường. Vào tháng 1-2001 Cơ quan quản lý thuốc và dược
phẩm Mỹ (FDA) đã cho phép dùng PEG interferon-peginterferon alfa-2b (PEGIntron) để điều trị viêm gan.
Tùy theo loại genotype mà điều trị, tức là kiểu loại di truyền của siêu vi.
Xét nghiệm này giúp cho bác sĩ điều trị xác định được là mình đang “đối mặt với
ai” để có thể quyết định các phương thức điều trị. Thời gian điều trị bệnh viêm
gan C sẽ tùy thuộc vào kết quả của cuộc thử máu này. Nếu genotype được xác
định là loại số 1, bệnh nhân cần điều trị khoảng một năm. Nếu là loại số 2 hoặc
3, thời gian sẽ là khoảng 6 tháng. Những loại khác có thể phải điều trị từ 6 đến
12 tháng, tùy theo từng trường hợp.

13

Bàng 1.1: Các thuốc trên thị trường dùng điều trị viêm gan C và các
thuốc có triển vọng [22]
Tên Thuốc

Công ty

Cơ chế tác động

Có trên thị trường
PEG-Interferon-alpha

Roche

Interferron tác động kéo dài

Schering-Plough

Interferon tác động kéo dài

®

(Pegasys )
PEG-Interferron-alpha 2b
®

(Peg-Intron )
Ribavirin

Copegas®(Roche),Rebetol®

Nucleosid ức chế polymerase
®

( Schering Plough), Ribaphere ,
Interferon alpha-2a

Vilona®,Virazole®

(Roferon-A )

Roche

Hiệp lực với interferon

Interferon alpha-2b
(Intron® A )

Schering-Plough

Interferon

Các hãng thuốc và dạng thuốc generic Interferron điều trị viêm gan siêu vi B
khác

và một số dạng C

Đang nghiên cứu
Pha III
Viramidine(Taribavirin)

Valeant Pharma

Interferon –Beta

Serono

Tiến dược của ribavirin

Zadaxin

SciClone

Interveron-Beta 1a,tác nhân miễn

Nucleosid ức chế polymerase

dịch
Pha II
VX-950

Certex

Ức chế NS3 serine protease

Valoppicitabine (NM283)

Indenix/Novartis

Nucleosid ức chế polymerase

SCH503034

Schering-Plough

Ức chế NS3 serine protease

Albuferon

Human Genome Sciences/Novartis

Interferon-alpha gắn kết với albumin)
Xanh methylen

Suvus (Methylene blue)

Bioenvision

Tác nhân miễn dịch

Omega interferon

Intarcia Therapeutics

Interferon tác động kéo dài,đã sử

Multiferon

Viragen/Valentis

dụng ở một số quốc gia,ngoại trừ Hoà

Kỳ và chau âu

Actilon (CPG 10101)

Chủ vận TLR9 ( Tác nhận miễn dịch)

Coley

14


1.6. Định lượng RNA-HCV trong huyết thanh
1.6.1.Phương pháp PCR ELISA [8], [15], 17]
1.6.1.1 Định nghĩa:
ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay - Xét nghiệm hấp thu
miễn dịch liên kết với enzyme) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện sự hiện
diện của kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu xét nghiệm.
Phương pháp này dựa vào nguyên lý tính bắt cặp đặc hiệu giữa kháng
nguyên và kháng thể. Do trong thành phần phản ứng có enzyme, khi thêm cơ
chất tương ứng, enzyme sẽ biến đổi cơ chất và tạo tín hiệu có thể xác định được.
Khi virus viêm gan C vào trong cơ thể thì hệ thống miễn dịch của cơ thể
sẽ tạo ra những chất để chống lại việc xâm nhập này, những chất này gọi là
kháng thể. Nếu cơ thể có kháng thể (Anti-HCV) có nghĩa là đã có sự hiện diện
của virus viêm gan C.
Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên kháng thể sẽ quyết định cường
độ màu ánh sáng phát ra.
1.6.1.2 Phương pháp xét nghiệm virus HCV bằng ELISA
Có 2 cách :
+ Phương pháp gián tiếp là phương pháp miễn dịch, nghĩa là qua
phản ứng kháng nguyên kháng thể ta sẽ xác định được kiểu của kháng thể, từ đó

biết được type huyết thanh của siêu vi C (HCV serotype)
+ Phương pháp trực tiếp dựa trên sự phân tích trực tiếp trên gen của
siêu vi C để xác định kiểu gen của siêu vi C (HCV genotype).
Ưu điểm của kỹ thuật này là đơn giản, không sợ nguy cơ ngoại nhiễm và
có thể thực hiện hoàn toàn trên máy tự động. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn
còn ít nhiều nhược điểm như không định được chi kiểu (subtype), không biết
được tình trạng bệnh nhân có hay không có HCV-RNA (tình trạng siêu vi đang
tăng sinh để điều trị đặc hiệu), ở bệnh nhân bị ức chế hay suy giảm miễn dịch sẽ
không có anti HCV từ đó không xác định được loại HCV, không phân biệt được

15


giữa anti HCV nhiễm trước đây còn tồn tại và loại HCV đang nhiễm. Và một
điều cực kỳ quan trọng là sự phù hợp giữa type huyết thanh và kiểu gen vẫn còn
nhiều khác nhau. Dễ bị dương tính giả, chi phí cao.
Hiện nay, người ta kết hợp phương PCR với phương pháp ELISA để phát
hiện virus HCV, người ta hay gọi là phương pháp PCR-ELISA. Để nhân bản
cDNA được tách chiết từ RNA HCV trong huyết thanh người bệnh, sau đó ta
cho vào trong vi giếng tiến hành xét nghiệm.

Hình 1.7. Các vi giếng của microtiter plate chứa kháng nguyên

*Phương pháp PCR-ELISA:
Dưới sự xúc tác của enzyme kết hợp với kháng thể kháng digoxigenin.
Đầu tiên, người ta tách chiết HCV RNA từ huyết thanh và chuyển thành cDNA
nhờ enzyme phiên mã ngược, cDNA này được dùng làm bản mẫu (template) cho
phản ứng PCR. Trong thành phần của phản ứng PCR, một trong hai primer sẽ
được đánh dấu ở đầu 5’ với biotin, như vậy, sản phẩm PCR tạo ra sẽ có một
mạch được đánh dấu biotin ở đầu 5’. Sau bước nhân bản, sản phẩm PCR được

biến tính thành dạng mạch đơn và được cho vào các vi giếng. Mặt trong mỗi vi
giếng được phủ streptavidin là một protein có ái lực đặc biệt cao đối với biotin sẽ
giữ các mạch mang bitotin ở đầu 5’. Tiếp theo, người ta cho probe đặc hiệu cho
HCV vào vi giếng và tiến hành phản ứng lai. Probe này được đánh dấu ở đầu 3’
với digoxigenin sẽ bắt cặp bổ sung với mạch mang biotin ở đầu 5’. Phức hợp
kháng thể kháng digoxigenin-alkaline phosphatase được cho vào và ủ trong một
thời gian thích hợp, phần dư thừa sẽ được loại bỏ. Phản ứng màu sẽ xuất hiện khi

16


cơ chất hiện màu của alkaline phosphatase được cho vào. Cường độ màu tương
ứng với hàm lượng sản phẩm PCR có trong mẫu.
Việc định lượng HCV RNA có trong mẫu được thực hiện bằng cách quy
giá trị cường độ màu ở mỗi vi giếng vào một đường chuẩn xây dựng từ những
mẫu có nồng độ HCV RNA biết trước. Phương pháp này có khả năng phát hiện
HCV với nồng độ là 600 IU/ml. Độ tuyến tính của phương pháp nằm trong
khoảng 600 IU/ml đến 850.000 IU/ml.
Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt
cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu.
Nhưng phương pháp này rất hạn chế do KN không đặc hiệu sẽ ảnh hưởng
đến kết quả xét nghiệm.
1.6.2. Phương pháp khuếch đại tín hiệu [12], [14]
Phương pháp khuếch đại tín hiệu: là phương pháp phát hiện và định lượng
RNA bằng kỹ thuật lai và khuếch đại tín hiệu. Bộ gen virus lúc đầu được lai vào
một giá, thì các bộ dò oligonucleotide liên kết/bắt cặp đặc hiệu, sau đó tín hiệu
phát ra bởi các phân tử lai được khuếch đại và đo lường. Có hai kỹ thuật hay sử
dụng:
+Kỹ thuật DNA nhánh (Branched DNA technology)
+Phương pháp bắt giữ lai (hybrid capture)

1.6.2.1. Kỹ thuật DNA nhánh-bDNA (Branched DNA technology)
Trong xét nghiệm này, mẫu dò lai với acid nucleic đích không khuếch đại
trước. Có sự gia tăng tín hiệu lai đáng kể, thường được thêm vào bộ khuếch đại
bDNA (bDNA Amlifier). RNA được lai với các probe đặc hiệu. Sau đó, phức
hợp RNA HCV – probe được cố định trên một vi giếng (microwell) và tiếp tục
được lai với các probe khuếch đại tín hiệu, mỗi probe này liên kết với nhiều phân
tử alkline phosphatase (Hình 1.8). Cuối cùng, cơ chất của enzyme được cho vào
vi giếng và tín hiệu hóa quang (chemiluminescent) sẽ được thu nhận bởi máy
đọc tín hiệu ánh sáng.

17


Hình 1.8. Kỹ thuật bDNA nhánh

Trong phương pháp định lượng bằng bDNA thì việc thiết kế các probe
mục tiêu là vô cùng quan trọng. Cả hai lọai probe (probe cố định RNA HCV vào
vi giếng và probe khuếch đại tín hiệu RNA HCV) phải được thiết kế sao cho có
thể định lượng mọi genotype HCV với hiệu quả như nhau.
Phương pháp này có thể phát hiện tối thiểu 7.105 phân tử HBV-DNA/ml
máu. So với Real-time PCR, kĩ thuật bDNA ít nhạy hơn và không thể đo lượng
virus < 200.000 bản sao/ml.
1.6.2.2. Phương pháp bắt giữ lai (hybrid capture)
Kỹ thuật này dự trên nguyên tắc lai phân tử giữa một mạch của phân tử
DNA mạch đôi và phân tử RNA tạo thành một thể lai DNA:RNA. Các mẫu được
xử lý bằng dung dịch ly giải để giải phóng các nucleic acid có trong tế bào. Sau
đó các probe DNA hoặc RNA được cho vào và phản ứng lai xảy ra. Phức hợp lai

18

được cho vào trong các ống nghiệm hoặc trong các vi giếng của microtiter plate
có phủ một kháng thể đa dòng (polyclonal antibody). Kháng thể đa dòng này bắt
giữ (capture) toàn bộ các phân tử lai DNA:RNA hiện diện trong phản ứng. Các
phân tử nucleic acid khác như phân tử DNA mạch đơn, RNA, thể lai DNA:RNA,
RNA:RNA không phản ứng với kháng thể này và bị rửa trôi.
Sau đó, các phân tử lai DNA:RNA đã được bắt giữ sẽ liên kết đặc hiệu với
một kháng thể thứ hai cộng hợp với alkaline phosphatase. Một phân tử lai có thể
liên kết với nhiều phức hợp kháng thể - alkaline phosphatase nên sẽ làm gia tăng
độ nhạy của kỹ thuật.
Hàm lượng trình tự mục tiêu được định lượng bằng giá trị RLU (Relative
Light Unit) có cường độ tương ứng với hàm lượng trình tự đích có trong mẫu
ban đầu.
1.6.3. Phương pháp PCR [3], [5]
Kỹ thuật PCR (PCR - polymerase chain reation: phản ứng tổng hợp chuỗi
nhờ DNA polymerase) được mô tả năm 1985 bởi K.Mullis và các cộng sự cho
phép khuyếch đại, nghĩa là làm tăng một cách rất lớn, lượng DNA sử dụng ban
đầu, mức độ khuếch đại là vô cùng lớn, mà về lý thuyết người ta có thể có được
một lượng nguyên liệu (nhiều microgram) từ một phân tử DNA.
Bằng phương pháp tạo dòng in vivo người ta có thể khuyến đại AND nhờ
vi khuẩn. Trong kỹ thuật PCR, sự khuếch đại được thực hiện in vitro, nhờ
enzyme (đó là DNA - polymerase), không cần đến sự hiện diện của tế bào.
1.6.3.1. Nguyên tắc của phương pháp PCR:
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới
từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những
đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và
DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR đã
được hình thành dựa vào những đặc tính đó của các DNA polymerase. Thật vậy
nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự

19


DNA, ta chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để
khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự
đó để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi (sens
primer) và một mồi ngược (antisens primer). Từ “xuôi” và “ngược” phải hiểu là
xuôi và ngược so với chiều phiên mã của gen.
1.6.3.2 Các giai đoạn của một chu kỳ phản ứng PCR
Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì
gồm ba bước: (Hình 1.9)

Hình 1.9. Nguyên tắc hoạt động của PCR

20

[10]


Bước 1: Giai đoạn biến tính (denaturation)
Phân tử bị biến tính cao hơn Tm của phân tử. Nhiệt độ phản ứng là 94oC 95oC trong 30 giây đến 1 phút, hai mạch DNA khuôn bị biến tính, duỗi xoắn và
tách ra.
Bước 2: Giai đoạn lai (hybridization)
Nhiệt độ được hạ thấp xuống nhiệt độ Ta (nhiệt độ bắt cặp) của mồi,
khoảng 40 - 70oC trong 30 giây đến 1 phút, cho phép các mồi bắt cặp vào khuôn.
Bước 3: kéo dài (nhiệt độ 72oC)
Nhiệt độ được tăng lên 72oC, là nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme DNA
polymerase để hoạt động tổng hợp mạch mới từ đoạn mồi. Thời gian này tùy
thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại (từ 30 giây đến vài phút).
Thông thường một phản ứng PCR không được vượt quá 40 chu kỳ.

1.6.3.3. Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR
Một phản ứng PCR thường gồm 6 thành phần cơ bản sau:
- Khuôn acid nudcleic
DNA mẫu phải thật tinh sạch, nhưng nếu DNA thu nhận trực tiếp từ dịch
chiết tế bào thì việc chẩn đoán bằng PCR vẫn cho ra kết quả tốt. Giảm lượng
mẫu ban đầu còn lại sẽ hạn chế được việc khuếch đại “ký sinh”, tạo ra những sản
phẩm phụ không mong muốn. DNA mạch đôi hay mạch đơn đều có thể là nguồn
vật chất ban đầu cho phản ứng PCR, chúng được tách chiết từ tế bào thực vật,
động vật, vi khuẩn hoặc virus. Ưu điểm lớn khác của phương pháp PCR là cho
phép khuếch đại những mẫu DNA không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy
thành từng phần nhưng trong các vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, hóa
thạch, tóc, móng tay của người đã chết,… Thông thường, nồng độ DNA ban đầu
tốt nhất cho phản ứng PCR ở khoảng 105 bản sao/phản ứng.
-Enzyme chịu nhiệt Taq polymerase
Enzyme này có thể chịu được nhiệt độ tới 95oC, không bị phá hủy ở nhiệt
độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng. Một

21


phản ứng PCR từ 25 - 50µl thông thường có liều lượng Taq polymerase nằm
trong giới hạn từ 0.5 - 2.5 đơn vị. Enzyme này có hoạt tính polymerase 5’- 3’ và
hoạt tính exonuclease 5’- 3’ nhưng không có hoạt tính exonuclease 5’- 3’ nhưng
không có hoạt tính exonuclease 3’- 5’ (đọc sửa), chỉ dùng Tag DNA polymerase
để phiên mã ngược cDNA từ mARN để phát hiện ra virus HCV nói riêng và xét
nghiệm có hay không có một gen cụ thể trong DNA đích nói chung, chứ không
dùng enzyme này để nghiên cứu chức năng của gen vì enzyme này có tỷ lệ sai
xót 1/10000, nghĩa là sau 25 lần tái bản thì khoảng 10% sản phẩm có chứa đột
biến.
-Mồi ( Primer )

Đây là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR, để
đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao, có vai trò làm mồi cho
hoạt động kéo dài mạch của DNA polymerase. Do đó, việc thiết kế mồi phải
được tiến hành thật chính xác, và là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR.
Nồng độ mồi trong mỗi phản ứng PCR phải được tính toán tối ưu bằng thực
nghiệm. Nếu nồng độ mồi quá cao sẽ dẫn đến hiện tượng khuếch đại kí sinh,
ngược lại sẽ làm hiệu quả khuếch đại của phản ứng không cao. Giới hạn nồng độ
mồi thường là 0.1-1µl.
Mồi thiết kế phải tuân thủ những nguyên tắc sau:
+Tm của mồi “xuôi” và mồi “ngược” không khác nhau quá 5oC.
+Tránh sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ngược”.
+Tránh các cấu trúc “kẹp tóc” trong thành phần mỗi mồi.
+Thành phần nucleotide của mồi phải cân bằng.
+Tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần.
+Thành phần GC khoảng 40-60%.
+Trình tự mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần nhân bản.
-dNTPs (deoxynucleotide triphosphates)

22


Gồm bốn loại nucleotide được dùng trong phản ứng PCR là: dATP, dTTP,
dGTP, dCTP. Nồng độ của mỗi loại nu trong mỗi phản ứng (với nồng độ MgCl2
1.5mM) là 200-250µl, chúng ta phải giữ nồng độ của tất cả các deoxynucleotide
bằng nhau, để tránh sự gắn kết nhầm lẫn. Nếu nồng độ dNTPs cao hơn 4µl sẽ
dẫn đến sự khuếch đại “kí sinh”, và sự mất cân bằng nồng độ giữa các loại nu sẽ
làm tăng lỗi sao chép của DNA polymerase
-MgCl2
Có vai trò là một cofactor cho enzyme Tag polymerase hoạt động. Ngoài
ra, mồi; DNA bản mẫu; dNTPs; EDTA cũng có thể liên kết với MgCl2 và do đó

sẽ cạnh tranh với DNA polymerase. Nếu nồng độ MgCl2 cao sẽ dẫn đến hiện
tượng khuếch đại kí sinh. Ngược lại nếu nồng độ quá thấp (<0.5µM) sẽ làm xấu
đi quá trình kéo dài chuỗi. Vì vậy, phải thiết kế nồng độ MgCl2 tối ưu nhất nhằm
đảm bảo kết quả số lượng sản phẩm và sự chuyên tính của sản phẩm PCR, thông
thường là từ 1.5 - 4µM. Ph sẽ giảm khi nhiệt độ tăng.
-Dung dịch đệm PCR
Dung dịch này có vai trò cung cấp những ion cần thiết cho phản ứng xảy
ra. Tùy theo nguồn DNA polymerase mà nồng độ và pH của dung dịch đệm cũng
như nồng độ KCl tối ưu sẽ thay đổi cho phù hợp. Thông thường, một phản ứng
PCR sẽ có dung dịch đệm điển hình là: 50mM KCl, 10mM Tris – HCl, pH 8.3 ở
nhiệt 200C. pH sẽ giảm khi nhiệt độ tăng.
1.6.3.4. Phương pháp Real-time PCR [4, tr. 152-153], [9], [11]
Trong sinh hoc phân tử Real - time PCR (PCR đúng thời điểm) là kỹ thuật
phòng thí nghiệm dựa trên phản ứng PCR dùng để nhân bội và định lượng đồng
thời phân tử DNA đích. Nó có khả năng vừa phát hiện vừa định lượng trình tự
đặc hiệu trong mẫu DNA.
) Nguyên tắc real-time PCR cũng dựa trên PCR thường, đặc điểm cơ
bản của Reat - time PCR là DNA nhân bội được định lượng đúng thời điểm sau
mỗi chu kỳ phản ứng, nhưng phương pháp này có thể định lượng được hàm

23


lượng DNA/RNA có trong mẫu nhờ các chất nhuộm phát huỳnh quang
(fluorescent dye) vào DNA mạch kép hoặc dùng mẫu dò DNA oligonucleotide
được biến đổi để phát huỳnh quang khi lai với DNA bổ trợ, phản ứng PCR đúng
thời điểm được kết hợp với RT - PCR (revserse transcription-polymerase chain
reaction) để định lượng mRNA có hàm lượng nhỏ, giúp nhà nghiên cứu định
lượng mức độ biểu hiện gen một cách tương đối tại một thời điểm cụ thể hoặc ở
những tế bào hoặc mô cụ thể.

Sau khi nhân bản, các sản phẩm PCR mục tiêu sẽ được theo dõi hàm
lượng theo một thời gian thật (real time) của phản ứng.
) Thiết bị
Thực chất, thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng được
yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác và cũng không cần phải qua
bước điện di hoặc lai phân tử như kỹ thuật PCR truyền thống, vì vậy nguy cơ
ngoại nhiễm do sản phẩm của lần nhân bản trước được loại bỏ và việc phân tích
kết quả sau phản ứng được tiến hành hoàn toàn tự động nên đặc biệt thích hợp
thao tác trên số lượng mẫu lớn.
Thiết bị nhân bản nucleic acid có sử dụng huỳnh quang thông dụng trên
thị trường hiện này gồm có máy Mx 400 hay Mx 300 (Stratagene).
Máy real-time PCR và hệ thống máy tính, phần mềm hỗ trợ.

Hình 1.10. Máy Stratagene Mx3000P
24


Các chất phát huỳnh quang trong mỗi phản ứng được kích thích bằng một
nguồn sáng laser (ABI Prism 7700) hoặc đèn tungsten halogen (iCycler). Ánh
sáng huỳnh quang phát ra được thu nhận qua một Charged Coupled Device
camera (CCD camera) và được chuyển thành một tính hiệu mà máy vi tính có
thể phân tích được.
) Phản ứng phát huỳnh quang (khi dùng mẫu dò Taqmam)
Việc định lượng số bản sao khuếch đại sẽ dựa vào mẫu dò (probe). Mẫu
dò là một đoạn oligonucleotide ngắn xác định, được đánh dấu bằng nhiều
phương pháp khác nhau dùng để nhận diện các đoạn acid nucleic khác có trình
tự bổ sung với nó. Về cơ bản, mẫu dò cũng tương tự như mồi, chỉ khác ở chỗ
mẫu dò được gắn thêm một cơ chất có thể phát tín hiệu (thường là đồng vị phóng
xạ P32/P33, hoặc chất phát huỳnh quang).
Trong real-time PCR có nhiều loại mẫu dò nhưng trong chẩn đoán HCV

chỉ sử dụng mẫu dò thủy giải (hydrolysis probe) :
Mẫu dò thủy giải (Hydrolysis probe): còn được gọi là Taqman probe,
người ta dựa vào đăc tính exonuclease 5’- 3’ của Tag polymerase để hình thành
phương pháp, loại mẫu dò dựa trên sự truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh
quang khi lai ( Hình 1.11).
Mẫu dò này là oligonucleotide có chứa thuốc nhuộm “phát huỳnh quang”
(reporter) thường gắn vào base ở đầu 5’ và một chất “dập tắt” huỳnh quang
(quencher) ở đầu 3’. Mẫu dò được thiết kế để lai với vùng giữa của sản phẩm
PCR. Khi phát xạ, thuốc nhuộm phát huỳnh quang bị kích thích, truyền năng
lượng cho phân tử thuốc nhuộm dập tắt bên cạnh chứ không phát sáng, tạo nên
cơ chất không phát huỳnh quang. Trong quá trình PCR, khi enzyme DNA
polymerase tái bản khuôn có mẫu dò gắn vào, hoạt tính 5’- 3’ của enzyme cắt bỏ
mẫu dò. Động thái đó tách thuốc nhuộm phát huỳnh quang khỏi thuốc nhuộm
dập tắt và sự truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang không xảy ra nữa. Ánh
sáng huỳnh quang phát ra sẽ tương ứng với hàm lượng sản phẩm PCR có trong

25